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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Um guia para a produção, cristalização e determinação da estrutura de IKK1 humana/α

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

I κB quinase 1/α (IKK1/α CHUK) é uma Ser/Thr proteína quinase que está envolvida em uma miríade de atividades celulares, principalmente através da ativação de fatores de transcrição NF-κB. Aqui, descrevemos as principais etapas necessárias para a produção e a determinação de estrutura de cristal desta proteína.

Abstract

Uma classe de estímulos extracelulares requer ativação de IKK1/α para induzir a geração de uma subunidade de NF-κB, p52, através do processamento de seu precursor p100. P52 funciona como um homodímero ou heterodímero com outra subunidade de NF-κB, RelB. Esses dímeros regulam, por sua vez, a expressão de centenas de genes envolvidos na inflamação, sobrevivência da pilha e ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente associado com IKK2/β e NEMO como um complexo ternário. No entanto, uma pequena piscina de também é observada como um complex(es) de baixo peso molecular. Desconhece-se a actividade de transformação de p100 é desencadeada por ativação de IKK1/α dentro a maior ou a menor piscina complexa. Atividade constitutiva de IKK1/α foi detectada em vários tipos de câncer e doenças inflamatórias. Para entender o mecanismo de ativação de IKK1/α e permitir a sua utilização como um alvo de drogas, manifestámos IKK1/α recombinante em sistemas de host diferentes, tais como Escherichia coli, inseto e células de mamíferos. Conseguimos expressar IKK1/α solúvel em baculovirus infectados células de inseto, obtenção de quantidades de mg de proteína altamente pura, cristaliza na presença de inibidores e determinar sua estrutura de cristal de raio-x. Aqui, descrevemos as etapas detalhadas para produzir a proteína recombinante, sua cristalização e sua determinação de estrutura de cristal de raio-x.

Introduction

Atividades transcriptional da família NF-κB de factores de transcrição dimérica são necessárias para diversas funções celulares, variando de inflamação e imunidade a sobrevivência e a morte. Estas actividades são rigorosamente controladas em células e uma perda de regulamento conduz a diversas condições patológicas, incluindo doenças auto-imunes e câncer1,2,3. Na ausência de um estímulo, as atividades do NF-κB são mantidas inibidas pelo i-κB (inibidor da - κB) proteínas4. A fosforilação de resíduos específicos de EMISSAO SERIE sobre proteínas i κB marca-los para ubiquitination e degradação proteasomal subsequentes ou processamento seletivo5. As duas cinases Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β e IKK1/α, atuam como centrais reguladores das actividades do NF-κB realizando esses eventos de fosforilação6,7.

Interações entre um ligante e um receptor transduces um sinal através de uma série de mediadores, levando à ativação de fatores de NF-κB. O processo de sinalização do NF-κB pode ser classificado em duas vias distintas – canônica e não-canônicos (alternativo)8. A atividade de IKK2/β regula principalmente o NF-κB sinalização do percurso canônico que é essencial para inflamatória e inata respostas imunes9. Uma característica distinta deste percurso é uma ativação rápida e de curta duração de IKK2/β10 dentro de um complexo de IKK até então bioquimicamente descaracterizada — presume-se que seja composto de IKK1 e IKK2, bem como um componente regulamentar, NEMO (NF-κB modulador essencial )11,12,13. Entre as duas subunidades IKK catalíticas do complexo IKK, IKK2 é principalmente responsável14 para a fosforilação de resíduos específicos de protótipos IκBs (α - β e γ-) vinculado a NF-κB e também uma proteína i κB atípica, NF-κB1/p105, que é um precursor do NF-κB p50 subunidade5. Fosforilação induzido ubiquitination e degradação proteasomal de i κB (ou processamento de p105) leva à liberação e ativação de um conjunto específico de NF-κB dímeros15. Aberrante atividade do NF-κB devido a função mis regulamentada de IKK2 tem sido observada em muitos cânceres, bem como em doenças auto-imunes2,3,16.

Em contraste com IKK2/β, a atividade de IKK1/α regula NF-κB sinalização da via não-canônicos, que é essencial para o desenvolvimento e a imunidade. IKK1 fosforila resíduos específicos da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, que leva ao seu processamento e geração de p52. A formação de p52:RelB transcricionalmente ativo heterodímero inicia uma resposta lenta e sustentada para sinais do desenvolvimento7,17,18,19,20. Curiosamente, a geração da central NF-κB fator p52 este percurso é criticamente dependente de outro fator,21,NF-κB induzindo quinase (NIK)22, mas não no IKK2 ou NEMO. Nas células de descanso, o nível de NIK permanece baixo devido a sua constante degradação proteossomo dependente23,24,25. Após estimulação das células por ligantes 'não-canônicos' e em certas células malignas, NIK torna-se estabilizada para recrutar e ativar IKK1 / α. atividades da quinase de NIK e IKK1 são essenciais para o processamento eficiente de p100 em p527. IKK1 e NIK fosforilar três serinas (Ser866, 870 e 872) da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, levando para seu processamento e geração de p52. Aberrante ativação da via não-canônicos tem sido implicada em muitas Neoplasias, incluindo mieloma múltiplo de27,26,28.

Vários inibidores altamente eficientes e específicos para IKK2/β são conhecidos, embora nenhum até agora têm acabou por ser uma droga eficaz. Em contraste, os inibidores específicos/α-IKK1 são escassos. Isto pode se originar em parte de nossa falta de informações estruturais e bioquímicas na IKK1/α, que limita a nossa compreensão da base mecanicista da ativação do NF-κB pelo IKK1 em células e desenho racional de droga. As estruturas de raio-x de IKK2/β nos forneceram insights sobre o mecanismo de ativação de IKK2/β29; no entanto, essas estruturas não poderiam revelar como diferentes estímulos montante desencadear a ativação de IKK1/α ou β/IKK2 para regular a conjuntos distintos de NF-κB atividades 30,31. Para entender a base mecanicista subjacente a distinta função sinalização de IKK1/α e estabelecer uma plataforma para o projeto racional da droga, focamos na determinação da estrutura de IKK1/α.

