Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

دليل للإنتاج وتبلور، وتصميم هيكل للبشرية IKK1/α

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

كيناز IκB 1/α (IKK1/α الشق) هو كيناز بروتين Ser/منتدى المجالس الرومانسية التي تشارك في مجموعة متنوعة أنشطة الخلوية أساسا من خلال تفعيل عوامل النسخ نف κB. وهنا يصف لنا الخطوات الرئيسية اللازمة لإنتاج وتصميم هيكل الكريستال هذا البروتين.

Abstract

فئة من المحفزات خارج الخلية يتطلب التنشيط من IKK1/α للحث على جيل من وحدة فرعية NF-κB، p52، من خلال تجهيز p100 السلائف. وظائف p52 هوموديمير أو هيتيروديمير مع وحدة فرعية NF-κB آخر، ريلب. وتنظم هذه dimers بدوره التعبير عن مئات جينات المعنية بالتهاب وبقاء الخلية، ودورة الخلية. IKK1/α أساسا يظل المقترنة مع IKK2/β ونيمو كمجمع ثلاثي. ومع ذلك، يلاحظ أيضا بركة صغيرة لأنها complex(es) وزن الجزيئي منخفض. من غير المعروف إذا كان يتم تشغيل نشاط تجهيز p100 بتفعيل IKK1/α داخل أكبر أو أصغر مجموعة معقدة. تم الكشف عن نشاط المكونة من IKK1/α في العديد من أنواع السرطان والأمراض الالتهابية. لفهم الآلية لتفعيل IKK1/α، ويمكن استخدامه كهدف المخدرات، أعربنا عن المؤتلف IKK1/α في أنظمة المضيف مختلفة، مثل كولاي، والحشرات، وخلايا الثدييات. لقد نجحنا في التعبير عن IKK1/α القابلة للذوبان في باكولوفيروس إصابة خلايا الحشرات، الحصول على كميات ملغ من البروتين النقي جداً، وبلورة ذلك حضور مثبطات، وتحديد هيكلها كريستال بالأشعة السينية. هنا، نحن تصف الخطوات التفصيلية لإنتاج البروتين المؤتلف وفي التبلور، وعزمه الهيكل كريستال بالأشعة السينية.

Introduction

الأنشطة النسخي NF-κB الأسرة من عوامل النسخ dimeric مطلوبة من أجل وظائف خلوية متنوعة تتراوح بين الالتهاب والحصانة للبقاء على قيد الحياة والموت. وتخضع هذه الأنشطة صارم في الخلايا وفقدان التنظيم يؤدي إلى مختلف الحالات المرضية، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية والسرطان1،،من23. نظراً لغياب حافز، يتم الاحتفاظ بأنشطة NF-κB تحول دون ب البروتينات IκB (المانع-κB)4. علامات الفسفرة بقايا Ser محددة على البروتينات IκB لهم أوبيكويتينيشن وتدهور proteasomal اللاحقة أو معالجة انتقائية5. اثنين مؤنزم Ser/Thr عالية مثلى، IKK2/β و IKK1/α، تعمل كوسط منظمي الأنشطة NF-κB بالاضطلاع بهذه الأحداث الفسفرة6،7.

التفاعلات بين يجند ومستقبلات ترانسدوسيس إشارة من خلال سلسلة من الوسطاء مما يؤدي إلى تنشيط عوامل NF-κB. ويمكن تصنيف عملية التنبيه NF-κB على نطاق واسع إلى مسارين متميزة-المقبول وغير المقبول (البديلة)8. وينظم نشاط IKK2/β أساسا NF-κB إشارات من مسار الكنسي الذي يعتبر أساسيا للاستجابات المناعية التحريضية والفطرية9. سمة مميزة لهذا المسار تنشيط السريع ولم تدم طويلاً من IKK2/β10 داخل إيك أونتشاراكتيريزيد المتحلل حتى الآن معقدة – يفترض أن تكون مؤلفة من IKK1 و IKK2، فضلا عن عنصر تنظيمي، نيمو (NF-κB "المغير الأساسية" )11،،من1213. بين وحدتين فرعيتين إيك الحفاز لمجمع إيك، IKK2 هو أساسا مسؤولة14 الفسفرة بقايا محددة لتنميط IκBs (α،-β، وγ) منضمة إلى NF-κB، وأيضا بروتين IκB شاذة، NF-κB1/p105، الذي تمهيدا ل وحدة فرعية p50 NF-κB5. الناجم عن الفسفرة أوبيكويتينيشن وتدهور proteasomal IκB (أو تجهيز p105) يؤدي إلى إطلاق سراح والتنشيط لمجموعة محددة من NF-κB dimers15. وقد لوحظ نشاط NF-κB الشاذة بسبب سوء تنظيم وظيفة IKK2 في العديد من أنواع السرطان، وكذلك كما هو الحال في اضطرابات المناعة الذاتية2،،من316.

على النقيض من IKK2/β، ينظم نشاط من IKK1/α NF-κB يشير المسار غير متعارف عليه، هو أمر ضروري للتنمية والحصانة. IKK1 فوسفوريلاتيس بقايا محددة من NF-κB2/p100 في جزئه IκBδ ج-الطرفية، مما يؤدي إلى المعالجة وتوليد p52. يبدأ تشكيل هيتيروديمير p52:RelB ترانسكريبتيونالي النشطة استجابة بطيئة ومتواصلة لإشارات التنموية7،17،،من1819،20. من المثير للاهتمام، جيل p52 عامل نف κB المركزية لهذا المسار اعتماداً كبيرا على عامل آخر، كيناز الذي يحفز NF-κB (NIK)21،22، لكن ليس على IKK2 أو نيمو. في الخلايا يستريح، لا يزال مستوى NIK منخفضا بسبب لها التردي المستمر تعتمد على بروتوزوم23،24،25. عند تنشيط خلايا يغاندس 'غير مقبول'، وفي بعض الخلايا الخبيثة، يصبح استقرت NIK لتوظيف وتفعيل IKK1/α-أنشطة كيناز NIK و IKK1 ضرورية لفعالية تجهيز p100 إلى p527. IKK1 و NIK فوسفوريلاتي سيرينس الثلاثة (Ser866، 870 و 872) من NF-κB2/p100 في جزئه IκBδ ج-الطرفية مما يؤدي إلى المعالجة وتوليد p52. قد تورط الشاذة تفعيل المسار غير متعارف عليه في كثير من الأورام الخبيثة بما في ذلك الورم النخاعي المتعدد26،،من2728.

عدة مثبطات كفاءة عالية ومحددة ل IKK2/β معروفة، على الرغم من أن لا شيء حتى الآن وقد اتضح أن دواء فعال. وفي المقابل، مثبطات IKK1/α-محددة متفرق. وهذا قد تنبع جزئيا من افتقارنا للمعلومات الهيكلية والبيوكيميائية على IKK1/α، مما يحد من فهمنا للأساس آليا إلى تفعيل NF-κB التي IKK1 في الخلايا، وتصميم الأدوية العقلاني. هياكل الأشعة السينية IKK2/β قدم لنا رؤى في تفعيل إليه بيتا IKK2/29؛ ومع ذلك، هذه الهياكل يمكن أن لا تكشف عن مدى اختلاف المحفزات المنبع يؤدي التنشيط IKK1/α أو IKK2/β لتنظيم مجموعات متميزة من NF-κB الأنشطة 30،31. لفهم أساس الميكانيكية الأساسية لوظيفة التنبيه متميزة IKK1/α، وإنشاء منبر لتصميم الأدوية العقلاني، ركزنا على تحديد هيكل IKK1/α.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد مناسبة للتعبير واسع النطاق من IKK1/α المؤتلف الفيروس

