Summary

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

Published: September 12, 2017
doi:

Summary

Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Abstract

La aorta es la arteria más grande en el cuerpo. La pared aórtica se compone de una capa interna de células endoteliales, una capa intermedia de alternan laminillas elásticas y células musculares lisas (SMCs) y una capa externa de fibroblastos y matriz extracelular. En contraste con el extenso estudio de modelos patológicos (por ejemplo, ateroesclerosis) en la aorta del adulto, mucho menos se sabe sobre la aorta embrionaria y perinatal. Aquí, nos centramos en comités y protocolos para el análisis de la morfogénesis y patogénesis de la SMCs aorta embrionarias y perinatales en el desarrollo normal y la enfermedad. Específicamente, los cuatro protocolos incluidos son: i) en vivo destino embrionario mapeo y análisis clonal; II) explante aorta embrionaria cultura; III) aislamiento SMC de la aorta perinatal; y iv) colocación de mini-bomba osmótico subcutánea en ratones embarazadas (o no-). Así, estos enfoques facilitan la investigación de los orígenes, destino y arquitectura clonal de comités en la aorta en vivo. Que permiten la modulación de morfogénesis de aorta embrionaria en el útero por la continua exposición a agentes farmacológicos. Además, explantes de tejido aórtico aislado o comités aórticas pueden utilizarse para ganar penetraciones en el papel de objetivos gen específico durante procesos fundamentales tales como la migración, proliferación y muscularization. Estos experimentos de generación de hipótesis en comités aislados y la aorta explanted entonces pueden evaluarse en el contexto de en vivo a través de enfoques farmacológicos y genéticos.

Introduction

Circulatorio de la función de los organismos multicelulares para entregar nutrientes y oxígeno a las células son no en contacto con el medio externo y para eliminar productos de desecho y dióxido de carbono de estas células. En vertebrados, el sistema circulatorio primario consiste en el corazón, que las bombas de la sangre a través de una serie de vasos sanguíneos. Las paredes de grandes vasos sanguíneos, como arterias y venas, consisten en tres capas: i) la íntima o capa interna de células endoteliales; II) los medios de comunicación o capa media alternancia circunferencial alargada de las células musculares lisas comités y laminillas elásticas; y iii) la adventicia o capa externa de tejido conectivo y los fibroblastos. La gran mayoría de los estudios en biología vascular se centran en las células endoteliales, investiga la formación de nuevos tubos de revestimiento de células endoteliales a través de la angiogénesis. En comparación, comités reciben relativamente poca atención. Sin embargo, los comités son un tipo de célula fundamental en la construcción de la pared arterial normal y patologías vasculares.

La aorta es la arteria de mayor calibre en el cuerpo, recibiendo el gasto cardíaco del ventrículo izquierdo del corazón. Es afectado por diversas enfermedades humanas, incluyendo la aterosclerosis, aneurisma y disección. En organismos adultos, la aorta y sus ramas principales son intensamente estudiados en modelos de enfermedad vascular. Por ejemplo, dieta alta en grasas alimentó ratones que son nulos para el gen que codifica el receptor de lipoproteína de baja densidad o apolipoproteína E, desarrollar la ateroesclerosis, y estudios recientes de asignación de destino indican que SMCs preexistentes dan lugar a múltiples tipos de células en la 1de la placa aterosclerótica. En aneurismas de la aorta, los cambios patológicos incluyen SMC apoptosis y matriz extracelular remodelación2,3.

Sustancialmente se sabe menos sobre SMC morfogénesis y patogénesis durante los períodos embrionarios y perinatales. Aquí, le ofrecemos protocolos para estudiar embrionaria y perinatal aórtica SMCs en vivo, en explantes de tejidos y en células aisladas. Por ejemplo, la primera sección del protocolo delinea destino mapeo y análisis clonal en ratones embrionarios. Recombinase de CRE expresado bajo el control de un promotor específico de célula facilita el marcado de células específicas y su progenie4,5,6; sin embargo, el control temporal de células específicas de etiquetado puede ser difícil durante el desarrollo embrionario en ratones. En este contexto, con los embriones expresando el CreER condicional bajo un promotor activo en comités (e.g.,Myh11 o Acta2) y un reportero de Cre, ofrecemos métodos para inyectar el tamoxifeno o su metabolito activo 4-OH-tamoxifeno en las madres embarazadas y para analizar las células etiquetadas en embriones o vástagos postnatal. Además, en contraste con estudios de asignación de destino, que predominantemente utilizan Cre reporteros con un solo reportero fluoróforo1,7, análisis clonal es sustancialmente mejorado con reporteros de Cre de varios colores.

Las secciones segunda y terceros del protocolo describen los métodos para aislar y cultivar explantes aórticos embrionarios y aórticas comités de recién nacidos, respectivamente. Estos enfoques permiten la manipulación de vías de señalización, concretamente en explantes aórticos o PYME y para analizar los efectos directos de los agentes farmacológicos. Así, el papel de genes específicos en el tejido de interés puede ser defendido en una manera mucho más rápida que a través de manipulaciones genéticas tradicionales en ratones. Además, los estudios aislados de SMC facilitan el análisis de la migración celular y adherencia, que son técnicamente limitado en vivo.

Por último, la cuarta sección de protocolo delinea la colocación de una mini-bomba osmótica subcutánea repleta de agentes farmacológicos en ratones embarazadas (o no-). Este método facilita el análisis del efecto sobre el desarrollo embrionario causada por agentes que requieren infusión continua debido a metabolismo rápido. La alternativa de inyecciones frecuentes no es práctica para muchos agentes y debe evitarse, ya que puede causar malestar significativo en la presa embarazada.

Protocol

todos los protocolos de ratón son aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en Universidad de Yale. 1. mapeo de destino embrionario In Vivo y análisis Clonal Nota: hemos utilizado estos enfoques ampliamente para evaluar los orígenes de las células y su arquitectura clonal en modelos de desarrollo y la enfermedad 7 , 8 , 9 , <sup cl…

Representative Results

En un representante análisis clonal de comités en el mutante de embriones para el Eln (el gene que codifica la elastina proteína de matriz extracelular), Eln(+/-), CreER Acta2T2 ratones fueron apoyadas en ratones Eln(+/-) también lleva la multicolor ROSA26R(Rb/Rb) reportero. Como se describe en el paso 1, se revisaron las bujías presas embarazadas fueron inducidos con una inyección de tamoxifeno solo (1,5 mg) e…

Discussion

En contraste con las investigaciones extensas de la aorta murina y sus ramas principales en adultos condiciones patológicas, tales como modelos de aterosclerosis, se sabe menos sobre la morfogénesis y la patogenesia de la aorta embrionaria y perinatal. Aquí nos centramos en la aorta embrionaria/perinatal, especialmente las PYME y proporcionar protocolos para estudiar la aorta a través de en vivo, explantes de tejido, y aislamiento de SMC se acerca. Estos enfoques cortesía proporcionan al investigador con di…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Dean Li para el intercambio de protocolo de su laboratorio para el aislamiento de SMC aórtica. Apoyo financiero fue provisto por los institutos nacionales de salud (R21NS088854, R01HL125815 y R01HL133016 a D.M.G), la Asociación Americana del corazón (14GRNT19990019 subvenciones a D.M.G.) y la Universidad de Yale (Brown-Coxe beca para A.M. y puesta en marcha fondos a D.M.G.).

Materials

Tamoxifen Sigma T5648
Corn oil Sigma C-8267 Vehicle for tamoxifen
4-OH-tamoxifen Sigma H7904 Active metabolite of tamoxifen
Progesterone Sigma P8783-5G Use at half the concentration of tamoxifen
OCT compound Sakura tissue tek 4583 For making cryoblocks
Cryomolds Polysciences inc 18986
DAPI Sigma D9542 IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml
Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody Sigma A2547 IHC staining of SMA, final dilution 1:500
Anti-CD31 antibody BD Pharmingen 550274 IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml
Anti-GFP antibody Thermo Fisher Scientific A-11121 IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 Life Technologies a21244 IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml
Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 Life Technologies a11008 IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml
DMEM Thermo Fisher Scientific 10567-014 For cell culture
FBS Thermo Fisher Scientific 10437028
Anti-integrin beta3 blocking antibody BD Biosciences 553343 Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml
Collagenase Worthington Biochemical Corp 44H14977A For digesting aorta
Elastase Worthington Biochemical Corp 34K15139 For digesting aorta
Antibiotic-antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Recombinant human FGF Promega G5071
Recombinant human EGF Promega G5021
Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140122
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific 15290026
Tissue culture plates Corning CLS430165
Alzet osmotic mini-pump Durect Corporation 2001
ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope Nikon
TCS SP5 Leica
Branson Sonifier 450 VWR
Myh11-CreERT2 mice The Jackson Laboratory 19079
Acta2-CreERT2 mice Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 mice The Jackson Laboratory 8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) mice The Jackson Laboratory 026862
ROSA26R(EYFP/EYFP) mice The Jackson Laboratory 006148
ROSA26R(Confetti/Confetti) mice The Jackson Laboratory 13731
ROSA26R(Rb/Rb) mice Lab of Dr. Irv Weissman Obtained from lab of Dr. Irv Weissman

References

  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
  3. Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
  4. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
  5. Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
  6. Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
  7. Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
  8. Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
  9. Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
  10. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
  11. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
  12. Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
  13. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  15. Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
  16. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  18. Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
  19. Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
  20. Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
  21. Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
  22. Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
  23. Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
  24. Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
  25. Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
  26. Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
  27. Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
  28. Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
  29. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  30. Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).

Play Video

Cite This Article
Misra, A., Feng, Z., Zhang, J., Lou, Z., Greif, D. M. Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta. J. Vis. Exp. (127), e56039, doi:10.3791/56039 (2017).

View Video