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Protocol

1. preparação do vírus recombinante apropriado para a expressão de grande escala de IKK1/α

  1. Preparação de vírus P1 32
    1. Dia 1: Células placa Sf9 (~ 6 X 105) (passagem número inferior a 10) em 2 mL de meio de inseto celular Sf900 III em cada bem de uma placa de 6 e incubar a 27 ° C. Passagem de células quando eles alcançam uma densidade de 2 a 3 X 106 células por mL em suspensão diluindo em mídia fresca em uma densidade de ~ 6 X 105.
    2. Dia 2: Dilua 8 µ l de reagente de Transfeccao de Sf9 em 100 µ l de Sf900 III ou de Grace meio de inseto sem antibióticos e soro. Vórtice brevemente.
    3. Diluir 1 µ g de bacmid recombinante kit-purificado (detalhes são fornecidos em 'Representante resultados')32 em outro 100 µ l de meio mesmo, em um tubo separado.
    4. Combinar o DNA diluído e reagente de transfeccao (μL de volume total ~ 210-220) e incubar a temperatura ambiente por 15-30 min.
    5. Retire o meio do poço. Adicione 1 mL de meio fresco sem antibióticos e soro.
    6. Adicione a mistura de reagente de Transfeccao de DNA diluída gota a gota para as células. Ajuste o tamanho da gota, tal que ele não desalojar as células aderentes.
    7. Depois de ~ 6 h, adicionar 1,5 mL de meio fresco em cima ou remover o meio e adicionar 2,5 mL de meio fresco. Meio fresco morno a 25-27 ° C antes de adição.
    8. Incube as celulas a 27 ° C. Verifique os poços periodicamente cada ~ 12h para sinais de infecção viral. Realizar todos os Sf9 manutenção e expressão a 27 ° C.
    9. Dia 5: Retire o meio contendo a infecção de post de 60-72 h de células. Centrifugue por 5 min em 500 x g e 4 ° C. Salvar o sobrenadante; Este é o estoque de P1-vírus. Congelar pequenas alíquotas a-80 ° C.
  2. Selecionando o melhor expressando P1 clone de vírus.
    1. Células da placa da mesma forma como descrito no passo 1.1.
    2. Próximo post dia ou h ~ 6 chapeamento, adicionar 20 µ l e 50 µ l de diferentes estoques de clone de vírus de P1 para as células em diferentes poços.
    3. Desalojar as células aderentes pipetando suave e recolher a infecção de post de 60-72 h de células infectadas por centrifugação por 5 min em 500 x g e 4 ° C. Salve o sobrenadante. Este é o estoque de vírus de P2. Loja pequenas alíquotas do estoque a-80 ° C.
    4. Adicione 100 µ l de tampão de x Laemmli SDS 2 para o centrifugado colhidos. Aqueça no > 95 ° C por 10 min. centrifugador (normalmente > 10.000 x g) por 5 min.
    5. Execute 10-15 µ l de cada amostra em SDS-PAGE de 8-10% em 120-160 V até a frente de corante atinge o fundo do gel.
    6. Electro-transferência (20 V, 30-45 min) de protocolo de transferência de proteínas resolvidas por padrão semi seco em uma membrana de nitrocelulose/PVDF.
    7. Borre com anticorpo anti-IKK1 (diluição ~ 1:2, 000, deve ser otimizado) ou anticorpo anti-PentaHis (diluição ~ 1:3, 000, deve ser otimizado) para a expressão.
    8. Escolha o melhor clone de vírus P1, comparando a expressão da IKK1 recombinante.
  3. Preparação da escala grande estoque de vírus P3.
    1. Células da placa da mesma forma como descrito na etapa 1.1 em uma placa de 15 cm, contendo 25-30 mL de meio de Sf900 III.
    2. ~ 6 h post chapeamento, adicione 150-300 µ l do estoque de vírus melhor expressando P1 para as células.
    3. Após 72 h pós infecção, Aspire o meio cuidadosamente da placa em um tubo apropriado (estéril) e centrifugar o tubo a 500-1000 X g durante 10 minutos a 4 ° C. Descartar o centrifugado (se um é formado) e salvar o sobrenadante. Este é o estoque de vírus P3.
  4. Determinar o título de vírus ideal para expressão de proteínas de grande escala
    1. Células de placa em 2 mL do meio de Sf900 III, conforme descrito no ponto 1.1, em uma placa de 6.
    2. Adicione 20, 30, 40 e 50 µ l de P3 ~ 6 h post chapeamento de poços de estoque de vírus em separado. Inclua um controle não infectado.
    3. Colheita de células de cada infecção de post bem h 48-60.
    4. Adicione 100 µ l de tampão de SDS de Laemmli X 2. Aqueça no > 95 ° C por 10 min. centrifugar (tipicamente 14.000 x g) por 5 min.
    5. Resolva a 10-15 µ l de cada amostra em um gel de SDS-PAGE 8-10%.
    6. Transferi proteína resolvida para uma membrana de nitrocelulose/PVDF, como mencionado em 1.2.6.
    7. Borre com anticorpo anti-IKK1 (diluição ~ 1: 2000, deve ser otimizado) ou anticorpo anti-PentaHis (diluição ~ 1:3000, deve ser otimizado).
    8. Use o vírus com o melhor expressar o título para expressões de grande escala.

2. grande escala expressão de 6 x, sua tag humana IKK129,33

  1. Proceder a expressão de grande escala em uma cultura de suspensão. Dividir células em 1 L de meio Sf900 III em um frasco de Erlenmeyer 2 L com tampa exalada. A densidade celular deve ser ~ 5 x 105 células/mL.
  2. Cultivar estas células em suspensão ~ 100 RPM a 27 ° C em um shaker ~ 2 dias até atingir uma densidade de 1-2 x 106/mL. Densidade de célula não deve exceder 2 x 106/mL.
  3. Adicione a quantidade desejada de vírus P3, avaliada em 1,4.
  4. Cresce a cultura infectada por h 48-60 ~ 100 RPM a 27 ° C em uma coqueteleira.
  5. Colheita de células por centrifugação a < 1.500 x g a 4 ° C.
  6. Salve o centrifugado e descartar o meio.
  7. Prossiga para a purificação da proteína diretamente. Flash congelar o centrifugado em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C para uso futuro.

