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Biochemistry

생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

IκB 키 1/α (IKK1/α CHUK)는 Ser/Thr 단백질 키 니 아 NF κB 녹음 방송 요인의 활성화를 통해 주로 세포 활동의 무수 한에 관련 된 이다. 여기, 우리가 생산 및이 단백질의 크리스탈 구조 결정에 필요한 주요 단계를 설명합니다.

Abstract

세포 외 자극의 클래스는 NF-κB 소 단위, p52의 선구자 p100의 처리를 통해의 생성을 유도 하 IKK1/α의 활성화를 필요 합니다. p52는 homodimer 또는 heterodimer 다른 NF-κB 소 단위, RelB와 함께 작동합니다. 이러한 이합체 차례로 염증, 세포 생존, 및 세포 주기 관련된 유전자의 수백의 표정을 통제 한다. IKK1/α 주로 삼항 복합물으로 니 모 IKK2/β와 관련 된 남아 있습니다. 그러나, 그것의 작은 수영장은 또한 낮은 분자량 complex(es)로 관찰 된다. 그것은 p100 처리 작업 내의 더 큰 IKK1/α의 활성화 또는 작은 복잡 한 수영장에 의해 트리거되는 경우 불명 하다. IKK1/α의 제정 활동 여러 암 및 염증 성 질환에서 발견 되었습니다. IKK1/α의 활성화의 메커니즘을 이해 하 고 약물 표적으로 그것의 사용을 가능 하 게, 우리는 대장균, 다른 호스트 시스템에 재조합 IKK1/α를 표현, 곤충 및 포유류 세포. 에 성공 하는 우리 곤충 세포, 밀리 그램 양의 매우 순수한 단백질을 얻기, 억제제, 존재 crystallizing 및 그것의 x 선 결정 구조를 결정 감염 성 IKK1/α 잠재에 표현. 여기, 우리는 재조합 단백질, 그것의 결정 화 및 그것의 x 선 결정 구조 결정 하는 자세한 단계를 설명 합니다.

Introduction

Dimeric 녹음 방송 요인 NF-κB 가족의 transcriptional 활동은 염증과 면역에서 생존과 죽음에 이르기까지 다양 한 세포 기능에 필요 합니다. 이러한 활동은 세포와 자가 면역 질환, 그리고 암1,2,3를 포함 하 여 다양 한 병 적인 조건에 규제 리드의 손실에 엄격 하 게 제어 됩니다. 자극의 부재에서 NF-κB의 활동 저해 IκB (-κB의 억제제) 단백질4에 의해 유지 됩니다. IκB 단백질에 특정 Ser 잔류물 인 산화 ubiquitination 및 후속 proteasomal 저하 또는 선택적 처리5에 대 한 그들을 표시합니다. 두 개의 높은 동종 Ser/Thr kinases, IKK2/β와 IKK1/α, NF-κB 활동의 중앙 레 귤 레이 터가 인 산화 이벤트6,7을 수행 하 여 역할.

ligand와 수용 체 간의 상호 작용 transduces NF κB 요인의 활성화를 선도 하는 중재자의 시리즈를 통해 신호. NF-κB 신호 과정은 광범위 하 게 두 가지 경로-정규 및 비정규 (대체)8로 나눌 수 있다. IKK2/β의 활동은 주로 염증 성 및 타고 난 면역 반응9필수적인 정식 통로의 NF-κB 신호 통제 한다. 이 통로의 뚜렷한 특징은 지금까지 화학적 새롭거나 IKK 복잡 한 내 IKK2/β10 의 신속 하 고 단기 활성화-IKK1 및 IKK2, 뿐만 아니라 규제 구성 요소, 니 모를 찾아서 (NF κB 필수 변조기의 구성 될 것으로 추정 )11,,1213. 2 개의 촉매 IKK subunits IKK 복합물의, 사이 IKK2는 주로 책임14 원형 IκBs (α-β,-γ)의 특정 잔류물의 인 산화에 대 한 NF-κB, 그리고 또한 비정형 IκB 단백질에 바인딩된은 NF-κB1/p105는 NF-κB p50 소 단위5의 전조 인 산화 유도 ubiquitination 그리고 proteasomal IκB (또는 p105의 처리)의 저하 리드 릴리스 및 NF κB 이합체15의 특정 집합의 활성화. IKK2의 미 규제 기능 때문에 탈 선 NF κB 활동 면역 질환2,,316에서 뿐만 아니라 많은 암에 관찰 되었습니다.

IKK2/β, 달리 IKK1/α의 활동 NF κB 개발 및 내성에 대 한 필수적입니다 정식이 아닌 통로의 신호 조절. IKK1 phosphorylates의 처리, p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 특정 잔류물. Transcriptionally 활성 p52:RelB heterodimer 형성 발달 신호7,17,18,,1920느리고 지속적인 응답을 시작합니다. 흥미롭게도,이 통로의 중앙 NF κB 요소 p52의 세대는 또 다른 요인은, NF-κB 유도 니 (닉)21,22에 IKK2 또는 니 비판적으로 의존 합니다. 휴식 셀에 닉의 수준 때문에 상수 프로테아좀 종속 저하23,,2425낮은 남아 있습니다. ' 비정규 ' ligands에 의해 그리고 특정 악성 세포에서 세포의 자극, 시 닉 모집을 활성화 하 고 IKK1 안정 된다/α. 닉의 IKK1 키 니 아 제 활동 p527에 p100의 효율적인 처리를 위해 필수적인. IKK1와 닉 phosphorylate 처리 및 p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 3 serines (Ser866, 870, 872). 비정규 통로의 탈 선 활성화 여러 myeloma26,,2728를 포함 하 여 많은 악성 종양에 연루 되었습니다.

비록 아무도 지금까지 것으로 밝혀졌다는 효과적인 약 IKK2/β에 대 한 몇 가지 매우 효율적이 고 구체적인 억제제 알려져 있습니다. 반면, IKK1/α-특정 억제제 스파스 있습니다. 이 일부 IKK1/α, 셀, 및 합리적인 약 디자인에 IKK1에 의해 NF-κB의 활성화의 기계 기초의 우리의 이해를 제한에 대 한 구조 및 생 화 확 적인 정보의 부족에서에서 줄기 수 있습니다. IKK2/β의 엑스레이 구조 IKK2/β29;의 인증 메커니즘에 대 한 통찰력 제공 그러나, 이러한 구조는 어떻게 다른 업스트림 자극 공개 하지 수 IKK1/α 또는 IKK2/β NF κB 활동 30,31의 명료한 세트를 규제의 활성화를 방 아 쇠. 기계적으로 IKK1/α의 뚜렷한 신호 기능을 기본을 이해 하 고 합리적인 약 디자인을 위한 플랫폼을 구축, 우리 IKK1/α의 구조 결정에 집중 했다.

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Protocol

1. 재조합 형 바이러스 IKK1/α의 대규모 식 적합의 준비

  1. P1 바이러스 준비 32
    1. 주: 1 격판덮개 Sf9 셀 (6 ~ 10 X5) (통로 번호 10 미만) 각 Sf900 III 곤충 세포 매체의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 잘와 27 ° c.에 품 어 6 ~ 10 X의 밀도에 신선한 미디어로 diluting 하 여 정지에 mL 당 2 ~ 3 × 106 셀의 밀도 도달할 때 셀 통로5.
    2. 주 2: 8 µ L 항생제 및 혈 청 하지 않고 Sf900 III 또는 그레이스의 곤충 매체의 100 µ L에서 Sf9 transfection 시 약의 희석. 짧게 소용돌이입니다.
    3. 1 µ g 키트 정화 재조합 bacmid (자세한 내용은 ' 대표 결과 '에서 제공 됩니다)의 희석으로 별도 튜브에서 같은 매체의 또 다른 100 µ L32 .
    4. 희석된 DNA와 transfection 시 약 (전체 볼륨 ~ 210-220 μ), 결합 하 고 15-30 분 동안 실 온에서 품 어.
    5. 우물에서 매체를 제거 합니다. 항생제 및 혈 청 하지 않고 신선한 매체의 1 mL를 추가 합니다.
    6. 셀에 dropwise 희석된 DNA transfection 시 혼합물을 추가 합니다. 부착 세포를 꺼내 하지 않습니다 같은 드롭 크기를 조정 합니다.
    7. 후 ~ 6 h 위에 1.5 mL 신선한 매체의 추가 또는 매체를 제거 하 고 2.5 mL 신선한 매체의 추가. 추가 하기 전에 25-27 ° C에 따뜻한 신선한 매체.
    8. 27 ° c.에 셀을 품 어 주기적으로 바이러스 성 감염의 징후에 대 한 모든 ~ 12 h 우물을 확인 하십시오. 모든 Sf9 유지 보수 및 27 ° c.에 식
    9. 제 5 일: 셀 60-72 h 포스트 감염을 포함 하는 매체를 꺼내. G와 4 ° C x 500에서 5 분 동안 원심 분리기 상쾌한; 저장 이것은 P1 바이러스 주식 이다. -80 ° c.에 작은 aliquots 고정
  2. P1 바이러스 복제를 표현 하는 최고의 선택.
    1. 1.1 단계에 설명 된 대로 마찬가지로 플레이트 세포입니다.
    2. 다음 날 또는 ~ 6 h 포스트 도금, 다른 우물에서 20 µ L와 셀에 서로 다른 P1 바이러스 복제 주식 50 µ L를 추가 합니다.
    3. 부드러운 pipetting으로 부착 세포를 꺼내와 centrifuging g와 4 ° C x 500에서 5 분에 의해 감염 된 세포 60-72 h 포스트 감염을 수확 상쾌한을 저장 합니다. 이것은 P2 바이러스 주식 이다. -80 ° c.에 주식의 작은 aliquots를 저장
    4. 수확된 셀 펠 릿에 2 x Laemmli SDS 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 열 > 10 분 원심 분리기에 대 한 95 ° C (일반적으로 > 10000 g x) 5 분.
    5. 염료 전면 젤의 하단에 도달할 때까지 8-10 %SDS-120-160 V에서 페이지에 각 샘플의 10-15 µ L를 실행 합니다.
    6. 전기 전송 표준 세미 드라이 의해 확인 된 단백질 전송 프로토콜 (20 V, 30-45 분) 니트로/PVDF 막에.
    7. 안티-IKK1 항 체와 오 점 (희석 ~ 1:2, 000, 낙관 한다) 또는 안티-PentaHis 항 체 (희석 ~ 1:3, 000, 낙관 한다) 식에 대 한.
    8. 재조합 IKK1의 식을 비교 하 여 최고의 P1 바이러스 복제를 선택 합니다.
  3. 대규모 P3 바이러스 주식 준비 합니다.
    1. 마찬가지로 Sf900 III 매체의 25-30 mL를 포함 하는 15 cm 접시에서 1.1 단계에 설명 된 대로 플레이트 세포.
    2. ~ 6 h 도금 게시물, 셀에 최고의 표현 P1 바이러스 주식의 150-300 µ L를 추가 합니다.
    3. 72 h 후 감염 게시, 발음 (살 균), 적당 한 튜브에 접시에서 신중 하 게 매체 및 원심 500-1000 X g 4 ° c.에서 10 분에 관 (하나는 형성) 하는 경우 셀 펠 릿을 무시 하 고는 상쾌한 저장 합니다. 이것은 P3 바이러스 주식 이다.
  4. 대규모 단백질 표정에 대 한 최적의 바이러스 titre 결정
    1. 1.1 6-잘 접시에에 설명 된 대로 Sf900 III 매체의 2 mL에 플레이트 세포.
    2. 20, 30, 40, 그리고 별도의 바이러스 재고가 우물 게시물 도금 ~ 6 h p 3의 50 µ L를 추가 합니다. 감염 되지 않은 컨트롤을 포함 합니다.
    3. 각 잘 48-60 h 포스트 감염에서 세포를 수확.
    4. 2 X Laemmli SDS 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 열 > 10 분 분리기 (14000 x g)에서 일반적으로 5 분 동안 95 ° C.
    5. 8-10 %SDS-PAGE 젤에 각 샘플의 10-15 µ L를 해결.
    6. 1.2.6에서 언급 한 대로 해결된 단백질 니트로/PVDF 막에 전송.
    7. 안티-IKK1 항 체와 오 점 (희석 ~ 1: 2000, 낙관 되어야 한다) 또는 안티-PentaHis 항 체 (희석 ~ 1:3000, 낙관 되어야 한다).
    8. 바이러스를 사용 하 여 대규모 식 titre 표현 하는 최고의.

2. 대규모 표현의 6 x 그의 인간 IKK129,33 태그

  1. 서 스 펜 션 문화에 대규모 식 실시 합니다. 배기 모자 2 L 삼각 플라스 크에 Sf900 III 매체의 1 L에 셀을 분할 합니다. 셀 밀도 ~5 셀/10ml x 5 여야 합니다.
  2. ~ 2 일 1-2 106/mL x의 밀도 도달할 때까지 통에 27 ° C에서 ~ 100 rpm에이 세포를 성장. 셀 밀도 2 x 106/mL을 초과 하지 않아야 합니다.
  3. 1.4에서 평가 P3 바이러스의 원하는 금액을 추가 합니다.
  4. 성장 통에 27 ° C에서 ~ 100 rpm에서 48-60 h에 대 한 감염 된 문화.
  5. 원심 분리에 의해 세포를 수확 < 4 ° c.에 1500 x g
  6. 셀 펠 렛을 저장 하 고 매체를 삭제.
  7. 단백질 정화로 직접 이동 합니다. 플래시 액체 질소에 나중에 사용-80 ° C에 게 셀 펠 릿을 동결.

