Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) is een Ser/Thr proteïne kinase dat in een horde van cellulaire activiteiten voornamelijk via activering van NF-recombination transcriptiefactoren betrokken is. Hier beschrijven we de belangrijkste stappen die nodig zijn voor de productie en de crystal structuurbepaling van dit eiwit.

Abstract

Een klasse van extracellulaire stimuli vereist activering van IKK1/α voor het opwekken van de generatie van een NF-recombination subeenheid, p52, door verwerking van haar voorloper p100. P52 fungeert als een homodimer of heterodimer met een ander NF-recombination subeenheid, RelB. Deze Dimeren reguleren op hun beurt de expressie van genen die betrokken zijn bij ontsteking, overleving van de cel en celcyclus honderden. IKK1/α blijft voornamelijk geassocieerd met IKK2/β en NEMO als een ternaire complex. Een klein zwembad voor het wordt echter ook als een laag molecuulgewicht complex(es) waargenomen. Het is onbekend of de p100 verwerking activiteit wordt geactiveerd door activering van IKK1/α binnen het grotere of het kleinere complex zwembad. Constitutieve activiteit van IKK1/α is geconstateerd in de verschillende vormen van kanker en ontstekingsziekten. Om te begrijpen van het mechanisme van activering van IKK1/α en het gebruik ervan als een drug target inschakelt, we recombinante IKK1/α uitgedrukt in verschillende hostsystemen, zoals E. coli, insect, en zoogdiercellen. Gelukt insect cellen, verkrijgen van mg hoeveelheden van zeer zuivere eiwitten, het kristalliseren in aanwezigheid van Remmers, en voor het vaststellen van zijn X-ray kristalstructuur uiting van oplosbare IKK1/α in baculovirus besmet. Hier beschrijven we de gedetailleerde stappen voor het produceren van de recombinant eiwit, haar kristallisatie en vastbesloten met X-ray kristal structuur.

Introduction

Transcriptionele activiteiten van de NF-recombination familie van dimeric transcriptiefactoren zijn vereist voor diverse cellulaire functies variërend van ontsteking en immuniteit tot overleving en dood. Deze activiteiten worden strikt gecontroleerd in cellen en een verlies van verordening leidt tot verscheidene pathologische condities, zoals auto-immune aandoeningen en kanker1,2,3. Bij het ontbreken van een stimulans, worden de activiteiten van NF-recombination geremde IκB (remmer van - recombination) eiwitten4bewaard. De fosforylatie van specifieke Ser residuen op IκB eiwitten markeert ze voor ubiquitination en aantasting van de latere remmen of selectieve verwerking5. Twee zeer homologe Ser/Thr kinases, IKK2/β en IKK1/α, fungeren als centrale regulatoren van NF-recombination activiteiten door het uitvoeren van deze fosforylatie gebeurtenissen6,7.

Interacties tussen een ligand en een receptor transduces een signaal door een reeks van bemiddelaars die leiden tot de activering van NF-recombination factoren. De NF-recombination seingeving proces kan globaal worden ingedeeld in twee afzonderlijke trajecten-canonieke en niet-canonieke (alternatieve)8. De activiteit van IKK2/β regelt voornamelijk de NF-recombination signalering van het canonieke leertraject dat essentieel is voor inflammatoire en aangeboren immuunresponsen9. Een duidelijk kenmerk van dit traject is een snelle en kortstondige activering van IKK2/β10 binnen een tot nu toe biochemically genfunctieonderzoek IKK complexe — geacht te worden samengesteld uit IKK1 en IKK2, evenals een regelgevende component, NEMO (NF-recombination essentiële Modulator )11,12,13. Tussen de twee katalytische IKK subeenheden van het complex IKK, IKK2 is voornamelijk verantwoordelijk14 voor de fosforylatie van bepaalde residuen van prototypische IκBs (α en -β, γ-) gebonden aan NF-recombination, en ook een atypische IκB eiwit, NF-κB1/p105, die een voorloper van de NF-recombination p50 subeenheid5. Fosforylering geïnduceerde ubiquitination en remmen de afbraak van IκB (of verwerking van p105) leidt tot de release en de activering van een bepaalde set van NF-recombination Dimeren15. Aberrant NF-recombination activiteit als gevolg van verkeerd gereglementeerde functie van IKK2 heeft waargenomen bij veel kankers zo goed zoals auto-immune aandoeningen2,3,16.

In tegenstelling tot IKK2/β regelt de activiteit van IKK1/α NF-recombination signalering van de niet-canonieke pathway, die essentieel is voor ontwikkeling en immuniteit. IKK1 kinaseenzym specifieke residuen van NF-κB2/p100 op haar C-terminal IκBδ-segment, wat tot de verwerking en de generatie van p52 leidt. De vorming van transcriptionally actieve p52:RelB heterodimer initieert een langzaam en duurzaam antwoord op ontwikkelingsstoornissen signalen7,17,18,19,20. Interessant, is de generatie van de centrale NF-recombination factor p52 van dit traject kritisch afhankelijk van een andere factor, NF-recombination inducerende Kinase (NIK)21,22, maar niet op IKK2 of NEMO. In rustende cellen blijft het niveau van NIK laag vanwege haar constante proteasoom-afhankelijke degradatie23,24,25. Bij stimulatie van cellen door 'niet-canonieke' liganden, en in bepaalde kwaadaardige cellen, NIK wordt gestabiliseerd te werven en te activeren IKK1 / α. Kinase activiteiten van zowel de IKK1 als de NIK zijn essentieel voor een efficiënte verwerking van p100 in p527. IKK1 en NIK phosphorylate drie serines (Ser866, 870 en 872) van NF-κB2/p100 op zijn segment van de C-terminal IκBδ wat leidt tot de verwerking en de generatie van p52. Aberrant activering van de niet-canonieke pathway heeft betrokken bij vele maligniteiten waaronder multiple myeloma26,27,28.

Verscheidene zeer efficiënte en specifieke remmers voor IKK2/β zijn bekend, hoewel niemand tot nu toe hebben bleek te zijn een effectieve drug. In tegenstelling, zijn IKK1/α-specifieke remmers schaars. Dit kan het gevolg zijn deels van ons gebrek aan structurele en biochemische informatieover IKK1/α, waardoor ons begrip van de mechanistische basis van activering van NF-recombination door IKK1 in cellen, en rationele drug design wordt beperkt. De X-ray structuren van IKK2/β voorzien ons van inzichten in het mechanisme van de activering van IKK2/β29; echter, deze structuren niet kon onthullen hoe verschillende upstream prikkels activeren activering van IKK1/α of IKK2/β voor het regelen van verschillende sets van NF-recombination activiteiten 30,31. Om te begrijpen de mechanistische basis ten grondslag liggen aan de duidelijke signaalfunctie van IKK1/α, en om een platform voor rationele drug design, we gericht op het bepalen van de structuur van IKK1/α.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van recombinante Virus geschikt voor grootschalige uitdrukking van IKK1/α