3. purificação de sua-IKK133

  1. No dia 1, Ressuspender as células em 40 mL de tampão de lise (pH de Tris 25mm 8.0, 0,2% NP-40, 200 mM NaCl, imidazol 10 mM, 10% de glicerol, 5mm β-Mercaptoetanol e coquetel de inibidor de protease).
    Nota: O wet centrifugado massa não foi determinada. Normalmente, ~ 2 L da cultura era utilizada para esta etapa.
  2. Lisar as células pelo sonication em ciclos de 60-70%, 5-10 pulsos de duração 30 de s em um intervalo de > 1 min, mantendo a suspensão de eritrócitos refrigerados no gelo.
    Nota: Esta etapa exige otimização com cada modelo de sonicador. Não deixe que a amostra aquecer acima de 10 ° C.
  3. Clarificar o lisado por centrifugação a ≥ 28.000 x g durante 45 min a 4 ° C.
  4. Equilibrar a 4 mL de resina de Agarose Ni-NTA com Lise e misturar o esclareceu lisado (sobrenadante) seguindo o protocolo do fabricante.
  5. Permitir que a proteína ligar a resina incubando por 2h em um misturador rotativo em uma sala de 4 ° C.
  6. Lave a resina com o tampão de Lise contendo imidazole 30mm. Verifica a concentração de proteína na fração de lavar periodicamente usando o ensaio de Bradford. Lave até esta concentração de proteína na fração de lavagem atinge 0,1 mg/mL. Normalmente o volume de cama > 20 de tampão de lavagem é necessário para chegar a este ponto.
  7. Elute com sua tag IKK1/α proteína sob fluxo de gravidade, utilizando 20 mL de tampão de eluição (o tampão de Lise contendo imidazole 250 mM). Coleta de frações de 1-1,5 mL.
  8. Verificar a pureza da proteína eluted em um gel de SDS PAGE 8 ou 10% carregando 5-10 µ l da amostra de todas as frações misturadas com Laemmli buffer.
  9. Fracções de pico (concentração ≥ 2mg/mL) do pool e medir a concentração da proteína usando o ensaio de Bradford.
  10. Digerir com TEV (01:30-50 (TEV protease: IKK1)) protease durante a noite (≥12 h) a 4 ° C.
    Nota: Otimizar a quantidade de protease PEV necessário para completar a digestão (≥ 95%) do 6 X, sua marca apriorísticas. Protease TEV foi purificado em casa.
  11. Na manhã do dia 2, incubar a proteína com 1 mM de ATP na presença de 20 mM MgCl2, β-glicerofosfato de 20 mM, 10 mM NaF e ortovanadato de sódio 1mm por 1h a 27 ° C.
  12. Filtre a solução da proteína através de um filtro de 0,45 ou 0,22 μm.
  13. Carrega 6 mL da amostra para uma coluna de tamanho-exclusão preparativa da ~ 120 mL ligada a um sistema automatizado de cromatografia líquida. Equilibrar a coluna com tampão A (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 5 mM DTT, 5% glicerol), antes da aplicação da amostra de proteína.
    Nota: Uma coluna menor poderia ser usada dependendo do rendimento de proteína após a etapa de purificação de afinidade Ni-NTA. Ajustar/calcular o volume de carga para ser 5% do volume de coluna).
  14. Executar a cromatografia de exclusão de tamanho em uma taxa de fluxo de 1 mL/min e monitorar a eluição em 254 e 280 nm. Colete frações de tamanho de 2 mL.
  15. Verificar a pureza das frações pico (tipicamente em torno de ~ 60-70 mL) em um gel de SDS-PAGE 8-10%.
  16. Piscina as frações puras (pureza ≥ 95% com uma concentração de ≥0.5 mg/mL) e concentrar-se em um kDa 10 ou o peso molecular de 30 kDa concentrador de proteína centrífugas de corte seguindo as instruções do fabricante.
  17. Periodicamente Verifique a concentração da proteína do concentrado pelo método de Bradford e concentrar a amostra até 8-12 mg/mL.
  18. Dispense 25 alíquotas μL e congelamento flash em nitrogênio líquido. Armazene esses flash amostras congeladas no freezer-80 ° C.

4. tela para condição de cristalização de IKK1

  1. Calcule o montante total de proteína necessária para a tela para cristais, seguindo os métodos descritos abaixo (em volume).
  2. Tente diferentes inibidores (inibidores da quinase genérico: AMPPNP e Staurosporine; IKK-specific inibidores: MLN120B, composto A e XII IKK-inibidor) para realizar a triagem de cristalização. Fazer as soluções destes compostos seguindo as instruções do fabricante. Certifique-se de que a concentração máxima do composto na sua solução não exceda 20 μM.
  3. Preparar o complexo de IKK:inhibitor para a tela de cristalização por mistura 100 μM de IKK1 com inibidor de 200 μM e incubar a 18-20 ° C por 30-40 min. centrifugar esta mistura no > 15.000 x g por 2 min à temperatura ambiente. Salve o sobrenadante para tela de cristalização.
  4. Use as telas de cristalização comercialmente disponíveis (consulte a Tabela de materiais).
  5. Pipete 80-100 μL de cada reagente de cristalização (soluções de reservatório), usando uma pipeta multicanal ou um robô, no reservatório de uma placa de 96 poços. O prato está pronto para configurar gotas. Certifique-se de que a placa acomoda cristalização de 2 a 3 gotas para que inibidores de 2 a 3 podem ser exibidos em um único prato.
  6. Usando um robô de cristalização, dispensar e misturar 0,2 – 0.25 μL de complexo de IKK1:inhibitor com o mesmo volume de solução do reservatório.
    Nota: Triagem pode ser realizada manualmente usando volumes maiores de gota (0,5-1,0 μL de complexo de IKK1:inhibitor com o mesmo volume de solução do reservatório). No entanto, a utilização de um robô ajudaria salvar reagentes valiosos.
  7. Sele as placas imediatamente depois de definir as gotas com filmes opticamente claras para evitar a evaporação. Selar corretamente usando o aplicador apropriado. Fazer placas de réplica para cada conjunto de inibidor. Incube uma placa a 18 ° C e o outro no quarto frio (temperatura de ~ 4 – 6 ° C). Certifique-se que as incubadoras não são afetadas pela vibração.
  8. Use um estereomicroscópio com um polarizador para verificar a aparência de cristais em cada gota todos os dias durante os primeiros sete dias e então em intervalos mais longos. Sistematicamente, observe e marcar estas observações.
    Nota: Use um estereomicroscópio com um polarizador, para que os defeitos de crescimento de cristais podem ser avaliados visualmente. Aqui, cristais apareceram em uma condição onde a solução do reservatório contido 3% w/v dextrano sulfato sódio sal Mr 5.000, 0,1 M pH BICINE 8.5, 15% w/v polietilenoglicol 20.000. Cristais de IKK1 cresceu apenas na presença de IKK-inibidor XII.

5. cristal crescimento otimização29,33

  1. Preparação das soluções estoque.
    1. Prepare soluções de 30% p/v de sulfato de dextrano de diferente peso molecular (AVG. MW 5.000, 8.000, 15.000, 40.000 Da) em desionizada H2solução O. filtro usando 0,22 μm de filtros.
    2. Prepare acções de 1 M ou 0,5 M de buffers diferentes na faixa de pH de 6,5 a 9. Filtre soluções usando 0,22 μm de filtros.
    3. Prepare-se 25% ou 50% (p/v) PEG soluções de peso molecular diferente (AVG. MW:1000, 1.500 3.350, 4.000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, Da 20.000). Filtre soluções usando 0,22 μm de filtros.
    4. Execute uma tela de grade variando sistematicamente tipo de buffer, pH, concentração e tipo de PEG e sulfato de dextrano.
  2. Otimize a triagem tanto a 18 ° C e no quarto frio (temperatura de ~ 4-6 ° C).
  3. Misture uma quantidade igual da IKK1:Inhibitor complexo com solução bem e incubar durante a solução bem em um ambiente fechado. Esta etapa pode ser executada manualmente ou usando um robô aplicadora.
    Nota: Aqui, os cristais maiores e bem definidos (como avaliado pela cor uniforme sob o polarizador que indicou crescimento uniforme) foram obtidos as seguintes condições: 100mm BisTris pH 7.0, 2.8-3.5% de sulfato de dextrano (média 15 MW kDa), 8,5-10% PEG-20 kDa no quarto frio.

6. crescimento de cristais em grandes números

  1. Preparar as seguintes soluções estoque e filtrá-los através de filtro de 0,22 μm.
    1. Prepare-se 0,5 M BisTris pH 7.0 e o BisTris propano pH 7.0 e 7.5.
    2. Prepare-se 30% (p/v) de sulfato de dextrano (MW médios ~ 15 kDa). Loja a 4 ° C.
    3. Preparar 50% PEG (MW médios ~ 12 kDa).
  2. Uso 24 bem penduradas placas de gota.
  3. Aplique graxa vedante levantados anéis de cada poço.
  4. Preparar a solução bem como segue (concentração final): 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2.8-3.5% sulfato de dextrano ~ 15 kDa, 8.5 – 10% PEG ~ 12 kDa. Prepare-se 1 mL da solução bem em tubos de 1,5 mL.
    Nota: Observou-se uma variação menor na condição de cristalização dependendo do lote de proteína, e/ou sulfato de dextrano, assim, um julgamento de uma faixa estreita é recomendado. Tanto BisTris como BisTris buffers de propano de faixa de pH mesmo rendem monocristais.
  5. Manter as soluções bem e placas untadas no quarto frio pelo menos 1 h.
  6. Prepare IKK1:Inhibitor complexo conforme descrito no ponto 4.3. Transferi as soluções bem de tubos de 1,5 mL aos poços da placa 24 bem individuais.
  7. Limpa siliconizado (comercial ou in-house (siliconização/silanização)) usando toalhetes fiapos de lamínulas de vidro e aplique jactos de ar de alta pressão identificado usando o espanador de aerossol comercialmente disponível.
  8. Coloque 1-1,5 μL de solução bem sobre uma lamínula limpa. Pipetar um volume igual de IKK1:inhibitor complexas, misture suavemente pipetando para cima e para baixo 3 - 4 vezes. Vire o deslizamento da tampa de vidro e coloque sobre o respectivo bem com fórceps e selar o poço pressionando na graxa.
  9. Depois de configurar todas as gotas de uma placa de 24, incube a placa na sala fria no escuro. Verifica ocasionalmente as gotas sob um microscópio para o aparecimento e crescimento de cristais.
    Nota: Ele não foi testado se incubar as placas de cristal sob a luz mudaria o resultado. É fundamental, no entanto, que as placas são incubadas em um ambiente com mínimo/nenhuma vibração.

7. crio proteção de cristais

  1. Preparação das soluções de criogenia.
    1. Preparar A Cryo (~ 2% de sulfato de dextrano, ~ 10% PEG 12000, 60mm BisTris propano (do mesmo pH como a solução bem pretendido), 5 mM Tris pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 2,5% glicerol).
    2. Preparar a Cryo B (~0.3% sulfato de dextrano, ~ 10% PEG 12000, 60mm BisTris propano (do mesmo pH como a solução bem pretendido), 5 mM Tris pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 20 ou 25% glicerol ou 20 ou 25% glicol de etileno).
      Nota: Teste cryo-protetores diferentes além de glicerol e etilenoglicol (por exemplo, PEG-200, PEG 400, 550 de MME PEG PEG 1000).
  2. Suavemente retire a lamela de vidro que contém o cristal e coloque-a sobre uma superfície sólida com a gota de cristal voltado para cima. Delicadamente, adicionar 10 μL de solução de Cryo A em cima da gota e misture suavemente pipetando para que o cristal não é tocado.
    Nota: Esta limpa a superfície do cristal de detritos e ajudar a equilibrar o cristal com o buffer de cryo inicial. Evite os esforços mecânicos e térmicos para o cristal. Execute todas as etapas subsequentes ao microscópio para evitar qualquer dano para o cristal.
  3. Lentamente, remova o cristal líquido e manter sobre 5-8 μL da solução. Evite a desidratação do cristal. Tome cuidado para evitar o estresse mecânico e desidratação do cristal em todas as etapas subsequentes.
  4. Delicadamente adicione 2.5 – 4 μL da solução para a queda de Cryo B, misture suavemente pipetando. Cubra com um pequeno prato de Petri para evitar o fluxo de ar direto sobre o cristal. Espere 5 min. sempre tenha cuidado que o cristal não sofre mudanças rápidas da pressão osmótica ou desidratação.
  5. Repita a etapa 7.4 quatro vezes para aclimatar lentamente o cristal para a solução de criogenia.
  6. Manter 10 – 20 μL da solução cryo nesta fase (i.e., permitir que o cristal ser banhado em cerca de 20 – 25% solução contendo cryo-protetor). Mergulhe por diferentes períodos de tempo (5 min a 1 h) em crio-solução final.
  7. Congela vários cristais nos pontos de tempo diferentes.
  8. Escolha cuidadosamente um único cristal suspensa em um apropriado cryo-loop montado sobre uma base apropriada e mergulho-freeze em líquido N2. Execute esta etapa sem problemas e rapidamente para evitar a formação de gelo no cristal.
    Nota: Escolha o cristal usando um diâmetro de laço um pouco maior que o maior eixo do cristal, de modo que pode ser montado no goniômetro robótico usado em Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory.
  9. Guarde o cristal contendo cryo-loops em discos imergidos em líquido N2. Guarde estes discos em líquido N2 frasco de Dewar até que estejam prontos para a expedição por difração de raios x no Síncrotron. Proceda à recolha de dados de difração de raios-x e processamento (seções 8 e 9).
    Nota: Dados de difração de cristais de IKK1 de fontes de raios-x em casa não eram de resolução alta o suficiente para ensaios de determinação de estrutura, embora ele indicou a qualidade dos cristais para ser exibido no Síncrotron. Todos os dados de difração foram coletados em diferentes de luz síncroton (principalmente 19ID) da fonte de fótons de avanço, Argonne National Laboratory, EUA.

8. coleta de dados x-ray

  1. Colete dados de difração de raios x para a trajetória de ID19 da fonte de síncrotron APS, usando a coleção de dados remoto software34.
    Nota: Mais de 100 cristais foram testados por suas propriedades de difração. Os cristais difractado rotineiramente para uma resolução de 7-11 Å, só raramente cristais que difratada para além de 5 Å foram observado e somente um grande cristal difractado além 4.5 Å. Desde que os cristais se deteriorado rapidamente durante a coleta de dados, conjuntos de dados em diferentes partes do mesmo cristal foram coletados. Isso foi possível, já que os cristais eram grandes (maior que 400 µm), e o diâmetro do feixe utilizado foi de 100 µm.

9. raio-x processamento de dados

  1. Mescle todos os conjuntos de dados coletados em diferentes partes do mesmo cristal34.
    Nota: fundiram-se partir do melhor cristal sete conjuntos de dados e os dados resultantes foram de 93% completa. Global eu / σ foi ~ 6,8) e Rmerge foi de 89% na caixa de resolução mais alta (5.4-4.5 Å).
  2. Processo de datasets com HKL200034 para obter o grupo espacial, dimensões da unidade celular, teor de solvente e plausível composição da unidade assimétrica.

10. estrutura solução

  1. Elaboração de modelos de pesquisa
    1. Com base em modelos estruturais disponíveis de hIKK2 (pdb id 4E3C e 4KIK35), gerar uma série de dímeros com diferentes orientações de KD o N-terminal (que processa uma abertura de 30 e 62 Å, entre P578 de dois KD no dímero). Nenhum destes modelos buscada uma solução de pesquisa molecular substituição após experiências repetidas.
    2. Gere um mapa de IKK1 a partir de dados single-particle cryo-EM33.
    3. Gerar um modelo de IKK1 humano da estrutura mais alta resolução de IKK2 (pdb 4KIK de identificação).
    4. Encaixe os domínios individuais do modelo IKK1 humano na cryo EM densidade mapa da IKK1 humana usando COOT36. Este girado a orientação KD cerca de 24 graus e modificado o abertura ao ~ 58 Å N-terminal.
    5. Aplica a orientação KD do modelo cryo-EM instalados (o monômero) para todos os dímeros gerados em 10.1.1.
  2. Substituição molecular
    1. Use dímeros de 10.1.1 e 10.1.5 como modelos de pesquisa em programas PHASER37, MOLREP38 e CNS39,40.
      Nota: Aqui, usando um dos dímeros de 10.1.5 (abertura de 52 Å) como um modelo de pesquisa, seis dímeros (dois hexâmeros) foram localizados na unidade assimétrica usando MOLREP. A 52 Å abertura no modelo de pesquisa é semelhante à abertura de Å 49-50 dos dímeros (todos os seis dímeros) na estrutura refinada.

11. estrutura refinamento

  1. Procedimento de refinamento de estrutura
    1. Fixe a orientação e a posição deste modelo inicial pelo refinamento de corpo rígido no CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Refine a estrutura ainda mais usando a minimização e recozimento simulado com uma função de destino de máxima verossimilhança e uma apartamento em massa-solvente correção usando o sistema de CNS39,40.
    3. Construa o modelo baseado na 2FO-FC e Fo-Fc mapas usando Xtalview41.
      Nota: Aplicam-se DEN-assistida refinamento42 e NCS frear durante os refinamentos para melhor precisão do modelo. Com efeito, refinamento DEN melhorou dramaticamente geometrias e R-fatores da estrutura e o fator R foi de 22,2% e livre R fator foi de 27,8% para o modelo final. A melhoria dramática da R livre deve ser devido ao modelo de alta precisão de IKK1 domínios que foram gerados a partir do modelo de IKK2 (4KIK).

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Representative Results

Clonagem e expressão de diferentes construções da IKK1/α
Comprimento total que ikk1/α humano foi clonado no pFastBacHTa de vetor de expressão baculovirus dentro de seus sítios de restrição EcoRI e NotI para obter um N-terminal hexa-histidina marcados IKK1. A tag pode ser removida por digestão de protease TEV. Desde que o comprimento total IKK1/α contém regiões flexíveis em ambas as extremidades, e regiões flexíveis geralmente tornam uma proteína difícil cristalizar, nós clonado vários fragmentos truncados de IKK1/α dentro os sites acima referidos do vetor pFastBacHTa. Vários mutantes de truncamento de IKK1/α foram gerados com selvagem-tipo (wt) e S176E, 180E backbones (EE). EE IKK1/α refere-se a mimética da forma constitutivamente ativa da quinase fosforilada. Produção de baculovirus recombinante e expressão da proteína foram realizados usando um protocolo previamente publicado com pequenas modificações43 (Figura 1).

Dificuldade em cristalização IKK1/α
Desde que o humano IKK2/β e IKK1 são homólogas, e nós poderíamos cristalizar versões diferentes da humana IKK2/β sob várias condições diferentes, que esperávamos IKK1/α para cristalizar em condições similares usando estratégias semelhantes. No entanto, após experiências repetidas com diversas variantes diferentes do IKK1, obtivemos cristais com apenas uma construção truncada (IKK1 10-667 EE) (Figura 2) e que também só na presença de IKK inibidor XII44 exibido adequado Propriedades de difração de raios x.

Solução de estrutura
Cristais de IKK1/α sofriam de inúmeros problemas de crescimento, e os dados exibidos frequentemente mosaicity muito alto. Embalagem de cristal fraco associados com grande conteúdo de solvente e a natureza dinâmica do monômero/dímero IKK1 são a provável razão por trás disso. Para contornar esses problemas, o esforço foram tirado para obter os melhores Cristais possíveis, e o procedimento de crio-preservação foi realizado com o máximo cuidado em diversas condições e com vários buffers de cryo-conservante. Os dados foram coletados, também, com uma precisão final para minimizar danos do feixe. Desde que os cristais eram grande (maior dimensão muitas vezes superior a 400 mícrons), diferentes áreas dos cristais mesmos foram expostas ao feixe de raios-x para coletar vários conjuntos de dados. Isto permitiu diferentes conjuntos de dados a ser escalado e para obter um conjunto de dados razoavelmente completo com maior redundância e minimizou o erro. Imersão com átomos pesados, ou átomo pesado clusters (por exemplo, TaBr e Thais), causou os cristais para difração inadequadamente. Apesar de localizarmos a posição de TaBr clusters em dados derivados, a má qualidade dos dados além da não-isomorphocity fornecido pouco, se houver, informações de fase.

Nós processamos datasets com HKL2000 usando vários parâmetros disponíveis. O padrão de difração revelou que o cristal pertence ao grupo espaço P21 com dimensões da unidade celular, um = 174.51, b = 186.94, c = 275.83 Å e β = 98,84 graus. Usamos principalmente eu / σ para estimar o cut-off e testei vários cortes para os conjuntos de dados. Obtivemos um conjunto de dados mesclado de 4.5 Å resolução de 4 de 7 conjuntos de dados de difração coletada em um cristal. Decidimos manter dados até 4.5 Å de inspeção visual do mapa densidade final. Pode ser interessante usar CC1/2, uma vez que podemos estimar analiticamente CC do dataset Mesclado contra as verdadeiras intensidades (normalmente incomensuráveis) usando CC *45. Devido a grande unidade célula combinada com a baixa simetria do grupo do espaço, nós antecipamos a unidade assimétrica para conter 12 a 24 moléculas com base no teor de solvente de 70% a 40%.

O efeito combinado de baixa resolução dados de raio-x com fraca intensidade (ou seja, erros significativos em dados) (Figura 3), (12) de grande número de moléculas de IKK1 na unidade assimétrica e variação conformacional IKK1 monoméricos/dimérica modelo em comparação com IKK2 conhecidos modelos, inicialmente nos impediu de obtenção de uma solução de substituição molecular IKK1 e assim determinar sua estrutura.

IKK1/α e β/IKK2 contêm um domínio de cinase (KD), um domínio do ubiquitin-como (ULD) e um domínio de dimerização do andaime por-helicoidal (SDD). A estrutura do IKK1 revelou que forma dímeros da mesma forma que IKK2 utilizando uma interface quase idêntica de subunidade inter da região distal do SDD. No entanto, dímero de IKK1 exibido um posicionamento relativo significativamente diferente do KD N-terminal em relação ao SDD + ULD comparado em dímeros de IKK2 conhecidos. Diferentes estruturas de IKK2 anteriormente indicaram orientação intermonomer diferente dentro de seus dímeros (Figura 4um painel), para que as distâncias entre os carbonos alfa dos P578 no KD dois em quatro modelos diferentes de dímero variaram entre 39 e 61 Å. Desde que as sequências de quinases esses dois são muito semelhantes e resíduos na interface do dímero são idênticos, antecipamos que IKK1/α formaria um dímero semelhante; no entanto, uma vez que existem diferenças significativas nos resíduos da interface KD-SDD (por exemplo, W424 e F111 em IKK2 são V e P respectivamente), antecipamos que talvez uma orientação KD ainda diferente em IKK1. Com efeito, a estrutura IKK1/α indicado que as orientações relacionadas do KD a SDD é único, e se desvia de todos os modelos conhecidos de IKK2/β. Mais de cem dímero modelos foram usados como modelos de pesquisa em programas PHASER, MOLREP e CNS, sem sucesso, indicando a necessidade de um modelo de pesquisa bastante precisos para o sucesso dos ensaios de substituição molecular, especialmente com os nossos dados de baixa resolução. Um modelo de monômero tem muito pouca massa para pegar qualquer solução nos dados de difração fraco da grande unidade assimétrica contendo 12 monômeros. Além disso, a inclusão ou omissão de água no modelo de pesquisa não fez diferença nas pesquisas de substituição molecular, especialmente por causa dos dados de difração fraco. CC1/2 e CC * indica que dados até 4.5 Å são bastante precisos. Usamos um corte de resolução conservadora de 4.5 Å com base em I / σ de 1.5. Os conjuntos de dados com resolução diferente cortes não mostrou qualquer diferença gritante durante operações de busca de substituição molecular e mapas finais refinados contra esses conjuntos de dados não apresentaram qualquer melhoria distinta nos recursos de mapa em cima estendendo a resolução cortes. A compilação final do modelo é bastante precisa, mais do que o que poderia ser construído a partir sozinha, a densidade derivada provavelmente desde os modelos de substituição molecular inicial foram construídos a partir de modelos com uma alta resolução de dados e utilizamos a cryo-EM mapa/densidade para verificar as características do mapa, especialmente em regiões onde os mapas eram claros.

Em retrospectiva, a obtenção de um modelo de pesquisa útil foi possível só por causa da disponibilidade do mapa cryo-EM baixa resolução e um modelo de precisão bastante elevado de IKK1 domínios que poderiam ser gerados com base na estrutura de IKK2 (Figura 4 de alta resolução painel B). Poderia atracar os domínios de IKK1 no mapa de cryo-EM de IKK1 para obter um modelo razoavelmente perto do dímero. O modelo inicial indicado uma orientação do KD girado cerca de 24 graus em relação de um monômero de IKK2 e N-terminal abertura de 58 Å (entre P578 de dois KDs em um dímero). Nosso conhecimento prévio das diferentes estruturas de dímero de IKK2/β (e sua variação) permitiram-nos aperfeiçoar o modelo de pesquisa alterando as aberturas entre 30-62 Å. Using dentre os dímeros (52 Å abertura) como um modelo de pesquisa, localizamos seis dímeros na unidade assimétrica usando programa MOLREP46. Estes seis dímeros são organizados em dois hexâmeros na unidade assimétrica, e o solvente calculado tem um volume de 68%.

Figure 1
Figura 1: purificação de IKK1. (A) expressão de IKK1 (10-667) em células de inseto. (B) um fluxograma para a purificação de IKK1; (C) gel de SDS-PAGE An mostrando pureza de IKK1 após a etapa de cromatografia de afinidade Ni-NTA. Perfil de tamanho-exclusão (D) indicando o dímero de IKK1. Gel de SDS-PAGE (E) mostrando a pureza de IKK1 partir das fracções de tamanho-exclusão de pico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: morfologia e tamanho dos cristais de IKK1. (A) um cristal de IKK1 construir 10-667; a queda de cristalização também mostra cristais de outra morfologia (placas finas) que não difração bem. (B) ampliada tendo em conta o cristal que difratada para além de 5 Å. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3:. Dados cristalográficos obtidos de cristais de IKK1. (A) perfil de difração de um raio-x de um cristal de IKK1 indicando Propriedades pobre difração de cristais de IKK1 típicos. (B) HKL2000 estatísticas dimensionamento do conjunto de dados mesclado utilizado para determinação da estrutura de IKK1 e redundância dos dados. Linear R = soma (ABS (eu - < i >)) / soma (I), Praça R = soma ((eu - < i >) * * 2) / SUM (eu * * 2), Chi * * 2 = soma ((eu - < i >) * * 2) / (erro * * 2 * N / (N-1))), CC1/2 = coeficiente de correlação, CC * = coeficiente de correlação de dataset Mesclado contra intensidades de verdadeiras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: preparação de modelos de pesquisa. (A) modelos diferentes de dímero IKK2, indicando diferentes orientações do KD relativo SDD (dando origem à separação diferente entre dois KD); Estes modelos foram testados inicialmente para encontrar uma solução de substituição molecular sem qualquer sucesso. (B) geração de IKK1 modelos de pesquisa - mapa de Cryo-EM de dímero de IKK1 em 11 resolução Å; EM-mapa equipado modelo inicial de pesquisa IKK1, domínios individuais são baseados no modelo de IKK2 (4KIK); Um IKK1 modelo de pesquisa mais belas-tweaked (orientação apropriada de KD) com base em várias possibilidades como julgados de IKK2 modelos descrevem acima na 4A; Superposição de EM-mapa equipado modelo para o modelo de pesquisa que gerou a solução de substituição molecular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Solução de produção, cristalização e estrutura de duas proteínas IKK relacionadas
Partimos para determinar a estrutura de cristal de raio-x de IKK1/α com a noção de que seria um exercício relativamente simples, dado a nossa experiência com a produção de proteína IKK2/β, cristalização e a determinação de estrutura. No entanto, nos surpreendemos altamente que essas duas proteínas relacionadas comportou-se muito diferentemente em relação a facilidade de cristalização. Apesar dos esforços de vários laboratórios de alto perfil, a determinação da estrutura de IKK1 levou quase duas décadas. Isto resultou em grande parte da alguns gargalos de chave.

A primeira dificuldade foi para obter um formulário de proteínas altamente puro e solúvel. O sistema de expressão de células inseto permitiu-nos obter quantidades de mg de proteína pura que foi razoavelmente solúvel. No que se refere ao nível de expressão, todas as construções IKK1/α expressaram em níveis muito mais baixos do que IKK2/β constrói em sistemas de expressão de células de inseto. Deve notar-se que nenhuma das proteínas é solúvel e funcional quando expresso em e. coli. Em um sistema de expressão célula insetos, fragmentos de IKK2/β, expressados em níveis elevados, variou de 10 a 30 mg/L de cultura dependendo as construções. Em contraste, construções IKK1/α podem ser geradas apenas em 0,5 a 2,0 mg/L de cultura. A razão para esta diferença é ainda desconhecida para nós. Devemos também tentar expressão de IKK1 em células hospedeiras nativo (ou seja, sistema de superexpressão de mamíferos em caso de uma proteína IKK mamíferos), especialmente porque as modificações borne-translational tais como auto - ou trans-fosforilação ocorrem comumente em IKK ocorrerá mais eficiente e adequada no seu ambiente nativo. Purificação de complexos IKK diretamente da cultura em larga escala de células de mamíferos também é atualmente ameno.

Enquanto trabalhava com IKK2/β, notamos que pode ser homogênea autofosforilada, tratando com ATP, e isso faz com que a proteína passível de cristalização. Da mesma forma, a incubação da proteína IKK1 com ATP e o resultante autofosforilação, renderam uma IKK1 registrados que era solúvel e apropriado para a caracterização bioquímica e determinação da estrutura de cristal.

Um passo fundamental para obter cristais bem diffracting era afinar as condições de cristalização, em particular a adição do tipo apropriado e a concentração de moléculas de sulfato de dextrano. A densidade indica limite moléculas de sulfato de dextrano, e seu efeito resultante na IKK1 era provável crítico para cristalização.

A flexibilidade inerente de IKK1, que é frequentemente observado em quinases, é o principal impedimento para cristalização e está muitas vezes ligada ao noivado do domínio com o laço da ativação da quinase. IKK2 com nativos (S177 e S181) e phosphomimetic (EE) formas de serinas do laço de ativação pode ser cristalizado, mas só obtivemos cristais com IKK1/α truncado da SS para versão mutante EE e que também só na presença de inibidor IKK XII. Estes cristais difratados bem o suficiente para a determinação da estrutura somente quando crescido no quarto frio (~ 4-6 ° C). Se nos deparamos com um comportamento obstinado da mesma forma com qualquer homólogo de IKK1 (ou um ortholog IKK), podemos tentar várias modificações de espinha dorsal (especialmente dos resíduos de serina de laço de sítio ativo que são comumente fosforiladas). Podemos também tentar co cristalização na presença de proteínas de parceiro interagindo. Quinases de muitos, incluindo os da família IKK, interagem com as proteínas do parceiro e residam dentro de complexos de alta ordem.

Vários inibidores ajudaram a produzir cristais de IKK2 em várias condições (por exemplo, com os dois sal elevado, CLASSIFIQUEI como um dessensibilizador), ambos a 18 ° C e no quarto frio. No entanto, em condições semelhantes e com uma variedade de inibidores, IKK1/α não produziu qualquer cristal. Assim, o uso de um repertório maior de inibidores certamente aumentará as chances de encontrar um que permitem a cristalização.

Outro passo crítico na determinação da estrutura foi o cuidado de crio-preservação e procedimento de coleta de dados. Os dados fracos e rápida deterioração dos cristais com o feixe de raio-x justifica a necessidade de maiores cristais e coleção de vários conjuntos de dados de cristais do mesmos. Sem um razoável conjunto de dados completo de alta precisão, poderia não conseguimos na obtenção de uma solução de substituição molecular.

Finalmente, não conseguimos determinar a estrutura de IKK1/α por substituição molecular usando mais de 100 modelos criados a partir de conhecidos modelos estruturais IKK2/β disponíveis no banco de dados público. Assim, a obtenção de um modelo adequado para um procedimento de substituição molecular foi imperdível. O mapa de cryo-EM, modelos estruturais de alta precisão de domínios individuais, juntamente com estudos comparativos de determinado anteriormente IKK2 estruturas levaram-na obter um modelo de pesquisa que nos buscado a solução de substituição molecular.

A cristalização de uma proteína é inerentemente aleatória, então apesar de seguir a orientação estruturada acima, nós pode enfrentar problemas na cristalização do homólogo de IKK1 outro ou uma outra construção completo ou truncada do IKK1 humano. Independentemente disso, conhecimento destes passos críticos permitirá que um pesquisador explorar condições racionais que irão aumentar as chances de obter um bem diffracting cristal IKK.

IKK1/α e β/IKK2 exibem a organização de domínio semelhante mas diferente organização entre domínios
Não surpreendentemente, ambos IKK1/α e β/IKK2 adotam uma arquitetura de domínio altamente similares decorrentes da sua sequência alta similaridade33,43. Conforme indicado anteriormente, tanto IKK1/α e β/IKK2 dobram em três distintos domínios: domínio do N-terminal quinase, ubiquitina como domínio (ULD) e domínio de dimerização do andaime (SDD). Ambos IKK1/α e β/IKK2 formam dímeros estáveis em que o C-terminal metade do SDD participar de dimerização. Envolvidos na formação do dímero de resíduos são idênticos. No entanto, as interações entre domínios entre SDD/ULD e KD são um pouco diferentes, desde que estes envolvem diferentes resíduos. Isto também provavelmente causado a orientação relativa do domínio de cinase para o SDD em IKK1/α para diferir do que em IKK2/β. Isto não era totalmente inesperado, pois também observamos diferenças entre os modelos disponíveis de dímero de IKK2/β. Curiosamente, dímeros de IKK2/β podem organizar em tetrâmeros no lattice de cristal, apesar desta propensão tetramerization é fraco em solução. No entanto, dímeros α/IKK1 formaram exclusivos hexâmeros. Estes hexâmeros também são observados em solução, embora apenas uma pequena piscina de dímeros α/IKK1 existir como hexâmeros. Estas sugerem que hexamerization é provável que tenha uma função específica e crítica.

Diferenciando as diferenças funcionais de diferenças estruturais
IKK1/α e β/IKK2 executam funções distintas nas células. No entanto, a relação entre estrutura e função de IKK1/α permaneceu indescritível. IKK1/α claramente existe em diferentes formas: como dímero livre ou hexâmero e dentro de um complexo de hetero-trímero até então descaracterizado juntamente com IKK2/β e NEMO. Desde que a ativação de IKK2/β por sinalização canônico não requer IKK1/α, o papel funcional de IKK1/α no heterotrimer (IKK-complexo canônico) permanece obscuro. Também é incerto se a ativação de IKK1/α induzida por sinalização de não-canônicos baseia-se na enciclopédia dimérica IKK1/α e/ou hexamérica IKK1/α. Desde mutacional revelaram que o rompimento da interface do hexâmero afeta fortemente sinalização não-canônicos, hexamerization é susceptível de ser essencial em algum momento durante a sinalização não-canônicas.

Projetar inibidores de pequena molécula usando a estrutura de IKK1/α
Conhecendo que a estrutura do IKK1/α nos permite investigar a superfície patches em um monômero ou bolsos nas interfaces entre domínios ou entre monômero, que pode ser alvo de pequenas moléculas. IKKs tem sido considerados alvos droga importante. No entanto, a essencialidade destas quinases em uma variedade de funções incluindo a homeostase celular, a viabilidade e imunidade torna extremamente difícil para orientá-las. Até agora, nenhuma molécula de IKK-alvo foi encontrada que pode ser usado com segurança em pacientes.

IKK1/α e β/IKK2 são muitas vezes alvo simultaneamente de seus inibidores desde seus domínios quinase são altamente similares em sequência e estrutura. Esforço de pesquisa considerável foi gasto em encontrar inibidores específicos visando apenas dentre estes dois quinases. Consequentemente, foram descobertos vários inibidores específicos/β-IKK2, alguns dos quais não afetam a função IKK1/α. No entanto, a nosso conhecimento que tal composto não existe que efetivamente inibe IKK1/α sem distorçer função IKK2/β. Esta ausência poderia ser atribuída à falta de informações estruturais sobre IKK1/α. Nossos estudos estruturais e celulares indicam que, embora o arranjo de domínio e subunidade global estruturas são altamente similares em destas duas proteínas, eles exibem exclusivos arranjos de alta-ordem empregando superfície específica patches33. Estas diferenças que permitem diferentes interações com proteínas associadas devem traduzir em suas diferenças funcionais. Estamos esperançosos de que estas distinções reveladas entre o IKK1/α e interações intere intrasubunidade de IKK2/β podem ser exploradas para fazer inibidores alostéricos subunidade específica.

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Disclosures

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Acknowledgments

Agradecemos os funcionários a 19ID de Luz Síncroton, 24ID e 13ID no Advanced Photon Source, Lemont, IL, pelo apoio durante a coleta de dados em vários cristais. Nós estamos gratos ao Dmitry Lyumkis, Instituto Salk para buscar-no mapa de cryo-EM baixa resolução em estágios iniciais EM mapa/modelo de edifício, que foi usado para construir o modelo de pesquisa de substituição molecular inicial do IKK1. A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento de bolsas NIH AI064326, CA141722 e GM071862 para GG. SP é atualmente um Wellcome Trust DBT Índia intermediário companheiro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

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References

  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

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Bioquímica edição 141 proteína serina-treonina quinase IKK1/α NF-κB estrutura cristalina substituição molecular inibidor
Um guia para a produção, cristalização e determinação da estrutura de IKK1 humana/α
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Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

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