3. IKK1 그의33 의 정화

  1. 하루에 1, 세포의 용 해 버퍼의 40 mL에 셀 펠 릿 resuspend (25mm Tris pH 8.0 0.2 %NP-40, 200 mM NaCl, 이미 10 m m, 10% 글리세롤, 5mm β-mercaptoethanol, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일).
    참고: 젖은 셀 펠 릿 대량 결정 하지 했다. 일반적으로, 문화의 ~ 2 L이이 단계에 대 한 사용 되었다.
  2. 쥡니다 60-70% 듀티 사이클, 간격 30 s의 5-10 펄스에 의해 세포를 lyse > 세포 현 탁 액을 유지 하는 1 분 얼음에 냉장.
    참고:이 단계는 최적화를 sonicator의 각 모델 필요합니다. 샘플을 10 ° c.의 위 워밍업 하지 마십시오
  3. 4 ° c.에 45 분 ≥ 28000 x g에서 원심 분리 하 여는 lysate 명확히
  4. 4 mL의 Ni NTA Agarose 수 지 세포의 용 해 버퍼와 믹스는 명확히 lysate (상쾌한) 제조 업체의 프로토콜을 따르고 equilibrate
  5. 단백질 2 h 4 ° C 방에 회전 믹서에 대 한 배양 하 여 수 지를 바인딩할 수 있습니다.
  6. 30 mM 이미 포함 된 세포의 용 해 버퍼와 수 지를 철저히 씻으십시오. Bradford 분석 실험을 사용 하 여 주기적으로 세척 분수에서 단백질 농도 확인 합니다. 워시 워시 분수에이 단백질 농도 0.1 mg/mL에 도달할 때까지. 일반적으로 > 20 침대 양의 워시 버퍼는이 지점에 도달 해야 합니다.
  7. 차입 버퍼 (250 m m 이미 포함 된 세포의 용 해 버퍼) 20 mL를 사용 하 여 중력 흐름에서 그의 태그 IKK1/α 단백질 elute 1-1.5 mL 분수를 수집 합니다.
  8. 모든 분수 Laemmli 버퍼와 혼합에서 샘플의 5-10 μ를 로드 하 여 8 또는 10 %SDS 페이지 젤에 eluted 단백질의 순도 확인 합니다.
  9. 피크 분수 (농도 ≥ 2 mg/mL), 수영장과 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 농도 측정.
  10. (1시 30분-50 (TEV 프로 테아 제: IKK1)) TEV protease 하룻밤 (h ≥12) 4 ° c.에와 소화
    참고: 최적화 TEV 프로 테아 제에 필요한 금액의 6 X 그의 태그 선험적(≥ 95%) 소화를 완료. TEV 프로 테아 제는 집에서 순화 되었다.
  11. 하루 2의 아침에 1mm ATP 20 m m MgCl2의 존재, 20 m m β-glycerophosphate, 10 mM, NaF와 27 ° c.에 1 시간에 1mm 나트륨 orthovanadate 단백질을 품 어
  12. 단백질 해결책 0.45 또는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
  13. 자동된 액체 크로마토그래피 시스템에 연결 된 ~ 120 mL 대리점 크기 제외 열에 샘플의 6 mL 로드. Equilibrate 버퍼 A 열 (20 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 m m NaCl, 5mm DTT, 5% 글리세롤), 단백질 견본을 적용 하기 전에.
    참고: 작은 열 수 사용 단백질의 수익률에 따라 Ni NTA 선호도 정화 단계 후. 조정/열 량의 5% 부하 볼륨 계산).
  14. 1 mL/min의 유량에서 크기 배제 크로마토그래피를 실행 하 고 280 및 254 nm에서 차입을 모니터링. 2 mL 크기의 분수를 수집 합니다.
  15. 피크 분수의 순도 확인 (~ 60-70의 주위에 일반적으로 mL)에 8-10 %SDS-PAGE 젤.
  16. Pool 순수한 분수 (이들 mg/mL의 농도와 순도 ≥95%) 하 고 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷오프 원심 단백질 집중 장치 제조업체의 지침에 따라에 집중.
  17. 정기적으로 브래드 메서드에서 집중의 단백질 농도 확인 하 고 8-12 mg/mL까지 샘플을 집중.
  18. 25 μ aliquots 및 액체 질소에 플래시 동결 분배. 이러한 플래시 냉동된 샘플-80 ° C 냉동 실에 저장 합니다.

4입니다. 화면 IKK1의 결정 화 조건에 대 한

  1. 화면 아래에 설명 된 방법에 따라 결정 하는 데 필요한 단백질의 (볼륨)에 의해 총 금액을 계산 합니다.
  2. 시도 다른 억제제 (일반 kinase 억제제: AMPPNP, 및 Staurosporine; IKK-specific 억제제: MLN120B, 화합물, 및 IKK 억제제 XII) 결정 화에 대 한 심사를 수행 하기 위해. 제조업체의 지침에 따라 이러한 화합물의 재고 솔루션을 확인 합니다. 재고 솔루션에 화합물의 최대 농도 20 μ M를 초과 하지 않는 확인 하십시오.
  3. 200 μ M 억제제와 IKK1의 혼합 100 μ M에 의해 결정 화 화면에 대 한 복잡 한 IKK:inhibitor를 준비 하 고 30-40 분 원심이 혼합물에 대 한 18-20 ° C에서 품 어 > 실 온에서 2 분 동안 15000 x g. 결정 화 화면에 대 한 상쾌한을 저장 합니다.
  4. 상업적으로 사용 가능한 결정 화면 ( 재료의 표참조)를 사용 합니다.
  5. 96 잘 접시의 저수지로 멀티 채널 피 펫 또는 로봇을 사용 하 여 각 결정 화 시 약 (저수지 솔루션)의 80-100 μ 플라스틱 접시 이제 상품을 설정할 준비가 되어 있습니다. 접시에 2 ~ 3 결정 화 방울 수용 2-3 억제제 단일 플레이트에서 상영 될 수 있도록 확인 하십시오.
  6. 결정 화 로봇을 사용 하 여, 분배 하 고 혼합 0.2-0.25 μ 복잡 한 IKK1:inhibitor의 저수지 솔루션의 같은 볼륨.
    참고: 검사 실행 될 수 있다 큰 드롭 볼륨을 사용 하 여 수동으로 (0.5-1.0 저수지 솔루션의 같은 볼륨으로 복잡 한 IKK1:inhibitor의 μ). 그러나, 로봇의 사용은 중요 한 시 약 저장 도움이 될.
  7. 광학 투명 필름으로 증발을 피하기 위해 방울을 설정한 후 즉시 접시를 봉인. 적절 한 주걱을 사용 하 여 제대로 봉인. 각 억제제 집합에 대 한 복제 번호판을 확인 합니다. 18 ° C, 그리고 차가운 방 (온도 범위 4 ~-6 ° C)에서 다른 한 접시를 품 어. Incubators 진동에 의해 영향을 받지 않습니다 것을 확인 하십시오.
  8. 편광판은 stereomicroscope를 사용 하 여 모양을 결정 각 드롭의 매일 첫 번째 7 일 동안 그리고 더 긴 간격에 대 한 확인. 체계적으로 및 이러한 관찰 점수.
    참고: 사용 하 여 한 stereomicroscope는 편광판과 결정에서 성장 결함을 시각적으로 평가 될 수 있다. 여기, 크리스탈 등장 조건에 어디 저수지 솔루션 포함 3 %w / v Dextran 황산 나트륨 소금 Mr 5000, 0.1 m M BICINE pH 8.5, 15 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 20000. IKK1 크리스탈 IKK 억제제 XII 존재만 성장 했다.

5. 결정 성장 최적화29,33

  1. 재고 솔루션의 준비입니다.
    1. Dextran 황산 이온 H2o. 필터 솔루션 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 다른 분자량 (평균 MW 5000, 8000, 15000, 40000 다)의 30 %w / v 솔루션을 준비 합니다.
    2. 6.5 9의 pH 범위에서 다른 버퍼의 1 개 M 또는 0.5 M 주식을 준비 합니다. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
    3. 25% 또는 50% (w/v) 다른 분자량의 PEG 솔루션 준비 (평균 MW:1000, 1500, 3,350, 4000, 6000, 8000, 10000, 12000, 20000 다). 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
    4. PH, 버퍼 유형, 농도, 및 말뚝 및 Dextran 황산의 유형을 체계적으로 변화 하 여 그리드 화면을 수행 합니다.
  2. 18 ° C에서, 그리고 차가운 방 (온도 범위 4 ~-6 ° C)에서 심사를 최적화 합니다.
  3. 잘 솔루션으로 복잡 한 IKK1:Inhibitor의 동일한 금액을 혼합 하 고 밀폐 된 환경에서 잘 솔루션에 품 어. 이 단계를 수동으로 수행할 수 또는 디스 펜스 로봇을 사용 하 여.
    참고: 여기, 크고 잘 정의 된 결정 (균일 한 성장을 표시 편광판에서 균일 한 색으로 평가)로 가져온 다음 조건: 100 mM BisTris pH 7.0, Dextran 황산 (평균 MW 15 kDa), 8.5-10% 말뚝 20의 2.8-3.5% 추운 방에 kDa입니다.

6. 성장 하는 다 수 결정

  1. 다음 재고 솔루션을 준비 하 고 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
    1. 0.5 M BisTris pH 7.0, 및 BisTris 프로 판 pH 7.0 및 7.5를 준비 합니다.
    2. 30% (w/v) Dextran 황산 (평균 MW ~ 15 kDa)를 준비 합니다. 4 ° c.에 게
    3. 준비 하는 50% 말뚝 (평균 MW ~ 12 kDa).
  2. 사용 24 잘 걸려 드롭 접시.
  3. 각 잘 제기 반지에 실 란 트 윤활제를 적용 합니다.
  4. (최종 농도) 다음과 같이 잘 솔루션 준비: 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2.8-3.5 %Dextran 황산 ~ 15 kDa, 8.5-10% ~ 12 kDa 던지다. 1.5 mL 튜브에 1 mL 잘 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 결정 화 조건에 사소한 변화는 단백질, Dextran 황산의 배치에 따라 관찰 되었다, 따라서 재판 좁은 범위의 것이 좋습니다. BisTris와 BisTris 둘 다 동일한 pH 범위의 프로 판 버퍼 단일 결정 얻을.
  5. 적어도 1 시간에 대 한 차가운 방에 잘 솔루션와 기름칠된 접시를 유지.
  6. 4.3에 설명 된 대로 복잡 한 IKK1:Inhibitor를 준비 합니다. 1.5 mL 튜브에서 24 잘 플레이트의 개별 우물 잘 솔루션을 전송.
  7. 깨끗 한 시 (상업적 또는 사내 (siliconization/silanization)) 커버 전표 보풀 잎사귀를 사용 하 여 유리 고 지목 하는 높은 압력 공기 제트기는 상용에 어로 졸 살포 기를 사용 하 여 적용.
  8. 깨끗 한 커버 슬립에 잘 솔루션의 1-1.5 μ를 놓습니다. 동일한 양의 IKK1:inhibitor 복잡 한 플라스틱, 아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합 3-4 회. 유리 커버 슬립을 설정 하 고 각각에 집게와 잘 놓고 기름에 눌러 잘 밀봉.
  9. 24-잘 접시의 모든 방울을 설정한 후 어둠 속에서 차가운 방에 접시를 품 어. 때때로 모양 및 결정의 성장에 대 한 현미경 드랍 스 확인 합니다.
    참고: 그것은 테스트 되지 여부 빛 아래 크리스탈 접시 배양 결과 바꿀 것 이다. 그러나 그것은 중요 한,, 격판덮개는 최소/no 진동 환경에서 알을 품입니다.

7. Cryo 보호 결정의

  1. 곳을 알아내는 솔루션의 준비입니다.
    1. 곳을 알아내는 A 준비 (Dextran 황산 염에 ~ 2% ~ 10% 말뚝 12000, 60 mM BisTris 프로 판 (의 의도 잘 솔루션으로 같은 pH), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 m m NaCl, 2.5% 글리세롤).
    2. 곳을 알아내는 B 준비 (~0.3% Dextran 황산, ~ 10% 말뚝 12000, 60 mM BisTris 프로 판 (의 의도 잘 솔루션으로 같은 pH), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 m m NaCl, 20 또는 25% 글리세롤 또는 20 또는 25% 에틸렌 글리콜).
      참고 사항: 글리세롤과 에틸렌 글리콜 (예를 들어, 목이 200, 말뚝 400, MME 550 던지다, 던지다 1000) 이외에 다른 곳을 알아내는-protectants 테스트 합니다.
  2. 부드럽게 포함 하는 크리스털 유리 커버 슬립을 제거 하 고 위쪽으로 향하게 하는 크리스탈 드롭 고체 표면에 놓습니다. 부드럽게 드롭, 위에 Cryo A 솔루션의 10 μ를 추가 하 고 크리스탈을 터치 하지 있도록 pipetting으로 부드럽게 혼합.
    참고:이 크리스탈 표면의 파편을 청소 하 고 초기 cryo 버퍼와 크리스털을 equilibrate 하는 데 도움이. 크리스탈을 기계 및 열 스트레스를 하지 마십시오. 크리스탈에 손상을 피하기 위해 현미경 모든 후속 단계를 수행 합니다.
  3. 천천히 크리스탈에서 일부 액체를 제거 하 고 유지에 대 한 솔루션의 5-8 μ. 크리스탈의 탈수를 하지 마십시오. 기계적 스트레스와 모든 후속 단계에서 크리스탈의 탈수를 피하기 위해 주의 걸릴.
  4. 부드럽게 추가 하락에 Cryo B 솔루션의 2.5-4 μ, 매우 부드럽게 pipetting으로. 크리스털을 통해 직접 공기 흐름을 피하기 위해 작은 페 트리 접시 커버. 5 분 기다립니다 항상 조심 크리스탈 삼투성 압력 또는 탈수의 빠른 변화를 용납 하지 않습니다.
  5. 반복 단계 7.4 4 천천히 cryo 솔루션으로 크리스탈을 순응 시간.
  6. 곳을 알아내는 솔루션의 10-20 μ가이 단계에서 계속 (즉, 약 20-25%에서 목욕을 크리스탈 허용 cryo 막는 포함 솔루션). 다른 기간 (1 시간 5 분) 최종 cryo-솔루션에 담근 다.
  7. 다른 시간 지점에서 여러 결정을 고정 합니다.
  8. 신중 하 게 적절 한 자료와 식이-동결 액체 N2에 장착 된 적절 한 곳을 알아내는-루프에서에서 단 결정을 선택 합니다. 원활 하 고 신속 하 게이 단계를 수행 크리스탈 얼음 형성을 피하기 위해.
    참고: 크리스탈 고급 광자 소스, 아르곤 국립 연구소에서에서 사용 하는 로봇 각도에 장착할 수 있도록 크리스털의 긴 축 보다 약간 더 큰 루프 직경을 사용 하 여 선택 합니다.
  9. 곳을 알아내는-루프 키 액체 N2에 포함 된 크리스탈을 저장 합니다. 그들에 싱크 로트 론 x-선 회절에 대 한 선적을 위한 준비가 될 때까지 액체 N2 Dewar 플라스 크에에서이 키를 저장 합니다. X 선 회절 데이터 수집 및 처리 (섹션 8 및 9)를 진행 합니다.
    참고: 홈 x 선 소스의 IKK1 결정의 회절 데이터 되지 않았다 구조 결정 실험, 충분히 높은 해상도의 비록는 싱크 로트 론에서 상영 결정의 품질 표시. 모든 회절 데이터 사전 광자 소스, Argonne 국립 연구소, 미국의 다른 beamlines (주로 19ID)에서 수집 했다.

8. x 선 데이터 수집

  1. 원격 데이터 수집 소프트웨어34를 사용 하 여 APS 싱크 로트 론 근원의 ID19 beamline에 x 선 회절 데이터를 수집 합니다.
    참고: 100 크리스탈 위쪽으로 그들의 회절 속성에 대 한 테스트 되었습니다. 크리스탈 정기적으로 diffracted Å, 거의 7-11의 해상도를 결정 5 저쪽에 diffracted Å 했다 관찰, 그리고 하나의 큰 크리스탈 4.5 넘어 diffracted Å. 크리스탈 데이터 수집 중 급속 하 게 부패, 이후 데이터 집합 같은 크리스탈의 다른 부분에서 수집 했다. 이것은 때문에 결정 했다 큰 가능 했다 (400 µ m 보다 큰), 그리고 사용 하는 빔 직경 100 µ m.

9. x-선 데이터 처리

  1. 동일한 크리스탈34의 다른 부분에서 수집 된 모든 데이터 집합을 병합 합니다.
    참고: 최고의 크리스탈에서 7 데이터 집합 병합 하 고 결과 데이터는 93% 완료. 전체 난 / σ ~ 6.8) 및 Rmerge 높은 해상도 빈 (5.4-4.5 Å)에서 89% 이었다.
  2. 프로세스 HKL200034 공간 그룹, 단위 세포 크기, 용 매의 증기압 및 비대칭 단위의 그럴 듯 하 게 구성 된 데이터 집합.

10. 구조 솔루션

  1. 검색 모델의 준비
    1. HIKK2의 사용 가능한 구조 모델에 따라 (pdb id 4E3C와 4KIK35), N 맨끝 KD의 다른 방향으로 이합체의 일련을 생성 (하 30 그리고 62의 개방 렌더링 Å, P578는 이합체에 두 KD의 사이). 이러한 모델의 광범위 한 실험 후 분자 교체 검색 솔루션을 가져왔습니다.
    2. 단일 입자 cryo-EM 데이터33에서 IKK1의 지도 생성 합니다.
    3. IKK2의 가장 높은 해결책 구조에서 인간 IKK1의 모델 생성 (pdb id 4KIK).
    4. 곳을 알아내는 EM 밀도 지도 인간 IKK1의 쿳36을 사용 하 여에 인간 IKK1 모델의 개별 도메인을 도킹 합니다. 이 KD 방향 약 24도 회전 하 고 개방 ~ 58 Å N 맨끝 수정.
    5. 곳을 알아내는-EM 장착 모델 (단위체)의 KD 방향을 10.1.1에서 생성 된 모든 이합체에 적용 됩니다.
  2. 분자 교체
    1. 10.1.1 10.1.5에서 이합체를 사용 하 여 프로그램 페이저37MOLREP38 , CNS39,40검색 모델로.
      참고: 여기, a 검색 모델로 10.1.5 (52 Å 오프닝)에서 이합체 중 하나를 사용 하 여, 6 이합체 (2 개의 hexamers)은에 있는 비대칭 단위 MOLREP를 사용 하 여. 검색 모델에 여 52 Å 세련 된 구조에서 이합체 (모든 6 이합체)의 49-50 Å 열기와 비슷합니다.

11. 구조 상세

  1. 구조 수정 절차
    1. CNS (cns_solve_1.3)39,40에 강 체 구체화 하 여 방향과이 초기 모델의 위치를 수정.
    2. 더 최소화 하 고 최대 가능성 대상 기능 및 CNS 시스템39,40을 사용 하 여 평면 대량 용 매 보정 시뮬레이션 어 닐 링을 사용 하 여 구조를 구체화 합니다.
    3. 2 층OFC 에 따라 모델을 구축 하 고 Fo Fc Xtalview41을 사용 하 여 지도.
      참고: 덴 지원 구체화42 고 NCS는 모델의 정확도 높이기 위해 상세 동안 억제. 실제로, 덴 구체화 극적으로 개선 형상 및 구조의 R 요인 및 R 요인 22.2% 이었고 무료 R 요인은 최종 모델에 대 한 27.8% 이었다. 무료 R의 극적인 개선 때문에 IKK2 모델 (4KIK)에서 생성 된 IKK1 도메인의 높은 정확도 모델 이어야 합니다.

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Representative Results

복제 및 IKK1/α의 다른 구조 식
인간 IKK1/α는 N 맨끝 hexa-히스티딘을 자사의 EcoRI 및 노트 제한 사이트 내에서 잠재 식 벡터 pFastBacHTa로 복제 하는 전체 길이 IKK1 태그. 태그는 TEV 프로 테아 제 소화에 의해 제거 될 수 있습니다. 전체 길이 IKK1/α 양쪽 끝에 유연한 영역이 있기 때문에 유연한 영역 일반적으로 렌더링 단백질 구체화 하기 어려운, 우리 IKK1/α pFastBacHTa 벡터의 상술 사이트 내에서 다양 한 잘린된 조각 복제. IKK1/α의 다양 한 잘림 돌연변이 야생-타입 (wt)와 S176E, 180E 생성 된 (EE) 백본. IKK1/α EE phosphorylated 키의 constitutively 활성 폼의 모방을 말합니다. 단백질 표정과 재조합 잠재 생산 이전에 게시 프로토콜을 사용 하 여 약간 수정43 (그림 1)을 수행 했다.

IKK1/α 결정 화에 어려움
인간 IKK2/β와 IKK1는 동종, 우리는 여러 다른 조건 하에서 인간 IKK2/β의 다른 버전을 구체화 수 때문에, 우리는 비슷한 전략을 사용 하 여 비슷한 조건에서 구체화 하 IKK1/α 예상. 그러나, 여러 다른 IKK1 이체와 광범위 한 실험 후 우리가 얻은 하나만 잘린된 구문 (IKK1 10-667 EE)와 크리스탈 (그림 2), 그리고 또한만 IKK 억제제 XII44 적합 한 표시는 존재 X 선 회절 속성입니다.

구조 솔루션
IKK1/α 결정에서 많은 성장 문제, 고통 및 데이터는 종종 매우 높은 mosaicity를 표시. 약한 크리스탈 포장 콘텐츠에 연결 된 큰 용 매 그리고 IKK1 단위체 또는 이합체의 동적 특성은 뒤에 가능성이 이유. 이러한 문제를 회피, 근 면 한 노력 했다 최상의 가능한 결정을 얻을 그리고 다양 한 조건 하에서 최대한 배려와 다양 한 곳을 알아내는-방부 버퍼 cryo 보전 절차 수행 했다. 데이터 또한 궁극적인 정밀 빔 피해를 최소화 하기 위해 수집 되었다. 이후 결정 했다 큰 (큰 개의 차원 자주 초과 400 미크론), 같은 결정의 다른 지역 여러 데이터 집합을 수집 하는 x 선 빔에 노출 되었다. 이 확장할 수 고 높은 중복 합리적으로 완전 한 데이터 집합을 서로 다른 데이터 집합을 사용 하 고 오류를 최소화. 젖어 무거운 원자, 또는 무거운 원자 클러스터 (예를 들어, TaBr 및 탐), 부적당 하 게 diffract를 결정 한. 비록 우리가 파생 데이터에 TaBr 클러스터의 위치를 찾을 수 있습니다, 비-isomorphocity 뿐만 아니라 데이터의 품질이 작은 경우, 위상 정보 제공.

우리는 다양 한 사용할 수 있는 매개 변수를 사용 하 여 HKL2000로 데이터 집합 처리. 회절 패턴 공개 결정 단위 세포 크기, 공간 그룹 P21 에 속한다는 = 174.51, b 186.94, c = = 275.83 Å, β = 98.84도. 주로 내가 사용 / σ는 컷오프를 추정 하 고 테스트 데이터 집합에 대 한 다양 한 컷-오프. 우리는 4.5 Å 해상도 4 회절 데이터의 7 세트에서에서 한 크리스탈에 수집의 병합 된 데이터 세트를 얻었다. 우리는 최종 밀도 지도의 시각적 검사에서 4.5 Å까지 데이터를 계속 하기로 결정 했습니다. 그것은 이후 우리가 분석 참조 *45를 사용 하 여 진정한 (보통 unmeasurable) 농도 대 한 병합 된 집합의 CC를 예상할 수 있는 CC1/2를 사용 하 여 가치가 있을 수 있습니다. 공간 그룹의 낮은 대칭 결합 큰 단위 세포, 때문에 우리는 용 매의 증기압의 70% ~ 40%에 따라 12 ~ 24 분자를 포함 하는 비대칭 단위 예상.

낮은 해상도 약한 농도 (즉, 중요 한 데이터의 오류를에서)와 x-선 데이터의 결합된 효과 (그림 3), 비대칭 단위, 및 IKK1 단위체 dimeric 모델의 구조적 변화에 IKK1 분자의 많은 수 (12) 알려진된 IKK2에 비해 모델, 처음 방해 분자 대체 솔루션 IKK1, 및 이렇게 그것의 구조를 결정에서 우리.

IKK1/α 및 IKK2/β 키 도메인 (KD), 유비퀴틴-같은 도메인 (자민련), 및 비 계는 나선형 이합체 화 도메인 (SDD) 포함 되어 있습니다. IKK1의 구조는 SDD의 원심 영역의 거의 동일한 간 소 단위 인터페이스를 활용 하 여 유사 하 게 IKK2 이합체 형성을 밝혔다. 그러나, IKK1 이합체의 N 맨끝 KD SDD + 자민련 알려진된 IKK2 이합체에 그에 비해 상대적으로 크게 다른 상대 위치 표시. 다른 IKK2 구조는 이전 39와 61 Å 사이 다양 한 4 개의 다른 이합체 모델에서 두 개의 KD에서 P578의 알파 탄소 간의 거리는 그것의 이합체 (그림 4패널), 내에서 다른 intermonomer 방향 표시. 이러한 두 kinases의 시퀀스는 매우 유사 잔류물 이합체 인터페이스에 동일 이기 때문에, 우리는 IKK1/α; 비슷한 이합체 형성 예상 그러나, 이후 KD-SDD 인터페이스의 잔류물에 중요 한 차이가 있다 (예를 들어, W424 및 IKK2에 F111은 V P 각각), 우리 IKK1에서 아마도 아직 다른 KD 방향 예상. 실제로, IKK1/α 구조 표시 SDD에 KD의 관련된 방향 고유, 그리고 그것은 IKK2/β의 모든 알려진된 모델에서 일탈 한다. 백 이합체 초과 모델 프로그램에서 페이저, MOLREP, CNS 분자 대체 시험, 특히 우리의 저해상도 데이터의 성공에 대 한 보다 정확한 검색 모델에 대 한 필요성을 나타내는 어떤 성공도 없이 검색 모델로 사용 되었다. 단량체 모델 12 단위체를 포함 하는 큰 비대칭 단위의 약한 회절 데이터에 어떤 해결책 든 지 데리 러 너무 작은 질량은 이다. 또한, 포함 또는 물 검색 모델에서의 누락에는 분자 교체 검색에 차이가 특히 약한 회절 데이터 때문에 했다. CC1/2 및 참조 * 4.5 Å 데이터는 매우 정확 하 게 나타냅니다. 4.5의 보수적인 해상도 잘라 사용에 따라 Å / 1.5 σ. 다른 해상도 컷-오프 데이터 집합은 분자 교체 검색 작업 동안 어떤 스 탁 차이 보여주지 않았다와이 데이터 집합에 대 한 세련 된 마지막 지도 해상도 확장 시 지도 기능에 어떤 뚜렷한 개선 보여주지 않았다 컷-오프. 모델의 최종 빌드 꽤 정확한 무엇 혼자, 밀도에서 건설 될 수 있었다 보다는 더 많은 고해상도 데이터를 초기 분자 교체 모델 모델에서 만들어진 이후 가능성이 파생 이며, 우리가 활용 하는 곳을 알아내는-EM 지도/밀도를 크로스-검사의 지도 분명 되지 않은 지역에 특히 지도 기능.

돌이켜보면, 유용한 검색 모델의 획득 낮은 해상도 cryo-EM 지도 및 IKK2 구조 (그림 4 의 높은 해상도에 따라 생성 될 수 있는 IKK1 도메인의 오히려 높은 정확도 모델 때문 에서만 가능 했다 패널 B)입니다. 우리는 비교적 가까운 이합체 모델을 얻으려면 IKK1의 cryo-EM 지도에 IKK1 도메인 독 수 있습니다. 초기 모델 표시 KD의 방향을 회전 약 24도 IKK2 단위체의 및 58의 N 맨끝 개통 Å (사이 이합체에 두 KDs의 P578). 우리의 사전 지식의 다른 IKK2/β 이합체 구조 (및 그들의 편차) 사용 a 검색 모델 30-62 Å. 사용 중 이합체 (여 52 Å) 사이 구멍을 변경 하 여 검색 모델을 세밀 하 게, 우리는 사용 하 여 비대칭 단위에 있는 6 이합체 MOLREP46프로그램입니다. 이러한 6 이합체 비대칭 단위에 2 개의 hexamers로 구성 되어 있습니다 그리고 계산 된 용 매는 68%의 볼륨.

Figure 1
그림 1: IKK1의 정화. (A) 식의 IKK1 (10-667) 곤충 세포에서. (B) IKK1;의 정화에 대 한 흐름 차트 (C)는 SDS 페이지 젤 Ni NTA 친화성 크로마토그래피 단계 후 IKK1의 순수성을 보여주는. (D) 크기-배제 프로 파일 IKK1의 이합체를 나타내는. (E) SDS 페이지 젤 피크 크기 제외 분수에서 IKK1의 순수성을 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: IKK1 결정의 크기와 형태. (A) IKK1의 크리스탈 구성 10-667; 결정 화 방울 또한 잘 diffract 하지 않습니다 어떤 다른 형태학 (얇은 판)의 결정을 보여줍니다. (B) 5 저쪽에 diffracted 크리스탈 보기 확대 Å. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3:. 결정학 데이터 IKK1 결정에서 얻은입니다. 전형적인 IKK1 결정의 가난한 회절 속성을 나타내는 IKK1 크리스탈의 (A)는 x 선 회절 프로필. (B) HKL2000 IKK1 구조 결정, 및 데이터의 중복 사용 하는 병합 된 데이터 집합의 크기 조정 통계입니다. 선형 R = SUM (ABS (I-< i >)) / 합계 (I), R 스퀘어 = SUM ((I-< i >) * * 2) 합계 / (나 * * 2), 치 * * 2 = SUM ((I-< i >) * * 2) / (오류 * * 2 * N / (N-1))), CC1/2 상관 계수, 참조 * = 진정한 농도 대 한 병합 된 데이터 집합의 상관 계수 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 검색 모델의 준비. (기한 다른 구분 2 KD); SDD 기준으로 KD의 다른 방향을 나타내는 IKK2 이합체의 다른 모델 (A) 이 모델은 어떤 성공도 없이 분자 대체 솔루션을 처음 테스트 되었습니다. (B) 세대의 IKK1 검색 모델-11 Å 해상도; IKK1 이합체의 Cryo-EM 지도 EM-지도 장착 초기 IKK1 검색 모델, 개별 도메인 기반 IKK2 모델 (4KIK); IKK1 검색 모델 더 미세 조정 (적절 한 KD 방향) 심판을 IKK2 모델에서 다양 한 가능성에 따라 4A; 위의 설명 EM-지도 중첩 모델 분자 대체 솔루션을 생성 하는 검색 모델을 장착. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

두 개의 관련된 IKK 단백질의 구조, 결정 화 및 생산 솔루션
우리 개념 그것은 비교적 간단한 운동 IKK2/β 단백질 생산, 결정 화, 및 구조 결정 우리의 경험을 주어진 것으로 IKK1/α의 x 선 결정 구조를 결정 하기 위해 밖으로 설정 합니다. 그러나, 우리가이 두 가지 관련된 단백질 결정의 용이성에 관한 매우 다르게 행동 매우 놀 랐 다. 여러 높은 프로 파일 실험실에서 노력에도 불구 하 고 IKK1 구조 결정 거의 2 년간 했다. 이 크게 몇 가지 주요 병목 현상에서 비롯 된.

첫 번째 어려움은 매우 순수 하 고 수용 성 단백질 양식을 했다. 곤충 세포 표현 시스템 밀리 그램 양의 합리적으로 수용 했다 순수 단백질을 얻기 위해 우리가 사용할 수 있습니다. 식의 수준에 관한 모든 IKK1/α 구문 IKK2/β 곤충 세포 식 시스템에서 구성 보다 훨씬 낮은 수준에서 표현. 어느 단백질은 가용성과 대장균에 표현 기능을 주목 한다. 에 곤충 셀 식 시스템, 10에서 30 mg/L의 구문에 따라 문화에 배열 했다 높은 수준에서 표현 하는 IKK2/β 파편. 반면, IKK1/α 구문 0.5 ~ 2.0 m g/L의 문화에만 생성 될 수 있습니다. 이 차이 위한 이유는 여전히 우리에 게 알려진 아니다. 우리는 또한 포스트 번역 상 수정 같은 자동-또는 trans-인 산화에서 일반적으로 발생 이후 특히 네이티브 호스트 셀 (즉, 포유류 IKK 단백질의 경우 포유류 overexpression 시스템), IKK1의 식을 시도해 IKK 원래 환경에 가장 효율적이 고 적절 하 게 발생 합니다. 포유류 세포의 대규모 문화에서 직접 IKK 복합물의 정화는 또한 현재 의무가.

IKK2/β와 함께 작업 하면서 ATP, 함께 치료 함으로써 균질 자동 phosphorylated 수 있습니다 그리고 이것은 단백질 결정 화 의무가 우리 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, ATP, IKK1 단백질의 부 화 및 결과 자동 인 산화는 수용 성, 그리고 생 화 확 적인 특성 및 결정 구조 결정에 적합 한 활성화 IKK1 나왔고.

미세 조정 결정 화 조건에 특히 적절 한 유형의 추가 및 Dextran 황산 분자의 농도를 잘 diffracting 결정을 얻기 위해 중요 한 단계가 이었다. 밀도 나타냅니다 바인딩된 Dextran 황산 분자, 그리고 IKK1에 그것의 결과 효과 가능성이 결정에 대 한 중요 한.

종종 kinases에서 관찰 된 IKK1의 고유의 유연성 결정 화에 대 한 기본 억지 이며 종종 참여 활성화 루프와 니 도메인에 연결 되어. 네이티브 (S177 및 S181)와 phosphomimetic (EE) 형태의 활성화 루프 serines IKK2 결정 될 수 있는, 하지만 우리만 IKK 억제제 XII의 존재에만 너무 EE 돌연변이 버전에 SS의 잘린된 IKK1/α와 크리스탈을 얻을. 이러한 결정 충분히 차가운 룸에서 재배 하는 경우에 구조 결정에 대 한 diffracted (4 ~-6 ° C). 우리가 어떤 IKK1 체 (또는 IKK ortholog)와 마찬가지로 고집 동작이 발생, 우리 (특히의 활성 사이트 루프 떠들고 잔류물 phosphorylated 일반적으로) 다양 한 백본 수정 시도할 수 있다. 우리는 또한 상호 작용 파트너 단백질의 존재에 공동 결정 화를 시도할 수 있습니다. IKK 가족의 그들을 포함 하 여 많은 kinases와 상위 단지 내에 있는 파트너 단백질 상호 작용.

여러 억제제 도움이 다양 한 조건에서 IKK2 결정 생산 (예를 들어, 모두 높은 소금,는 비례적으로 말뚝), 18 ° C에서, 그리고 차가운 방에. 그러나, 유사한 조건에서와 억제제의 다양 한, IKK1/α는 어떤 크리스탈을 생성 하지 않았다. 따라서, 억제제의 큰 레 퍼 토리를 사용 하 여 결정 화를 가능 하 게 하나를 찾는 기회 증가 확실히 것입니다.

구조 결정에서 또 다른 중요 한 단계가 이었다 주의 cryo-보존 및 데이터 수집 절차. 약한 데이터와 x-선 빔에서 결정의 급속 한 감퇴 큰 크리스탈과 같은 결정에서 여러 데이터 집합의 컬렉션에 대 한 필요성을 보증합니다. 높은 정확도의 합리적인 완전 한 데이터 집합, 없이 우리 수 분자 대체 솔루션을 얻기에 성공 하지.

마지막으로, 우리 공공 데이터베이스에 사용할 수 있는 알려진된 IKK2/β 구조 모델에서 만든 100 개 이상의 모델을 사용 하 여 분자 교체에 의해 IKK1/α의 구조를 확인 하지 못했습니다. 따라서, 분자 교체 절차에 대 한 적절 한 모델을 취득 해야 했다. 곳을 알아내는-EM 지도, 높은 정확도의 비교 연구와 함께 개별 도메인의 구조 모델은 이전 IKK2 구조를 검색 모델을 우리에 게 분자 대체 솔루션을 가져온 우리가 주도 결정.

단백질의 결정 화는 본질적으로 무작위, 위의 구조적된 지도 따라에 불구 하 고 우리 다른 IKK1 체 또는 인간 IKK1의 다른 길이 또는 잘린 구문을 crystallizing에 문제에 직면 수 있습니다. 어쨌든, 중요 한 단계 지식을 잘 diffracting IKK 크리스탈을 얻기의 기회를 증가할 것 이다 합리적인 조건을 탐구 하는 연구원 수 있게 된다.

IKK1/α 및 IKK2/β 다른 우선 조직 하지만 비슷한 도메인 조직 표시
아니나 다를까, IKK1/α 및 IKK2/β 그들의 높은 시퀀스 유사성33,43에서 형태소 분석 하는 매우 비슷한 도메인 아키텍처를 채택 한다. IKK1/α와 IKK2/β 3 가지 도메인으로 접어 앞 표시: N 맨끝 키 도메인, 도메인 (자민련), 및 비 계 이합체 화 도메인 (SDD) 같은 유비퀴틴. IKK1/α와 IKK2/β는 안정적인 이합체를 형성 이합체 화에 참여는 SDD의 C-터미널. 이합체 형성에 관련 된 잔류물은 동일 합니다. 그러나, 이러한 다른 잔류물을 포함 SDD/자민련와 KD 간의 도메인 간 상호 작용은 다소 다르다. 이 또한 발생 키 도메인의 상대적 방향 IKK1/IKK2/β에는 다 α에 SDD를 합니다. 이 때문에 우리는 또한 사용 가능한 IKK2/β 이합체 모델 간의 차이 관찰 완전히 예기치 못한 되지 않았습니다. 흥미롭게도, IKK2/β 이합체가 tetramerization 성향 솔루션에서 약한 하더라도 결정 격자에서 tetramers로 구성할 수 있습니다. 그러나, IKK1/α 이합체 형성 고유 hexamers. 이 hexamers는 hexamers로 IKK1/α 이합체의 작은 수영장만 존재 하지만 솔루션,도 관찰 됩니다. 이 hexamerization 구체적이 고 중요 한 기능을가지고 것입니다 것이 좋습니다.

구조적 차이에서 차별화 기능 차이
IKK1/α 및 IKK2/β 세포에 고유한 기능을 수행합니다. 그러나, IKK1/α 기능과 구조 사이 관계는 애매 남아 있다. IKK1/α는 명확 하 게 다른 형태로 존재: 무료 이합체 또는 hexamer, 및 IKK2/β와 니 모는 지금까지 새롭거나 이종 삼합체 내. 이후 정식 신호에 의해 IKK2/β 활성화 IKK1/α를 필요로 하지 않습니다, heterotrimer (정식 IKK-복잡)에서 IKK1/α의 기능 역할 불분명 남아 있습니다. 그것은 또한 분명 IKK1/α 비정규 신호에 의해 유도 된 활성화 무료 dimeric IKK1/α hexameric IKK1/α에 의존 하는 경우. Mutational 실험 hexamer 인터페이스의 강하게 비정규 신호 영향을 공개, 이후 hexamerization 비정규 신호 하는 동안 어떤 단계에서 필수적인 것으로 가능성이 높습니다.

작은 분자 억제 물 IKK1/α 구조를 사용 하 여 설계
IKK1/α의 구조 조사 모노 머 또는 도메인 간 또는 간 단위체 인터페이스에서 주머니에 표면 패치 수 있습니다 알면, 어떤 작은 분자에 의해 대상 될 수 있습니다. IKKs 오랫동안 중요 한 약물 목표 간주 있다. 그러나, 다양 한 기능 세포 항상성, 면역, organismal 생존 능력 등에서 이러한 kinases 본성은 매우 어려운 그들을 대상으로 있습니다. 지금까지, 아니 IKK 대상 분자 환자에서 안전 하 게 사용할 수 있는 발견 되었습니다.

IKK1/α 및 IKK2/β는 종종 표적이 동시에 그들의 저 해제 이후 니 도메인의 순서와 구조에서 매우 비슷합니다. 상당한 연구 노력으로 이러한 두 kinases 중 하나만 대상으로 특정 억제제를 찾는 지출 되었습니다. 따라서, 여러 IKK2/β-특정 억제제 발견 되었습니다, 일부는 IKK1/α 기능에 영향을 주지 않습니다. 그러나, 우리의 상식으로 존재 하는 그런 화합물을 효과적으로 억제 IKK1/α perturbing IKK2/β 기능 없이. 이 부재 IKK1/α에 구조 정보 부족으로 표시 될 수 있습니다. 우리의 구조 및 세포 연구, 도메인 배열 및 글로벌 소 단위 구조는 매우 유사이 두 가지 단백질, 그들은 독특한 상위 준비 고용 특정 표면 패치33표시 나타냅니다. 관련 단백질 다른 상호 작용 수 있도록 이러한 차이 그들의 기능 차이로 번역 해야 합니다. 우리는 희망 IKK1/α와 IKK2/β 인테르-및 내부-소 단위 상호 작용 사이 밝혀 이러한 구분 소 단위 특정 allosteric 억제제를 만들기 위해 악용 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.

Acknowledgments

우리 직원을 beamlines 19ID, 24ID, 및 다양 한 결정에는 데이터 수집 중 지원에 대 한 고급 광자 소스, Lemont, 일리노이에서 13ID에 감사합니다. 우리는 우리 안에 지도/모델의 구축, 초기 IKK1 분자 대체 검색 모델을 구축 하는 데 사용 된 초기 단계에서 낮은 해상도 cryo-EM 지도 인출 하기 위한 드미트리 Lyumkis, 솔 크 연구소에 감사. 이러한 결과 연구 GG에 NIH 교부 금 AI064326, CA141722, 및 GM071862에서에서 자금 지원을 받고 있다. SP는 현재 Wellcome 신뢰 DBT 인도 중간 동료.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

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생화학 문제점 141 떠들고-트레오닌 단백질 키 니 아 제 IKK1/α NF-κB 결정 구조 분자 억제제
생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내
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Polley, S., Huang, D. B., Biswas,… More

Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

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