Summary
IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) è una proteina di Ser/Thr chinasi che è coinvolto in una miriade di attività cellulari principalmente attraverso l'attivazione di fattori di trascrizione NF-κB. Qui, descriviamo i principali passaggi necessari per la produzione e la determinazione di struttura di cristallo di questa proteina.
Abstract
Una classe di stimoli extracellulari richiede l'attivazione di IKK1/α per indurre la generazione di una subunità di NF-κB, p52, attraverso l'elaborazione del suo precursore p100. P52 funzioni come un omodimero o un eterodimero con un'altra subunità di NF-κB, RelB. Questi dimeri a loro volta regolano l'espressione di centinaia di geni coinvolti nel ciclo cellulare, la sopravvivenza delle cellule e l'infiammazione. IKK1/α rimane principalmente associato con IKK2/β e NEMO come un complesso ternario. Tuttavia, una piccola piscina di esso inoltre è osservata come un complex(es) di basso peso molecolare. Non è noto se l'attività di elaborazione p100 è attivato dall'attivazione di IKK1/α all'interno il più grande o più piccola piscina complessa. Attività costitutiva di IKK1/α è stato rilevato in diversi tumori e malattie infiammatorie. Per capire il meccanismo di attivazione di IKK1/α e consentirne l'utilizzo come un bersaglio di farmaci, abbiamo espresso IKK1/α ricombinante in sistemi host diversi, quali Escherichia coli, insetto e cellule di mammifero. Siamo riusciti a esprimere solubile IKK1/α in baculovirus infetta cellule di insetto, ottenere quantitativi di mg di proteina altamente pura, si cristallizzano in presenza di inibitori e determinare la sua struttura cristallina ai raggi x. Qui, descriviamo la procedura dettagliata per produrre la proteina ricombinante, sua cristallizzazione e sua determinazione di struttura di cristallo dei raggi x.
Introduction
Attività trascrizionali della famiglia di fattori trascrizionali dimerica NF-κB sono necessari per diverse funzioni cellulari, che vanno da infiammazione ed immunità alla sopravvivenza e morte. Queste attività sono rigorosamente controllate nelle cellule e una perdita di regolamento porta a varie circostanze patologiche, compreso i disordini autoimmuni e cancro1,2,3. In assenza di uno stimolo, l'attività di NF-κB sono tenute inibita di IκB (inibitore di-f-κB) proteine4. La fosforilazione di specifici residui di Ser IκB proteine marchia per ubiquitinazione e degradazione proteasomica successive o elaborazione selettiva5. Due altamente omologo Ser/Thr chinasi, IKK2/β e IKK1/α, agiscono come regolatori centrale delle attività di NF-κB effettuando questi eventi di fosforilazione6,7.
Interazioni tra un ligando e un recettore trasduce un segnale attraverso una serie di mediatori che portano all'attivazione di fattori di n-f-κB. Il processo di segnalazione di NF-κB possa essere classificato in due percorsi distinti – canoniche e non canoniche (alternativi)8. L'attività di IKK2/β regola principalmente la segnalazione di n-f-κB del pathway canonico che è essenziale per le risposte immunitarie infiammatorie e innata9. Una caratteristica distintiva di questa via è un'attivazione rapida e di breve durata di IKK2/β10 all'interno di un complesso di IKK finora biochimicamente atipici — presunto per essere composto di IKK1 e IKK2, nonché un componente regolamentazione, NEMO (n-f-κB modulatore essenziale )11,12,13. Tra le due subunità catalitiche IKK del complesso IKK, IKK2 è principalmente responsabile14 per la fosforilazione di specifici residui di prototipo IκBs (α, - β e γ-) associati a NF-κB e anche una proteina IκB atipica, NF-κB1/p105, che è un precursore della subunità p50 NF-κB5. Fosforilazione indotta ubiquitinazione e degradazione proteasomal di IκB (o elaborazione di p105) conduce al rilascio e attivazione di un set specifico di n-f-κB dimeri15. Attività di NF-κB aberrante a causa di cattiva regolazione funzione di IKK2 è stato osservato in molti cancri pure come in disordini autoimmuni2,3,16.
In contrasto con IKK2/β, attività di IKK1/α regola NF-κB segnalazione della via non canonica, che è essenziale per lo sviluppo e l'immunità. IKK1 fosforila residui specifici di NF-κB2/p100 sul relativo segmento C-terminale IκBδ, che conduce alla sua elaborazione e la generazione di p52. La formazione dell'eterodimero p52:RelB trascrizionalmente attiva inizia una risposta lenta e sostenuta a segnali dello sviluppo7,17,18,19,20. Interessante, la generazione del centrale p52 fattore NF-κB di questa via è criticamente dipendente da un altro fattore, n-f-κB inducendo chinasi (NIK)21,,22, ma non sul IKK2 o NEMO. Nelle cellule a riposo, il livello di NIK rimane basso a causa della sua costante degradazione proteasoma-dipendente23,24,25. Stimolazione delle cellule da ligandi 'non canoniche' e in alcune cellule maligne, NIK diventa stabilizzato per reclutare e attivare IKK1 / α. le attività della chinasi di NIK e di IKK1 sono essenziali per un'elaborazione efficiente di p100 in p527. IKK1 e NIK fosforilare tre serine (Ser866, 870 e 872), NF-κB2/P100 sul relativo segmento IκBδ C-terminale che porta l'elaborazione e la generazione di p52. Attivazione aberrante del pathway non canonico è stato implicato in molte malignità compreso il mieloma multiplo26,27,28.
Diversi inibitori altamente efficienti e specifici per IKK2/β sono noti, anche se nessuno finora si sono rivelati essere un farmaco efficace. Al contrario, gli inibitori IKK1/α-specific sono sparsi. Questo può derivare in parte dalla nostra mancanza di informazione strutturale e biochimica su IKK1/α, che limita la nostra comprensione della base meccanicistica dell'attivazione di NF-κB di IKK1 nelle cellule e progettazione razionale dei farmaci. Le strutture dei raggi x di IKK2/β ci ha fornito con intuizioni il meccanismo di attivazione di IKK2/β29; Tuttavia, queste strutture non ha potevano rivelare come i diversi stimoli a Monte innescare l'attivazione di IKK1/α o β/IKK2 regolare insiemi distinti di n-f-κB attività 30,31. Per capire la base meccanicistica sottostante la funzione di segnalazione distinta di IKK1/α e a istituire una piattaforma per la progettazione razionale dei farmaci, ci siamo concentrati sulla determinazione della struttura di IKK1/α.
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Protocol
1. preparazione del Virus ricombinante adatto a larga scala espressione di IKK1/α
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Preparazione di virus P1 32
- Giorno 1: Le celle di piastra Sf9 (~ 6 X 105) (passaggio numero meno di 10) in 2 mL di Sf900 III insetto medium cellulare in ciascuna di una piastra a 6 pozzetti ed incubare a 27 ° C. Cellule del passaggio quando raggiungono una densità di 2-3 X 106 cellule per mL in sospensione diluendo in media freschi ad una densità di ~ 6 X 105.
- Giorno 2: Diluire 8 µ l di reagente di Sf9-transfezione in 100 µ l di Sf900 III o di grazia insetto Medium senza siero e antibiotico. Vortice brevemente.
- Diluire 1 µ g di bacmid ricombinante purificato per kit (i dettagli sono forniti in 'Rappresentante risultati')32 in un altro 100 µ l del mezzo stesso, in un tubo separato.
- Combinare DNA diluito e reagente di transfezione (volume totale: ~ 210-220 µ l) e incubare a temperatura ambiente per 15-30 min.
- Rimuovere il supporto dal pozzo. Aggiungere 1 mL di terreno nuovo senza Antibiotico e siero.
- Aggiungere la miscela di reagente di transfezione del DNA diluita goccia a goccia sulle celle. Regolare la dimensione della goccia tale che esso non sloggiare le cellule aderenti.
- Dopo ~ 6 h, aggiungere 1,5 mL di terreno nuovo sulla parte superiore o rimuovere il mezzo e aggiungere 2,5 mL di terreno nuovo. Medium fresco caldo a 25-27 ° C prima dell'aggiunta.
- Incubare le cellule a 27 ° C. Controllare i pozzi periodicamente ogni ~ 12 h per segni di infezione virale. Effettuare tutte le Sf9 manutenzione ed espressione a 27 ° C.
- Giorno 5: Estrarre il mezzo che contiene cellule 60-72 h post infezione. Centrifugare per 5 min a 500 x g e a 4 ° C. Salvare il surnatante; Questo è lo stock di P1-virus. Congelare piccole aliquote a-80 ° C.
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Selezionando i migliori esprimendo clone di virus P1.
- Cellule di piastra similmente come descritto al punto 1.1.
- Successivo giorno o ~ 6 h, placcatura, aggiungere 20 µ l e 50 µ l di vari stock di clone virus P1 sulle celle in diversi pozzi.
- Sloggiare le celle aderenti pipettando delicato e raccogliere l'infezione di cellule infettate 60-72 h post mediante centrifugazione per 5 min a 500 x g e a 4 ° C. Salvare il supernatante. Questo è lo stock di virus di P2. Conservare le piccole aliquote dello stock a-80 ° C.
- Aggiungere 100 µ l di tampone x Laemmli SDS 2 per il pellet cellulare raccolto. Riscaldare a > 95 ° C per 10 min. centrifuga (in genere > 10.000 x g) per 5 min.
- Eseguire 10-15 µ l di ciascun campione in 8-10% SDS-PAGE a 120-160 V fino a quando la parte anteriore della tintura raggiunge il fondo del gel.
- Electro-trasferimento le proteine risolte da standard semi-dry transfer protocol (20 V, 30-45 min) su una membrana di nitrocellulosa/PVDF.
- Blot con anticorpi anti-IKK1 (diluizione ~ 1:2, 000, deve essere ottimizzato) o anticorpi anti-PentaHis (diluizione ~ 1:3, 000, deve essere ottimizzato) per l'espressione.
- Scegliere il miglior clone di virus P1 confrontando l'espressione di IKK1 ricombinante.
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Preparazione di stock di virus P3 su larga scala.
- Cellule di piastra similmente come descritto nel passaggio 1.1 in un piatto di 15 cm che contiene 25-30 mL di terreno di Sf900 III.
- ~ 6 h post placcatura, aggiungere 150-300 µ l di Best-Seller esprimenti stock virus P1 sulle celle.
- Dopo 72 h post infezione, aspirare il mezzo attentamente dalla piastra in un tubo adatto (sterile) e centrifugare la provetta a 500-1000 X g per 10 min a 4 ° C. Scartare il pellet cellulare (se uno è formato) e salvare il supernatante. Si tratta di stock di virus P3.
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Determinare il titolo di virus ottimale per l'espressione della proteina su larga scala
- Cellule di piastra in 2 mL di terreno di Sf900 III, come descritto in 1.1, in una piastra a 6 pozzetti.
- Aggiungere 20, 30, 40 e 50 µ l di P3 stock di virus in separato pozzi ~ 6 h post placcatura. Includere un controllo non infetto.
- Raccogliere le cellule da ogni infezione post di ben 48-60 h.
- Aggiungere 100 µ l di tampone di SDS di Laemmli X 2. Riscaldare a > 95 ° C per 10 min. Centrifugare (in genere a 14.000 x g) per 5 min.
- Risolvere il 10-15 µ l di ciascun campione in un gel di SDS-PAGE 8-10%.
- Trasferimento risolta proteina ad una membrana di nitrocellulosa/PVDF come accennato a 1.2.6.
- Blot con anticorpi anti-IKK1 (diluizione ~ 1: 2000, deve essere ottimizzato) o anticorpi anti-PentaHis (diluizione ~ 1: 3000, deve essere ottimizzato).
- Utilizzare il virus con i migliori esprimendo titre per le espressioni su larga scala.
2. su larga scala l'espressione di 6 x, la sua etichetta umana IKK129,33
- Eseguire su larga scala espressione in una coltura di sospensione. Dividere le celle in 1 L di medie Sf900 III in un matraccio di Erlenmeyer L 2 con un tappo di sfiato. La densità delle cellule dovrebbe essere ~ 5 x 105 cellule/mL.
- Crescere queste cellule in sospensione a ~ 100 rpm a 27 ° C in un agitatore per ~ 2 giorni fino a quando non raggiunge una densità di 1-2 x 106/ml. Densità delle cellule non deve superare 2 x 106/ml.
- Aggiungere la quantità desiderata di virus P3, come valutato in 1.4.
- Far crescere la cultura infettata per 48-60 h a ~ 100 rpm a 27 ° C in un agitatore.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a < 1.500 x g a 4 ° C.
- Salvare il pellet cellulare ed eliminare il prodotto.
- Procedere direttamente alla purificazione della proteina. Flash congelare il pellet cellulare in azoto liquido e conservare a-80 ° C per un uso futuro.
3. la purificazione della sua IKK133
- Il giorno 1, risospendere il pellet cellulare in 40 mL di tampone di lisi (25 mM Tris a pH 8.0, 0,2% NP-40, 200 mM NaCl, imidazolo di 10 mM, 10% glicerolo, 5mm β-mercaptoetanolo e inibitore della proteasi cocktail).
Nota: Il cella umida pellet massa non è stata determinata. In genere, ~ 2 L di cultura è stata utilizzata in questa fase. - Lisare le cellule di sonicazione a cicli di 60-70%, 5-10 impulsi della durata di 30 s ad un intervallo di > 1 min, mantenendo la sospensione cellulare refrigerati sul ghiaccio.
Nota: Questo passaggio richiede l'ottimizzazione con ogni modello di sonicatore. Non lasciate che il campione scaldare sopra 10 ° C. - Chiarire il lisato mediante centrifugazione a ≥ 28.000 x g per 45 min a 4 ° C.
- Equilibrare 4 mL di resina Ni-NTA agarosio con buffer di lisi e mescolare il chiarificato lisato (surnatante) seguendo il protocollo del produttore.
- Consentire la proteina associare la resina incubando per 2 h su un miscelatore rotante in una camera di 4 ° C.
- Lavare la resina con il buffer di lisi contenenti imidazolo di 30 mM. Controllare la concentrazione di proteina nella frazione di lavare periodicamente utilizzando analisi di Bradford. Lavare questa concentrazione di proteina nella frazione di lavare fino a 0,1 mg/mL. In genere il volume letto > 20 di tampone di lavaggio è necessaria per raggiungere questo punto.
- Eluire la proteina His-Tag IKK1/α sotto flusso di gravità, utilizzando 20 mL di tampone di eluizione (il buffer di lisi contenenti imidazolo 250 mM). Raccogliere le frazioni 1-1.5 mL.
- Verificare la purezza delle proteine eluite su un gel di SDS PAGE 8 o 10% di caricamento di 5-10 μL di campione da tutte le frazioni miscelate con tampone di Laemmli.
- Piscina frazioni di picco (concentrazione ≥ 2mg/mL) e misurare la concentrazione di proteina usando l'analisi di Bradford.
- Digerire con una notte di proteasi per il TEV (01:30-50 (TEV proteasi: IKK1)) (≥ 12 h) a 4 ° C.
Nota: Ottimizzare la quantità di proteasi TEV necessaria per completare la digestione (≥ 95%) di 6 X, la sua etichetta a priori. Proteasi TEV è stato purificato in casa. - La mattina del giorno 2, incubare la proteina con 1mm di ATP in presenza di 20 mM MgCl2, β-glicerofosfato di 20 mM, 10 mM NaF e orthovanadate del sodio di 1 mM per 1 h a 27 ° C.
- Filtrare la soluzione della proteina attraverso un filtro di 0.45 o 0,22 μm.
- Carico 6 mL del campione su una colonna di esclusione dimensionale preparativa ~ 120 mL collegata ad un sistema automatizzato di cromatografia liquida. Equilibrare la colonna con tampone A (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% glicerolo), prima di applicare il campione della proteina.
Nota: Una colonna più piccola poteva essere utilizzata a seconda del rendimento della proteina dopo la fase di purificazione di affinità Ni-NTA. Regolare/calcolare il volume di carico per essere il 5% del volume di colonna). - Eseguire la cromatografia di esclusione dimensionale ad una portata di 1 mL/min e monitorare eluizione a 280 e 254 nm. Raccogliere le frazioni di dimensione di 2 mL.
- Verificare la purezza delle frazioni picco (tipicamente intorno ~ 60-70 mL) su un gel di SDS-PAGE 8-10%.
- Piscina le frazioni pure (purezza ≥ 95% con una concentrazione di ≥0.5 mg/mL) e concentrare in un kDa 10 o 30 kDa concentratore centrifugo proteina di cut-off di peso molecolare seguendo le istruzioni del produttore.
- Periodicamente controllare la concentrazione nella proteina del concentrato con il metodo di Bradford e concentrare il campione fino a 8-12 mg/mL.
- Dispensare 25 μL aliquote e freeze flash in azoto liquido. Conservare questi flash campioni congelati nel freezer-80 ° C.
4. schermo per cristallizzazione condizione di IKK1
- Calcolare l'importo totale (in volume) di proteina necessaria allo schermo per cristalli seguendo i metodi descritti di seguito.
- Provare diversi inibitori (inibitori delle chinasi generico: AMPPNP e Staurosporine; IKK-specific inibitori: MLN120B, composto A e XII IKK-inibitore) per eseguire lo screening per la cristallizzazione. Rendere le soluzioni stock di questi composti seguendo le istruzioni del produttore. Assicurare che la massima concentrazione del composto nella sua soluzione di riserva non superi 20 μM.
- Preparare la IKK:inhibitor complesso per lo schermo di cristallizzazione di miscelazione 100 μM di IKK1 con inibitore di 200 μM e incubare a 18-20 ° C per 30-40 min. Centrifugare questa miscela a > 15.000 x g per 2 min a temperatura ambiente. Salvare il surnatante per schermo di cristallizzazione.
- Utilizzare le schermate di cristallizzazione commercialmente disponibili (Vedi la Tabella materiali).
- Pipettare 80-100 μL di ciascun reagente di cristallizzazione (soluzioni di serbatoio), utilizzando una pipetta multicanale o un robot, nel serbatoio di una piastra a 96 pozzetti. La piastra è ora pronta per impostare la pagina di gocce. Assicurarsi che la piastra ospita cristallizzazione di 2 o 3 gocce in modo che 2 o 3 inibitori possono essere proiettati in un'unica placca.
- Usando un robot di cristallizzazione, erogare e miscelare 0.2 – 0.25 μL di IKK1:inhibitor complesso con lo stesso volume di soluzione di serbatoio.
Nota: Lo Screening può essere eseguito manualmente utilizzando grandi volumi di goccia (0.5-1.0 μL di IKK1:inhibitor complesso con lo stesso volume di soluzione di serbatoio). Tuttavia, utilizzo di un robot sarebbe risparmiare preziosi reagenti. - Sigillare le piastre immediatamente dopo aver impostato le gocce con pellicole otticamente trasparenti per evitare l'evaporazione. Sigillare correttamente utilizzando appropriati applicatore. Fare tavole di replica per ogni set di inibitore. Incubare una piastra a 18 ° C e l'altro in camera fredda (temperatura ~ 4 – 6 ° C). Assicurarsi che gli incubatori non risentono delle vibrazioni.
- Utilizzare uno stereomicroscopio con un polarizzatore per verificare la comparsa di cristalli in ogni goccia ogni giorno per i primi sette giorni e poi a intervalli più lunghi. Sistematicamente nota e segnare queste osservazioni.
Nota: Utilizzare uno stereomicroscopio con un polarizzatore, in modo che i difetti di crescita in cristalli possono essere valutati visivamente. Qui, cristalli è comparso in una condizione dove la soluzione serbatoio conteneva 3% p/v Destrano solfato sodio sale Mr 5.000, 0,1 M pH BICINA 8.5, 15% w/v polietilenglicole 20.000. Cristalli di IKK1 è cresciuto solo in presenza di inibitore di IKK-XII.
5. cristallo crescita ottimizzazione29,33
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Preparazione delle soluzioni madri.
- Preparare 30% w/v soluzioni di Destrano solfato di diverso peso molecolare (medio a MW 5.000, 8.000, 15.000, Da 40.000) in deionizzata H2O. filtro soluzione utilizzando 0,22 μm filtri.
- Preparare 1 o 0,5 M scorte di diversi buffer nell'intervallo di pH di 6.5-9. Soluzioni utilizzando 0,22 μm filtri del filtro.
- Preparare il 25% o 50% (p/v) soluzioni di PEG di diverso peso molecolare (medio a MW:1000, 1.500, 3.350, 4.000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, Da 20.000). Soluzioni utilizzando 0,22 μm filtri del filtro.
- Eseguire una schermata di griglia variando sistematicamente pH, tipo di buffer, concentrazione e tipo di PEG e di solfato di destrano.
- Ottimizzare lo screening sia a 18 ° C e in camera fredda (temperatura ~ 4-6 ° C).
- Mescolare una quantità uguale della IKK1:Inhibitor complesso con soluzione bene e incubare sopra la soluzione bene in un ambiente sigillato. Questa operazione può essere eseguita manualmente o utilizzando un robot di erogazione.
Nota: Qui, i cristalli più grandi e ben definiti (come valutato dal colore uniforme sotto il polarizzatore che indicava una crescita uniforme) sono stati ottenuti le seguenti condizioni: 100mm BisTris pH 7.0, 2,8-3,5% di solfato di destrano (medio MW 15 kDa), 8,5-10% PEG 20 kDa nella stanza fredda.
6. cristalli nei grandi numeri in crescita
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Preparare le seguenti soluzioni stock e filtrarli attraverso filtro di 0,22 μm.
- Preparare 0,5 M BisTris pH 7.0 e BisTris propano pH 7.0 e 7.5.
- Preparare il 30% (p/v) solfato di destrano (medio MW ~ 15 kDa). Conservare a 4 ° C.
- Preparare 50% PEG (medio MW ~ 12 kDa).
- Utilizzo 24 ben appeso goccia piastre.
- Applicare sigillante grasso sugli anelli sollevati di ciascun pozzetto.
- Preparare la soluzione ben come segue (concentrazione finale): 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2.8 – 3,5% Destrano solfato ~ 15 kDa, 8,5 – 10% PEG ~ 12 kDa. Preparare 1 mL di soluzione ben in provette da 1,5 mL.
Nota: Una variazione minore in condizioni di cristallizzazione è stata osservata dipendendo il batch di proteina, e/o solfato di destrano, così una prova di una gamma stretta è raccomandata. Sia BisTris e BisTris buffer di propano dello stesso intervallo di pH resa monocristalli. - Mantenere le soluzioni ben e piastre unta in camera fredda per almeno 1 h.
- Preparare IKK1:Inhibitor complesso come descritto nel precedente paragrafo 4.3. Consente di trasferire i singoli pozzetti della piastra ben 24 le soluzioni bene da provette da 1,5 mL.
- Pulito siliconato (commerciale o in-House (siliconizzazione/silanizzazione)) vetrini coprioggetto utilizzando salviette panno di vetro e applicare getti di aria ad alta pressione ha individuato utilizzando spolverino aerosol disponibili in commercio.
- Posto 1 – 1.5 μL di soluzione ben su un vetrino pulito. Pipetta volume uguale di IKK1:inhibitor complesso, mescolare delicatamente pipettando su e giù 3 - 4 volte. Girare il vetro vetrini coprioggetto e posizionare sul rispettivo bene con forcipe e sigillare il pozzo premendo sul grasso.
- Dopo aver impostato tutte le gocce di una piastra a 24 pozzetti, incubare la piastra in camera fredda nel buio. Controllare visivamente le gocce sotto un microscopio per aspetto e crescita dei cristalli.
Nota: Esso non è stato testato se incubando piatti in cristallo sotto la luce sarebbe cambiare il risultato. È fondamentale, tuttavia, che le piastre vengono incubate in un ambiente con minimo/assenza di vibrazioni.
7. Cryo protezione dei cristalli
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Preparazione delle soluzioni di cryo.
- Preparare A Cryo (~ 2% Destrano solfato, ~ 10% PEG 12000, 60 mM BisTris propano (del pH stesso come la soluzione ben previsto), 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 2.5% glicerolo).
- Preparare Cryo B (~0.3% solfato di destrano, ~ 10% PEG 12000, 60 mM BisTris propano (del pH stesso come la soluzione ben previsto), 5 mM Tris-HCl pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 20 o 25% glicerolo o 20 o 25% glicole etilenico).
Nota: Test diversi cryo-protectants oltre a glicerolo e glicole etilenico (ad es., PEG 200, PEG 400, PEG MME 550 PEG 1000).
- Rimuovere il vetrino coprioggetto vetro contenente il cristallo delicatamente e posizionarlo su una superficie solida con la goccia di cristallo verso l'alto. Delicatamente aggiungere 10 μL di soluzione di Cryo A sopra la goccia e mescolare delicatamente pipettando affinché il cristallo non è toccato.
Nota: Questo pulisce la superficie di cristallo di detriti e contribuire a equilibrare il cristallo con il buffer di cryo iniziale. Evitare sollecitazioni meccaniche e termiche al cristallo. Eseguire tutti i passaggi successivi al microscopio per evitare di danneggiare il cristallo. - Lentamente togliere un po' di liquido dal cristallo e tenere circa 5-8 μL della soluzione. Evitare la disidratazione del cristallo. Prendere la cura estrema per evitare sollecitazioni meccaniche e disidratazione del cristallo in tutte le fasi successive.
- Delicatamente aggiungere 2,5 – 4 μL della soluzione di Cryo B sulla goccia, mescolare molto delicatamente pipettando. Coprire con un piccolo piatto di Petri per evitare il flusso diretto dell'aria sopra il cristallo. Attendere 5 min sempre attenti che il cristallo non subiscono rapidi cambiamenti di pressione osmotica o disidratazione.
- Ripetere il punto 7.4 quattro volte per acclimatare lentamente il cristallo nella soluzione di cryo.
- Mantenere 10 – 20 μL della soluzione di cryo in questa fase (cioè, consentire il cristallo essere inondata di circa 20 – 25% contenente soluzione di cryo-protectant). Ammollo per diversi periodi di tempo (5 min a 1 h) in cryo-soluzione finale.
- Congelare cristalli multipli a intervalli di tempo diversi.
- Scegliere attentamente un singolo cristallo dalla goccia in un appropriato cryo-ciclo montato su una vera e propria base e tuffo-freeze in liquido N2. Eseguire questo passaggio senza intoppi e in modo da evitare la formazione di ghiaccio sul cristallo.
Nota: Scegliere il cristallo utilizzando un anello di diametro leggermente più grande rispetto l'asse più lungo del cristallo, in modo che può essere montato nel goniometro robotico utilizzato nell'origine di fotone avanzate, Argonne National Laboratory. - Memorizzare il cristallo contenente cryo-loop in pucks immerso nel liquido N2. Conservare queste pastiglie in liquido N2 pallone Dewar finché non sono pronti per la spedizione per diffrazione dei raggi x al sincrotrone. Procedere alla raccolta dei dati di diffrazione di raggi x e l'elaborazione (articoli 8 e 9).
Nota: Dati di diffrazione dei cristalli di IKK1 da casa sorgenti di raggi x non erano abbastanza ad alta risoluzione per le prove di determinazione di struttura, anche se indicato la qualità dei cristalli che saranno proiettati presso il sincrotrone. Tutti i dati di diffrazione sono stati raccolti a diversi beamlines (principalmente 19ID) della fonte del fotone Advance, Argonne National Laboratory, USA.
8. raccolta di dati raggi x
- Raccogliere i dati di diffrazione a raggi x presso la beamline ID19 dell'origine sincrotrone APS, utilizzando dati remoti raccolta software34.
Nota: Verso l'alto di 100 cristalli sono stati testati per le loro proprietà di diffrazione. I cristalli diffratte ordinariamente a una risoluzione di 7-11 Å, solo raramente cristalli che diffratto per oltre 5 Å sono stato osservato e solo un grande cristallo diffratte oltre 4.5 Å. Poiché i cristalli decadde rapidamente durante la raccolta dei dati, sono stati raccolti i DataSet in diverse parti del cristallo stesso. Questo è stato possibile poiché i cristalli erano grandi (superiori a 400 µm), e il diametro del fascio utilizzato era 100 µm.
9. elaborazione dei dati raggi x
- Unire tutti i set di dati raccolti su diverse parti del cristallo stesso34.
Nota: sette set di dati sono state fuse da cristallo migliore e i dati risultanti erano completo al 93%. Nel complesso ho / σ era ~ 6.8) e Rmerge era 89% nella collocazione di risoluzione più alta (5.4-4.5 Å). - Set di dati di processo con HKL200034 per ottenere spazio group, dimensioni cella unità, contenuto di solventi e plausibile composizione dell'unità asimmetrica.
10. struttura soluzione
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Preparazione di modelli di ricerca
- Basato su modelli strutturali disponibili di hIKK2 (pdb id 4E3C e 4KIK35), generare una serie di dimeri con diversi orientamenti di KD del N-terminale (che esegue il rendering di un'apertura di 30 e 62 Å, tra P578 di due KD in dimero). Nessuno di questi modelli recuperati una soluzione di ricerca molecolare sostituzione dopo lunghe prove.
- Generare una mappa di IKK1 da singola particella cryo-EM dati33.
- Generare un modello di IKK1 umana dalla struttura più alta risoluzione di IKK2 (pdb id 4KIK).
- Ancorare i singoli domini del modello umano IKK1 nella mappa di densità EM cryo di IKK1 umano utilizzando folaga36. Questo ruotato l'orientamento di KD circa 24 gradi e modificato il N-terminale di apertura a ~ 58 Å.
- Applicare l'orientamento di KD del modello cryo-EM montato (il monomero) a tutti i dimeri generati nella versione 10.1.1.
-
Sostituzione molecolare
- Utilizzare dimeri da 10.1.1 e 10.1.5 come modelli di ricerca in programmi PHASER37, MOLREP38 e CNS39,40.
Nota: Qui, utilizzando uno dei dimeri da 10.1.5 (52 apertura Å) come modello di ricerca a, sei dimeri (due esameri) si trovavano nell'unità asimmetrica utilizzando MOLREP. Il Å 52 apertura nel modello di ricerca è simile all'apertura di Å 49-50 dei dimeri (tutti i sei dimeri) nella struttura raffinata.
- Utilizzare dimeri da 10.1.1 e 10.1.5 come modelli di ricerca in programmi PHASER37, MOLREP38 e CNS39,40.
11. struttura raffinatezza
-
Routine di raffinatezza della struttura
- Difficoltà l'orientamento e la posizione di questo modello iniziale di raffinatezza di corpo rigido in CNS (cns_solve_1.3)39,40.
- Perfezionare la struttura ulteriormente utilizzando minimizzazione e ricottura simulata con una funzione di destinazione di massima verosimiglianza e una correzione di appartamento massa-solvente utilizzando la CNS sistema39,40.
- Costruire il modello basato su 2FO-FC e Fo-Fc mappe utilizzando Xtalview41.
Nota: Applicare DEN-assistita raffinatezza42 e NCS trattenere durante i perfezionamenti per una migliore precisione del modello. Infatti, raffinatezza DEN migliorato drammaticamente geometrie e R-fattori della struttura e il fattore R era 22,2% e gratuito R fattore era 27,8% per il modello finale. Il miglioramento drammatico della R gratuito deve essere a causa del modello di alta precisione di IKK1 domini che sono stati generati dal modello IKK2 (4KIK).
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Representative Results
Clonazione ed espressione di diversi costrutti di IKK1/α
Figura intera che umana IKK1/α è stato clonato nel baculovirus espressione vettoriale pFastBacHTa all'interno dei suoi siti di restrizione EcoRI e NotI per ottenere un N-terminale hexa-istidina etichetta IKK1. Il tag poteva essere rimossi da digestione della proteasi TEV. Poiché integrale IKK1/α contiene regioni flessibile su entrambe le estremità e regioni flessibili rendono solitamente una proteina difficili a cristallizzare, abbiamo clonato troncati vari frammenti di IKK1/α all'interno dei siti di cui sopra del vettore di pFastBacHTa. Vari mutanti di troncamento di IKK1/α sono stati generati con wild-type (wt) e S176E, 180E dorsali (EE). EE IKK1/α si intende la mimetica della forma costitutivamente attiva della chinasi fosforilata. Produzione di baculovirus ricombinanti e l'espressione della proteina sono stati eseguiti utilizzando un protocollo precedentemente pubblicato con modifiche minori43 (Figura 1).
Difficoltà nella cristallizzazione di IKK1/α
Poiché sono omologo umano IKK2/β e IKK1, e abbiamo potuto cristallizzare diverse versioni di umana IKK2/β sotto diverse condizioni, ci aspettavamo IKK1/α a cristallizzarsi in condizioni simili, utilizzando strategie simili. Tuttavia, dopo estese prove con diverse varianti di IKK1, abbiamo ottenuto cristalli con un solo costrutto troncato (IKK1 10-667 EE) (Figura 2) e che anche solo in presenza della IKK inibitore XII44 che visualizzato adatto Proprietà di diffrazione di raggi x.
Soluzione di strutture
Cristalli di IKK1/α soffrivano di numerosi problemi di crescita, e i dati visualizzati spesso mosaicity molto alta. Imballaggio di cristallo debole associati con grande contenuto di solvente e la natura dinamica di IKK1 monomero/dimero sono il probabile motivo dietro questo. Per ovviare a questi problemi, scrupoloso impegno sono stati presi per ottenere i migliori cristalli possibili e la crioconservazione è stata eseguita con la massima cura in varie condizioni e con vari buffer di cryo-conservante. Sono stati inoltre raccolti con la massima precisione per minimizzare i danni del fascio. Poiché i cristalli erano grandi (più grandi dimensioni spesso superiore a 400 micron), diverse aree dei cristalli stessi sono stati esposti per il fascio di raggi x per raccogliere più set di dati. Questo abilitato set di dati diversi per essere scalata e ottenere un dataset ragionevolmente completo con maggiore ridondanza e ridotto al minimo errore. Ammollo con atomi pesanti, o atomi pesanti cluster (per esempio, TaBr e TAMM), ha causato i cristalli per diffrangono insufficientemente. Anche se potevamo individuare la posizione di TaBr cluster nei dati derivati, la scarsa qualità dei dati oltre il non-isomorphocity fornito poco, se del caso, informazioni di fase.
Abbiamo elaborato i set di dati con HKL2000 utilizzando vari parametri disponibili. Il modello di diffrazione ha rivelato che il cristallo appartiene al gruppo spazio P21 con dimensioni di cella di unità, un = 174,51, b = 186.94, c = 275.83 Å e β = 98,84 gradi. Abbiamo usato principalmente I / σ per stimare il cut-off e testato vari cut-off per i set di dati. Abbiamo ottenuto un set di dati Unito di 4.5 Å risoluzione da 4 dei 7 set di dati di diffrazione raccolti su un cristallo. Abbiamo deciso di mantenere i dati fino a 4.5 Å da ispezione visiva della mappa densità finale. Può essere utile utilizzare CC1/2, dato che possiamo stimare analiticamente CC del dataset Unite contro le intensità (di solito non misurabile) vere usando CC *45. A causa della cellula di grande unità combinata con la bassa simmetria del gruppo spazio, abbiamo anticipato l'unità asimmetrica per contenere 12 a 24 molecole basate su un contenuto di solvente del 70% al 40%.
L'effetto combinato di bassa risoluzione dati radiologici con intensità debole (cioè, errori significativi nei dati) (Figura 3), grande numero (12) di molecole di IKK1 nell'unità asimmetrica e variazione conformazionale del modello monomerico/dimerica IKK1 rispetto al noto IKK2 modelli, inizialmente ci ha impedito di ottenere una soluzione di sostituzione molecolare IKK1 e determinando così la sua struttura.
IKK1/α e β/IKK2 entrambi contengono un dominio chinasi (KD), un dominio di ubiquitin-like (ULD) e un dominio di dimerizzazione di impalcatura a-elicoidale (SDD). La struttura del IKK1 ha rivelato che forma dimeri similmente a IKK2 utilizzando una quasi identica interfaccia inter-unità secondaria della regione distale del SDD. Tuttavia, IKK1 dimero visualizzato un posizionamento relativo significativamente differenti di KD N-terminale relativo SDD + ULD rispetto a quella nei noti IKK2 dimeri. Diverse strutture di IKK2 indicato prima intermonomer diverso orientamento all'interno della sua dimeri (Figura 4Pannello A), in modo che le distanze tra i carboni alfa di P578 in due KD in quattro modelli differenti dimero ha variato fra 39 e 61 Å. Poiché le sequenze di queste due chinasi sono molto simili e residui all'interfaccia del dimero sono identici, abbiamo anticipato che ikk1/α sarebbe formare un dimero simile; Tuttavia, poiché ci sono differenze significative nei residui dell'interfaccia KD-SDD (ad es., W424 e F111 in IKK2 sono V e P rispettivamente), abbiamo anticipato forse un orientamento ancora diverso di KD in IKK1. Infatti, la struttura IKK1/α indicato che gli orientamenti correlati di KD per SDD è unico, e si discosta da tutti i modelli noti di IKK2/β. Oltre un centinaio dimero modelli sono stati usati come modelli di ricerca in programmi PHASER, MOLREP e CNS senza alcun successo, indicando la necessità di un modello di ricerca piuttosto accurate per il successo delle prove di sostituzione molecolare, soprattutto con i nostri dati a bassa risoluzione. Un modello di monomero ha massa troppo poco a prendere qualsiasi soluzione nei dati di diffrazione debole dell'unità asimmetrica grande contenente 12 monomeri. Inoltre, l'inclusione o l'omissione dell'acqua nel modello di ricerca ha fatto alcuna differenza nelle ricerche di sostituzione molecolare, soprattutto a causa dei dati di diffrazione debole. La CC1/2 e CC * indica che i dati fino a 4.5 Å sono abbastanza precisi. Abbiamo usato un cut-off risoluzione conservatore di 4.5 Å basata su I / σ di 1,5. I set di dati con diversa risoluzione cut-off non ha mostrato alcuna differenza stark durante le operazioni di sostituzione molecolare ricerca e mappe finale raffinate contro questi set di dati non hanno mostrato alcun miglioramento distinto in oggetti cartografici su estendendo ad alta risoluzione Cut-off. La build finale del modello è abbastanza precisa, più di quello che potrebbe essere costruito dalla densità da solo, probabilmente poiché i modelli di sostituzione molecolare iniziale sono stati costruiti da modelli derivati con un dati ad alta risoluzione e abbiamo utilizzato la mappa di cryo-EM/densità per Verifica incrociata le caratteristiche della mappa, soprattutto nelle regioni dove le mappe erano poco chiare.
Col senno di poi, l'ottenimento di un modello di ricerca utile era possibile solo a causa della disponibilità della mappa cryo-EM bassa risoluzione e un modello piuttosto elevata precisione di IKK1 domini che potrebbero essere generate basato su alta risoluzione IKK2 struttura (Figura 4 Pannello B). Abbiamo potuto dock i domini di IKK1 nella mappa cryo-EM di IKK1 per ottenere un modello di dimero ragionevolmente vicino. Il modello iniziale indicato un orientamento di KD ruotato circa 24 gradi rispetto a quella di un monomero di IKK2 e apertura del N-terminale di 58 Å (tra P578 di due KDs in un dimero). La nostra conoscenza delle differenti strutture di dimero di IKK2/β (e la loro variazione) ci ha permesso di perfezionare il modello di ricerca modificando le aperture fra 30-62 Å. usando uno dei dimeri (52 Å apertura) come un modello di ricerca, ci trova sei dimeri nell'unità asimmetrica utilizzando programma MOLREP46. Questi sei dimeri sono organizzati in due esameri nell'unità asimmetrica, e il solvente calcolato ha un volume del 68%.
Figura 1: purificazione di IKK1. (A) espressione di IKK1 (10-667) in cellule di insetto. (B) un diagramma di flusso per la purificazione di IKK1; (C) An SDS-PAGE gel risultati purezza di IKK1 dopo il passaggio di cromatografia di affinità Ni-NTA. Profilo di esclusione dimensionale (D) che indica dimero di IKK1. Gel di SDS-PAGE (E) risultati purezza di IKK1 dalle frazioni di esclusione dimensionale di picco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: morfologia e le dimensioni dei cristalli di IKK1. (A) un cristallo di IKK1 costruire 10-667; la goccia di cristallizzazione Mostra anche cristalli di un'altra morfologia (lamelle) che diffrangono non bene. (B) ingrandita in considerazione il cristallo che diffratto per oltre 5 Å. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Dati cristallografici ottenuti da cristalli IKK1. Profilo di diffrazione raggi x An (A) di un cristallo di IKK1 che indica proprietà di diffrazione poveri dei tipici IKK1 cristalli. (B) HKL2000 scala statistiche del dataset risultante utilizzato per la determinazione della struttura IKK1 e ridondanza dei dati. R lineare = somma (ABS (I - < i >)) / somma (I), Piazza R = somma ((I - < i >) * * 2) / somma (ho * * 2), Chi * * 2 = SUM ((I - < i >) * * 2) / (errore * * 2 * N / (N-1))), CC1/2 = coefficiente di correlazione, CC * = coefficiente di correlazione di dataset Unite contro vera intensità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: preparazione di ricerca modelli. (A) diversi modelli di dimero di IKK2 che indica diversi orientamenti di KD relativo SDD (dando luogo alla separazione diversa tra due KD); questi modelli sono stati testati inizialmente per trovare una soluzione di sostituzione molecolare senza alcun successo. (B) generazione di IKK1 modelli di ricerca - Mappa di Cryo-EM di IKK1 dimero a 11 risoluzione Å; EM-mappa montato modello iniziale di ricerca IKK1, singoli domini sono basati sul modello IKK2 (4KIK); Un IKK1 ricerca modello ulteriormente ottimizzato di multa (orientamento appropriato KD) basato su varie possibilità come giudicato dai modelli IKK2 descritto sopra in 4A; Sovrapposizione di EM-mappa modello per il modello di ricerca che ha reso la soluzione di sostituzione molecolare sfiancato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Soluzione di produzione, la cristallizzazione e la struttura delle due proteine IKK relative
Abbiamo precisato per determinare la struttura di cristallo dei raggi x di IKK1/α con la nozione che sarebbe stato un esercizio relativamente semplice, dato la nostra esperienza con la produzione della proteina IKK2/β, cristallizzazione e determinazione della struttura. Tuttavia, siamo rimasti molto sorpresi che queste due proteine correlate si comportavano in modo molto diverso per quanto riguarda la facilità di cristallizzazione. Nonostante gli sforzi da parecchi laboratori di alto-profilo, la determinazione della struttura di IKK1 ha preso quasi due decenni. Questo derivava in gran parte da pochi principali strozzature.
La prima difficoltà era quello di ottenere una forma proteica altamente puro e solubile. Il sistema di espressione delle cellule dell'insetto permesso di ottenere quantità di mg di proteina pura che era ragionevolmente solubile. Per quanto riguarda il livello di espressione, tutti i costrutti di IKK1/α espresso a livelli molto inferiori alla IKK2/β costruisce in sistemi di espressione in cellule di insetto. Si noti che nessuna delle due proteine sono solubile e funzionale quando espresso in Escherichia coli. In un sistema di espressione delle cellule dell'insetto, frammenti di IKK2/β espressi ad alti livelli ha variati da 10 a 30 mg/L di cultura a seconda i costrutti. Al contrario, costrutti IKK1/α possono essere generati solo a 0,5 a 2,0 mg/L di cultura. La ragione di questa differenza è ancora sconosciuta a noi. Dovremmo anche cercare espressione di IKK1 in cellule di host nativo (cioè, sistema di sovraespressione dei mammiferi in caso di una mammifera proteina IKK), soprattutto perché le modificazioni post-traduzionali quali auto - o trans-fosforilazione che si verificano comunemente in IKK verificherà più efficientemente e in modo appropriato nel suo ambiente nativo. Purificazione di complessi IKK direttamente dalla cultura su larga scala di cellule di mammifero è anche attualmente favorevole.
Mentre si lavora con IKK2/β, abbiamo notato che può essere auto-fosforilato in modo omogeneo trattando con ATP, e questo rende la proteina suscettibili di cristallizzazione. Allo stesso modo, l'incubazione della proteina di IKK1 con l'ATP e la conseguente auto-fosforilazione, ha reso un IKK1 attivato che era solubile e adatto sia per caratterizzazione biochimica e determinazione della struttura di cristallo.
Un passaggio fondamentale per ottenere cristalli ben diffrangano era di mettere a punto le condizioni di cristallizzazione, in particolare l'aggiunta del tipo appropriato e la concentrazione di molecole di solfato di destrano. La densità indica associati molecole di solfato di destrano e suo effetto risultante sul IKK1 era probabile critico per cristallizzazione.
La flessibilità intrinseca di IKK1, che è spesso osservata in chinasi, è il principale deterrente per cristallizzazione ed è spesso legata al fidanzamento del dominio chinasi con il ciclo di attivazione. IKK2 con sia native (S177 e S181) e phosphomimetic (EE) forme di serine ciclo di attivazione potrebbe essere cristallizzato, ma abbiamo ottenuto solo cristalli con troncata IKK1/α degli SS a versione mutante EE e che anche solo in presenza di inibitore IKK XII. Questi cristalli diffratte abbastanza bene per la determinazione della struttura solo se coltivate in ambiente freddo (~ 4-6 ° C). Se incontriamo un comportamento allo stesso modo ostinato con qualsiasi omologo di IKK1 (o un ortholog IKK), possiamo provare varie modifiche di spina dorsale (soprattutto dei residui di serina del ciclo sito attivo che comunemente vengono fosforilate). Possiamo anche provare co-cristallizzazione in presenza di proteine partner interagenti. Molte chinasi, compresi quelli della famiglia IKK, interagiscono con proteine partner e risiedono all'interno di complessi di alto ordine.
Diversi inibitori hanno contribuito a produrre cristalli di IKK2 in varie condizioni (ad es., con due sale alto, PEG come un precipitante), sia a 18 ° C e nella stanza fredda. Tuttavia, in condizioni simili e con una varietà di inibitori, IKK1/α non ha prodotto alcun cristallo. Pertanto, l'uso di un repertorio più ampio di inibitori certamente aumenterà le possibilità di trovare uno che permettono la cristallizzazione.
Un altro passo fondamentale nella determinazione della struttura era la crio-conservazione attenta e procedura di raccolta dati. I deboli dati rapido decadimento dei cristalli nel fascio di raggi x giustificato l'esigenza di più grandi cristalli e raccolta di più set di dati dai cristalli stessi. Senza un set di dati completo ragionevole di alta precisione, ci potremmo non sono riusciti a ottenere una soluzione di sostituzione molecolare.
Infine, non siamo riusciti a determinare la struttura di IKK1/α da sostituzione molecolare utilizzando più di 100 modelli realizzati da noti modelli strutturali IKK2/β disponibili nel database pubblico. Così, ottenendo un modello appropriato per una procedura di sostituzione molecolare era un must. La mappa di cryo-EM, modelli strutturali di alta precisione di singoli domini, insieme a studi comparativi di precedentemente determinato strutture IKK2 ci ha portato ad ottenere un modello di ricerca che ci ha recuperato la soluzione di sostituzione molecolare.
La cristallizzazione di una proteina è intrinsecamente casuale, quindi nonostante seguendo la guida strutturata sopra, potremmo affrontare problemi a cristallizzare un altro omologo di IKK1 o un altro costrutto troncato o full-length della IKK1 umana. Indipendentemente da ciò, conoscenza di questi passaggi critici consentirà un ricercatore per esplorare condizioni razionale che aumenteranno le probabilità di ottenere un cristallo IKK ben diffrangano.
IKK1/α e β/IKK2 visualizzare organizzazione di dominio simile ma differente organizzazione tra domini
Non sorprendentemente, sia IKK1/α e β/IKK2 adottare un'architettura altamente simile dominio derivanti dalla loro alta sequenza somiglianza33,43. Come indicato in precedenza, sia IKK1/α e β/IKK2 piegare in tre distinti domini: dominio chinasi N-terminale, ubiquitina come dominio (ULD) e il dominio di dimerizzazione dell'impalcatura (SDD). Sia IKK1/α e β/IKK2 formare dimeri stabile in cui il C-terminale metà del SDD partecipare dimerizzazione. Residui coinvolti nella formazione del dimero sono identici. Tuttavia, le interazioni di inter-dominio tra SDD/ULD e KD sono leggermente diverse, poiché questi coinvolgono i residui differenti. Questo anche probabilmente causato l'orientamento relativo del dominio chinasico di SDD in IKK1/α a differire da quello in IKK2/β. Questo non era totalmente inaspettato dato che osserviamo anche le differenze tra i modelli disponibili di dimero IKK2/β. È interessante notare che, dimeri di IKK2/β possono organizzare in tetrameri nella grata di cristallo, anche se questa propensione tetramerization è debole in soluzione. Tuttavia, dimeri di IKK1/α formano unico esameri. Questi esameri si osservano anche in soluzione, anche se solo una piccola piscina di dimeri di IKK1/α esiste come esameri. Questi suggeriscono che hexamerization rischia di avere una funzione specifica e critica.
Differenziando le differenze funzionali da differenze strutturali
IKK1/α e β/IKK2 eseguire funzioni distinte in cellule. Tuttavia, la relazione tra struttura e funzione IKK1/α è rimanere evasiva. IKK1/α chiaramente esiste in forme diverse: come dimero gratuito o hexamer e all'interno di un complesso etero-trimero finora atipico insieme IKK2/β e NEMO. Poiché l'attivazione di IKK2/β di segnalazione canonico non richiede IKK1/α, il ruolo funzionale di IKK1/α in eterotrimerica (canonico IKK-complesso) rimane poco chiaro. Non è inoltre chiaro se l'attivazione di IKK1/α indotto da segnalazione non canonico si basa sul libero dimerica IKK1/α e/o esamerica IKK1/α. Poiché mutational esperimenti rivelano che la perturbazione dell'interfaccia hexamer interessa fortemente segnalazione non canonico, hexamerization rischia di essere essenziale ad un certo punto durante la segnalazione non canonico.
Progettazione di piccole molecole inibitrici utilizzando struttura IKK1/α
Conoscendo che la struttura di IKK1/α ci permette di indagare le patch di superficie su un monomero o tasche alle interfacce di inter-dominio o Inter-monomero, che possono essere mirati di piccole molecole. IKKs lungamente sono stati considerati importanti bersagli. Tuttavia, l'essenzialità di queste chinasi in una varietà di funzioni tra cui l'omeostasi cellulare, attuabilità organismal ed immunità rende estremamente difficile da impostare come destinazione. Finora, nessuna molecola IKK-mirati è stata trovata che potrebbe essere utilizzato in modo sicuro in pazienti.
IKK1/α e β/IKK2 sono spesso bersaglio simultaneamente da loro inibitori poiché i loro domini chinasi sono altamente simili nella sequenza e nella struttura. Sforzo di ricerca considerevole è stato speso in ricerca di inibitori specifici di targeting solo uno di questi due chinasi. Di conseguenza, sono stati scoperti diversi inibitori specifici/β-IKK2, alcuni dei quali non influenzano la funzione IKK1/α. Tuttavia, a nostra conoscenza, nessun tale residuo esiste che efficacemente inibisce IKK1/α senza perturbare la funzione IKK2/β. Questa assenza potrebbe essere attribuita alla mancanza di informazioni strutturali su IKK1/α. I nostri studi strutturali e cellulari indicano che, sebbene la disposizione di dominio e strutture globali subunità sono altamente simili a queste due proteine, visualizzano unici significativi accordi impiegando superficie specifica patch33. Queste differenze che permettono diverse interazioni con proteine associate devono tradurre in loro differenze funzionali. Siamo fiduciosi che queste distinzioni ha rivelate tra l'IKK1/α e interazioni inter - e intra-subunità IKK2/β possono essere sfruttate per rendere subunità specifici inibitori allosterici.
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Disclosures
Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo il personale presso il beamlines 19ID, 24ID e 13ID alla Advanced Photon fonte, Lemont, IL, per il supporto durante la raccolta di dati su vari cristalli. Siamo grati a Dmitry Lyumkis, Istituto di Salk per noi il recupero la mappa di cryo-EM bassa risoluzione alle fasi iniziali di EM mappa/modello edificio, che è stato usato per costruire il modello di ricerca molecolare sostituzione IKK1 iniziale. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti da sovvenzioni NIH AI064326, CA141722 e GM071862 a GG. SP è attualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
| Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
| SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
| anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
| anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
| Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
| Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
| Compound A | Bayer | ||
| Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
| Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
| MLN120B | Millenium | Gift item | |
| AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
| Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
| Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
| PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
| Crystallization Screens | |||
| Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
| Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
| PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
| SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
| Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
| Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |
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