  1. إعداد الفيروس P1 32
    1. يوم 1: الخلايا Sf9 لوحة (~ 6 × 105) (رقم إصدار أقل من 10) في 2 مل من Sf900 الثالث المتوسط خلية الحشرات في كل جيد من لوحة 6-جيدا واحتضان عند 27 درجة مئوية. مرور الخلايا عندما تصل كثافة من 2 إلى 3 × 106 خلايا كل مل في تعليق بتمييع في وسائط جديدة في كثافة ~ 6 × 105.
    2. يوم 2: تمييع ميليلتر 8 من كاشف Sf9-تعداء في 100 ميليلتر من "المتوسطة الحشرات" Sf900 الثالث أو سماح بدون المضادات الحيوية والأمصال. الدوامة بإيجاز.
    3. تمييع 1 ميكروغرام لتنقية كيت باكميد المؤتلف (ترد التفاصيل في 'نتائج الممثل')32 إلى آخر ميليلتر 100 المتوسط نفسها، في أنبوب منفصل.
    4. الجمع بين الحمض المخفف وكاشف تعداء (ميكروليتر الحجم الإجمالي ~ 210-220)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة.
    5. إزالة المتوسطة من البئر. أضف 1 مل متوسطة جديدة دون المضادات الحيوية والأمصال.
    6. إضافة خليط كاشف تعداء الحمض المخفف dropwise على الخلايا. ضبط حجم الانخفاض بأنه عدم إزاحة الخلايا ملتصقة.
    7. بعد ح ~ 6، إضافة 1.5 مل متوسطة جديدة في أعلى أو إزالة المتوسطة وإضافة 2.5 مل متوسطة جديدة. المتوسطة العذبة الدافئة إلى 25-27 درجة مئوية قبل الإضافة.
    8. احتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية. تحقق من الآبار بشكل دوري كل ح ~ 12 لأعراض العدوى الفيروسية. القيام بجميع الصيانة Sf9 والتعبير عند 27 درجة مئوية.
    9. اليوم الخامس: إخراج المتوسطة التي تحتوي على خلايا ح 60-72 بعد الإصابة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ز و 4 درجات مئوية. حفظ المادة طافية؛ وهذا المخزون P1-الفيروس. تجميد مختبرين الصغيرة في-80 درجة مئوية.
  2. اختيار أفضل معربا عن استنساخ الفيروس P1.
    1. لوحة الخلايا وبالمثل كما هو موضح في الخطوة 1، 1.
    2. القادم بوست يوم أو ح ~ 6 الطلاء، إضافة ميليلتر 20 و 50 ميليلتر الأرصدة استنساخ الفيروس P1 المختلفة على الخلايا في آبار مختلفة.
    3. إزاحة الخلايا ملتصقة بلطيف بيبيتينج وحصاد الخلايا المصابة ح 60-72 وظيفة العدوى من سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 500 x ز و 4 درجات مئوية. حفظ المادة طافية. وهذا المخزون الفيروسات P2. تخزين مختبرين صغيرة من المخزون الموجود في-80 درجة مئوية.
    4. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت x Laemmli الحزب الديمقراطي الصربي 2 بيليه خلية المقطوع. الحرارة في > 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي (عادة 10,000 > × ز) لمدة 5 دقائق.
    5. تشغيل 10-15 ميليلتر لكل عينة من 8-10% من مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة في الخامس 120-160 حتى الجبهة صبغ يصل إلى أسفل من الجل.
    6. الكهربائية والنقل بروتوكول (20 ت، 30-45 دقيقة) نقل البروتينات تحل بمعيار شبه الجاف في غشاء النيتروسليلوز/PVDF.
    7. لطخة مع الأجسام المضادة IKK1 (تمييع ~ 1:2، 000، يجب أن يكون الأمثل) أو الأجسام المضادة بينتاهيس (تمييع ~ 1:3، 000، يجب أن يكون الأمثل) للتعبير.
    8. اختر أفضل استنساخ الفيروس P1 بمقارنة التعبير عن IKK1 المؤتلف.
  3. إعداد نطاق واسع مخزون فيروس P3.
    1. لوحة الخلايا وبالمثل كما هو موضح في الخطوة 1، 1 في لوحة 15 سم يحتوي على 25-30 مل متوسطة الثالثة Sf900.
    2. ح ~ 6 وظيفة الطلاء، وإضافة 150-300 ميليلتر مخزون فيروس P1 تعرب عن أفضل على الخلايا.
    3. بعد 72 ساعة بعد الإصابة ونضح المتوسطة بعناية من اللوحة في أنبوب مناسب (عقيمة) والطرد المركزي الأنبوب في 500-1000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه الخلية (إذا لم يتم تشكيل واحد) وحفظ المادة طافية. وهذا مخزون فيروس P3.
  4. تحديد عيار الفيروس الأمثل للتعبير البروتين واسعة النطاق
    1. لوحة خلايا في 2 مل من Sf900 الثالث المتوسط، كما هو موضح في 1-1، في لوحة 6-جيدا.
    2. إضافة 20، 30 و 40 و 50 ميليلتر من P3 مخزون الفيروس في فصل الآبار ح ~ 6 وظيفة الطلاء. إدراج عنصر تحكم غير مصاب.
    3. حصاد الخلايا من كل عدوى وظيفة جيدا 48-60 ح.
    4. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للحزب الديمقراطي الصربي لايملي X 2. الحرارة في > 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي (عادة في 14,000 س ز) لمدة 5 دقائق.
    5. 10-15 ميليلتر لكل عينة في جل الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة 8-10% حل.
    6. نقل البروتين تحل بغشاء النيتروسليلوز/PVDF كما هو مذكور في 1.2.6.
    7. لطخة مع الأجسام المضادة IKK1 (تمييع ~ 1:2000، يجب أن يكون الأمثل) أو الأجسام المضادة بينتاهيس (تمييع ~ زائداً، يجب أن يكون الأمثل).
    8. استخدم الفيروس مع أفضل معربا عن عيار لتعبيرات واسعة النطاق.

2-التعبير واسعة النطاق من 6 x له معلم البشرية IKK129،33

  1. القيام بالتعبير واسع النطاق في ثقافة وقف. تقسيم الخلايا في 1 لتر متوسطة الثالثة Sf900 في قارورة Erlenmeyer ل 2 مع سقف تنفيس. ينبغي أن تكون كثافة الخلية ~ 5 × 105 خلايا/مل.
  2. تنمو هذه الخلايا في تعليق ~ 100 لفة في الدقيقة عند 27 درجة مئوية في شاكر ~ 2 أيام حتى تصل إلى كثافة 1-2 × 106/mL. يجب إلا تتجاوز كثافة الخلية 2 × 106/mL.
  3. إضافة المبلغ المطلوب من الفيروسات P3، كما تقيم في 1.4.
  4. تنمو ثقافة ح 48-60 ~ 100 لفة في الدقيقة عند 27 درجة مئوية في شاكر المصابة.
  5. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في < ز س 1,500 في 4 درجات مئوية.
  6. حفظ بيليه الخلية وتجاهل المتوسطة.
  7. المضي قدما لتنقية البروتين مباشرة. فلاش تجميد بيليه الخلية في النتروجين السائل ومخزن في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

3-تنقية صاحب IKK133

  1. في يوم 1، ريسوسبيند بيليه الخلية في 40 مل من "تحلل المخزن المؤقت" (25 مم تريس pH 8.0، 0.2% NP-40 مم 200 كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 ملم، 10% والغليسيرول، 5 مم β-mercaptoethanol ومثبط البروتياز كوكتيل).
    ملاحظة: بيليه الخلية الرطب الكتلة لم تحدد. بشكل عام، استخدمت ~ 2 لتر ثقافة لهذه الخطوة.
  2. الخلايا التي سونيكيشن في 60-70% واجب دورات، 5-10 نبضات مدتها 30 ثانية عند فاصل زمني من > 1 دقيقة، بالإبقاء على تعليق خلية مبردة على الثلج.
    ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة الأمثل مع كل نموذج من سونيكاتور. لا تدع العينة الاحماء أعلاه 10 ° C.
  3. توضيح بالطرد المركزي في ≥ س 28,000 ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. حجته 4 مل راتنج ني-جاتا [اغروس] مع المخزن المؤقت لتحلل، ومزيج توضيح ليستي (المادة طافية) يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  5. السماح للبروتين التي تلزم الراتنج بحضانة ح 2 في خلاط روتاري في غرفة 4 درجات مئوية.
  6. يغسل الراتنج جيدا مع تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 30 ملم ايميدازول. فحص تركيز البروتين في المياه والصرف الصحي بشكل دوري باستخدام "مقايسة برادفورد". المياه والصرف الصحي حتى يصل تركيز هذا البروتين في المياه والصرف الصحي إلى 0.1 مغ/مل. عادة > 20 سرير حجم المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي هو المطلوب للوصول إلى هذه النقطة.
  7. الوت البروتين صاحب معلم IKK1/α تحت تدفق الجاذبية، استخدام 20 مل من شطف المخزن المؤقت (تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على ايميدازول 250 ملم). جمع الكسور 1-1.5 مل.
  8. فحص نقاء التيد البروتين على هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 8 أو 10% عن طريق تحميل 5-10 ميكروليتر من عينة من جميع الكسور مختلطة مع لايملي المخزن المؤقت.
  9. تجمع الكسور الذروة (تركيز ≥ 2 مغ/مل)، وقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد.
  10. هضم مع TEV (01:30-50 (TEV البروتياز: IKK1)) مبطلات بين عشية وضحاها (ح إيه وان تو) في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تحسين مقدار حوزتي الإجمالية المطلوبة لإكمال الهضم (≥ 95 ٪) من العلامة X له 6 بداهة. تمت تنقيته حوزتي TEV في البيت.
  11. في صباح اليوم الثاني، احتضان البروتين مع 1 مم ATP حضور 20 مم مجكل2، 20 مم β-جليسيروفوسفاتي، 10 مم NaF وأورثوفاناداتي الصوديوم 1 مم ح 1 في 27 درجة مئوية.
  12. تصفية الحل البروتين من خلال عامل تصفية ميكرومترات 0.45 أو 0.22.
  13. تحميل 6 مل العينة على عمود حجم استبعاد محضرة ~ 120 مل المتصل نظام لوني سائل الآلي. حجته العمود مع المخزن المؤقت A (20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم DTT، 5% والغليسيرول) المسبقة لتطبيق نموذج البروتين.
    ملاحظة: يمكن استخدام عمود أصغر تبعاً لعائد البروتين بعد الخطوة تنقية تقارب ني-الإدارة الوطنية للسياحة. ضبط/حساب حجم التحميل 5 في المائة من حجم العمود).
  14. تشغيل حجم الاستبعاد اللوني بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة، ورصد شطف في 280 و 254 نانومتر. جمع الكسور ذات حجم 2 مل.
  15. تحقق نقاء الكسور الذروة (عادة حول ~ 60-70 مل) على هلام الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة 8-10%.
  16. تجمع الكسور البحتة (نقاء إيه ناين فايف % بتركيز ≥0.5 مغ/مل) والتركيز في كاتشين 10 أو 30 كاتشين الوزن الجزيئي وقف إنتاج مركزات البروتين الطرد المركزي اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  17. دورياً فحص تركيز البروتين من الركاز بواسطة الأسلوب برادفورد، والتركيز نموذج ما يصل إلى 8-12 ملغ/مل.
  18. الاستغناء عن 25 ميكروليتر مختبرين وفلاش التجميد في النيتروجين السائل. تخزين هذه العينات المجمدة فلاش في الثلاجة-80 درجة مئوية.

4-الشاشة من أجل بلورة حالة IKK1

  1. حساب المبلغ الإجمالي (من حيث الحجم) من البروتين المطلوب للشاشة لبلورات اتباع الأساليب المذكورة أدناه.
  2. حاول مثبطات مختلفة (مثبطات كيناز عامة: أمبنب، وستوروسبوريني؛ إيكسبيسيفيك مثبطات: MLN120B ومجمع بايك-المانع الثاني عشر) لإجراء الفحص للتبلور. جعل الحلول المخزون من هذه المركبات اتباع إرشادات الشركة المصنعة. ضمان عدم تجاوز أقصى تركيز المجمع في حل الأسهم 20 ميكرومتر.
  3. إعداد IKK:inhibitor معقدة للشاشة تبلور بخلط ميكرومترات 100 من IKK1 مع 200 ميكرومتر المانع، واحتضان في 18-20 درجة مئوية للطرد المركزي 30-40 دقيقة هذا الخليط في > ز س 15,000 لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حفظ المادة طافية لبلورة الشاشة.
  4. استخدام شاشات تبلور المتاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد).
  5. "الماصة؛" 80-100 ميكروليتر من كل بلورة الكاشف (خزان الحلول)، استخدام ماصة متعددة القنوات أو روبوت، وخزان لصفيحة 96-جيدا. اللوحة جاهز الآن لإعداد قطرات. تأكد من أن اللوحة يستوعب تبلور 2 إلى 3 قطرات حتى أنه يمكن أن يكون فحص مثبطات 2 إلى 3 في لوحة واحدة.
  6. استخدام روبوت تبلور، الاستغناء عن ومزيج 0.2-0.25 ميكروليتر IKK1:inhibitor المعقدة مع نفس الحجم من خزان الحل.
    ملاحظة: الفحص وتتم يدوياً باستخدام وحدات تخزين أكبر من انخفاض (0.5-1.0 ميكروليتر IKK1:inhibitor المعقدة مع نفس الحجم من خزان الحل). ومع ذلك، سيساعد استخدام روبوت حفظ قيمة الكواشف.
  7. ختم اللوحات فورا بعد وضع القطرات مع الأفلام واضحة بصريا لتجنب التبخر. ختم بشكل صحيح باستخدام المحاليل المناسبة. جعل لوحات متماثلة لكل مجموعة المانع. احتضان لوحة واحدة في 18 درجة مئوية، والأخرى في غرفة باردة (درجة الحرارة نطاق ~ 4 – 6 درجة مئوية). تأكد من أن الحاضنات لا تتأثر بالاهتزاز.
  8. استخدام ستيريوميكروسكوبي مع المستقطب للتحقق من ظهور البلورات في كل قطره كل يوم في الأيام السبعة الأولى، ومن ثم على فترات أطول. بشكل منهجي ملاحظة ونقاط هذه الملاحظات.
    ملاحظة: استخدام ستيريوميكروسكوبي مع المستقطب بحيث يمكن تقييم عيوب النمو في بلورات بصريا. هنا، بلورات ظهرت في حالة حيث حل الخزان الواردة 3% w/v ديكستران كبريتات الصوديوم ملح مص 5,000، 0.1 M بيسين pH 8.5، 15% w/v البولي إثيلين غليكول 20,000. ونما بلورات IKK1 إلا بحضور الثاني عشر إيك-المانع.

5. الكريستال النمو الأمثل29،33

  1. إعداد حلول الأسهم.
    1. إعداد 30% w/v الحلول من كبريتات ديكستران مختلفة الوزن الجزيئي (متوسط ميغاواط 5,000، 8,000، 15,000، دا 40,000) في منزوع ح2حل تصفية O. استخدام 0.22 ميكرومتر مرشحات.
    2. إعداد الأرصدة م 1 أو 0.5 متر من مخازن مختلفة في نطاق درجة الحموضة 6.5 إلى 9. تصفية الحلول استخدام 0.22 ميكرومتر مرشحات.
    3. إعداد 25% أو 50% (w/v) شماعة حلول مختلفة الوزن الجزيئي (avg. MW:1000، 1,500، 3,350، 4,000، 6,000، 8,000، 10,000، 12,000، دا 20,000). تصفية الحلول استخدام 0.22 ميكرومتر مرشحات.
    4. أداء شاشة شبكة قبل متفاوتة بشكل منهجي الأس الهيدروجيني ونوع المخزن وتركيز ونوع من شماعة وكبريتات ديكستران.
  2. تحسين الكشف في 18 درجة مئوية، وفي غرفة باردة (درجة الحرارة نطاق ~ 4-6 درجة مئوية).
  3. مزيج من مبلغ مساو من IKK1:Inhibitor المعقدة مع الحل جيدا واحتضان عبر الحل جيدا في بيئة مغلقة. يمكن إجراء هذه الخطوة يدوياً أو باستخدام روبوت الاستغناء عن.
    ملاحظة: هنا، بلورات أكبر ومحددة تحديداً جيدا (حسب تقييم لون موحد تحت المستقطب الذي أشار إلى نمو موحد) تم الحصول عليها تحت الظروف التالية: 100 مم بسترس pH 7.0، 2.8 إلى 3.5 في المائة من "كبريتات ديكستران" (متوسط 15 ميغاواط كاتشين)، 20% 8.5-10 ربط كاتشين في غرفة باردة.

6-ونمو البلورات بإعداد كبيرة

  1. إعداد الحلول الأسهم التالية وتصفية منهم خلال 0.22 ميكرومتر تصفية.
    1. إعداد 0.5 م بيستريس pH 7.0، ودرجة الحموضة البروبان بيستريس 7.0 و 7.5.
    2. إعداد 30% (w/v) "كبريتات ديكستران" (كاتشين "ميجاوات متوسط" ~ 15). مخزن في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد 50% شماعة (كاتشين "ميجاوات متوسط" ~ 12).
  2. استخدام 24 جيدا معلقة لوحات قطره.
  3. تطبيق تسرب الشحوم على الحلقات التي أثيرت من كل بئر.
  4. إعداد الحل جيدا كما يلي (تركيز النهائي): 100 مم بسترس 7.0 درجة الحموضة – 7.5، 2.8 – 3.5% كبريتات ديكستران ~ 15 كاتشين، ربط 8.5 – 10% ~ 12 كاتشين. إعداد 1 مل الحل جيدا في أنابيب 1.5 مل.
    ملاحظة: قد لوحظ تباين طفيف في حالة تبلور تبعاً لهذه الدفعة من البروتين، و/أو "كبريتات ديكستران"، وبالتالي محاكمة طائفة ضيقة المستحسن. بسترس وبسترس البروبان المخازن المؤقتة لنفس الرقم الهيدروجيني النطاق تؤدي بلورات مفردة.
  5. الاحتفاظ بحلول جيدا ولوحات مدهون في الغرفة الباردة على الأقل ح 1.
  6. إعداد IKK1:Inhibitor معقدة كما هو موضح في 4.3. نقل الحلول جيدا من أنابيب 1.5 مل إلى الآبار الفردية للوحة جيدا 24.
  7. تنظيف siliconized (تجارية أو داخلية (سيليكونيزيشن/سيلانيزيشن)) الزجاج كشوف الغطاء باستخدام مناديل خالية من الوبر وتطبيق الضغط العالي أوضحت الطائرات الجوية استخدام خرقه الهباء الجوي المتاحة تجارياً.
  8. ضع ميكروليتر 1 – 1.5 من حل جيد في كشف غطاء نظيف. "الماصة؛" تساوي حجم IKK1:inhibitor المعقدة، وتخلط بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 3-4 مرات. بدوره بكشف غطاء الزجاج ومكان في كل منهما جيدا مع الملقط وختم البئر بالضغط على الشحوم.
  9. بعد إعداد جميع قطرات من صفيحة 24-حسنا، احتضان اللوحة في الغرفة الباردة في الظلام. أحياناً التحقق من قطرات تحت مجهر لظهور ونمو البلورات.
    ملاحظة: فإنه لم يتم اختباره سواء تفرخ لوحات الكريستال تحت الضوء تغيير النتيجة. بيد أنه من الحاسم، أن هي المحتضنة اللوحات في بيئة مع الاهتزاز الحد الأدنى/لا.

7-البرد حماية البلورات

  1. إعداد حلول البرد.
    1. إعداد Cryo A (كبريتات ديكستران ~ 2%، % ~ 10 ربط 12000، 60 ملم البروبان بسترس (من الرقم الهيدروجيني نفسها كحل جيدا المقصود)، 5 ملم تريس درجة الحموضة 7.5، 40-50 مم كلوريد الصوديوم، 2.5% والغليسيرول).
    2. إعداد ب Cryo (~0.3% "ديكستران كبريتات"، ~ 10% ربط 12000، 60 ملم البروبان بسترس (من الرقم الهيدروجيني نفسها كحل جيدا المقصود)، 5 ملم تريس درجة الحموضة 7.5، 40-50 مم كلوريد الصوديوم، 20 أو 25% والغليسيرول أو 20 أو 25% جليكول).
      ملاحظة: اختبار الريفيين البرد المختلفة بالإضافة إلى الجلسرين وجليكول (مثلاً، ربط 200، 400 ربط، وربط 550 مدام، ربط 1000).
  2. بلطف إزالة بكشف غطاء الزجاج الذي يحتوي على البلورة ووضعه على سطح صلب مع انخفاض كريستال تواجه صعودا. إضافة 10 ميكروليتر من حل البرد على رأس هذا الانخفاض بلطف، وتخلط بلطف من بيبيتينج حيث أنه لم يتم التطرق الكريستال.
    ملاحظة: هذا ينظف سطح الكريستال من الحطام ويساعد حجته الكريستال مع المخزن المؤقت cryo الأولى. تجنب الإجهاد الميكانيكية والحرارية للبلورة. تنفيذ كافة الخطوات اللاحقة تحت المجهر لتجنب أي ضرر للبلورة.
  3. إزالة بعض السائل من البلورة ببطء وتبقى حول 5-8 ميكروليتر من الحل. تجنب جفاف الكريستال. اتخاذ الحذر الشديد لتجنب الإجهاد الميكانيكي والجفاف من الكريستال في جميع الخطوات اللاحقة.
  4. بلطف إضافة 2.5 – 4 ميكروليتر من محلول ب البرد على الانخفاض، وتخلط بلطف جداً من بيبيتينج. تغطية مع صحن بيتري صغيرة لتجنب تدفق الهواء مباشرة عبر البلورة. انتظر دقيقة 5 دائماً احرص على البلورة لا تعاني التغيرات السريعة للضغط الاسموزي أو الجفاف.
  5. كرر الخطوة 7، 4 أربع مرات للتأقلم الكريستال ببطء إلى حل البرد.
  6. يبقى 10 – 20 ميكروليتر من الحل البرد في هذه المرحلة (أيالسماح الكريستال أن حمم في حوالي 20-25% cryo-بروتيكتانت التي تحتوي على الحل). نقع لفترات مختلفة من الوقت (دقيقة 5 إلى ح 1) في البرد-الحل النهائي.
  7. تجميد بلورات متعددة في نقاط زمنية مختلفة.
  8. بعناية اختيار بلورة مفردة من الانخفاض في حلقة البرد مناسبة التي شنت على قاعدة سليمة وتجميد يغرق في سائل ن2. تنفيذ هذه الخطوة بسلاسة وبسرعة لتجنب تشكيل الجليد على البلورة.
    ملاحظة: اختيار كريستال استخدام حلقة قطرها أكبر قليلاً من المحور أطول من الكريستال بحيث يمكن تركيبها في جونيوميتير الروبوتية المستخدمة في "مصدر متقدم فوتون"، مختبر أرغون الوطني.
  9. تخزين البلورة تحتوي على حلقات البرد في كرات الصولجان مغمورة في سائل ن2. تخزين هذه كرات الصولجان في سائل ن2 قارورة ديوار حتى تكون جاهزة للشحن حيود الأشعة السينية في السنكروتروني. الشروع في جمع البيانات حيود الأشعة السينية وتجهيز (المادتان 8 و 9).
    ملاحظة: البيانات الحيود من بلورات IKK1 من مصادر الأشعة السينية المنزل لم القرار عالية بما يكفي للمحاكمات تصميم الهيكل، على الرغم من أنه أشار إلى نوعية البلورات تفتيش عند السنكروتروني. جمعت كل حيود المعطيات في بيملينيس مختلفة (أساسا 19ID) "مقدما فوتون المصدر"، "مختبر أرغون الوطني"، الولايات المتحدة الأمريكية.