  1. P1 virus voorbereiding 32
    1. Dag 1: Plaat Sf9 cellen (~ 6 X 105) (passage nummer minder dan 10) in 2 mL van Sf900 III insect cel medium in elk goed voor een 6-well-plate en Incubeer bij 27 ° C. Passage van cellen wanneer ze een bevolkingsdichtheid van 2 tot 3 X 106 cellen per mL in suspensie bereiken door verder verdunnen in verse media bij een dichtheid van ~ 6 X 105.
    2. Dag 2: Verdun 8 µL van Sf9-transfectiereagens in 100 µL van Sf900 III of Grace Insect Medium zonder antibioticum en serum. Vortex kort.
    3. Verdunnen 1 µg kit-gezuiverd recombinant bacmid (details vindt u in 'De resultaten van de vertegenwoordiger')32 in een andere 100 µL van hetzelfde medium, in een aparte buis.
    4. Combineer verdunde DNA en transfectiereagens (totale volume ~ 210-220 μL), en Incubeer bij kamertemperatuur voor 15-30 min.
    5. Verwijder het medium van de put. Voeg 1 mL verse medium zonder antibioticum en serum.
    6. Voeg de verdunde DNA-transfectie reagens mengsel ontkleuring op de cellen. De daling van de grootte aanpassen zodat het niet Adherente cellen verjagen doet.
    7. Na ~ 6 h, voeg 1,5 mL verse medium bovenop of verwijderen van het medium en toevoegen van 2.5 mL verse voedingsbodem. Warme verse middellange tot 25-27 ° C vóór toevoeging.
    8. Incubeer de cellen bij 27 ° C. Controleer de putjes periodiek elke ~ 12 h voor tekenen van virale infectie. Uitvoeren van alle Sf9 onderhoud en expressie bij 27 ° C.
    9. Dag 5: Nemen het medium met cellen 60-72 h post infectie. Centrifugeer gedurende 5 min bij 500 x g- en 4 ° C. Sla het supernatant; Dit is het aandeel van de P1-virus. Bevriezen van kleine aliquots bij-80 ° C.
  2. Het selecteren van de beste uitdrukken P1 virus kloon.
    1. Plaat cellen op dezelfde manier zoals beschreven in stap 1.1.
    2. Volgende dag of ~ 6 h post plating, Voeg 20 µL en 50 µL van verschillende P1 kloon virusvoorraden op de cellen in verschillende putten.
    3. De Adherente cellen verjagen door zachte pipetteren en oogst van de geïnfecteerde cellen 60-72 h post infectie door centrifugeren voor 5 min bij 500 x g- en 4 ° C. Sla het supernatant. Dit is de P2 virus voorraad. Kleine porties van de opslag van de voorraad op-80 ° C.
    4. Voeg 100 µL van 2 x Laemmli SDS buffer aan de geoogste cel pellet. Warmte op > 95 ° C gedurende 10 min. Centrifuge (meestal > 10.000 x g) gedurende 5 minuten.
    5. 10-15 µL van elk monster op 8-10% SDS-pagina op 120-160 V uitgevoerd totdat de kleurstof voorzijde onderkant van de gel bereikt.
    6. Electro-overdracht de opgelost eiwitten door standaard semi-droge transfer protocol (20 V, 30-45 min) op een membraan van het Nitrocellulose/PVDF.
    7. Blot met anti-IKK1 antistof (verdunning ~ 1:2, 000, moet worden geoptimaliseerd) of anti-PentaHis antistof (verdunning ~ 1:3, 000, moet worden geoptimaliseerd) voor de expressie.
    8. Kies de beste P1 virus kloon door vergelijking van de expressie van recombinante IKK1.
  3. Voorbereiding van grootschalige P3 virus voorraad.
    1. Plaat cellen op dezelfde manier zoals beschreven in stap 1.1 in een 15 cm plaat met 25-30 mL van Sf900 III medium.
    2. ~ 6 h post beplating, 150-300 µL van het best waarin P1 virus materieel op de cellen toe te voegen.
    3. Na 72 uur post infectie, gecombineerd het medium zorgvuldig van de plaat in een geschikte buis (steriele) en centrifugeer de buis bij 500-1000 X g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De cel pellet gooien (als die er één is opgericht) en sla het supernatant. Dit is de P3 virus voorraad.
  4. Bepalen van de optimale virus titer voor grootschalige eiwit expressie
    1. De cellen van de plaat in 2 mL van Sf900 III medium, zoals beschreven in punt 1.1, in een 6-well-plate.
    2. Voeg toe 20, 30, 40 en 50 µL van P3 virus voorraad in aparte wells ~ 6 h post plating. Een niet-geïnfecteerde besturingselement opnemen.
    3. Oogsten van cellen uit elke goed 48-60 h post-infectie.
    4. Voeg 100 µL van 2 X Laemmli SDS buffer. Warmte op > 95 ° C gedurende 10 min. Centrifuge (doorgaans op 14.000 x g) gedurende 5 minuten.
    5. Oplossen van 10-15 µL van elk monster in een 8-10% SDS-pagina gel.
    6. Opgelost eiwit aan een membraan van het Nitrocellulose/PVDF overdragen, zoals vermeld in 1.2.6.
    7. Blot met anti-IKK1 antistof (verdunning ~ 1:2000, moet worden geoptimaliseerd) of anti-PentaHis antistof (verdunning ~ 1:3000, moet worden geoptimaliseerd).
    8. Het virus met de beste uitdrukken titer voor grootschalige expressies gebruiken.

2. grote schaal uitdrukking van 6 x-zijn gelabeld menselijke IKK129,33

  1. Uitvoeren van grootschalige expressie in de cultuur van een schorsing. Hiermee splitst u cellen in 1 L voor Sf900 III medium in een erlenmeyer van 2 L met een geventileerde cap. De celdichtheid dient ~ 5 x 105 cellen/mL.
  2. Groeien deze cellen in suspensie van ~ 100 toeren per minuut bij 27 ° C in een shaker ~ 2 dagen totdat een dichtheid van 1-2 x 106/mL is bereikt. Celdichtheid mag niet groter zijn dan 2 x 106/mL.
  3. Voeg de gewenste hoeveelheid P3 virus, dat wordt geraamd in 1.4.
  4. Groeien de besmette cultuur voor 48-60 h ~ 100 RPM bij 27 ° C in een shaker.
  5. Oogsten van cellen door centrifugeren op < 1.500 x g bij 4 ° C.
  6. Sla de cel pellet en negeren van het medium.
  7. Ga direct naar eiwitreiniging. Flash bevriezen de cel pellet in vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.

3. de zuivering van zijn-IKK133

  1. Op dag 1, resuspendeer de pellet cel in 40 mL lysisbuffermengsel (25 mM Tris pH 8.0, 0,2% NP-40, 200 mM NaCl, 10 mM imidazool, 10% Glycerol, 5 mM β-mercaptoethanol en proteaseinhibitor cocktail).
    Opmerking: De natte cel pellet massa was niet bepaald. ~ 2 L van cultuur werd meestal gebruikt voor deze stap.
  2. Lyse de cellen met het ultrasoonapparaat op 60-70% plicht cycles, 5-10 pulsen van 30 s duur met een tussenpoos van > 1 min, houden de celsuspensie gekoeld op ijs.
    Opmerking: Deze stap vereist optimalisatie met elk model van ultrasoonapparaat. Laat niet het monster opwarmen boven de 10 ° C.
  3. De lysate verduidelijken door centrifugeren bij ≥ 28.000 x g gedurende 45 min bij 4 ° C.
  4. Equilibreer 4 mL Ni-NTA Agarose hars met lysis-buffermengsel, en meng de geklaarde lysate (supernatant) volgens protocol van de fabrikant.
  5. Laat de eiwitten te binden de hars door gedurende 2 uur op een roterende mixer in een kamer van 4 ° C incuberen.
  6. De hars grondig wassen met de lysis-buffermengsel met 30 mM imidazool. Controleer de eiwitconcentratie in de Fractie van de wash periodiek via analyse van Bradford. Wassen totdat deze eiwitconcentratie in de wash-fractie 0,1 mg/mL tot. > 20 bed hoeveelheid-was buffer is meestal vereist om dit punt te bereiken.
  7. Elueer zijn-gelabeld IKK1/α eiwit onder zwaartekracht stroom, met behulp van 20 mL elutie buffer (de lysis-buffermengsel met 250 mM imidazol). 1-1.5 mL breuken te verzamelen.
  8. Controleer de zuiverheid van geëlueerd eiwit op een 8 of 10% gel voor SDS-pagina 5-10 μl van monster door uit te laden alle breuken gemengd met Laemmli buffer.
  9. Zwembad piek breuken (concentratie ≥ 2mg/mL) en meet eiwitconcentratie met behulp van de analyse van Bradford.
  10. Verteren met TEV (1:30-50 (TEV protease: IKK1)) protease's nachts (≥12 h) bij 4 ° C.
    Nota: Het bedrag van de TEV protease vereist voor optimaliseren (≥ 95%) vertering van de 6 X-Hsi tag een priorivoltooien. TEV protease werd gezuiverd in huis.
  11. Op de ochtend van dag 2, Incubeer het eiwit met 1 mM ATP in aanwezigheid van 20 mM MgCl2, β-glycerophosphate 20 mM, 10 mM NaF en 1 mM natrium orthovanadate gedurende 1 uur bij 27 ° C.
  12. Filtreer de oplossing van de eiwitten door een 0,45 of 0,22 μm-filter.
  13. Laden 6 mL van het monster op een ~ 120 mL preparatieve grootte-uitsluiting kolom op een geautomatiseerde vloeistofchromatografie-systeem is aangesloten. De kolom met Buffer A equilibreer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% Glycerol), voorafgaande aan het toepassen van de eiwitSteekproef.
    Opmerking: Een kleinere kolom kan worden gebruikt afhankelijk van de opbrengst van eiwit na de zuivering van de Ni-NTA-affiniteit. Aanpassen/belasting volume om 5% van kolom volume berekenen).
  14. De grootte-uitsluiting-chromatografie op een debiet van 1 mL/min uitvoeren en volgen van elutie op 280 en 254 nm. Verzamelen van fracties van 2 mL grootte.
  15. Controleren van de zuiverheid van de piek breuken (meestal rond de ~ 60-70 mL) op een 8-10% SDS-pagina gel.
  16. Zwembad de zuivere breuken (zuiverheid ≥95% met een concentratie van ≥0.5 mg/mL) en concentreren in een 10 kDa of 30 kDa molecuulgewicht cut-off centrifugaal eiwit concentrator na instructies van de fabrikant.
  17. Periodiek controleren eiwitconcentratie van het concentraat door de Bradford-methode, en concentreren van het monster tot 8-12 mg/mL.
  18. Afzien 25 μL aliquots en flash bevriezing in vloeibare stikstof. Deze flash bevroren monsters opgeslagen in de vriezer-80 ° C.

4. scherm voor kristallisatie conditie van IKK1

  1. Berekent het totale bedrag (in volume) van eiwit nodig is om te screenen op kristallen na de onderstaande methoden.
  2. Probeer verschillende remmers (generieke kinase remmers: AMPPNP en Staurosporine; IKK-specific remmers: MLN120B, Compound A en IKK-remmer XII) voor het uitvoeren van screening voor kristallisatie. Het maken van stamoplossingen van deze stoffen na instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de maximale concentratie van de stof in de stamoplossing niet hoger is dan 20 μM.
  3. De IKK:inhibitor complexe voorbereiden in het kristallisatie scherm door mengen 100 μM van IKK1 met 200 μM-remmer en Incubeer bij 18-20 ° C, voor 30-40 min. Centrifugeer dit mengsel op > 15.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Sla het supernatant voor kristallisatie scherm.
  4. Gebruik de verkrijgbare kristallisatie schermen (Zie de Tabel van de materialen).
  5. Pipetteer μL van de 80-100 van elke kristallisatie reagens (reservoir oplossingen), met behulp van een meerkanaalspipet of een robot, in het reservoir van een 96-wells-plaat. De plaat is nu klaar om in te stellen van druppels. Ervoor zorgen dat de plaat kristallisatie van 2 tot 3 druppels herbergt zodat remmers van 2 tot en met 3 kunnen worden vertoond in een enkele plaat.
  6. Met behulp van een robot kristallisatie, afzien en meng 0,2 – 0,25 μL van IKK1:inhibitor complex met dezelfde hoeveelheid reservoir oplossing.
    Opmerking: Screening kan worden uitgevoerd handmatig met behulp van grotere daling van de volumes (0.5-1.0 μL van IKK1:inhibitor complex met dezelfde hoeveelheid reservoir oplossing). Echter zou gebruik van een robot helpen besparen waardevolle reagentia.
  7. Verzegel de platen meteen na het instellen van de druppels met optisch duidelijk films om verdamping. Seal met behulp van goed passende applicator. Het maken van replica platen voor elke set van de Inhibitor van de omwenteling. Incubeer één plaat bij 18 ° C, en anderzijds op de koude kamer (temperatuur bereik ~ 4 – 6 ° C). Zorg ervoor dat starterscentra worden niet beïnvloed door trillingen.
  8. Gebruik een stereomicroscoop met een polarisator om uiterlijk van kristallen in elke daling elke dag voor de eerste zeven dagen, waarna langere tussenpozen te controleren. Systematisch opmerking en score van deze opmerkingen.
    Opmerking: Gebruik een stereomicroscoop met een polarisator zodat de groei defecten in kristallen visueel kunnen worden beoordeeld. Hier, verscheen kristallen in een staat waar de reservoir oplossing opgenomen 3% w/v Dextran sulfaat natrium zout Mr 5.000, 0,1 M BICINE pH 8,5, 15% w/v polyethyleenglycol 20.000. Kristallen van IKK1 groeide slechts in het bijzijn van IKK-remmer XII.

5. de kristalgroei optimalisatie29,33

  1. Voorbereiding van de stamoplossingen.
    1. 30% w/v oplossingen Dextran sulfaat met verschillende molecuulgewicht (Avg. MW 5.000, 8000, 15.000, 40.000 Da) in gedeïoniseerd H2O. Filter oplossing met behulp van 0,22 μm filters voor te bereiden.
    2. Bereiden van 1 M of 0,5 M voorraden van verschillende buffers in het pH-bereik van 6,5 tot en met 9. Filteren van oplossingen met behulp van 0,22 μm filters.
    3. Bereiden van 25% of 50% (m/v) PEG oplossingen met verschillende molecuulgewicht (Avg. MW:1000, 1.500 3.350, 4.000, 6000, 8000, 10.000, 12.000, 20.000 Da). Filteren van oplossingen met behulp van 0,22 μm filters.
    4. Een raster scherm uitvoeren door het systematisch variëren van pH, buffer type, concentratie en soort PEG zowel Dextran sulfaat.
  2. Optimaliseren screening zowel bij 18 ° C, en op de koude kamer (temperatuur bereik ~ 4-6 ° C).
  3. Meng een gelijke hoeveelheid van de complexe IKK1:Inhibitor met goed oplossing en incubeer ten opzichte van het goed oplossing in een gesloten omgeving. Deze stap kan handmatig worden uitgevoerd of met behulp van een verstrekking robot.
    Opmerking: Hier, de grootste en welomschreven kristallen (zoals beoordeeld door uniforme kleur onder de polarisator die uniforme groei aangegeven) werden verkregen onder de volgende voorwaarden: 100 mM BisTris pH 7.0, 2.8-3.5% Dextran sulfaat (gemiddelde MW 15 kDa), PEG 8.5-10%-20 kDa in de koelruimte.

6. het groeien van kristallen in grote aantallen

  1. De onderstaande voorraadoplossingen bereiden en filtreer hen door 0,22 μm filter.
    1. 0.5M BisTris pH 7.0, en BisTris propaan pH 7.0 en 7.5 voorbereiden.
    2. 30% (g/v) Dextran sulfaat (gemiddelde MW ~ 15 kDa) voor te bereiden. Bewaren bij 4 ° C.
    3. Bereiden van 50% PEG (gemiddelde MW ~ 12 kDa).
  2. Gebruik 24 goed opknoping drop platen.
  3. Breng Afdichtmiddelen vet op de verhoogde ringen van elk putje.
  4. Bereid de goed oplossing als volgt (eindconcentratie): 100 mM BisTris pH 7.0 – 7.5, 2.8 – 3,5% Dextran sulfaat ~ 15 kDa, 8,5 – 10% PEG ~ 12 kDa. Bereiden 1 mL goed oplossing 1,5 mL tubes.
    Opmerking: Een kleine variatie in kristallisatie voorwaarde werd waargenomen afhankelijk van de partij en/of eiwit, Dextran sulfaat, dus een proefversie van een smalle bandbreedte wordt aanbevolen. Zowel BisTris als BisTris propaan buffers van hetzelfde pH bereik opbrengst enkele kristallen.
  5. Houd het goed oplossingen en ingevette platen op de koude kamer gedurende ten minste 1 uur.
  6. Voorbereiden IKK1:Inhibitor complexe zoals beschreven in 4.3. Breng de goed oplossingen van 1,5 mL buizen aan de individuele putjes van de plaat voor 24 goed.
  7. Schoon gesiliconiseerd (commerciële of in-house (siliconization/silanization)) glazen cover slips met behulp van pluisvrije doekjes en hogedruk gelokaliseerd lucht jets met behulp van commercieel verkrijgbare aërosol stofdoek toe te passen.
  8. Plaats 1-1.5 μL van goed oplossing op een schone slip van de cover. Pipetteer gelijk volume IKK1:inhibitor complex, meng zachtjes op en neer waarbij 3 - 4 keer. Zet de glazen cover slip en plaats op de respectieve goed met een tang en verzegel de put door te drukken op het vet.
  9. Na het opzetten van alle de druppels van een 24-well-plaat, de plaat in de koude kamer in het donker uit te broeden. Af en toe controleren de druppels onder een Microscoop voor uiterlijk en groei van kristallen.
    Opmerking: Het is niet getest of het broeden van crystal platen onder de licht de uitkomst veranderen zou. Het is echter cruciaal, dat de platen worden geïncubeerd in een omgeving met minimale/Nee trillingen.

7. Cryo bescherming van kristallen

  1. Voorbereiding van cryo oplossingen.
    1. Bereiden Cryo A (~ 2% Dextran sulfaat, ~ 10% PEG 12000, 60 mM BisTris propaan (van de dezelfde pH als de beoogde goed oplossing), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 2,5% Glycerol).
    2. Bereiden Cryo B (~0.3% Dextran sulfaat, ~ 10% PEG 12000, 60 mM BisTris propaan (van de dezelfde pH als de beoogde goed oplossing), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 20 of 25% Glycerol of 20 of 25% ethyleen Glycol).
      Opmerking: Test verschillende cryo-protectants naast Glycerol en ethyleenglycol (b.v., PEG 200, 400 PEG, PEG MME 550, PEG 1000).
  2. Zachtjes verwijderen de glazen cover slip met het kristal en plaats deze op een effen oppervlak met de daling van de kristallen naar boven zijn gericht. Zachtjes Voeg 10 μL van Cryo A oplossing op de top van de daling, en zachtjes Meng door pipetteren zodat het kristal wordt niet geraakt.
    Opmerking: Dit reinigt het kristal oppervlak van puin en helpen equilibreer het kristal met de eerste cryo-buffer. Vermijd mechanische en thermische stress bij het kristal. Voer alle volgende stappen onder de Microscoop om te voorkomen dat schade aan het kristal.
  3. Langzaam Verwijder wat vloeistof uit het kristal en houd over 5-8 μL van de oplossing. Vermijden van uitdroging van het kristal. Nemen uiterste zorg om te voorkomen dat de mechanische belasting en uitdroging van de kristallen in alle opeenvolgende stappen.
  4. Zachtjes toevoegen van 2,5-4 μL van de Cryo B-oplossing op de daling, meng heel zachtjes door pipetteren. Bedek met een kleine petrischaal om directe luchtstroom over het kristal. 5 min. wachten voorzichtig altijd dat het kristal heeft niet te kampen snelle veranderingen van de osmotische druk of uitdroging.
  5. Herhaal stap 7.4 vier keer om te acclimatiseren langzaam het kristal in de cryo-oplossing.
  6. Houden van 10 – 20 μL van de cryo-oplossing in dit stadium (d.w.z., het toestaan van het kristal te worden gebaad in ongeveer 20-25% cryo-protectant met oplossing). Geniet voor verschillende perioden (5 min tot 1 h) in de uiteindelijke cryo-oplossing.
  7. Bevriezen meerdere kristallen op verschillende tijdstippen.
  8. Kies een enkele kristal vanuit naar de waterdruppel zorgvuldig in een passende cryo-lus gemonteerd op een goede basis en duik-freeze in vloeistof N2. Voer deze stap uit soepel en snel om te voorkomen dat ijsgang op de kristallen.
    Opmerking: Kies het kristal met behulp van een lus diameter iets groter dan de langste as van het kristal, zodat het kan worden gemonteerd in de robotachtige goniometer gebruikt in geavanceerde Photon bron, Argonne National Laboratory.
  9. Bewaar het kristal met cryo-lussen in pucks ondergedompeld in vloeibare N2. Bewaar deze pucks in vloeistof N2 Dewar kolf totdat ze gereed voor verzending voor röntgendiffractie op de synchrotron zijn. Ga verder met röntgendiffractie gegevensverzameling en -verwerking (artikelen 8 en 9).
    Opmerking: Diffractie gegevens van IKK1 kristallen uit huis X-ray bronnen waren niet hoog genoeg resolutie voor structuur vastberadenheid proeven, hoewel het de kwaliteit van de kristallen worden vertoond op de synchrotron aangegeven. Op verschillende straallijnen (voornamelijk 19ID) werden alle diffractie gegevens verzameld van de Advance Photon bron, Argonne National Laboratory, USA.

8. X-ray gegevensverzameling

  1. Röntgendiffractie gegevens op de beamline van de ID19 van de APS synchrotron source, met behulp van externe gegevens collectie software34verzamelen.
    Opmerking: Meer dan 100 kristallen werden getest voor hun diffractie eigenschappen. De kristallen routinematig eiwitkristallen naar een resolutie van 7-11 Å, slechts zelden kristallen die eiwitkristallen aan dan 5 Å werden waargenomen, en alleen één groot kristal eiwitkristallen buiten 4.5 Å. Aangezien de kristallen verval snel tijdens het verzamelen van gegevens, werden datasets in verschillende delen van het hetzelfde kristal verzameld. Dit was mogelijk omdat de kristallen groot waren (groter dan 400 µm), en de diameter van de lichtbundel gebruikt was 100 µm.

9. X-ray gegevensverwerking

  1. Samenvoegen alle datasets verzameld op verschillende delen van de dezelfde crystal34.
    Opmerking: zeven datasets werden samengevoegd uit het beste kristal en de resulterende gegevens was 93% voltooid. De totale ik / σ was ~ 6,8) en Rmerge werd 89% in de hoogste resolutie bin (5.4-4.5 Å).
  2. Proces datasets met HKL200034 te verkrijgen ruimtegroep, eenheid cel afmetingen, gehalte aan oplosmiddelen en plausibel samenstelling van de asymmetrische eenheid.

10. structuur oplossing

  1. Opstelling van zoek modellen
    1. Op basis van beschikbare structurele modellen van hIKK2 (VOB id 4E3C en 4KIK35), genereren een aantal Dimeren met verschillende oriëntaties van de N-terminale KD (dat maakt een opening van 30 en 62 Å, tussen de P578 van twee KD in het dimeer). Geen van deze modellen een moleculaire vervanging zoekoplossing opgehaald na uitgebreide proeven.
    2. Een kaart van IKK1 uit single-deeltje cryo-EM gegevens33genereren.
    3. Genereren van een model van menselijke IKK1 uit de hoogste resolutie structuur van IKK2 (VOB-id 4KIK).
    4. Het dok van de afzonderlijke domeinen van de menselijke IKK1 model in de cryo EM dichtheid kaart van menselijke IKK1 met behulp van COOT36. Dit de KD oriëntatie ongeveer 24 graden gedraaid en de N-terminal openen ~ 58 Å gewijzigd.
    5. De KD-oriëntatie van het model van de cryo-EM gemonteerd (het monomeer) toepassen op alle Dimeren gegenereerd in 10.1.1.
  2. Moleculaire vervanging
    1. Dimeren van 10.1.1 en 10.1.5 gebruiken als Zoek modellen in programma's PHASER37, MOLREP38 en CNS39,40.
      Opmerking: Hier, met behulp van een van de Dimeren van 10.1.5 (52 Å openen) als a Zoek model, zes Dimeren (twee hexamers) waren gevestigd in de asymmetrische eenheid met behulp van MOLREP. De 52 Å openen in het zoek-model is vergelijkbaar met de opening van de 49-50-Å van de Dimeren (alle zes Dimeren) in de verfijnde structuur.

11. structuur verfijning

  1. Structuur verfijning procedure
    1. Het oplossen van de afdrukstand en positie van dit eerste model door vastlichaam verfijning in CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Verfijn de structuur verder met behulp van minimalisering en Gesimuleerde annealing met een maximale kans op doel-functie en een plat bulk-solvent-correctie met behulp van de CNS systeem39,40.
    3. Bouw het model gebaseerd op 2FO-FC en Fo-Fc kaarten met behulp van Xtalview41.
      Let op: Aanvragen DEN-bijgewoonde verfijning42 en NCS beperken tijdens de verfijningen voor betere nauwkeurigheid van het model. Inderdaad, DEN verfijning drastisch verbeterd geometrieën en R-factoren van de structuur, en de R-factor was 22,2% en gratis R factor was 27,8% voor het uiteindelijke model. De dramatische verbetering van de gratis R moet te wijten zijn aan het model van de hoge nauwkeurigheid van IKK1 domeinen die zijn gegenereerd uit het IKK2 model (4KIK).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klonen en expressie van verschillende constructies van IKK1/α
Volledige lengte die menselijke IKK1/α werd gekloond in de baculovirus expressie vector pFastBacHTa binnen haar beperkingsplaatsen EcoRI en kennisgevingen te verkrijgen van een N-terminal hexa-Histidine gelabeld IKK1. De tag kan worden verwijderd door TEV protease spijsvertering. Aangezien volledige lengte IKK1/α flexibele regio's aan beide uiteinden bevat, en flexibele regio's meestal een eiwit bemoeilijken te kristalliseren, gekloond we verschillende afgeknotte fragmenten van IKK1/α binnen de bovengenoemde sites van pFastBacHTa vector. Verschillende truncatie mutanten van IKK1/α werden gegenereerd met wild-type (wt) én S176E, 180E (EE) backbones. IKK1/α EE verwijst naar de mimetische van de constitutively actieve vorm van de gefosforyleerd kinase. Recombinante baculovirus productie en eiwit expressie werden uitgevoerd met behulp van een eerder gepubliceerde protocol met kleine wijzigingen43 (Figuur 1).

Moeilijkheid in IKK1/α kristallisatie
Aangezien menselijke IKK2/β en IKK1 homologe zijn, en we kunnen verschillende versies van menselijke IKK2/β onder verscheidene verschillende omstandigheden kristalliseren, verwachtten we IKK1/α te kristalliseren in vergelijkbare omstandigheden met behulp van soortgelijke strategieën. Echter, na uitgebreide proeven met verschillende varianten van de IKK1, verkregen we kristallen met slechts één afgeknotte construct (IKK1 10-667 EE) (Figuur 2), en die ook alleen in de aanwezigheid van de IKK remmer XII44 die geschikt X-ray diffractie eigenschappen.

Structuur oplossing
IKK1/α kristallen leed aan talrijke problemen van de groei en de gegevens weergegeven vaak zeer hoge mosaicity. Zwakke crystal verpakking gekoppeld aan grote gehalte aan oplosmiddelen en de dynamische aard van de IKK1 monomeer/dimeer zijn de waarschijnlijke reden achter dit. Om deze problemen te omzeilen, nauwgezette inspanningen te verkrijgen van de beste mogelijke kristallen zijn genomen, en de cryo-behoud procedure werd uitgevoerd met de grootste zorg onder verschillende omstandigheden en met verschillende cryo-conserveermiddel buffers. De gegevens ook met ultieme precisie om te minimaliseren van de schade van de lichtbundel zijn verzameld. Aangezien de kristallen waren grote (grootste afmeting vaak meer dan 400 micron), werden verschillende gebieden van de dezelfde kristallen blootgesteld aan de X-ray-balk voor het verzamelen van meerdere datasets. Dit ingeschakeld verschillende datasets worden geschaald, en het verkrijgen van een redelijk compleet dataset met hogere redundantie en fouten tot een minimum beperkt. Soaking met zware atomen, of zware atoom clusters (bijvoorbeeld, TaBr en TAMM), veroorzaakt de kristallen op onvoldoende diffract. Hoewel we kunnen de positie van TaBr clusters in afgeleide gegevens hebt gevonden, betekent dit dat de slechte kwaliteit van de gegevens naast de niet-isomorphocity weinig of geen fase informatie verstrekt.

We verwerkt datasets met HKL2000 met behulp van de verschillende beschikbare parameters. Het patroon van de diffractie geopenbaard dat het kristal tot de ruimte groep P2,1 met eenheid cel afmetingen behoort, een = 174.51, b = 186.94, c = 275.83 Å en β = 98.84 graden. We gebruiken voornamelijk I / σ te schatten van de licht-donkerscheiding en getest diverse cut-offs voor de gegevenssets. We verkregen een samengevoegde gegevensset van 4.5 Å resolutie van 4 uit 7 sets van diffractie gegevens verzameld op één kristallen. We besloten om gegevens te bewaren tot 4.5 Å van visuele inspectie van de definitieve dichtheid kaart. Het kan zijn moeite waard om het gebruik van CC1/2, aangezien wij analytisch CC van de samengevoegde dataset tegen de ware (meestal onmeetbaar) intensiteiten met behulp van CC *45kunt schatten. Vanwege de grote eenheidscel gecombineerd met de lage symmetrie van de ruimtegroep, verwachten we de asymmetrische eenheid bevatten van 12 tot en met 24 moleculen op basis van een gehalte aan oplosmiddelen van 70% tot 40%.

Het gecombineerde effect van lage resolutie X-ray gegevens met zwakke intensiteit (dat wil zeggen, aanzienlijke fouten in gegevens) (Figuur 3), groot aantal (12) IKK1 moleculen in de asymmetrische unit en conformationele variatie van IKK1 monomeer/dimeric model in vergelijking met bekende IKK2 belet modellen, in eerste instantie ons van het verkrijgen van een moleculaire vervangende oplossing IKK1, en dus het vaststellen van de structuur.

IKK1/α en IKK2/β beide bevatten een kinase domein (KD), een ubiquitin-achtige domein (ULD) en een a-spiraalvormige steiger dimerisatie domein (SDD). De structuur van de IKK1 bleek dat het Dimeren ook aan IKK2 met behulp van een bijna identiek tussen subeenheid interface van het distale gebied voor SDD vormt. Echter weergegeven IKK1 dimeer een beduidend verschillend relatieve positionering van de N-terminale KD ten opzichte van de SDD + ULD vergeleken met die in de bekende IKK2-Dimeren. Verschillende structuren van de IKK2 eerder aangegeven verschillende intermonomer richting binnen zijn dimeren (Figuur 4deelvenster A), zodat de afstanden tussen de alpha koolstofatomen van P578 in de twee KD in vier verschillende dimeer modellen tussen de 39 en 61 Å varieerde. Aangezien de sequenties van deze twee kinases zeer vergelijkbaar zijn en residuen op het raakvlak van dimeer identiek zijn, verwacht we dat ikk1/α zou vormen een soortgelijke dimeer; echter, aangezien er aanzienlijke verschillen in de residuen van de KD-SDD-interface (bijvoorbeeld, W424 en F111 in IKK2 zijn V en P respectievelijk), we misschien toch verschillend KD in stand van een IKK1 verwacht. Inderdaad, IKK1/α structuur aangegeven dat de daarmee verband houdende richtsnoeren van KD aan SDD is uniek, en het wijkt af van alle bekende modellen van IKK2/β. Meer dan honderd dimeer werden modellen gebruikt als Zoek modellen in programma's PHASER, MOLREP en CNS zonder enig succes, met vermelding van de noodzaak voor een vrij nauwkeurige Zoek model voor het succes van moleculaire vervanging proeven, met name met onze gegevens met een lage resolutie. Een monomeer model heeft te weinig massa te halen van een oplossing in de zwakke diffractie-gegevens van de grote asymmetrische eenheid met 12 monomeren. Ook, de opneming of de nalatigheid van water in het zoek-model maakte geen verschil in moleculaire vervanging zoekopdrachten, met name vanwege de zwakke diffractie-gegevens. De CC1/2 en CC * geeft aan dat gegevens tot en met 4.5 Å is vrij nauwkeurig. We gebruikten een conservatieve resolutie cut-off van 4.5 Å gebaseerd op I / σ van 1,5. De datasets met verschillende resolutie cut-offs toonde geen enkel schril verschil tijdens moleculaire vervanging zoekbewerkingen en definitieve kaarten verfijnd tegen deze datasets toonde niet een duidelijke verbetering in kaartelementen op uit te breiden cut-offs. De definitieve versie van het model is vrij nauwkeurig, meer dan wat zou kunnen worden gebouwd van de dichtheid alleen, waarschijnlijk omdat de eerste moleculaire vervanging modellen werden gebouwd van modellen afgeleid met een hoge resolutie data, en wij gebruikt de cryo-EM kaart/dichtheid aan onderlinge toetsing van de kenmerken van de kaart, met name in gebieden waar de kaarten onduidelijk waren.

Achteraf gezien was de aanschaf van een nuttige zoek model mogelijk alleen vanwege de beschikbaarheid van de lage resolutie cryo-EM-kaart, en een vrij hoge nauwkeurigheid model van IKK1 domeinen die zouden kunnen worden gegenereerd gebaseerd op hoge resolutie IKK2 structuur (Figuur 4 Configuratiescherm B). We kunnen de IKK1 domeinen in de cryo-EM-kaart van IKK1 te verkrijgen van een redelijk nauwe dimeer model dok. Het eerste model aangegeven een oriëntatie van KD gedraaid ongeveer 24 graden ten opzichte van die van een monomeer IKK2 en N-terminal opening van 58 Å (tussen P578 van twee KDs in een dimeer). Onze voorafgaande kennis van verschillende IKK2/β dimeer structuren (en hun variatie) ons in staat gesteld om te fine-tunen van de zoek-model door het veranderen van de openingen tussen 30-62 Å. gebruik een van de Dimeren (52 Å openen) als a Zoek model, wij zes Dimeren gevestigd in de asymmetrische eenheid gebruiken programma MOLREP46. Deze zes Dimeren zijn onderverdeeld in twee hexamers in de asymmetrische eenheid, en de berekende oplosmiddel heeft een volume van 68%.

Figure 1
Figuur 1: zuivering van IKK1. (A) expressie van IKK1 (10-667) in insect cellen. (B) een stroomschema voor zuivering van IKK1; (C) een SDS-pagina gel voor het weergeven van zuiverheid van IKK1 na de Ni-NTA stap voor de chromatografie van de affiniteit. (D) grootte-uitsluiting profiel die aangeeft dimeer van IKK1. (E) SDS-pagina gel tonen zuiverheid van IKK1 van de piek grootte-uitsluiting breuken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: morfologie en de grootte van kristallen IKK1. (A) een kristal van IKK1 bouwen 10-667; de daling van de kristallisatie toont ook kristallen van een andere morfologie (dunne platen) die doen niet goed diffract. (B) in-of uitgezoomd met het oog op het kristal dat eiwitkristallen aan dan 5 Å. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3:. Kristallografische gegevens verkregen uit IKK1 kristallen. (A) An X-ray diffractie-Profiel van een IKK1-kristal die arme diffractie eigenschappen van typische IKK1 kristallen aangeeft. (B) HKL2000 schalen statistieken van de samengevoegde dataset gebruikt voor IKK1 structuurbepaling en redundantie van de gegevens. Lineaire R = som (ABS (I - < i >)) / som (I), R-kwadraat = som ((I - < i >) ** 2) / som (ik ** 2), Chi ** 2 = som ((I - < i >) ** 2) / (fout ** 2 * N / (N-1))), CC1/2 = correlatiecoëfficiënt, CC * = correlatiecoëfficiënt van samengevoegde dataset tegen echte intensiteiten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: opstelling van zoek modellen. (A) verschillende modellen van IKK2 dimeer met vermelding van de verschillende beleidslijnen van de KD ten opzichte van de SDD (die aanleiding geven tot verschillende scheiding tussen twee KD); Deze modellen werden in eerste instantie getest om te zoeken naar een oplossing van de moleculaire vervanging zonder enig succes. (B) generatie van IKK1 Zoek modellen - Cryo-EM kaart van IKK1 dimeer bij 11 Å resolutie; EM-kaart uitgerust eerste IKK1 Zoek model, afzonderlijke domeinen zijn gebaseerd op IKK2 model (4KIK); Een IKK1 zoeken model verder fine-getweaked (passende KD geaardheid) op basis van verschillende mogelijkheden zoals beoordeeld vanuit IKK2 modellen beschrijft hierboven in 4A; Superpositie van EM-kaart uitgerust model het zoek-model dat de moleculaire vervangende oplossing leverde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Productie, kristallisatie en structuur oplossing van twee verwante IKK eiwitten
We bepalen de X-ray kristalstructuur van IKK1/α met de gedachte dat het een relatief eenvoudige oefening gezien onze ervaring met IKK2/β eiwitproductie, kristallisatie en structuurbepaling zou zijn uiteengezet. Maar waren we zeer verrast dat deze twee verwante proteïnen heel anders met betrekking tot het gemak van kristallisatie gedragen. Ondanks pogingen van verschillende spraakmakende laboratoria nam de bepaling van de structuur van de IKK1 bijna twee decennia. Dit kwam grotendeels voort uit enkele grote knelpunten.

De eerste moeilijkheid was te verkrijgen van een zeer zuivere en oplosbaar eiwit vorm. Het insect cel expressie systeem konden we verkrijgen mg hoeveelheden pure eiwit dat redelijk oplosbaar was. Met betrekking tot het niveau van expressie, alle constructies van IKK1/α uitgedrukt op veel lagere niveaus dan IKK2/β in insect cel expressiesystemen construeert. Opgemerkt moet worden dat noch eiwit is oplosbaar en functionele als uitgedrukt in E. coli. In een insect cel expressie systeem, IKK2/β fragmenten uitgedrukt op hoog niveau die varieerden van 10 tot 30 mg/L cultuur afhankelijk van de constructies. IKK1/α constructies kunnen daarentegen worden gegenereerd alleen op 0,5 naar 2.0 mg/L van cultuur. De reden voor dit verschil is nog steeds onbekend voor ons. We moeten ook proberen uitdrukking van IKK1 in native gastheer cellen (dat wil zeggen, zoogdieren overexpressie systeem in geval van een zoogdieren IKK eiwit), vooral sinds de posttranslationele modificaties zoals auto - of trans-fosforylatie vaak voorkomen in IKK treedt meest efficiënt en naar behoren in zijn eigen omgeving. Zuivering van IKK complexen rechtstreeks van grootschalige cultuur van zoogdiercellen is ook op dit moment vatbaar.

Tijdens het werken met IKK2/β, merkten we dat het kan homogeen auto-phosphorylated door behandelen met ATP, en dit het eiwit vatbaar voor kristallisatie maakt. Ook leverde de incubatie van IKK1 eiwit met ATP, en de resulterende auto-fosforylatie, een geactiveerde IKK1 die oplosbaar en geschikt voor zowel Biochemische karakterisering en structuurbepaling van kristal was.

Een belangrijke stap om het verkrijgen van goed diffracting kristallen was te fine-tunen van de kristallisatie-voorwaarden, met name de toevoeging van het juiste type en concentratie van Dextran sulfaat moleculen. De dichtheid geeft aan afhankelijke Dextran sulfaat moleculen, en de daaruit voortvloeiende gevolgen daarvan voor IKK1 was waarschijnlijk cruciaal voor kristallisatie.

De inherente flexibiliteit van IKK1, die vaak in kinases wordt waargenomen, is de primaire afschrikking voor kristallisatie en is vaak gekoppeld aan de betrokkenheid van de kinase-domein met de activering lus. IKK2 met zowel native (S177 en S181) en phosphomimetic (EE) vormen van activering lus serines kon worden gekristalliseerd, maar we alleen kristallen met afgekapte IKK1/α van de SS naar EE mutant versie en die ook alleen in aanwezigheid van IKK remmer XII verkregen. Deze kristallen eiwitkristallen goed genoeg voor de structuurbepaling alleen als volwassen op de koude kamer (~ 4-6 ° C). Als we een evenzo koppige gedrag met een IKK1 homolog (of een ortholog IKK) tegenkomen, kunnen we proberen verschillende wijzigingen van de ruggengraat (met name voor de actieve site lus serine residuen die zijn vaak phosphorylated). We kunnen ook co-kristallisatie proberen in aanwezigheid van interagerende partner eiwitten. Vele kinases, waaronder die van de familie IKK interactie met partner eiwitten en verblijf op eersterangs complexen.

Verschillende remmers hielp produceren IKK2 kristallen in verschillende omstandigheden (bijvoorbeeldmet beide hoge zout, PEG als een neerslaande), zowel bij 18 ° C, en in de koelruimte. Echter, onder vergelijkbare omstandigheden en met een verscheidenheid van Remmers, IKK1/α deed niet produceren een kristal. Dus, het gebruik van een grotere repertoire van remmers zal zeker vergroot de kans dat het vinden van een waarmee kristallisatie.

Een andere belangrijke stap in structuurbepaling was de zorgvuldige cryo-behoud en gegevens verzameling procedure. De zwakke gegevens en het snelle verval van de kristallen in de X-ray-balk gerechtvaardigd de behoefte aan grotere kristallen en het verzamelen van meerdere data sets uit de dezelfde kristallen. Zonder een redelijke volledige dataset van hoge nauwkeurigheid, kon niet gelukt bij het verkrijgen van een moleculaire vervangende oplossing.

Tot slot, wij gefaald om te bepalen van de structuur van IKK1/α door moleculaire vervanging met behulp van meer dan 100 modellen gemaakt van bekende IKK2/β structurele modellen beschikbaar in de openbare database. Dus, het verkrijgen van een passende model voor een moleculaire vervangingsprocedure was een must. De cryo-EM-kaart, de structurele modellen van de hoge nauwkeurigheid van afzonderlijke domeinen, samen met vergelijkende studies van eerder vastgestelde IKK2 structuren leidde ons naar het verkrijgen van een model zoeken die ons de moleculaire vervangende oplossing hebt gehaald.

De kristallisatie van een eiwit is inherent willekeurig, dus ondanks het volgen van de bovenstaande gestructureerde begeleiding, we problemen kunnen in het kristalliseren van een andere IKK1 homolog of een ander full-length of afgekapte constructie van de menselijke IKK1. Ongeacht, zal kennis van deze kritische stappen een onderzoeker te verkennen rationele voorwaarden die verhoogt kansen op het verkrijgen van een goed diffracting IKK kristal inschakelen.

IKK1/α en IKK2/β weergeven soortgelijke domein organisatie maar andere interdomain organisatie
Niet verrassend, vast zowel IKK1/α en IKK2/β een zeer soortgelijk domein architectuur die voortvloeien uit hun hoge sequentie gelijkenis33,43. Zoals eerder aangegeven, zowel IKK1/α en IKK2/β Vouw in drie verschillende domeinen: N-terminale kinase domein, ubiquitin zoals domein (ULD) en steiger dimerisatie domein (SDD). Zowel IKK1/α en IKK2/β vormen stabiele Dimeren waarin het C-terminal de helft van de SDD dimerisatie deelnemen. Residuen die betrokken zijn bij de dimeer vorming zijn identiek. De Inter-Domain interacties tussen SDD/ULD en KD zijn echter enigszins verschillend, aangezien hierbij verschillende residuen. Dit veroorzaakt ook waarschijnlijk de relatieve stand van het kinase-domein naar de SDD in IKK1/α afwijken van die in IKK2/β. Dit was niet geheel onverwacht, aangezien wij ook verschillen tussen de beschikbare IKK2/β dimeer modellen observeren. Interessant, kunnen IKK2/β Dimeren onderverdelen in tetramers in een kristalrooster hoewel deze neiging tetramerization zwak in oplossing is. Echter gevormd IKK1/α Dimeren unieke hexamers. Deze hexamers zijn ook waargenomen in oplossing, hoewel er slechts een klein zwembad voor IKK1/α Dimeren bestaan als hexamers. Deze suggereren dat hexamerization dreigt te doen van een specifieke en essentiële functie.

Differentiatie van functionele verschillen van structurele verschillen
IKK1/α en IKK2/β vervullen verschillende functies in de cellen. De relatie tussen IKK1/α functie en structuur heeft echter bleef ongrijpbaar. IKK1/α duidelijk bestaat in verschillende vormen: als gratis dimeer of hexamer, en binnen een tot nu toe genfunctieonderzoek hetero-trimeer complex samen met IKK2/β en NEMO. Aangezien IKK2/β activering door het canonieke signalering geen IKK1/α vereist, blijft de functionele rol van IKK1/α in de heterotrimer (canonieke IKK-complex) onduidelijk. Het is ook onduidelijk als de activering van IKK1/α geïnduceerd door niet-canonieke signalering is afhankelijk van de vrije dimeric IKK1/α en/of hexameer IKK1/α. Aangezien vogelgriepvirus experimenten blijkt dat verstoring van de hexamer-interface sterk van invloed op niet-canonieke signalering, is hexamerization waarschijnlijk essentiële op een bepaald moment tijdens de niet-canonieke signalering.

Ontwerpen van klein molecuul remmers met behulp van IKK1/α structuur
Het kennen van de structuur van IKK1/α laat ons toe om onderzoeken oppervlak vlekken op een monomeer of zakken op Inter-Domain of inter monomeer interfaces, die kunnen worden gericht door kleine moleculen. IKKs hebben lang beschouwd als belangrijke drug targets. Echter maakt de Wezenlijkheid van deze kinases in allerlei functies waaronder cellulaire homeostase, organisch levensvatbaarheid en immuniteit het uiterst moeilijk te richten op hen. Tot nu toe heeft geen IKK-gerichte molecuul gevonden die veilig kunnen worden gebruikt bij patiënten.

IKK1/α en IKK2/β zijn vaak het doelwit gelijktijdig door hun remmers sinds hun kinase-domeinen zeer vergelijkbaar in de volgorde en structuur zijn. Aanzienlijke onderzoeksinspanning heeft besteed in het vinden van specifieke remmers gericht op slechts één van deze twee kinases. Daarom verschillende IKK2/β-specifieke remmers zijn ontdekt, waarvan sommige hebben geen invloed op IKK1/α-functie. Echter, om onze kennis geen dergelijke verbinding bestaat die effectief remt IKK1/α zonder storing veroorzaakt IKK2/β-functie. Deze afwezigheid kan worden toegeschreven aan het gebrek aan structurele informatie over IKK1/α. Onze structurele en cellulaire studies blijkt dat, hoewel domein regeling en globale subeenheid structuren zeer vergelijkbaar in deze twee eiwitten zijn, ze unieke eersterangs regelingen die specifieke oppervlakte patches33weergeven. Deze verschillen waarmee verschillende interacties met bijbehorende eiwitten moeten vertalen in hun functionele verschillen. We zijn hoopvol gestemd dat deze verschillen tussen de IKK1/α en IKK2/β inter - en intra-subunit interacties onthuld kunnen worden benut om de subeenheid-specifieke allosteric remmers maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Acknowledgments

Wij danken het personeel van de straallijnen 19ID, 24ID en 13ID bij de geavanceerde Photon bron, Lemont, IL, voor ondersteuning tijdens het verzamelen van de gegevens op verschillende kristallen. Wij zijn dankbaar aan Dmitry Lyumkis, Salk Instituut voor het ophalen van de lage resolutie cryo-EM kaart in vroege stadia van EM kaart/modelbouw, die werd gebruikt om de eerste IKK1 moleculaire vervanging zoeken model te bouwen. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van NIH grants AI064326, CA141722 en GM071862 naar GG. SP is momenteel een Wellcome Trust DBT India tussenliggende Fellow.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Tags

Biochemie kwestie 141 Serine-Threonine proteïne Kinase IKK1/α NF-recombination kristalstructuur moleculaire vervanging remmer
Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Polley, S., Huang, D. B., Biswas,… More

Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter