Summary

Использование в естественных условиях и тканей и клеток экспланта подходы к изучению морфогенеза и патогенез эмбриональных и перинатальной аорты

Published: September 12, 2017
doi:

Summary

Протоколы для изучения эмбриональных и перинатальной мышиных аорты, используя в vivo Клональный анализ и сопоставление судьба, аорты эксплантов и изолированных гладких мышц, которые подробно клетки здесь. Эти разнообразные подходы облегчить расследование морфогенеза эмбриональных и перинатальной аорты в нормальное развитие и патогенезе заболеваний.

Abstract

Аорты является крупнейшим артерий в организме. Аорты стена состоит из внутреннего слоя эндотелиальных клеток, средний слой знакопеременных упругих ламелей и гладкомышечные клетки (SMCs) и наружный слой фибробластов и внеклеточного матрикса. В отличие от широко распространенной изучение патологических моделей (например, атеросклероз) в взрослых аорты гораздо меньше известно о эмбриональных и перинатальной аорты. Здесь, мы ориентируемся на SMCs и предоставить протоколы для анализа Морфогенез и патогенезе эмбриональных и перинатальной aortic SMCs нормального развития и болезней. В частности, являются четыре протоколы включены: я) в естественных условиях эмбриональных судьба картирования и Клональный анализ; II) экспланта эмбриональных аорты культуры; III) SMC изоляции от перинатальной аорты; и iv) подкожной осмотического мини-насос размещение в беременных (или небеременных) мышах. Таким образом эти подходы облегчить расследование origin(s), судьба и клоновых архитектуры SMCs в аорте в естественных условиях. Они позволяют для плавного эмбриональных аорты морфогенеза в утробе матери , продолжительное фармакологических агентов. Кроме того изолированные аорты ткани эксплантах или aortic SMCs может использоваться для получения понимание роли конкретных генов цели во время основных процессов, таких как muscularization, распространением и миграции. Эти гипотезы генерации эксперименты на изолированных SMCs и explanted аорты затем может оцениваться в контексте в естественных условиях через фармакологических и генетических подходов.

Introduction

Сосудистой системы многоклеточных организмов функции для доставки питательных веществ и кислорода к клеткам, которые не контакт с внешней окружающей среды и удаления отходов и диоксида углерода из этих клеток. В позвоночных первичной сердечно-сосудистой системы состоит из сердца, которые насосы крови через серию кровеносных сосудов. Стены из крупных кровеносных сосудов, артерий и вен, состоят из трех слоев: я) интима, или внутренний слой эндотелиальных клеток; II СМИ, или средний слой чередующихся окружности удлиненные гладкомышечные клетки SMCs и упругие ламели; и iii) адвентиции или наружный слой соединительной ткани и фибробластов. Подавляющее большинство исследований в сосудистая биология сосредоточиться на эндотелиальных клеток, расследование формирования новой эндотелиальных клеток выстроились трубок по ангиогенез. В сравнении SMCs получают относительно мало внимания. Однако SMCs являются тип критической ячейки в строительстве нормальной артериальной стенки и в сосудистой патологии.

Аорты является крупнейшим калибр артерий в организме, получении сердечного выброса из левого желудочка сердца. Она страдает от различных заболеваний человека, включая атеросклероз, аневризма и рассечение. В взрослых организмов аорты и ее ветвей крупных интенсивно учился в модели сосудистых заболеваний. Например, высоким содержанием жиров кормили мышей, которые являются null для кодирования рецепторов липопротеинов низкой плотности или аполипопротеин E, ген развитие атеросклероза, и недавние судьба сопоставления исследования показывают, что существующие SMCs порождают множественные типы клеток в 1атеросклеротических бляшек. В аневризмы аорты патологические изменения включают SMC апоптоза и внеклеточного матрикса, Ремоделирование2,3.

Значительно меньше известно относительно SMC морфогенеза и патогенез периоды эмбрионального и перинатальной. Здесь мы предоставляем протоколы для изучения эмбриональных и перинатальной аорты SMCs в естественных условиях, в ткани эксплантов и изолированных клеток. Например первый раздел протокола определены судьба сопоставления и Клональный анализ в эмбриональных мышей. CRE рекомбиназа выразил под контролем клетки конкретной промоутера облегчает маркировка отдельных ячеек и их потомства4,5,6; Однако временной контроль клеток конкретных маркировки может быть сложным во время эмбрионального развития у мышей. В этом контексте с эмбрионами, выражая условного CreER под промоутер активно SMCs (e.g.,Myh11 или Acta2) и Cre репортер, мы предоставляем методы для инъекций тамоксифен или его активный метаболит 4-OH-тамоксифен в беременных плотин и для анализа помечены клетки эмбрионов или послеродовой потомство. Кроме того в отличие от судьбы картографические исследования, которые преимущественно используют Cre Репортеры с один репортер Флюорофор1,7, Клональный анализ существенно повышается с многоцветной Cre журналистами.

Второго и третьего протокола описаны методы для изоляции и культивировании эмбриональных эксплантов аорты и аортального SMCs от новорожденных, соответственно. Эти подходы позволяют для манипулирования сигнальных путей, специально в аортальной эксплантов или SMCs и для анализа прямых последствий фармакологических агентов. Таким образом роль конкретных генов в тканях интерес может проверяться в гораздо более быстрой моды чем через традиционные генетические манипуляции в мышах. Кроме того отдельные исследования SMC облегчить анализ миграции клеток и адгезии, которые технически являются ограниченными в естественных условиях.

Наконец в четвертом разделе протокол очерчивает размещения подкожной осмотического мини-насос, загружен с фармакологическими агентами в беременных (или небеременных) мышах. Этот метод облегчает анализ воздействия на эмбриональное развитие, вызванные агентов, которые требуют постоянного притока из-за быстрого метаболизма. Альтернатива частые инъекции не является практичным для многих агентов и следует избегать, так как это может вызвать значительный дискомфорт в беременных дам.

Protocol

все протоколы мыши утверждаются институциональный уход животных и использования Комитетом в Йельском университете. 1. In Vivo эмбриональных судьба картирования и Клональный анализ Примечание: мы использовали эти подходы широко для оценки происхождени…

Representative Results

Представитель клоновых анализа SMCs в мутанта эмбрионов для АНО (ген кодирования белков эластина внеклеточная матрица), АНО(+/-), Acta2-CreERT2 мышей были повязана АНО(+/-) мышах также перевозящих многоцветные ROSA26R(РБ/Rb) репортер. Как описано…

Discussion

В отличие от тщательного расследования мышиных аорты и ее крупных филиалов в взрослых патологических состояний, такие как модели атеросклероза меньше известно относительно Морфогенез и патогенезе эмбриональных и перинатальной аорты. Здесь мы ориентируемся на эмбриональных/перината…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Дин ли для обмена его лаборатории протокол для аорты SMC изоляции. Финансовая поддержка была оказана национальных институтов здравоохранения (R21NS088854, R01HL125815 и R01HL133016 к D.M.G), Американской ассоциации сердца (целевые субсидии 14GRNT19990019 до D.M.G.) и Йельский университет (Браун-Кокс стипендий до утра и запуска средства для D.M.G.).

Materials

Tamoxifen Sigma T5648
Corn oil Sigma C-8267 Vehicle for tamoxifen
4-OH-tamoxifen Sigma H7904 Active metabolite of tamoxifen
Progesterone Sigma P8783-5G Use at half the concentration of tamoxifen
OCT compound Sakura tissue tek 4583 For making cryoblocks
Cryomolds Polysciences inc 18986
DAPI Sigma D9542 IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml
Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody Sigma A2547 IHC staining of SMA, final dilution 1:500
Anti-CD31 antibody BD Pharmingen 550274 IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A-11121 IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 Life Technologies a21244 IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 Life Technologies a11008 IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml
DMEM Thermo Fisher Scientific 10567-014 For cell culture
FBS Thermo Fisher Scientific 10437028
Anti-integrin beta3 blocking antibody BD Biosciences 553343 Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml
Collagenase Worthington Biochemical Corp 44H14977A For digesting aorta
Elastase Worthington Biochemical Corp 34K15139 For digesting aorta
Antibiotic-antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Recombinant human FGF Promega G5071
Recombinant human EGF Promega G5021
Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140122
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Tissue culture plates Corning CLS430165
Alzet osmotic mini-pump Durect Corporation 2001
ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope Nikon
TCS SP5 Leica
Branson Sonifier 450 VWR
Myh11-CreERT2 mice The Jackson Laboratory 19079
Acta2-CreERT2 mice Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 mice The Jackson Laboratory 8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) mice The Jackson Laboratory 026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) mice The Jackson Laboratory 006148
ROSA26R(Confetti/Confetti) mice The Jackson Laboratory 13731
ROSA26R(Rb/Rb) mice Lab of Dr. Irv Weissman Obtained from lab of Dr. Irv Weissman

References

  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
  3. Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
  4. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
  5. Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
  6. Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
  7. Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
  8. Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
  9. Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
  10. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
  11. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
  12. Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
  13. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  15. Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
  16. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  18. Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
  19. Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
  20. Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
  21. Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
  22. Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
  23. Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
  24. Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
  25. Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
  26. Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
  27. Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
  28. Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
  29. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  30. Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).

Play Video

Cite This Article
Misra, A., Feng, Z., Zhang, J., Lou, Z., Greif, D. M. Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta. J. Vis. Exp. (127), e56039, doi:10.3791/56039 (2017).

View Video