8-الأشعة السينية جمع البيانات

  1. جمع البيانات حيود الأشعة السينية في بيمليني ID19 مصدر السنكروتروني وكالة الأنباء الجزائرية، باستخدام بيانات الاستشعار عن بعد مجموعة البرمجيات34.
    ملاحظة: ما يزيد عن 100 من بلورات تم اختبارها لخصائص الحيود. البلورات ديفراكتيد بشكل روتيني إلى قرار من 7-11، إلا في حالات نادرة البلورات التي ديفراكتيد لتتجاوز 5 تم ملاحظتها، وفقط واحد كريستال كبيرة ديفراكتيد تتجاوز 4.5. منذ البلورات التهاوي السريع أثناء جمع البيانات، تم جمع مجموعات البيانات في أجزاء مختلفة من نفس البلورة. كان هذا ممكناً نظراً للبلورات كبيرة (أكبر من 400 ميكرون)، وكانت قطر شعاع يستخدم 100 ميكرومتر.

9. تجهيز البيانات بالأشعة السينية

  1. دمج جميع مجموعات البيانات التي تم جمعها في أجزاء مختلفة من كريستال نفس34.
    ملاحظة: تم دمج مجموعات البيانات السبعة من الكريستال أفضل وكان 93% كاملة من البيانات الناتجة. عموما أنا كان σ ~ 6.8) وكان رميرجي 89% في بن القرار أعلى (5.4-4.5 Å).
  2. مجموعات البيانات العملية مع HKL200034 للحصول على مجموعة مساحة وأبعاد الخلية وحدة ومحتوى المذيبات والمعقول تشكيل الوحدة غير متماثل.

10-هيكل الحل

  1. إعداد نماذج البحث
    1. استناداً إلى النماذج الهيكلية المتاحة من hIKK2 (pdb معرف 4E3C و 4KIK35)، إنشاء سلسلة من dimers مع توجهات مختلفة دينار كويتي الطرفي ن (أن يجعل فتح 30 و 62، بين P578 دينار كويتي اثنين في ديمر). أيا من هذه النماذج جلب حل بحث استبدال جزيئي بعد محاكمات واسعة النطاق.
    2. إنشاء مخطط ل IKK1 من بيانات مفرد-الجسيمات cryo-م33.
    3. إنشاء نموذج IKK1 البشرية من أعلى هيكل القرار IKK2 (pdb معرف 4KIK).
    4. قفص الاتهام في المجالات الفردية من طراز IKK1 البشرية في الخريطة الكثافة م البرد من IKK1 البشرية باستخدام أبله36. هذا استدارة اتجاه دينار كويتي حوالي 24 درجة وتعديل الانفتاح ~ 58 Å ن--المحطة الطرفية.
    5. تطبيق اتجاه دينار كويتي من طراز cryo-م تركيب (مونومر) لجميع dimers التي تم إنشاؤها في 10.1.1.
  2. استبدال الجزيئية
    1. استخدام dimers من 10.1.1 و 10.1.5 كنماذج البحث في البرامج فيزر37ومولريب38 و39،الجهاز العصبي المركزي40.
      ملاحظة: هنا، استخدام أحد dimers من 10.1.5 (52 Å الافتتاحية) كنموذج البحث، dimers ستة (اثنين هيكساميرس) تقع في الوحدة غير متماثلة باستخدام مولريب. Å 52 فتح في نموذج البحث مشابه لافتتاح Å 49-50 dimers (جميع dimers ستة) في هيكل المكرر.

11-هيكل الصقل

  1. هيكل التحسين الداخلي
    1. تصحيح اتجاه وموقف من هذا النموذج الأولى بصقل هيئة جامدة في الجهاز العصبي المركزي (cns_solve_1.3)39،40.
    2. تحسين الهيكل كذلك استخدام تدنية ومحاكاة الصلب مع دالة هدف الحد أقصى لاحتمال وتصحيح معظم المذيبات شقة استخدام39،نظام الجهاز العصبي المركزي40.
    3. بناء نموذج يستند إلى 2 واوس-وج وخرائط Fo-نادي باستخدام إكستالفيو41.
      ملاحظة: تنطبق صقل دن ساعدت42 وكبح جماح النيجيرية خلال التحسينات لأفضل دقة النموذج. في الواقع، صقل دن تحسنت بشكل كبير R-العوامل للهيكل، وهندستها ومعامل البحث والتطوير 22.2 في المائة والحرة R عامل كان 27.8 في المائة للنموذج النهائي. يجب أن يكون التحسن الكبير للبحث الحر بسبب نموذج عالية الدقة IKK1 المجالات التي تم إنشاؤها من طراز IKK2 (4KIK).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الاستنساخ والتعبير عن نيات مختلفة من IKK1/α
طول كامل تم استنساخ البشر IKK1/α في بفاستباتشتا ناقلات التعبير باكولوفيروس داخل مواقعها تقييد اكوري و NotI للحصول على سداسي-الحامض الأميني الطرفي ن المعلمة IKK1. يمكن إزالة العلامة بحوزتي TEV الهضم. منذ طول كامل IKK1/α تحتوي على مناطق مرنة على كلا الطرفين، ومناطق مرنة تجعل عادة بروتين صعبة لبلورة، نحن استنساخ مختلف أجزاء مبتوراً من IKK1/α داخل المواقع المذكورة أعلاه لناقل بفاستباتشتا. مختلف طفرات الاقتطاع من IKK1/α تم إنشاؤها مع البرية من نوع (wt) و S176E، 180E العمود الفقري (هة). EE IKK1/α يشير إلى ميميتيك من النموذج النشط مؤثرا من كيناز فوسفوريلاتيد. إنتاج باكولوفيروس المؤتلف والتعبير البروتين أجريت باستخدام بروتوكول تم نشرها في السابق مع إدخال تعديلات طفيفة عليها43 (الشكل 1).

صعوبة في بلورة IKK1/α
منذ البشرية IKK2/β و IKK1 مثلى، ونحن يمكن أن تتبلور إصدارات مختلفة من البشرية IKK2/β تحت ظروف مختلفة عدة، كنا نتوقع IKK1/α لبلورة تحت ظروف مماثلة باستخدام استراتيجيات مماثلة. ومع ذلك، بعد محاكمات واسعة مع عدة أنواع مختلفة من IKK1، حصلنا على بلورات مع بناء مبتوراً واحد فقط (IKK1 10-667 ه) (الشكل 2)، وهذا أيضا إلا حضور إيك المانع الثاني عشر44 التي عرضها مناسبة خصائص حيود الأشعة السينية.

هيكل الحل
بلورات IKK1/α يعانون من مشاكل عديدة في النمو، وعرض البيانات غالباً ما موسيسيتي عالية جداً. كريستال ضعف التعبئة المقترنة مع المحتوى المذيبات الكبيرة والطبيعة الدينامية ل IKK1 مونومر/ديمر هي السبب المحتمل وراء هذا. للالتفاف حول هذه المشكلات، اتخذت الجهود المضنية للحصول على بلورات ممكن أفضل، وكان تنفيذ الإجراء cryo-حفظ بعناية فائقة في مختلف الظروف ومع مختلف المخازن المؤقتة للبرد-حافظة. كما تم جمع البيانات مع الدقة في نهاية المطاف الحد من الأضرار شعاع. ولما كانت البلورات كبيرة (البعد أكبر كثيرا ما تتجاوز 400 ميكرون)، مجالات مختلفة من بلورات نفس تعرضوا لشعاع الأشعة السينية لتجميع مجموعات البيانات متعددة. هذا تمكين وحدات dataset مختلفة يمكن قياسه، والحصول على مجموعة بيانات كاملة مع التكرار العالي والتقليل من الخطأ. مغطس مع الذرات الثقيلة، أو الذرة الثقيلة المجموعات (مثلاً، تابر وبلدية)، تسبب البلورات ديفراكت غير كافية. على الرغم من أننا يمكن تحديد موقع مجموعات تابر في البيانات المشتقة، سوء نوعية البيانات بالإضافة إلى إيسومورفوسيتي-غير معلومات قليلة، أن وجدت، المرحلة.

علينا معالجة مجموعات البيانات مع HKL2000 باستخدام مختلف المعلمات المتوفرة. نمط حيود كشفت أن الكريستال ينتمي إلى مجموعة الفضاء P21 مع أبعاد الخلية وحدة، = 174.51، ب = 186.94، ج = 275.83 و β = 98.84 درجات. كنا أساسا أنا/σ لتقدير وقف إنتاج واختبار مختلف انقطاع لمجموعات البيانات. حصلنا على مجموعة البيانات مدمجة من 4.5 جمعت قرار من 4 7 مجموعات من البيانات الحيود عن كريستال واحدة. قررنا الاحتفاظ بالبيانات حتى 4.5 Å من الفحص البصري لخريطة الكثافة النهائية. قد يكون من المفيد استخدام CC1/2، حيث يمكن أن نقدر تحليلي نسخة من dataset المدمجة ضد الكثافات (يقاس عادة) صحيحاً باستخدام CC *45. بسبب الخلية وحدة كبيرة جنبا إلى جنب مع التماثل منخفضة من مجموعة الفضاء، توقعنا الوحدة غير المتناظر تحتوي على جزيئات 12 إلى 24 استناداً إلى محتوى المذيبات من 70% إلى 40%.

التأثير المشترك لدقة منخفضة بيانات الأشعة السينية مع ضعف كثافة (أي، أخطاء كبيرة في البيانات) (الشكل 3)، عدد كبير (12) من جزيئات IKK1 في وحدة غير المتماثلة، وتباين كونفورماشونال من طراز موحودي/ديميريك IKK1 IKK2 المعروفة بالمقارنة مع النماذج، في البداية منعنا من الحصول على حل بديل جزيئية IKK1، وتحديد هيكلها وهكذا.

IKK1/α و IKK2/β تحتوي على مجال كيناز (دينار كويتي)، ومجال مثل أوبيكويتين (الصوفية) ومجال ثنائي سقالة حلزونية (SDD). وكشف هيكل IKK1 أنها تشكل dimers المثل إلى IKK2 استخدام واجهة وحدة فرعية بين متطابقة تقريبا من المنطقة البعيدة من SDD. ومع ذلك، عرض ديمر IKK1 الموضع النسبي تختلف اختلافاً كبيرا من دك الطرفي ن بالنسبة إلى SDD + الصوفية مقارنة بالتي في المعروفة IKK2 dimers. هياكل IKK2 مختلفة في وقت سابق أشار إلى اتجاه إينتيرمونومير مختلفة داخل dimers به (الرقم 4، وهو الفريق)، حيث أن المسافات بين الكربونات ألفا من P578 في دك اثنين في أربعة نماذج ديمر مختلفة تتراوح بين 39 و 61 Å. نظراً لتطابق تسلسل هذه مؤنزم اثنين متشابهة جداً والمخلفات في واجهة ديمر، توقعنا IKK1/α ستشكل ديمر مماثلة؛ ومع ذلك، حيث أن هناك اختلافات كبيرة في مخلفات واجهة SDD دينار كويتي (مثلاً، W424 و F111 في IKK2 هي V و P على التوالي)، توقعنا ربما اتجاه دينار كويتي بعد مختلفة في IKK1. والواقع أن هيكل IKK1/α أشارت إلى أن التوجهات ذات الصلة دينار كويتي إلى SDD فريدة من نوعها، وأنها تنحرف عن جميع النماذج المعروفة من IKK2/β. واستخدمت نماذج ما يزيد على مائة ديمر كنماذج البحث في البرامج فيزر، مولريب، والجهاز العصبي المركزي دون أي نجاح، مما يشير إلى الحاجة لنموذج بحث دقيقة بدلاً من ذلك لنجاح المحاكمات الاستبدال الجزيئي، لا سيما مع البيانات ذات الدقة المنخفضة. نموذج مركب له كتلة صغيرة جداً لالتقاط أي حل في البيانات حيود ضعيفة للوحدة غير المتناظر الكبيرة التي تحتوي على 12 مونومرات. أيضا، إدراج أو إغفال للمياه في نموذج البحث لم يصنع فارقا في عمليات البحث عن بديل الجزيئية، لا سيما بسبب البيانات الضعيفة الحيود. CC1/2 و CC * يشير إلى أن البيانات تصل إلى 4.5 Å دقيقة جداً. كنا وقف قرار محافظ 4.5 استناداً إلى أنا/σ 1.5. مجموعات البيانات بدقة مختلفة انقطاع لم تظهر أي اختلاف صارخ أثناء عمليات البحث عن استبدال الجزيئية، وصقل ضد مجموعات البيانات هذه الخرائط النهائية لم تظهر أي تحسن متميزة في خريطة الميزات عند توسيع نطاق القرار انقطاع. البنية النهائية للنموذج دقيقة جداً وأكثر من ما يمكن أن يبني من كثافة وحدها، المستمدة المحتمل حيث تم بناء نماذج أولية الاستبدال الجزيئي من النماذج مع بيانات ذات الدقة عالية ونحن تستخدم الخريطة cryo-م/الكثافة إلى التحقق من ميزات الخريطة، ولا سيما في المناطق التي فيها خرائط غير واضحة.

في وقوعه، أمكن الحصول على نموذج البحث مفيدة فقط بسبب توافر خريطة م البرد دقة منخفضة، ونموذج دقة مرتفعة إلى حد IKK1 المجالات التي يمكن أن تتولد استناداً إلى دقة عالية الهيكل IKK2 (الشكل 4 ، لوحة ب.) أننا يمكن أن ترسو المجالات IKK1 في خريطة cryo-م IKK1 الحصول على نموذج ديمر معقول وثيق. النموذج الأولى أشارت إلى تناوب توجه من دينار كويتي حوالي 24 درجة بالنسبة إلى مونومر IKK2، وافتتاح محطة N 58 (بين P578 كاي اثنان في ديمر). لدينا علم مسبق بمختلف الهياكل ديمر IKK2/β (وعلى الاختلاف) تمكين لنا بضبط نموذج البحث بواسطة تغيير الفتحات بين 30-62 Å. استخدام أحد dimers (52 Å فتح) كنموذج البحث، نحن يقع dimers ستة في الوحدة غير متماثلة باستخدام برنامج مولريب46. يتم تنظيم هذه dimers الستة في هيكساميرس اثنين في الوحدة غير المتماثلة، والمذيب المحسوبة حجم 68%.

Figure 1
رقم 1: تنقية IKK1. (أ) التعبير من IKK1 (10-667) في خلايا الحشرات. (ب) مخطط تدفق لتنقية IKK1؛ (ج) الحزب الديمقراطي الصربي صفحة جل عرض نقاء IKK1 بعد الخطوة اللوني تقارب ني-الإدارة الوطنية للسياحة. (د) حجم الاستبعاد الشخصية التي تشير إلى ديمر IKK1. (ه) جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عرض نقاء IKK1 من كسور حجم الاستبعاد الذروة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مورفولوجيا وحجم بلورات IKK1. (أ) بناء كريستال IKK1 10-667؛ كما يبين انخفاض تبلور بلورات أخرى مورفولوجيا (ألواح رقيقة) التي لا ديفراكت جيدا. (ب) أسرع نظراً للبلورة التي ديفراكتيد لتتجاوز 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3:. بلورية البيانات المتحصل عليها من بلورات IKK1. (A) الشخصية حيود "الأشعة السينية" كريستال IKK1 التي تشير إلى خصائص الحيود الفقيرة نموذجي IKK1 بلورات. (ب) HKL2000 الإحصاءات التحجيم لمجموعة البيانات المدمجة المستخدمة لتصميم هيكل IKK1، ومن البيانات الزائدة عن الحاجة. R الخطي = SUM (ABS (-< I >))/SUM (ط)، ساحة R = SUM ((-< I >) * * 2)/مجموع (أنا * * 2)، تشي * * 2 = SUM ((-< I >) * * 2)/(خطأ * * 2 * N/(N-1)))، CC1/2 = معامل الارتباط، CC * = معامل الارتباط لمجموعة البيانات المدمجة ضد الكثافات الحقيقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: إعداد نماذج البحث. (أ) نماذج مختلفة من ديمر IKK2 التي تشير إلى التوجهات المختلفة لدك بالنسبة SDD (مما أدى إلى فصل مختلفة بين اثنين دينار كويتي)؛ تم اختبار هذه النماذج في البداية لإيجاد حل بديل جزيئية دون أي نجاح. (ب) توليد IKK1 البحث نماذج-خريطة م Cryo ديمر IKK1 في 11 Å القرار؛ م-خريطة مزودة IKK1 البحث عن النموذج الأولى، وهي المجالات الفردية استناداً إلى طراز IKK2 (4KIK)؛ IKK1 بحث نموذج زيادة الغرامة، أنب (اتجاه دينار كويتي المناسبة) استناداً إلى مختلف الاحتمالات ما الحكم من نماذج IKK2 وصف أعلاه في 4A؛ تراكب الخريطة م تركيب نموذج إلى نموذج البحث التي أسفرت عن حل بديل الجزيئية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حل الإنتاج وتبلور وهيكل من اثنين من البروتينات إيك ذات الصلة
لقد حددنا لتحديد هيكل الكريستال الأشعة السينية IKK1/α مع الفكرة القائلة أنه سيكون عملية معقدة نسبيا نظراً لتجربتنا مع IKK2/β إنتاج البروتين والتبلور، وتصميم الهيكل. ومع ذلك، فوجئنا بدرجة عالية أن هذه البروتينات ذات الصلة اثنين تصرفت بطريقة مختلفة جداً فيما يتعلق بسهولة تبلور. وعلى الرغم من الجهود المبذولة من عدة مختبرات رفيعة، استغرق تصميم هيكل IKK1 ما يقرب من عقدين. وهذا ينبع إلى حد كبير من اختناقات رئيسية قليلة.

وكان أول صعوبة الحصول على نموذج بروتين نقي للغاية وقابل للذوبان. نظام التعبير خلية الحشرات مكنتنا من الحصول على كميات ملغ من البروتين النقي الذي كان معقول قابل للذوبان. وفيما يتعلق بمستوى التعبير، أعرب كافة بنيات IKK1/α مستويات أقل بكثير مما يبني IKK2/β في أنظمة تعبير خلية الحشرات. تجدر الإشارة إلى أن البروتين لا غير القابلة للذوبان والوظيفية عندما أعرب في كولاي. في نظام تعبير خلية الحشرات، شظايا IKK2/β أعرب عن المستويات العالية التي تتراوح من 10 إلى 30 ملغ/لتر ثقافة اعتماداً على بنيات. وفي المقابل، يمكن أن تتولد ثوابت IKK1/α فقط في 0.5 إلى 2.0 مغ/لتر ثقافة. والسبب في هذا الاختلاف لا يزال مجهولاً بالنسبة لنا. كما ينبغي لنا أن نحاول التعبير عن IKK1 في خلايا المضيف الأصلي (أي، نظام overexpression الثدييات في حالة بروتين إيك الثدييات)، خاصة وأن التعديلات التي بوستترانسلاشونال مثل السيارات-أو ترانس-الفسفرة التي تحدث عادة في وسوف تحدث إيك الأكثر كفاءة وعلى نحو ملائم في بيئتها الأصلية. تنقية مجمعات إيك مباشرة من ثقافة واسعة النطاق لخلايا الثدييات أيضا قابلة حاليا.

أثناء العمل مع IKK2/β، لاحظنا أنه يمكن أن يكون البلوتينيوم السيارات فوسفوريلاتيد بالتعامل مع ATP، وهذا يجعل البروتين قابلة للتبلور. وبالمثل، في الحضانة للبروتين IKK1 مع ATP، والناتجة عن ذلك السيارات-الفسفرة، أسفرت عن IKK1 المنشط الذي كان القابلة للذوبان، ومناسبة لتوصيف البيوكيميائية وتصميم بنية بلورية.

وكان خطوة حاسمة للحصول على بلورات ديفراكتينج جيدا لتهذيب شروط التبلور، وبخاصة إضافة النوع المناسب وتركيز جزيئات كبريتات ديكستران. يشير إلى الكثافة الجزيئات كبريتات ديكستران المنضم، وأثره الناتجة عن IKK1 على الأرجح الحرجة للتبلور.

المرونة المتأصلة في IKK1، الذي كثيرا ما يلاحظ في مؤنزم، هو الرادع الأساسي لبلورة ويرتبط غالباً بالمشاركة في المجال كيناز مع حلقة التنشيط. يمكن أن تبلور IKK2 مع السكان الأصليين (S177 و S181) وأشكال فوسفوميميتيك (EE) تفعيل حلقة سيرينس، ولكن نحن فقط الحصول على بلورات مع IKK1/α مقتطعة من SS هة نسخة متحولة وأن جداً إلا في وجود المانع إيك الثاني عشر. هذه البلورات ديفراكتيد جيدا بما يكفي لتحديد هيكل فقط عندما نمت في الغرفة الباردة (~ 4-6 درجة مئوية). إذا أننا نواجه سلوك العنيد وبالمثل مع أي هومولوج IKK1 (أو أورثولوج إيك)، يمكننا أن نحاول مختلف التعديلات العمود الفقري (لا سيما من بقايا سيرين حلقة الموقع النشط الذي يتم عادة فوسفوريلاتيد). ونحن أيضا محاولة بلورة المشارك في وجود التفاعل شريك البروتينات. تتفاعل مع البروتينات شريك مؤنزم كثيرة، بما في ذلك الأسرة، وايك ويقيمون داخل المجمعات ذات الترتيب العالي.

مثبطات عدة ساعدت في إنتاج IKK2 البلورات في ظروف مختلفة (مثلاً، مع كل الملح عالية، وربط مرسب)، سواء عند 18 درجة مئوية، وفي غرفة باردة. ومع ذلك، تحت ظروف مماثلة ومع مجموعة متنوعة من مثبطات، IKK1/α لم تسفر أي كريستال. وبالتالي، سيزيد استخدام مرجع أكبر من مثبطات التأكيد فرص العثور على واحد التي تمكن من بلورة.

وكان آخر خطوة حاسمة في تحديد هيكل دقيق cryo--الحفاظ على وإجراءات جمع البيانات. بيانات ضعيفة والانحلال السريع من البلورات في شعاع الأشعة السينية يبرر الحاجة إلى أكبر من بلورات ومجموعة من مجموعات البيانات متعددة من بلورات نفس. دون مجموعة بيانات كاملة معقولة لدرجة عالية من الدقة، ويمكن أن لا نجحنا في الحصول على حل بديل جزيئية.

وأخيراً، فشلنا في تحديد هيكل IKK1/α باستبدال الجزيئية باستخدام أكثر من 100 نماذج تم إنشاؤها من المعروف IKK2/β الهيكلية النماذج المتاحة في قاعدة البيانات العامة. وهكذا، كان الحصول على نموذج مناسب لإجراء استبدال جزيئية يجب أن. سبق أن قرر الخريطة م البرد، ونماذج عالية الدقة الهيكلية للمجالات الفردية، جنبا إلى جنب مع دراسات مقارنة للهياكل IKK2 أدى بنا الحصول على نموذج بحث الذي جلب لنا حل بديل الجزيئية.

بلورة البروتين طبيعتها العشوائية، حتى على الرغم من اتباع إرشادات المنظمة المذكورة أعلاه، قد نواجه مشاكل في بلورة آخر IKK1 هومولوج أو بناء كامل طول أو مبتوراً آخر من IKK1 البشرية. بغض النظر، والمعرفة بهذه الخطوات الحاسمة سيمكن باحث لاستكشاف ظروف الرشيد التي من شأنها زيادة فرص الحصول على بلورة إيك ديفراكتينج جيدا.

IKK1/α و IKK2/β عرض تنظيم المجال مماثل لكن المنظمة بين المجالات المختلفة
وليس من المستغرب، IKK1/α و IKK2/β اعتماد بنية مجال مماثلة العالية الناجمة عن تسلسل عالية تشابه33،43. وكما ذكر آنفا، IKK1/α و IKK2/β إضعاف في ثلاثة مجالات متميزة: المجال كيناز الطرفي ن، أوبيكويتين مثل المجال (الصوفية)، والمجال ثنائي سقالة (SDD). IKK1/α و IKK2/β تشكيل dimers مستقرة فيها نصف دينار المشاركة في ثنائي ج--المحطة الطرفية. بقايا تشارك في تشكيل ديمر متطابقة. ومع ذلك، التفاعلات بين المجال بين SDD/الصوفية ودك تختلف إلى حد ما حيث تنطوي هذه المخلفات المختلفة. كما يرجح أن تسبب هذا التوجه النسبي للمجال كيناز SDD في IKK1/α تختلف عن التي في IKK2/β. وهذا لم يكن غير متوقع تماما حيث نلاحظ أيضا الاختلافات بين النماذج ديمر IKK2/بيتا المتاحة. من المثير للاهتمام، يمكن تنظيم dimers IKK2/β في تيتراميرس في كرستل على الرغم من أن هذا الميل تيتراميريزيشن ضعيف في الحل. ومع ذلك، شكلت dimers IKK1/α هيكساميرس فريدة من نوعها. ولوحظت هذه هيكساميرس أيضا في الحل، بالرغم من وجود مجموعة صغيرة فقط من IKK1/α dimers ك hexamers. وتوحي هذه هيكساميريزيشن أن من المحتمل أن يكون وظيفة محددة وحاسمة.

التمييز بين الاختلافات الوظيفية من الاختلافات الهيكلية
IKK1/α و IKK2/β مهام متميزة في الخلايا. ومع ذلك، ظلت العلاقة بين هيكل ووظيفة IKK1/α بعيد المنال. IKK1/α موجود بوضوح في أشكال مختلفة: ديمر مجاناً أو هيكسامير، وداخل مجمع هترو-تريمير أونتشاراكتيريزيد حتى الآن جنبا إلى جنب مع IKK2/β ونيمو. حيث لا يتطلب التنشيط IKK2/β بالإشارات المتعارف عليه IKK1/α، دور IKK1/α الوظيفية في هيتيروتريمير (إيك-المجمع الكنسي) لا يزال غير واضح. كما أن من الواضح إذا كان تنشيط IKK1/α الناجم عن الإشارات غير قانوني يعتمد على IKK1 ديميريك الحرة/α و/أو هيكساميريك IKK1/α. حيث تكشف التجارب حيث أن اختلال واجهة هيكسامير يؤثر بشدة على إشارات غير متعارف عليه، هيكساميريزيشن من المحتمل أن يكون أساسيا في مرحلة ما خلال إشارات غير متعارف عليه.

تصميم مثبطات جزيء صغير باستخدام هيكل IKK1/α
معرفة هيكل IKK1/α يسمح لنا بالتحقيق البقع السطحية على مونومر أو جيوب في الواجهات بين المجال أو مونومر بين الوكالات، التي يمكن أن تستهدفها الجزيئات الصغيرة. طالما اعتبرت إيكس الأهداف الهامة من المخدرات. بيد أكفاء مؤنزم هذه في مجموعة متنوعة من الوظائف، بما في ذلك التوازن الخلوية والبقاء العضوي، والحصانة يجعل من الصعوبة بمكان استهداف لهم. حتى الآن، وقد تبين لا جزيء المستهدفة لايك التي يمكن استخدامها بأمان في المرضى.

IKK1/α و IKK2/β تستهدف في أغلب الأحيان في نفس الوقت بمثبطات بهم منذ نطاقاتها كيناز متشابهة جداً في التسلسل وفي الهيكل. وقد أنفق جهدا كبيرا للبحث في إيجاد مثبطات محددة تستهدف واحدة فقط من هذه مؤنزم اثنين. ونتيجة لذلك، فقد اكتشفت عدة IKK2/β-خاصة مثبطات، والبعض منها لا تؤثر على وظيفة IKK1/α. ومع ذلك، علمنا لا مجمع هذا موجود أن فعالية يحول دون IKK1/α دون مقاومة الدالة IKK2/β. يمكن أن يعزى هذا الغياب إلى الافتقار إلى المعلومات الهيكلية في IKK1/α. لدينا دراسات هيكلية والخلوية تبين، على الرغم من أن ترتيب المجال والهياكل العالمية وحدة فرعية متشابهة جداً في هذه البروتينات اثنين، أنها عرض فريدة من نوعها ذات الترتيب العالي ترتيبات توظيف محددة سطح بقع33. يجب أن تترجم هذه الاختلافات التي تمكن التفاعلات المختلفة مع البروتينات المرتبطة بهم الاختلافات الوظيفية. ونحن نأمل أن يمكن استغلال هذه الفروق بين IKK1/α والتفاعلات بين-وداخل-وحدة فرعية IKK2/β وكشف جعل مثبطات اللوستيريك وحدة فرعية محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية أو غيرها تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونحن نشكر الموظفين في 19ID بيملينيس، 24ID، و 13ID في "المتقدم فوتون المصدر"، ولاية، وايل، للدعم المقدم من خلال جمع البيانات عن بلورات مختلف. نحن ممتنون لديمتري ليومكيس، ومعهد سولك لجلب لنا خريطة م البرد دقة منخفضة في المراحل المبكرة من م خريطة/نموذج البناء، الذي كان يستخدم لبناء نموذج البحث استبدال الجزيئية IKK1 الأولى. البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تلقت تمويلاً من المعاهد الوطنية للصحة منح AI064326 و CA141722 و GM071862 جيغاغرام. SP هو حاليا "ويلكوم ترست DBT الهند الوسيطة زميل".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 141، سيرين-ثريونين البروتين كيناز، IKK1/α، NF-κB، بنية بلورية، واستبدال الجزيئية، مثبط
دليل للإنتاج وتبلور، وتصميم هيكل للبشرية IKK1/α
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Polley, S., Huang, D. B., Biswas,… More

Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter