Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En Guide til produksjon, krystallisering og proteinstrukturer av menneskelig IKK1/α

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

IκB Kinase 1/î± (IKK1/α CHUK) er en Ser/Thr protein kinase som er involvert i et mylder av mobilnettet aktiviteter primært gjennom aktivering av NF-κB transkripsjonsfaktorer. Her beskriver vi de viktigste trinnene som er nødvendig for produksjon og krystall proteinstrukturer av dette proteinet.

Abstract

En klasse ekstracellulære stimuli krever aktivering av IKK1/α å indusere generasjon av en NF-κB-underenheten, p52, gjennom behandling av sin forløper p100. p52 fungerer som en homodimer eller heterodimer med en annen NF-κB-underenheten, RelB. Disse dimers regulere igjen uttrykk for hundrevis av gener involvert i betennelser, celle overlevelse og celle syklus. IKK1/α fortsatt hovedsakelig forbundet med IKK2/β og NEMO som en trefoldig kompleks. Men er et lite basseng av det også observert som en lav molekylvekt complex(es). Det er ukjent om p100 behandling aktiviteten utløses av aktivering av IKK1/α i større eller mindre komplekse bassenget. Konstituerende aktiviteten til IKK1/α påvist i flere kreft og inflammatory lidelser. For å forstå mekanismen av aktivering av IKK1/α, og aktivere bruken som narkotika mål, uttrykte vi rekombinant IKK1/α i andre systemer, som E. coli, insekt, og pattedyrceller. Vi lyktes i å uttrykke løselig IKK1/α i baculovirus infisert insekt celler, skaffe mg mengder av svært ren protein, bandets det i nærvær av hemmere og å bestemme dens X-ray krystallstruktur. Her beskriver vi detaljerte trinn for å produsere rekombinant protein og dens krystallisering sin X-ray krystall proteinstrukturer.

Introduction

Transcriptional aktiviteter av NF-κB dimeric transkripsjonsfaktorer kreves for mangfoldig cellulære funksjoner, fra betennelse og immunitet til overlevelse og død. Disse aktivitetene er strengt kontrollert i celler og tap av forordning fører til ulike pathological betingelser, inkludert autoimmune sykdommer og kreft1,2,3. I fravær av en stimulus holdes aktivitetene til NF-κB hemmet av IκB (Inhibitor av - κB) proteiner4. Fosforylering av bestemte Ser rester på IκB proteiner merkes for ubiquitination og senere proteasomal fornedrelse eller Selektiv behandling5. To svært homologe Ser/Thr kinaser, IKK2/β og IKK1/α, opptre som sentral regulatorer av NF-κB ved å utføre disse fosforylering hendelser6,7.

Interaksjoner mellom en ligand og en reseptor transduces et signal gjennom en rekke meglere fører til aktivering av NF-κB faktorer. NF-κB signal prosessen kan grovt klassifiseres i to forskjellige baner-godkjent og ikke-kanoniske (alternativ)8. Aktiviteten til IKK2/β regulerer primært NF-κB noe av den kanoniske veien som er avgjørende for inflammatoriske og medfødte immunreaksjoner9. En distinkt funksjon i denne veien er en rask og kortvarige aktivering av IKK2/β10 innenfor en hittil biokjemisk uncharacterized IKK komplekse, antas å være sammensatt av IKK1 og IKK2, samt en regulerende komponent, NEMO (NF-κB viktig Modulator )11,12,13. Mellom de to katalytisk IKK underenheter av IKK komplekset, IKK2 er primært ansvarlig14 for fosforylering av bestemte rester av prototypiske IκBs (α, - β, og -γ) bundet til NF-κB, og også en atypisk IκB protein, NF-κB1/p105, som er et forløperen til NF-κB p50 delenhet5. Fosforylering indusert ubiquitination og proteasomal nedbrytning av IκB (eller behandling av p105) fører til utgivelsen og aktivering av et bestemt sett med NF-κB dimers15. Avvikende NF-κB aktivitet på grunn av mis regulert funksjon av IKK2 har blitt observert i mange kreft samt som autoimmune sykdommer2,3,16.

I motsetning til IKK2/β regulerer aktiviteten til IKK1/α NF-κB noe av den ikke-kanoniske veien, som er avgjørende for utvikling og immunitet. IKK1 phosphorylates bestemt rester av NF-κB2/p100 på sitt C-terminalen IκBδ segment, som fører til behandlingen og generering av p52. Dannelsen av transcriptionally aktive p52:RelB heterodimer starter en langsom og vedvarende svar utviklingsmessige signaler,7,,17,,18,,19,,20. Interessant, er generering av den sentrale NF-κB faktor p52 av denne veien kritisk avhengig av en annen faktor, NF-κB Inducing Kinase (NIK)21,22, men ikke på IKK2 eller NEMO. I hvile celler fortsatt nivået på NIK lav grunnet sin konstant proteasome-avhengige fornedrelse23,24,25. Ved stimulering av celler av "ikke-kanoniske" ligander, og i enkelte ondartede celler, NIK blir stabilisert for å rekruttere og aktivere IKK1 / α. Kinase aktiviteter både NIK og IKK1 er avgjørende for effektiv behandling av p100 i p527. IKK1 og NIK phosphorylate tre serines (Ser866, 870 og 872) av NF-κB2/p100 på sitt C-terminalen IκBδ segment fører til behandlingen og generering av p52. Avvikende aktivering av den ikke-kanoniske veien har vært innblandet i mange malignitet inkludert myelom26,27,28.

Flere svært effektiv og spesifikke hemmere mot IKK2/β er kjent, selv om ingen så langt har vist seg for å være et effektivt medikament. IKK1/α-spesifikke hemmere er sparsom. Dette kan stammer delvis fra vår mangel på strukturelle og biokjemiske informasjon på IKK1/α, som begrenser vår forståelse av mekanistisk grunnlaget for aktivering av NF-κB av IKK1 i cellene og rasjonell stoff design. X-ray strukturer av IKK2/β gitt oss innsikt i mekanismen aktivisering IKK2/β29; men disse strukturene ikke kunne avsløre hvordan ulike oppstrøms stimuli utløse aktivering av IKK1/α eller IKK2/β å regulere adskilt apparater av NF-κB aktiviteter 30,31. Å forstå grunnlag mekanistisk underliggende distinkte signalerer funksjon IKK1/α, og å etablere en plattform for rasjonell narkotika design, fokuserte vi på å bestemme strukturen til IKK1/α.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av rekombinant Virus egnet for storskala uttrykk for IKK1/α

  1. P1 virus forberedelse 32
    1. Dag 1: Plate Sf9 celler (~ 6 X 105) (passasje tall mindre enn 10) i 2 mL Sf900 III insekt celle medium i hver godt av en 6-vel plate og ruge på 27 ° C. Passasje celler når de når en tetthet av 2 til 3 X 106 celler per mL i suspensjon fortynne i frisk media på en tetthet av ~ 6 X 105.
    2. Dag 2: Fortynne 8 µL av Sf9-hva reagensen i 100 µL av Sf900 III eller Grace insekt Medium uten antibiotika og serum. Vortex kort.
    3. Fortynne 1 µg av kit-renset rekombinant bacmid (detaljer er gitt i 'Representant resultater')32 i en annen 100 µL av samme medium, i et separat rør.
    4. Kombiner utvannet DNA og transfection reagens (totalt volum ~ 210-220 μL), og ruge ved romtemperatur i 15-30 min.
    5. Fjerne mediet fra brønnen. Legg 1 mL av fersk medium uten antibiotika og serum.
    6. Legg utvannet DNA-transfection reagens blandingen dropwise til cellene. Justere slipp størrelsen slik at det ikke dislodge tilhenger celler.
    7. Etter ~ 6 h, Legg 1,5 mL av fersk medium øverst eller fjerne mediet og Legg 2,5 mL av fersk medium. Varm fersk middels til 25-27 ° C før addisjon.
    8. Inkuber cellene på 27 ° C. Sjekk brønnene regelmessig hver ~ 12 h etter tegn på virusinfeksjon. Utføre alle Sf9 vedlikehold og uttrykk på 27 ° C.
    9. Dag 5: Ta ut mediet som inneholder celler 60-72 h innlegget infeksjon. Sentrifuge for 5 min på 500 x g og 4 ° C. Lagre nedbryting; Dette er P1-virus aksjen. Fryse liten dele på-80 ° C.
  2. Velge best uttrykke P1 virus klone.
    1. Plate celler på samme måte som beskrevet i trinn 1.1.
    2. Neste dag eller ~ 6 h innlegg plating, legge til 20 µL og 50 µL av forskjellige P1 virus klone aksjer på cellene i forskjellige brønner.
    3. Løsne tilhenger cellene av mild pipettering og høste infiserte celler 60-72 h innlegget infeksjon av sentrifugering i 5 min på 500 x g og 4 ° C. Lagre nedbryting. Dette er P2 virus aksjen. Lagre små dele aksjen på-80 ° C.
    4. Legge til 100 µL av 2 x Laemmli SDS buffer høstet celle pellets. Varme på > 95 ° C i 10 min. sentrifuger (vanligvis > 10 000 x g) i 5 min.
    5. Kjør 10-15 µL av hvert utvalg på 8-10% SDS-side på 120-160 V til fargestoff foran når bunnen av gel.
    6. Electro-transfer løst proteiner av standard semi tørr overføre protokoll (20 V, 30-45 min) på en Nitrocellulose/PVDF membran.
    7. Blot med anti-IKK1 antistoff (fortynning ~ 1:2, 000, må være optimalisert) eller anti-PentaHis antistoff (fortynning ~ 1:3, 000, må være optimalisert) for uttrykket.
    8. Velge den beste P1 virus klone ved å sammenligne uttrykket av rekombinant IKK1.
  3. Utarbeidelse av storskala P3 virus lager.
    1. Plate celler på samme måte som beskrevet i trinn 1.1 i en 15 cm plate inneholder 25-30 mL av Sf900 III medium.
    2. ~ 6 h legge plating, tilsett 150-300 µL av best uttrykke P1 virus aksjer på cellene.
    3. Etter 72 h stolpe infeksjon, Sug opp mediet nøye platen i en egnet tube (sterilt) og sentrifuge røret 500-1000 X g i 10 min på 4 ° C. Utelate celle pellet (Hvis en er dannet) og lagre nedbryting. Dette er P3 virus lager.
  4. Bestemme den optimale virus titer for storskala protein uttrykk
    1. Plate cellene i 2 mL Sf900 III medium, som beskrevet i 1.1 i en 6-vel plate.
    2. Legge til 20, 30, 40 og 50 µL av P3 virus lager i egen brønn ~ 6 h innlegg plating. Inkluder en infisert kontroll.
    3. Høste celler fra hver godt 48-60 h innlegget infeksjon.
    4. Legg 100 µL av 2 X Laemmli SDS buffer. Varme på > 95 ° C i 10 min. sentrifuger (vanligvis på 14.000 x g) i 5 min.
    5. Løse 10-15 µL av hvert utvalg i en 8-10% SDS side gel.
    6. Overføre løst protein til en Nitrocellulose/PVDF membran som nevnt i 1.2.6.
    7. Blot med anti-IKK1 antistoff (fortynning ~ 1:2000, må være optimalisert) eller anti-PentaHis antistoff (fortynning ~ 1:3000, må være optimalisert).
    8. Bruk viruset med de beste uttrykke titer for storskala uttrykk.

2. storskala uttrykk for 6 x-hans merket menneskelige IKK129,33

  1. Utføre storskala uttrykk i en suspensjon kultur. Dele cellene i 1 L Sf900 III medium i en 2 L Erlenmeyer kolbe med en ventilerte cap. Cellen tetthet bør være ~ 5 x 105 celler/mL.
  2. Vokse disse cellene i suspensjon ~ 100 RPM ved 27 ° C i en shaker ~ 2 dager før den når en tetthet av 1-2 x 106/mL. Cellen tetthet må ikke overstige 2 x 106/mL.
  3. Legge til ønsket antall P3 virus, som vurdert i 1.4.
  4. Vokse infiserte kulturen 48-60 h ~ 100 RPM ved 27 ° C i en shaker.
  5. Høste celler med sentrifugering på < 1500 x g på 4 ° C.
  6. Lagre celle pellets og forkaste medium.
  7. Videre til protein rensing direkte. Flash fryse celle pellet i flytende nitrogen og store-80 ° c for fremtidig bruk.

3. rensing av hans-IKK133

  1. På dag 1, resuspend celle pellet i 40 mL lyseringsbuffer (25 mM Tris pH 8.0, 0,2% NP-40, 200 mM NaCl, 10 mM imidazole, 10% glyserol, 5 mM β-mercaptoethanol og protease hemmer cocktail).
    Merk: Den våte celle pellet masse ikke ble fastsatt. Vanligvis ble ~ 2 L kultur brukt for dette trinnet.
  2. Lyse cellene av sonication på 60-70% plikt sykluser, 5-10 pulser 30 s varighet på et intervall på > 1 min, holde celle suspensjon kjølt på is.
    Merk: Dette trinnet krever optimalisering med hver modell av sonicator. Ikke la prøven varme opp over 10 ° C.
  3. Avklare den lysate med sentrifugering ≥ 28 000 x g for 45 min på 4 ° C.
  4. Equilibrate 4 mL av Ni-NTA Agarose harpiks lyseringsbuffer og blanding av avklart lysate (nedbryting) etter produsentens protokoll.
  5. Tillate protein binde harpiks av rugende 2 h på en roterende mikser på 4 ° C rommet.
  6. Vask harpiks med lyseringsbuffer inneholder 30 mM imidazole. Sjekk protein konsentrasjon i vask fraksjonen jevnlig bruker Bradford analysen. Legg til denne protein konsentrasjonen i vask fraksjonen når 0,1 mg/mL. > 20 seng volumet av vaskebuffer kreves vanligvis å nå dette punktet.
  7. Elute hans-merket IKK1/α protein under gravitasjon flow, bruker 20 mL elueringsbufferen (lyseringsbuffer inneholder 250 mM imidazole). Samle 1-1,5 mL fraksjoner.
  8. Kontroller renheten av elut protein på en 8 eller 10% SDS siden gel ved lasting 5-10 μL utvalg fra alle fraksjoner blandes med Laemmli buffer.
  9. Basseng peak brøker (konsentrasjon ≥ 2mg/mL) og måle protein konsentrasjon bruke Bradford analysen.
  10. Fordøye med TEV (1:30-50 (TEV protease: IKK1)) protease natten (≥12 h) på 4 ° C.
    Merk: Optimalisere mengden TEV protease kreves for å fullføre (≥ 95%) fordøyelsen av 6 X-hans koden en priori. TEV protease var renset i huset.
  11. På morgenen i dag 2 ruge protein med 1 mM ATP i nærvær av 20 mM MgCl2, 20 mM β-glycerophosphate, 10 mM NaF og 1 mM natrium orthovanadate 1t på 27 ° C.
  12. Filtrere protein løsningen gjennom en 0,45 eller 0.22 μm filter.
  13. Last 6 mL av prøven på en ~ 120 mL preparative størrelse-utestenging kolonne knyttet til en automatisert flytende kromatografi system. Equilibrate kolonnen med Buffer A (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% glyserol), før bruke protein prøven.
    Merk: En mindre kolonne kan brukes avhengig av avkastningen av protein etter Ni-NTA affinitet rensing trinn. Justere/beregne Last volum skal 5% av kolonnen volum).
  14. Kjør størrelse-utestenging Ture på en strømningshastighet på 1 mL/min, og overvåke elueringsrør på 280 og 254 nm. Samle deler av 2 mL størrelse.
  15. Sjekk renhet av topp fraksjoner (vanligvis rundt ~ 60-70 mL) på en 8-10% SDS side gel.
  16. Basseng ren fraksjoner (renhet ≥95% med en konsentrasjon av ≥0.5 mg/mL) og konsentrere i 10 kDa eller 30 kDa molekylvekt cut-off sentrifugal protein konsentrator følge instruksjonene fra produsenten.
  17. Periodisk sjekk protein konsentrasjon av konsentrat av metoden Bradford og konsentrere prøven til 8-12 mg/mL.
  18. Dispensere 25 μL dele og flash fryse i flytende nitrogen. Lagre disse flash frosne prøvene i-80 ° C fryseren.

4. skjermen for krystallisering tilstand IKK1

  1. Beregn det totale beløpet (etter volum) protein må skjerm for krystaller følgende metodene som er beskrevet nedenfor.
  2. Prøv forskjellige hemmere (generisk kinase hemmere: AMPPNP og Staurosporine; IKK-specific hemmere: MLN120B og sammensatte A IKK-hemmer XII) til å utføre screening for krystallisering. Gjør lager løsninger av disse forbindelser etter produsentens instruksjoner. Kontroller at maksimal konsentrasjon av sammensatt i sin lagerløsning ikke overstiger 20 μM.
  3. Forberede IKK:inhibitor komplekse skjermbildet krystallisering av miksing 100 μM av IKK1 med 200 μM inhibitor, og ruge på 18-20 ° C for 30-40 min. sentrifuge denne blandingen på > 15.000 x g i 2 minutter ved romtemperatur. Lagre nedbryting for krystallisering skjermen.
  4. Bruke kommersielt tilgjengelige krystallisering skjermene (se Tabell for materiale).
  5. Pipetter 80-100 μL av hver krystallisering reagensen (reservoaret solutions), ved hjelp av en flerkanals pipette eller en robot i reservoaret av en 96-brønns plate. Platen er nå klar til å definere drops. Kontroller at platen tilpasses 2 til 3 krystallisering drops slik at 2 til 3 hemmere kan bli vist på en enkelt plate.
  6. Bruker en krystallisering robot, dispensere og bland 0,2-0,25 μL IKK1:inhibitor kompleks med samme volum av reservoaret løsning.
    Merk: Screening utføres manuelt med større slipp volumer (0,5-1.0 μL IKK1:inhibitor kompleks med samme volum av reservoaret løsning). Men vil bruk av en robot hjelpe lagre verdifulle reagenser.
  7. Forsegle platene umiddelbart etter dråper med optisk klart filmer å unngå fordampning. Forsegle riktig bruk av riktig applikatoren. Lage kopi platene for hvert inhibitor. Inkuber en plate på 18 ° C, og den andre på kalde rommet (temperatur område ~ 4-6 ° C). Kontroller at inkubatorer ikke påvirkes av vibrasjon.
  8. Bruk en stereomicroscope med en polarisator for å kontrollere utseendet på krystaller i hver dråpe hver dag i de første sju dagene, og deretter ved lengre intervaller. Systematisk oppmerksom og score disse observasjonene.
    Merk: Bruk en stereomicroscope med en polarisator slik at vekst mangler i krystaller kan vurderes visuelt. Her, krystaller dukket opp i en tilstand der reservoaret løsningen finnes 3% w/v dekstran sulfate natrium salt Mr 5000, 0.1 M BICINE pH 8.5, 15% w/v polyetylenglykol 20.000. Krystaller av IKK1 vokste kun gjennom IKK-hemmer XII.

5. krystall veksten optimalisering29,33

  1. Utarbeidelse av lager løsninger.
    1. Forberede 30% w/v-løsninger for dekstran sulfate av ulike molekylvekt (Gj.sn MW 5000, 8000, 15.000, 40.000 Da) i deionisert H2O. Filter løsning med 0.22 μm filtre.
    2. Forberede 1 M eller 0,5 M bestander av ulike buffere i hvilket pH 6,5 9. Filtrere løsninger ved hjelp av 0.22 μm filtre.
    3. Forberede 25% eller 50% (w/v) PEG løsninger av ulike molekylvekt (Gj.snitt MW:1000, 1500 3350 4000, 6000, 8000, 10.000, 12.000, 20.000 Da). Filtrere løsninger ved hjelp av 0.22 μm filtre.
    4. Utføre en rutenettet skjerm ved systematisk varierende pH, buffer type, konsentrasjon og både pinne og dekstran Sulfate.
  2. Optimalisere screening både på 18 ° C, og i kalde rommet (temperatur område ~ 4-6 ° C).
  3. Bland en lik mengde IKK1:Inhibitor kompleks med godt løsning og ruge over godt løsningen i et lukket miljø. Dette trinnet kan utføres manuelt eller bruke en dispensering robot.
    Merk: Her, de største og veldefinerte krystallene (som vurdert av jevn farge under polarisatoren som indikerte ensartet vekst) ble innhentet under følgende betingelser: 100 mM BisTris pH 7.0, 2.8-3,5% av dekstran Sulfate (gjennomsnittlig MW 15 kDa), 8.5-10% pinne 20 kDa i kalde rommet.

6. økende Crystals i stort antall

  1. Klargjør følgende lager løsninger og filtrere dem gjennom 0.22 μm.
    1. Forberede 0,5 M BisTris pH 7.0, og BisTris propan pH 7.0 og 7.5.
    2. Forberede 30% (w/v) dekstran Sulfate (gjennomsnittlig MW ~ 15 kDa). Butikken på 4 ° C.
    3. Forberede 50% pinne (gjennomsnittlig MW ~ 12 kDa).
  2. Bruk 24 godt hengende slipp plater.
  3. Bruk fugemasse fett hevet ringene av hver brønn.
  4. Forberede godt løsningen som følger (siste konsentrasjon): 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2.8-3,5% dekstran Sulfate ~ 15 kDa 8.5 – 10% pinne ~ 12 kDa. Forberede 1 mL godt løsning i 1,5 mL rør.
    Merk: En liten variasjon i krystallisering tilstand ble observert avhengig av batchen protein og/eller dekstran Sulfate, dermed en prøveversjon av et lite område anbefales. Både BisTris og BisTris propan buffere i samme pH-området gir enkelt krystaller.
  5. Holde godt løsninger og smurt plater i kalde rommet for minst 1 time.
  6. Forberede IKK1:Inhibitor kompleks som beskrevet i 4.3. Overføre godt løsningene fra 1,5 mL rør personlige fordelt av 24 godt plate.
  7. Rene silikoniserte (kommersielle eller internt (siliconization/silanization)) glass cover slips med lofri kluter og bruke høytrykk pekt fly ved hjelp av kommersielt tilgjengelig aerosol støvkost.
  8. Sted 1-1,5 μL godt løsning på en ren cover slip. Pipetter like volum av IKK1:inhibitor komplekse, bland forsiktig av pipettering opp og ned 3 - 4 ganger. Slå glass cover slip og plassere på de respektive godt med tang og forsegle brønnen ved å trykke på fett.
  9. Etter innstilling opp alle dråper av en 24-vel plate, ruge platen i kalde rommet i mørket. Sjekke faller under et mikroskop for utseende og vekst av krystaller.
    Merk: Det har ikke blitt testet om rugende krystall plater under lys ville endre utfallet. Det er viktig, men at platene er ruges i et miljø med minimum/ingen vibrasjoner.

7. Cryo beskyttelse av krystaller

  1. Utarbeidelse av cryo løsninger.
    1. Forberede Cryo A (~ 2% dekstran Sulfate, ~ 10% pinne 12000, 60 mM BisTris propan (av samme pH som den tiltenkte godt løsningen), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 2,5% glyserol).
    2. Forberede Cryo B (~0.3% dekstran Sulfate, ~ 10% pinne 12000, 60 mM BisTris propan (av samme pH som den tiltenkte godt løsningen), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 20 eller 25% glyserol eller 20 eller 25% etylenglykol).
      Merk: Prøv forskjellige cryo-protectants i tillegg til glyserol og Ethylene Glycol (f.ekspinne 200, PEG 400, PEG MME 550, PEG 1000).
  2. Forsiktig fjerne glass cover slip med krystall og plasser den på en solid overflate med krystall slipp vendt oppover. Forsiktig legge 10 μL Cryo A løsning på rullegardinmenyen, og bland forsiktig av pipettering slik at krystallen ikke er rørt.
    Merk: Dette renser krystall overflaten av rusk og hjelpe equilibrate krystall med den første cryo-bufferen. Unngå mekanisk og termisk stress til crystal. Utføre alle de påfølgende trinnene under mikroskop for å unngå skade på krystall.
  3. Sakte fjerne noen væske fra krystall og holde om 5-8 μL av løsningen. Unngå dehydration krystallet. Ta forsiktig å unngå mekaniske påkjenninger og dehydrering krystallet i alle etterfølgende trinnene.
  4. Forsiktig legge 2.5-4 μL Cryo B løsningen på drop, bland svært forsiktig ved pipettering. Dekk med en liten Petriskål å unngå direkte luftstrøm over krystall. Vent 5 min. Vær alltid forsiktig krystall ikke lide raske endringer i osmotisk trykk eller dehydrering.
  5. Gjenta trinn 7.4 fire ganger sakte acclimatize krystall cryo-løsning.
  6. Holde 10-20 μL cryo løsningen på dette stadiet (dvs.at krystallen til badet i ca 20-25% cryo-protectant inneholder løsning). Suge i ulike tidsperioder (5 min til 1 h) i den endelige cryo-løsningen.
  7. Fryse flere krystaller på ulike tidspunkt.
  8. Nøye velge én krystall fra rullegardinlisten i en passende cryo-løkke montert på en riktig base og styrter frostvæske i flytende N2. Utføre dette trinnet jevnt og raskt å unngå isdannelse på krystall.
    Merk: Velg krystallen med løkke diameter litt større enn den lengste aksen av crystal slik at den kan monteres i robot goniometer brukes i avanserte Foton kilde, Argonne National Laboratory.
  9. Lagre krystall som inneholder cryo-looper i pucker i flytende N2. Lagre disse pucker i flytende N2 Dewar kolbe til de er klare for levering for X-ray Diffraksjon på synchrotron. Videre til X-ray Diffraksjon innsamling og behandling (avsnitt 8 og 9).
    Merk: Diffraksjon data av IKK1 krystaller fra hjem X-ray kilder var ikke høy nok oppløsning for struktur besluttsomhet forsøk, selv om det angitt kvaliteten på krystaller til å bli vist på synchrotron. Alle Diffraksjon data var samlet på ulike beamlines (hovedsakelig 19ID) på forhånd Foton kilde, Argonne National Laboratory, USA.

8. X-ray datainnsamling

  1. Samle X-ray Diffraksjon data på ID19 beamline APS synchrotron kilde, bruker eksterne dataene samling programvare34.
    Merk: Opp 100 krystaller ble testet for deres Diffraksjon egenskaper. Krystallene rutinemessig diffracted en oppløsning på 7-11 Å bare sjelden krystaller som diffracted til utover 5 Å ble observert, og bare en stor krystall diffracted utover 4.5 Å. Siden krystallene forfalt raskt under datainnsamling, ble datasett på forskjellige deler av samme krystallen samlet. Dette var mulig siden krystallene var stor (større enn 400 µm), og strålen diameter brukt var 100 µm.

9. X-ray databehandling

  1. Flette alle datasett samlet på forskjellige deler av de samme krystall34.
    Merk: syv datasett slått sammen fra beste krystall og de resulterende dataene var 93% fullført. Samlet jeg / σ var ~ 6.8) og Rmerge var 89% i høyeste oppløsning hyllen (5.4 4,5 Å).
  2. Prosessen datasett med HKL200034 å få plassen gruppen, enheten cellen dimensjoner, løsemiddel innhold og plausibel sammensetning av asymmetrisk.

10. struktur løsning

  1. Utarbeidelse av søk modeller
    1. Basert på tilgjengelige strukturelle modeller av hIKK2 (pdb id 4E3C og 4KIK35), generere en rekke dimers forskjellige retninger på N-terminal KD (som gjengir en åpning av 30 og 62 Å, mellom P578 av to KD i dimer). Ingen av disse modellene hentet en molekylær erstatning løsning etter omfattende studier.
    2. Generere et kart over IKK1 single-partikkel cryo-EM data33.
    3. Generere en modell av menneskelig IKK1 fra høyeste oppløsning strukturen for IKK2 (pdb id 4KIK).
    4. Forankre enkeltdomener av menneskelig IKK1 modellen i cryo EM tetthet kart over menneskelige IKK1 bruker KVAKK36. Dette rotert KD retningen ca 24 grader og endret N-terminalen åpning til ~ 58 Å.
    5. Gjelde alle dimers generert i 10.1.1 KD retningen av cryo-EM utstyrt modellen (monomer).
  2. Molekylær erstatning
    1. Bruke dimers 10.1.1 og 10.1.5 som søk i programmer PHASER37, MOLREP38 og CNS39,40.
      Merk: Her bruker en av dimers fra 10.1.5 (52 Å åpning) som et søk modell, seks dimers (to hexamers) ble plassert i asymmetrisk enheten ved hjelp av MOLREP. Den 52 Å åpne i Søk modellen ligner på 49-50 Å åpningen av dimers (alle seks dimers) i raffinert strukturen.

11. struktur raffinement

  1. Strukturen raffinement prosedyre
    1. Fastsette retning og posisjon av denne første modellen av rigid kropp raffinement i CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Forbedre strukturen ytterligere ved hjelp av minimering og simulert annealing med en maksimal sannsynlighet mål-funksjon og en flat bulk-betalingsevne korrigering ved hjelp CNS systemet39,40.
    3. Bygge modell basert på 2FO-FC og Fo-Fc kart ved hjelp av Xtalview41.
      Merk: Bruk DEN-assistert raffinement42 og sokkel holde under forbedringer for bedre nøyaktighet av modellen. Faktisk DEN raffinement forbedret geometrier og R-faktorer av strukturen, og R faktor var 22.2% og gratis R faktor var 27.8% for den siste modellen. Dramatisk forbedring av R gratis må skyldes høy nøyaktighet modell av IKK1 domener som ble generert fra den IKK2 modellen (4KIK).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kloning og uttrykk for ulike konstruksjoner av IKK1/α
Full lengde menneskelige IKK1/α ble klonet i baculovirus uttrykk vektor pFastBacHTa i sin EcoRI og NotI begrensning områder å få en N-terminal hexa-histidin merket IKK1. Koden kan fjernes av TEV protease fordøyelse. Siden full lengde IKK1/α inneholder fleksible områder i begge ender, og fleksibel områder vanligvis gjengi et protein vanskelig å utkrystallisere, klonet vi ulike avkortet fragmenter av IKK1/α på ovennevnte nettstedene av pFastBacHTa vektor. Ulike trunkering mutanter av IKK1/α ble generert med både vill-type (wt) og S176E, 180E (EE) infrastruktur. IKK1/α EE refererer til den mimetic constitutively aktiv form av den phosphorylated kinase. Rekombinant baculovirus produksjon og protein uttrykk som ble utført med en tidligere publiserte protokoll med mindre endringer43 (figur 1).

Problemer med IKK1/α krystallisering
Siden IKK2/β og IKK1 er homologe, og vi kunne utkrystallisere ulike versjoner av menneskelig IKK2/β under flere ulike forhold, forventet vi IKK1/α å utkrystallisere under like forhold med lignende strategier. Imidlertid etter omfattende studier med flere forskjellige IKK1 varianter, vi fikk krystaller med bare en avkortet konstruere (IKK1 10-667 EE) (figur 2), og at også i nærvær av den IKK hemmer XII44 vises egnet X-ray Diffraksjon egenskaper.

Strukturen løsning
IKK1/α krystaller LED mange vekst problemer, og dataene vises ofte svært høy mosaicity. Svak krystall pakking knyttet til store løsemiddel innhold og dynamikken i IKK1 monomer/dimer er den sannsynlige årsaken bak dette. For å omgå disse problemene, møysommelig arbeid ble tatt for å få best mulig krystaller og cryo-bevaring prosedyren ble utført med omhu under ulike forhold og ulike cryo-konserveringsmiddel buffere. Dataene ble også samlet med ultimat presisjon å minimere strålen skade. Krystallene var store (største dimensjon ofte overstiger 400 mikron), ble ulike områder av samme krystallene utsatt for røntgenbilde stråle å samle flere DataSet. Dette aktivert forskjellige datasets skal skaleres, og å få et rimelig komplette datasett med høyere redundans og minimert feil. Bløtlegging med tunge atomer eller tunge atom klynger (f.eksTaBr og TAMM), forårsaket krystaller til diffract mangelfullt. Selv om vi finner plasseringen av TaBr klynger i avledede data, gitt den dårlige kvaliteten på dataene i tillegg til den ikke-isomorphocity liten, om noen, informasjon.

Vi behandlet datasett med HKL2000 med ulike tilgjengelige parameterne. Diffraksjon mønsteret avslørt at krystallen tilhører plass gruppe P21 med enhet-cellen dimensjoner, en = 174.51, b = 186.94, c = 275.83 Å og β = 98.84 grader. Vi brukte hovedsakelig jeg / σ å anslå cut-off og testet ulike avskjær for datasett. Vi fikk en sammenslått sett 4.5 Å oppløsning fra 4 til 7 datasett Diffraksjon samlet på én krystall. Vi besluttet å hindre data til 4,5 Å visuell inspeksjon av siste tetthet kart. Det kan være verdt å bruke CC1/2, siden vi kan analytisk beregne kopi av flettede datasettet mot de sanne (vanligvis unmeasurable) intensiteter bruke CC *45. På grunn av den store enhet cellen kombinert med den lave symmetrien i gruppen plass forventet vi asymmetrisk enheten inneholder 12 til 24 molekyler basert på et løsemiddel innhold på 70% til 40%.

Den kombinerte effekten av lav oppløsning X-ray data med svak intensitet (dvs., vesentlige feil data) (Figur 3), stort antall (12) IKK1 molekyler i asymmetriske enhet og conformational variant av IKK1 monomerisk/dimeric modell sammenlignet med kjente IKK2 forhindret modeller, først oss fra skaffe en molekylær erstatning løsning IKK1, og dermed bestemme strukturen.

IKK1/α og IKK2/β begge inneholder et kinase domene (KD), en ubiquitin-lignende domene (ULD) og et en-spiralformede stillaset dimerization domene (SDD). Strukturen til IKK1 avslørt at den danner dimers på samme måte som IKK2 utnytte en nesten identisk mellom delenhet grensesnitt i distale regionen SDD. IKK1 dimer vises imidlertid en signifikant forskjellig relativ plassering av N-terminal KD i forhold til SDD + ULL forhold i kjente IKK2 dimers. Ulike IKK2 strukturer angitt tidligere annen intermonomer retning i sin dimers (Figur 4panelet A), slik at avstanden mellom de alpha karbonatomer av P578 i to KD i fire forskjellige dimer modeller varierte mellom 39 og 61 Å. Siden sekvenser av disse to kinaser er svært like, og rester på dimer grensesnittet er identisk, forventet vi IKK1/α vil danne en lignende dimer; men siden det er betydelige forskjeller i rester av KD-SDD-grensesnittet (f.eksW424 og F111 i IKK2 er V og P henholdsvis), vi forventet kanskje en ennå annen KD retning i IKK1. Faktisk indikerte IKK1/α struktur at relaterte retningene av KD til SDD er unik, og den avviker fra alle kjente modeller av IKK2/β. Over hundre dimer ble modeller brukt som søk modeller i programmer PHASER, MOLREP og CNS uten suksess, indikerer behovet for en ganske nøyaktig søk modell for suksess for molekylær erstatning prøvelser, spesielt med lav oppløsning dataene. En monomer modellen har for lite masse å plukke opp noen løsning i svak Diffraksjon data av store asymmetrisk enheten som inneholder 12 monomerer. Også inkluderingen eller utelatelsen av vann i Søk modellen fremstilt nei differansen i molekylær erstatning søk, spesielt på grunn av svak Diffraksjon dataene. CC1/2 og CC * indikerer at data inntil 4,5 Å ganske nøyaktig. Vi brukte en konservativ oppløsning cut-off av 4.5 Å basert på jeg / σ på 1,5. Datasett med ulik oppløsning avskjær viser ikke noen sterk forskjell under molekylær erstatning søkeoperasjoner og endelige kartene raffinert mot disse datasett viser ikke noen distinkte forbedring i funksjoner på utvide oppløsning avskjær. Den endelige byggingen i modellen er ganske nøyaktig, mer enn det kan bygges fra tetthet alene, sannsynlig siden første molekylær erstatning modellene ble bygget fra modeller kommer med en høy oppløsning data, og vi utnyttet cryo-EM kart/tettheten til kryssjekke funksjonene i kartet, særlig i regioner der kart var uklart.

I ettertid var obtainment av en nyttig søke modell mulig bare på grunn av tilgjengeligheten av lav oppløsning cryo-EM kartet, og en ganske høy nøyaktighet modell av IKK1 domener som kan genereres basert på høy oppløsning IKK2 struktur (Figur 4 panel B). Vi kan forankre IKK1 domener i cryo-EM kart over IKK1 å få en rimelig nær dimer modell. Den første modellen indikerte retningen KD roteres rundt 24 grader av en IKK2 monomer, og N-terminal åpningen av 58 Å (mellom P578 av to KDs i således en dimer). Våre tidligere kunnskap om ulike IKK2/β dimer strukturer (og deres variant) mulig for oss å finjustere søk modellen ved å endre åpningene mellom 30-62 Å. bruke en av dimers (52 Å åpne) som et søk modell, vi seks dimers i asymmetrisk enheten bruker program MOLREP46. Disse seks dimers er ordnet i to hexamers i asymmetrisk enhet, og det beregnede løsemiddelet har et volum på 68%.

Figure 1
Figur 1: rensing av IKK1. (A) uttrykk for IKK1 (10-667) i insekt celler. (B) et flytskjema for rensing av IKK1; (C) en SDS side gel viser renhet av IKK1 etter Ni-NTA affinitet kromatografi trinn. (D) størrelse-utestenging profil indikerer dimer av IKK1. (E) SDS side gel viser renhet av IKK1 fra toppen størrelse-utestenging fraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: morfologi og størrelse av IKK1 krystaller. (A) en krystall av IKK1 konstruere 10-667; krystallisering fall viser også krystaller av en annen morfologi (plater) som ikke diffract godt. (B) zoomet i lys av crystal som diffracted til utover 5 Å. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3:. Krystallografisk data fra IKK1 krystaller. (A) en X-ray Diffraksjon profil av en IKK1 krystall som viser dårlig Diffraksjon egenskaper av typiske IKK1 krystaller. (B) HKL2000 skalering statistikk over flettede datasettet IKK1 proteinstrukturer, og redundans av dataene. R lineær = Summer (ABS (I - < i >)) / summen (I), R square = Summer ((I - < i >) ** 2) / SUM (jeg ** 2), Chi ** 2 = Summer ((I - < i >) ** 2) / (feil ** 2 * N / (N-1))), CC1/2 = korrelasjonskoeffisienten, CC * = korrelasjonskoeffisienten til flettede dataset mot ekte intensitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: utarbeidelse av søk modeller. (A) forskjellige modeller av IKK2 dimer indikerer forskjellige retninger på KD i forhold til SDD (gir opphav til forskjellige skille mellom to KD); disse modellene ble testet først for å finne en molekylær erstatning løsning uten suksess. (B) generasjon av IKK1 søk modeller - Cryo-EM kart over IKK1 dimer på 11 Å oppløsning. EM-kart utstyrt første IKK1 søk modell, enkeltdomener er basert på IKK2 modell (4KIK); Et IKK1 søk modell videre fin-tweaked (aktuelle KD orientering) basert på ulike muligheter som dømmes fra IKK2 modeller beskriver ovenfor i 4A; Superposisjon av EM-kart utstyrt modell søk modellen som ga den molekylære erstatning løsningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Produksjon, krystallisering og struktur løsning av to relaterte IKK proteiner
Vi begynte for å bestemme X-ray krystall strukturen av IKK1/α med forestillingen om at det ville være en relativt enkel øvelse gitt vår erfaring med IKK2/β protein produksjon, krystallisering og proteinstrukturer. Men var vi svært overrasket over at disse to relaterte proteiner oppførte seg veldig annerledes om enkel krystallisering. Til tross for forsøk fra flere høyprofilerte laboratorier tok fastsettelse av IKK1 struktur nesten to tiår. Dette hovedsakelig kom noen viktige flaskehalser.

Den første vanskeligheten var å få en svært ren og løselig protein form. Insekt celle uttrykk systemet aktivert å oppnå mg mengder ren protein som var rimelig løselig. I forhold til nivået på uttrykket, alle IKK1/α konstruksjoner uttrykt på mye lavere nivåer enn IKK2/β konstruksjoner i insekt celle uttrykk systemer. Det bør bemerkes at verken protein er løselig og funksjonelle når uttrykt i E. coli. I et insekt celle uttrykk system, IKK2/β fragmenter uttrykt på høye nivåer varierte fra 10 til 30 mg/L av kultur avhengig av sammensetningene. Derimot kan IKK1/α konstruksjoner genereres bare på 0,5 til 2,0 mg/L av kultur. Årsaken til denne forskjellen er fortsatt ukjent for oss. Vi bør også prøve uttrykk for IKK1 i native vertsceller (dvs., pattedyr overuttrykte systemet i tilfelle et pattedyr IKK protein), spesielt siden post-translasjonell endringene som auto - eller trans-fosforylering vanlig forekommende i IKK oppstår mest effektivt og hensiktsmessig i sitt eget miljø. Rensing av IKK komplekser direkte fra storskala kultur pattedyrceller er også for tiden mottakelig.

Mens du arbeider med IKK2/β, la vi merke til at det kan være homogent auto-fosforylert ved å behandle med ATP, og dette gjør protein mottakelig for krystallisering. Tilsvarende gitt inkubasjonstiden for IKK1 protein med ATP, og den resulterende auto-fosforylering, en aktivert IKK1 som var løselig, og passer for både biokjemiske karakterisering og krystall proteinstrukturer.

Et kritisk steg til få godt diffracting krystaller var å finjustere krystallisering forhold, spesielt tillegg av riktig type og konsentrasjonen av dekstran sulfate molekyler. Tetthet angir bundet dekstran sulfate molekyler, og den resulterende effekten på IKK1 var sannsynlig avgjørende for krystallisering.

Iboende fleksibiliteten til IKK1, som er ofte observert i kinaser, er den primære avskrekkende for krystallisering og er ofte knyttet til engasjement av kinase domene med aktiviseringen løkke. IKK2 med både native (S177 og S181) og phosphomimetic (EE) former for aktivisering løkke serines kunne være krystallisert, men vi bare fått krystaller med avkortede IKK1/α av SS EE mutert versjon og som også bare i nærvær av IKK hemmer XII. Disse krystallene diffracted godt nok for proteinstrukturer bare når dyrket i kalde rommet (~ 4-6 ° C). Hvis vi får en tilsvarende sta opptreden med noen IKK1 homolog (eller en IKK ortholog), kan vi prøve ulike ryggraden endringer (spesielt av de aktive området loop serine rester som er vanligvis fosforylert). Vi kan også prøve co-krystallisering i nærvær av samspill partner proteiner. Mange kinaser, inkludert IKK familien, samhandle med partner proteiner og bor innenfor signifikante komplekser.

Flere hemmere bidro til å produsere IKK2 krystaller i ulike forhold (f.eksmed både høy salt, pinne som en precipitant), både på 18 ° C, og i kalde rommet. Men produserer under like forhold og med en rekke hemmere, IKK1/α ikke noen krystall. Dermed vil bruk av et større repertoar av hemmere øke sjansene for å finne en at krystallisering.

Et viktig skritt i proteinstrukturer var forsiktig cryo-bevaring og datainnsamling prosedyre. Den svake data og rask nedbrytning av krystallene i røntgenbilde stråle garantert behovet for større krystaller og samling av flere datasett fra samme krystaller. Uten en rimelig komplette datasett av høy nøyaktighet, kunne vi ikke har klart å skaffe en molekylær erstatning løsning.

Til slutt, vi kunne bestemme strukturen av IKK1/α molekylær skifte bruker mer enn 100 modeller opprettet fra kjente IKK2/β strukturelle modeller tilgjengelig i offentlige databasen. Dermed var å oppnå en passende modell for en molekylær erstatning prosedyre et must. Cryo-EM kartet, høy nøyaktighet strukturelle modeller av enkelte domener, sammen med komparative studier av tidligere fastslått IKK2 strukturer førte oss til å få en søk modell som hentet oss molekylær erstatning løsningen.

Krystallisering av et protein er iboende tilfeldige, så til tross for følgende over strukturert veiledning, kan vi står overfor problemer i bandets en annen IKK1 homolog eller en annen full lengde eller avkortet konstruksjon av den menneskelige IKK1. Uansett, kan kunnskap om disse avgjørende skritt forsker å utforske rasjonell forhold som vil øke sjansene for å få en godt diffracting IKK krystall.

IKK1/α og IKK2/β vise lignende domene organisasjon men forskjellige interdomain organisasjon
Ikke overraskende, vedta både IKK1/α og IKK2/β en svært lignende domenearkitektur stammer fra deres høy sekvens likheten33,43. Som indikert tidligere, både IKK1/α og IKK2/β fold i tre forskjellige domener: N-terminal kinase domene, ubiquitin som domenet (ULD) og stillaset dimerization domenet (SDD). Både IKK1/α og IKK2/β danner stabile dimers som C-terminalen halvparten av SDD delta i dimerization. Rester involvert i dimer dannelsen er identiske. Men er mellom domene samspillet mellom SDD/ULL og KD noe annerledes siden disse innebærer forskjellige rester. Dette forårsaket også trolig relative retningen kinase domenet til SDD i IKK1/α kan avvike fra at i IKK2/β. Dette var ikke helt uventet siden ser vi også forskjeller mellom tilgjengelige IKK2/β dimer modeller. Interessant, kan IKK2/β dimers organisere i tetramers i krystall gitterverk selv om denne tetramerization tilbøyelighet er svak i løsningen. Men dannet IKK1/α dimers unike hexamers. Disse hexamers er også observert i løsning, selv om bare et lite basseng med IKK1/α dimers eksisterer som hexamers. Dette tyder på at hexamerization er sannsynlig å ha en bestemt og kritisk funksjon.

Unike funksjonelle forskjeller fra strukturelle forskjeller
IKK1/α og IKK2/β utføre forskjellige funksjoner i cellene. Forholdet mellom IKK1/α-funksjonen og struktur har imidlertid vært unnvikende. IKK1/α klart eksisterer i ulike former: gratis dimer eller praktiske, og en hittil uncharacterized hetero-trimer kompleks IKK2/β og NEMO. Siden IKK2/β aktivering av kanoniske signalisere ikke krever IKK1/α, IKK1/α funksjonelle rolle i heterotrimer (kanoniske IKK-komplekset) er fortsatt uklart. Det er også uklart om aktivering av IKK1/α indusert av ikke-kanoniske signalisere avhengig av gratis dimeric IKK1/α og/eller hexameric IKK1/α. Siden mutational eksperimenter avsløre at avbrudd av praktiske grensesnittet sterkt påvirker ikke-kanoniske signalisere trolig hexamerization være avgjørende på et tidspunkt under ikke-kanoniske signalisere.

Utforme lite molekyl hemmere ved hjelp IKK1/α strukturen
Kjenne strukturen til IKK1/α tillater oss å undersøke overflaten flekker på en monomer eller lommer på Inter domene eller mellom monomer grensesnitt, som kan bli målrettet av små molekyler. IKKs har lenge vært ansett stoffet mål. Men gjør the essentiality av disse kinaser i en rekke funksjoner, inkludert mobilnettet homeostase, organismebiologi levedyktighet og immunitet det svært vanskelig å målrette dem. Så langt har ingen IKK målrettede molekyl blitt funnet som kan brukes trygt hos pasienter.

IKK1/α og IKK2/β er ofte mål samtidig for deres hemmere siden domenene kinase er svært like i sekvens og struktur. Betydelig forskning innsatsen har vært brukt til å finne bestemte hemmere bare ett av disse to kinaser. Derfor flere IKK2/β-spesifikke hemmere har blitt oppdaget, noe som påvirker ikke IKK1/α-funksjonen. Men vi vet ikke slike sammensatte finnes som effektivt hemmer IKK1/α uten perturbing IKK2/β-funksjonen. Dette fraværet kan tilskrives mangel på strukturelle informasjon på IKK1/α. Våre strukturelle og cellulær studier viser at selv om domenet ordningen og globale delenhet strukturer er svært like i disse to proteinene, de viser unike høyeste ordninger ansette bestemt overflaten patcher33. Disse forskjellene at ulike interaksjoner med tilhørende proteiner må oversette til sine funksjonelle forskjeller. Vi er håpefull at disse forskjellene avslørt mellom IKK1/α og IKK2/β inter - og intra-delenhet interaksjoner kan utnyttes for å gjøre delenhet-spesifikke allosteric hemmere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker ansatte ved beamlines 19ID, 24ID og 13ID på Avansert Foton kilde, Lemont, IL, støtte under datainnsamlingen på forskjellige krystaller. Vi er takknemlige for Dmitry Lyumkis, Salk Institute for henting oss lav oppløsning cryo-EM kartet i tidlige stadier av EM kart/modell bygning som ble brukt til å bygge den første IKK1 molekylære erstatning søk modellen. Forskningen førte til disse resultatene har mottatt finansiering fra NIH tilskudd AI064326, CA141722 og GM071862 til GG. SP er Wellcome Trust DBT India mellomliggende Fellow.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Tags

Biokjemi problemet 141: Serine-threonin protein Kinase IKK1/α NF-κB krystallstruktur molekylær erstatning hemmer
En Guide til produksjon, krystallisering og proteinstrukturer av menneskelig IKK1/α
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Polley, S., Huang, D. B., Biswas,… More

Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter