Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Руководство по продукции, кристаллизации и определения структуры человеческого IKK1/α

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

IκB киназы 1/α (IKK1/α CHUK) является Ser/Чет протеинкиназы, которая участвует в бесчисленных клеточной деятельности, главным образом через активацию NF-κB транскрипционных факторов. Здесь мы опишем основные шаги, необходимые для производства и определения структуры кристалла этого белка.

Abstract

Класс внеклеточного раздражителей требует активации IKK1/α побудить поколения NF-κB Субблок p52, путем обработки его предшественник p100. P52 функции как Антуану или гетеродимера с другой NF-κB Субблок, RelB. Эти димеры в свою очередь регулируют выражение сотен генов, участвующих в воспаление, выживаемость клеток и клеточного цикла. IKK1/α главным образом остается связанной с IKK2/β и Немо как третичный комплекс. Однако небольшой бассейн это наблюдается также как низкой молекулярной массой complex(es). Неизвестно, если действие обработки p100 инициируется активации IKK1/α в течение большего или меньшего комплекс бассейна. Учредительный активность IKK1/α была обнаружена в нескольких раковых заболеваний и воспалительных заболеваний. Чтобы понять механизм активации IKK1/α и включить его использования в качестве целевого наркотиков, мы выразили рекомбинантных IKK1/α в различных хост-систем, таких как кишечная палочка, насекомых и млекопитающих клетки. Нам удалось выразить растворимых IKK1/α в бакуловирусы инфицированных насекомых клеток, получение количества мг чистого белка, кристаллизующийся в присутствии ингибиторов и определение его кристаллической структуры рентгеновского. Здесь мы описываем подробные шаги для получения рекомбинантных белков, его кристаллизации и его определения структуры рентгеновских кристалл.

Introduction

Транскрипционный анализ деятельность в семейства NF-κB димерной транскрипционных факторов, необходимых для различных клеточных функций, начиная от воспаления и иммунитет для выживания и смерти. Эти мероприятия строго контролируются в клетки и потеря регулирование приводит к различных патологических состояний, включая аутоиммунных заболеваний и рака1,2,3. В отсутствие стимула деятельность NF-κB хранятся тормозится IκB (ингибитор - κB) белки4. Фосфорилирование конкретных Ser остатков на белки IκB помечает их ubiquitination и последующего протеосомной деградации или выборочной обработки5. Два весьма гомологичных Ser/Чет киназы, IKK2/β и IKK1/α, выступать в качестве центрального регуляторы деятельности NF-κB осуществляя эти события фосфорилирование6,7.

Взаимодействия лигандов и рецептор передает сигнал через ряд посредников, ведущие к активации NF-κB факторов. NF-κB сигнализации процесс широко можно подразделить на два различных пути – канонические и нестандартные (альтернативных)8. Деятельность IKK2/β главным образом регулирует NF-κB сигнализации канонический путь, который имеет важное значение для воспалительных и врожденный иммунный ответ9. Отличительная черта этого пути является быстрое и недолго активации10 IKK2/β в пределах до сих пор биохимически uncharacterized IKK комплекс — предположительно будет состоять из IKK1 и IKK2, а также нормативно-правовой компонент, Немо (NF-κB основные модулятор )11,12,13. Между двумя каталитического IKK подразделений комплекса IKK, IKK2 является главным образом ответственный14 для фосфорилирование конкретных остатков прототип IκBs (α, - β и - γ) обязан NF-κB, а также нетипичные IκB белок, NF-κB1/p105, который является предшественником NF-κB p50 Субблок5. Фосфорилирование индуцированной ubiquitination и деградации протеосомной IκB (или обработки p105) приводит к выпуска и активации определенного набора NF-κB димеры15. Аберрантное NF-κB активности из-за неправильного регулируемой функции IKK2 наблюдается во многих раках, также как и аутоиммунных расстройств2,3,16.

В отличие от IKK2/β активность IKK1/α регулирует NF-κB сигнализации нестандартные пути, который имеет важное значение для развития и иммунитет. IKK1 фосфорилирует конкретные остатки NF-κB2/p100 на ее сегмент C-терминала IκBδ, что приводит к ее обработка и генерация p52. Формирование транскрипционно активных p52:RelB гетеродимера инициирует медленно и устойчивого реагирования на развития сигналы7,,1718,19,20. Интересно, что поколения Центральной p52 фактора NF-κB этот путь зависит от другой фактор, NF-κB вызывая киназы (ник)21,22, но не на IKK2 или Немо. В клетках отдых уровень NIK остается низким из-за его постоянной протеасом зависимой деградации23,24,25. После стимуляции клеток «не канонических» лигандов и в некоторых злокачественных клеток Ник стабилизируется набирать и активировать IKK1 / α. киназы деятельности Ник и IKK1 имеют важное значение для эффективной обработки p100 в p527. IKK1 и Ник фосфорилировать трех serines (Ser866, 870 и 872) NF-κB2/p100 приводит к ее обработка и генерация p52 сегмента IκBδ C-терминала. Ошибочной активации нестандартные пути были причастны многих злокачественных опухолей, включая множественной миеломы26,27,28.

Известны несколько весьма эффективные и конкретные ингибиторы для IKK2/β, хотя никто до настоящего времени оказались быть эффективный препарат. В отличие от IKK1/α-специфические ингибиторы являются скудными. Это может частично обусловлены нашего отсутствия структурных и биохимических информации о IKK1/α, который ограничивает наше понимание механистический основы активацию NF-κB, IKK1 в клетки и рациональных наркотиков дизайн. Структуры рентгеновского IKK2/β предоставил нам взглянуть на механизм активации IKK2/β29; Однако, эти структуры не могут выявить как различных вышестоящих раздражителей вызвать срабатывание IKK1/α или IKK2/β регулировать различные наборы NF-κB деятельности 30,31. Чтобы понять механистический основания, лежащие в основе функции distinct сигнализации IKK1/α и создать платформу для рационального наркотиков дизайн, мы сосредоточены на определении структуры IKK1/α.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка рекомбинантных вирус подходит для больших масштабах выражение IKK1/α

  1. Подготовка вирус P1 32
    1. День 1: Плита Sf9 клетки (~ 6 X 105) (проход число меньше 10) в 2 мл среды насекомых клеток Sf900 III в каждом также 6-ну плиты и Инкубируйте на 27 ° C. Проход клеток, когда они достигают плотность составляет 2-3 Х 106 клеток / мл в суспензии путем разбавления в свежие СМИ на плотности ~ 6 X 105.
    2. День 2: Развести 8 мкл Реагента Sf9-трансфекции в 100 мкл Sf900 III или Грейс насекомых среды без антибиотиков и сыворотки. Вихрь кратко.
    3. Разбавьте 1 мкг комплект очищенная рекомбинантных bacmid (подробная информация приводится в «Представитель результаты»)32 в другой 100 мкл той же среде, в трубку, отдельный.
    4. Объединить разреженных ДНК и трансфекции реагента (общий объем ~ 210-220 мкл) и инкубации при комнатной температуре 15-30 мин.
    5. Удалите носитель из колодца. Добавьте 1 mL свежих средних без антибиотиков и сыворотки.
    6. Добавьте разбавленные смеси реагентов ДНК трансфекции каплям на клетки. Отрегулируйте размер капли, таким образом, чтобы он не выбить адэрентных клеток.
    7. После ~ 6 h добавить 1,5 мл свежей среды на вершине или удалите среды и добавьте 2,5 мл свежей среды. Тепло свежих среднего до 25-27 ° C до сложения.
    8. Инкубировать клетки на 27 ° C. Проверьте скважинах периодически каждые ~ 12 ч для признаков вирусной инфекции. Провести все Sf9 обслуживание и выражение 27 ° c.
    9. День 5: Извлеките носитель содержит клетки 60-72 h пост инфекции. Центрифуги для 5 мин на 500 x g и 4 ° C. Сохранить супернатант; Это акции P1-вирус. Заморозить малых аликвоты-80 ° c.
  2. Выбор лучших выражения P1 вирус клон.
    1. Плита клетки так же, как описано в шаге 1.1.
    2. Следующий пост день или ~ 6 h обшивка, добавить 20 мкл и 50 мкл различных P1 вирус клон запасов на клетки в различных скважин.
    3. Выбить адэрентных клеток, нежный закупорить и урожай инфекции пост 60-72 h инфицированные клетки центрифугированием на 5 мин, 500 x g и 4 ° C. Сохраните супернатант. Это вирус запас P2. Храните небольшой аликвоты акций-80 ° c.
    4. Добавьте 100 мкл буфера 2 x Laemmli SDS в Пелле заготовленных клеток. Тепло в > 95 ° C на 10 мин центрифуги (обычно > 10000 x g) за 5 мин.
    5. Запустите 10-15 мкл каждого образца на 8-10% SDS-PAGE в 120-160 V, пока краска фронта достигает нижней части геля.
    6. Электро передача решена белков путем стандартных полусухое протокол (20 V, 30-45 мин) передачи на нитроцеллюлозную/PVDF мембрану.
    7. Пятно антитела анти IKK1 (разбавления ~ 1:2, 000, должны быть оптимизированы) или анти PentaHis антитела (разбавления ~ 1:3, 000, должны быть оптимизированы) для выражения.
    8. Выберите лучший клон вирус P1, сравнивая выражение рекомбинантных IKK1.
  3. Подготовка большого масштаба складе вирусом P3.
    1. Плита клетки так же, как описано в шаге 1.1 в 15 см пластины, содержащих 25-30 мл среды Sf900 III.
    2. ~ 6 h пост обшивка, 150-300 мкл наилучшим образом выражая запасов вируса P1 на клетки.
    3. После 72 ч пост инфекции, аспирационная среднего тщательно от пластины в подходящей трубки (стерильные) и центрифуги трубки на 500-1000 X g 10 мин при 4 ° C. Отменить Пелле ячейки (если один образуется) и сохраните супернатант. Это складе вирусом P3.
  4. Определение титр оптимальный вирус для больших масштабах выражения протеина
    1. Плита клетки в 2 мл средний Sf900 III, как описано в 1.1, в 6-ну пластине.
    2. Добавьте 20, 30, 40 и 50 мкл P3, вирус складе в отдельных скважинах ~ 6 ч после покрытия. Включите элемент неинфицированных.
    3. Урожай клетки от каждой инфекции хорошо 48-60 h пост.
    4. 100 мкл 2 X Лэмли SDS буфера. Тепло в > 95 ° C на 10 мин центрифуги (обычно в 14.000 x g) за 5 мин.
    5. Разрешить 10-15 мкл каждого образца в геля SDS-PAGE 8-10%.
    6. Решены белка можно передайте мембраны нитроцеллюлозы/PVDF как упомянуто в 1.2.6.
    7. Пятно антитела анти IKK1 (разбавления ~ 1: 2000, должны быть оптимизированы) или анти PentaHis антитела (разбавления ~ избытке, должны быть оптимизированы).
    8. Используйте вирус с лучшими, выражая титр для больших масштабах выражений.

2. крупномасштабные выражение 6 x его меткой человека IKK129,33

  1. Осуществляют крупномасштабные выражение в культуре подвеска. Разделение ячеек в 1 Л Sf900 III среды в 2 колбу Эрленмейера Л с крышкой вентилируемые. Плотность клеток должно быть ~ 5 x 105 клеток/мл.
  2. Растут эти клетки в виде суспензии в ~ 100 об/мин при 27 ° C в шейкере ~ 2 дней, пока он не достигнет плотность составляет 1-2 х 106/мл. Плотность клеток не должен превышать 2 x 10-6/мл.
  3. Добавьте необходимое количество вируса P3, оцененной в 1.4.
  4. Растут зараженных культуру для 48-60 h на ~ 100 об/мин при 27 ° C в шейкере.
  5. Урожай клетки центрифугированием в < 1500 x g при 4 ° C.
  6. Сохраните Пелле клеток и отказаться от среднего.
  7. Перейти непосредственно к очищение протеина. Вспышки заморозить Пелле клеток в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C для использования в будущем.

3. Очистка его IKK133

  1. День 1, Ресуспензируйте Пелле клеток в 40 мл буфера Lysis (25 мм трис рН 8,0, 0,2% NP-40, 200 мм NaCl, имидазола 10 мм, 10% глицерина, 5 мм β-меркаптоэтанол и ингибитор протеазы коктейль).
    Примечание: Гранулы мокрой клеточной массы не был определен. Как правило ~ 2 L культуры был использован для этого шага.
  2. Лизировать клетки, sonication в 60-70% циклов, 5-10 импульсов продолжительностью 30 s с интервалом > 1 мин, сохраняя суспензию клеток охлажденной на льду.
    Примечание: Этот шаг требует оптимизации с каждой моделью sonicator. Не позволяйте образца подогревают выше 10 ° C.
  3. Уточнить lysate центрифугированием в 28000 x g ≥ 45 мин при 4 ° C.
  4. Сбалансировать 4 мл Ni-НТА агарозы смолы с буфера lysis и смесь осветленный lysate (супернатант) после производителя протокол.
  5. Разрешить белка, чтобы привязать смолы, инкубации 2 h на роторный смеситель в комнате 4 ° С.
  6. Тщательно вымойте смолаы с буфера lysis, содержащий 30 мм имидазола. Проверьте концентрация белка в периодически используя Assay Брадфорд мыть. Вымойте, до тех пор, пока эта концентрация белка в мыть достигает 0,1 мг/мл. Обычно для достижения этой точки требуется > 20 кровать объем буфера мытья.
  7. Элюировать его меткой IKK1/α белков под самотечный поток, с помощью 20 мл буфера (литического буфера, содержащий 250 мм имидазола). Сбор фракций 1-1,5 мл.
  8. Проверьте чистоту eluted белка на 8 или 10% геля SDS-страницы, загрузка 5-10 мкл пример из всех фракций, смешанного с буфер Лэмли.
  9. Бассейн пик фракций (концентрация ≥ 2 мг/мл) и измерять концентрацию протеина используя assay Брадфорд.
  10. Дайджест с ТРВ (1:30-50 (TEV протеазы: IKK1)) протеазы на ночь (≥12 h) при 4 ° C.
    Примечание: Оптимизировать количество ТэВ протеазы, необходимых для завершения 6 X-его тег априорипищеварение (≥ 95%). TEV протеазы был очищен в доме.
  11. На утро дня 2 Инкубируйте белка с 1 мм АТФ в присутствии 20 мм MgCl2, β-Глицерофосфат 20 мм, 10 мм NaF и Ортованадат натрия 1 мм на 1 ч при 27 ° C.
  12. Фильтр раствор белка через фильтр 0,45 или 0,22 мкм.
  13. Загрузка 6 мл образца на ~ 120 мл препаративные столбец Размер изоляции придает системе автоматизированных жидкостной хроматографии. Сбалансировать столбце с буфером A (20 мм трис-HCl (рН 7,5), 150 NaCl, 5 мм DTT, 5% глицерина), до применения образец протеина.
    Примечание: Меньше столбец может использоваться в зависимости от урожайности белка после Шаг очищение сродства Ni-НТА. Настройка/вычислить объем нагрузки 5% объема колонки).
  14. Размер-гель-проникающей хроматографии на скорости потока 1 мл/мин и отслеживать элюции 280 и 254 Нм. Сбор фракций размером 2 мл.
  15. Проверить чистоту пик фракций (обычно около ~ 60-70 мл) на геля SDS-PAGE 8-10%.
  16. Бассейн чистый фракций (≥95% чистоты с концентрацией ≥0.5 мг/мл) и концентрироваться в 10 кДа или 30 кДа молекулярный вес производства центробежных белка концентратор следуя инструкциям производителя.
  17. Периодически проверять концентрацию белка концентрата методом Брэдфорд и сконцентрировать образца до 8-12 мг/мл.
  18. Отказаться от 25 мкл аликвоты и флэш-замораживание в жидком азоте. Храните эти флэш замороженных образцов в морозильной камере-80 ° C.

4. экран для кристаллизации состояние IKK1

  1. Рассчитайте общее количество белков, необходимых для экрана для кристаллов методов, описанных ниже (по объему).
  2. Попробуйте различные ингибиторы (универсальный протеинкиназы ингибиторов: AMPPNP и Staurosporine; IKK-specific ингибиторов: MLN120B, соединение A и IKK-ингибитор XII) для выполнения проверки для кристаллизации. Сделайте акций решения этих соединений, следуя инструкциям производителя. Убедитесь, что максимальная концентрация комплекса в его Стоковый раствор не превышает 20 мкм.
  3. Подготовить комплекс IKK:inhibitor для кристаллизации экрана путем смешивания 100 мкм IKK1 с 200 мкм ингибитор и Инкубируйте на 18-20 ° C за 30-40 мин центрифуга эту смесь на > 15000 x g на 2 мин при комнатной температуре. Сохраните супернатант для кристаллизации экрана.
  4. Использование коммерчески доступных кристаллизации экраны (см. Таблицу материалов).
  5. Пипетка 80-100 мкл Реагента каждого кристаллизации (водохранилище решения), используя многоканальные пипетки или робот, в водохранилище, 96-луночных плиты. Пластину теперь готов для установки капли. Убедитесь, что пластины могут разместиться кристаллизации 2-3 капли, так что 2-3 ингибиторы могут проверяться в одной пластине.
  6. С помощью робота кристаллизации, обойтись и смесь 0,2 – 0,25 мкл IKK1:inhibitor комплекс с такой же объем водохранилища решения.
    Примечание: Скрининг может выполняться вручную с использованием больших объемов падение (0,5-1,0 мкл IKK1:inhibitor комплекс с такой же объем водохранилища решения). Однако использование робота поможет сохранить ценные реагентов.
  7. Уплотнение пластины сразу же после установки капли с оптически ясно фильмов, чтобы избежать испарения. Уплотнение должным образом с помощью соответствующих аппликатор. Сделайте пластины реплики для каждого набора ингибитора. Инкубируйте одной пластины на 18 ° C, а другой в холодной комнате (температурный диапазон ~ 4 – 6 ° C). Убедитесь, что инкубаторы не подвержены вибрации.
  8. Используйте стереомикроскопом с поляризатора для проверки внешний вид кристаллов в каждой капле каждый день в течение первых семи дней, а затем на более длительные интервалы. Систематически внимание и оценка этих наблюдений.
    Примечание: Используйте стереомикроскопом с поляризатором, так что можно визуально оценить рост дефекты в кристаллах. Здесь кристаллы появился в состоянии где водохранилище решения содержится 3% w/v декстран сульфата натрия соли Mr 5000, 0,1 М BICINE рН 8,5, 15% w/v полиэтиленгликоль 20000. Кристаллы IKK1 вырос только в присутствии IKK-ингибитор XII.

5. Кристалл роста оптимизации29,33

  1. Подготовка запасов решений.
    1. Подготовка 30% w/v решения декстран сульфата разной молекулярной массы (Avg. МВт 5000, 8000, 15000, 40000 да) в дейонизированной H2O. фильтр решение с использованием фильтров 0,22 мкм.
    2. Подготовка 1 М или 0,5 М запасов различных буферов в диапазоне pH от 6,5 до 9. Фильтр решения с использованием фильтров 0,22 мкм.
    3. Подготовка 25% или 50% (w/v) ПЭГ решения разной молекулярной массы (Avg. MW:1000, 1500, 3350, 4000, 6000, 8000, 10000, 12000, 20000 да). Фильтр решения с использованием фильтров 0,22 мкм.
    4. Выполните сетки экрана изменяя систематически рН, тип буфера, концентрации и тип привязки и декстран сульфата.
  2. Оптимизация проверки как на 18 ° C, так и в холодной комнате (температурный диапазон ~ 4-6 ° C).
  3. Mix равное количество IKK1:Inhibitor комплекс хорошо раствором и инкубировать также решения в закрытой среде. Этот шаг может быть выполнена вручную или с помощью робота дозирования.
    Примечание: Здесь, крупнейший и четко кристаллы (по оценкам однородного цвета под поляризатор, которая указывается форма роста) были получены при следующих условиях: 100 мм BisTris pH 7.0, 2.8-3,5% декстран сульфата (средняя 15 МВт кДа), 20 PEG 8,5-10% кДа в холодной комнате.

6. выращивания кристаллов в больших количествах

  1. Подготовить следующие решения запасов и их фильтрации через 0,22 мкм фильтр.
    1. Подготовьте 0,5 М BisTris pH 7.0 и BisTris пропан pH 7.0 и 7.5.
    2. Подготовка 30% (w/v) декстран сульфата (средняя МВт ~ 15 кДа). Хранить при 4 ° C.
    3. Подготовка 50% ПЭГ (средняя МВт ~ 12 кДа).
  2. Использование 24 хорошо висит падение пластины.
  3. Наносите смазку герметик на поднятые кольца каждой скважины.
  4. Подготовить хорошо решение следующим образом (конечная концентрация): 100 мм 2,8 – 3,5% декстран сульфата ~ 15 кДа, BisTris рН 7,0-7,5, 8,5-10% PEG ~ 12 кДа. Подготовьте хорошо 1 мл раствора в 1,5 мл пробирок.
    Примечание: Незначительные изменения состояния кристаллизации было отмечено, в зависимости от пакета белка, и/или декстран сульфата, таким образом пробу узкого круга рекомендуется. BisTris и BisTris пропан буферов же рН доходность монокристаллов.
  5. Храните хорошо решения и смазанную маслом тарелки в холодной комнате для по крайней мере 1 час.
  6. Подготовка IKK1:Inhibitor комплекс, как описано в разделе 4.3. Трансфер хорошо решения от 1.5 мл пробирок отдельных скважин 24 хорошо пластины.
  7. Чистой силиконизированный (коммерческие или внутренних (siliconization/silanization)) стеклянная крышка скользит с помощью безворсовой салфетки и применить воздушных форсунок высокого давления pinpointed использование коммерчески доступных аэрозоля тряпкой.
  8. Место 1 – 1.5 мкл раствора хорошо на чистой крышка выскальзования. Пипетка равный объем IKK1:inhibitor комплекс, осторожно перемешать, закупорить вверх и вниз 3 - 4 раза. Повернуть стекло крышки выскальзования и место на соответствующих хорошо с щипцами и печать также, нажав на смазку.
  9. После настройки все капли пластины 24-Ну, Инкубируйте пластину в холодной комнате в темноте. Время от времени проверяйте капли под микроскопом появление и рост кристаллов.
    Примечание: Это не тестировалась ли инкубации хрустальные пластины под свет будет изменить результат. Важно, однако, что пластины инкубируют в среде с минимальной/нет вибрации.

7. крио защиты кристаллов

  1. Подготовка крио решений.
    1. Подготовить Cryo A (~ 2% декстран сульфата, ~ 10% PEG 12000, 60 мм BisTris пропан (Всего же рН как решение предназначенных хорошо), 5 мм трис рН 7,5, 40-50 мм NaCl, 2,5% глицерина).
    2. Подготовить Cryo B (~0.3% декстран сульфата, ~ 10% PEG 12000, 60 мм BisTris пропан (Всего же рН как решение предназначенных хорошо), 5 мм трис рН 7,5, 40-50 мм NaCl, 20 или 25% глицерина или 20 или 25% этиленгликоля).
      Примечание: Испытания различных крио буферные помимо глицерина и этиленгликоля (например, ПЭГ 200, ПЭГ-400, ЗАБОЛТАТЬ 550 MME, 1000, ПЭГ).
  2. Аккуратно удалите скольжения крышка стекла, содержащие кристалл и поместите его на твердую поверхность с кристалл падение вверх. Аккуратно добавить 10 мкл Cryo A решения поверх падение и осторожно перемешать, закупорить так что кристалл не тронули.
    Примечание: Это очищает поверхности кристалла мусора и помочь сбалансировать кристалла с первоначального крио буфера. Избегайте механических и термических напряжений для кристалла. Выполните все последующие под микроскопом, чтобы избежать повреждения кристалла.
  3. Медленно удалить некоторые жидкости из хрусталя и держать около 5-8 мкл раствора. Избегайте обезвоживания кристалла. Принять крайней осторожностью, чтобы избежать механического напряжения и обезвоживания кристалла на всех последующих этапах.
  4. Аккуратно добавить 2,5 – 4 мкл раствора Cryo B на падение, очень осторожно перемешать, закупорить. Крышка с небольшой Петри, чтобы избежать прямого воздушного потока через кристалл. Подождите 5 минут всегда будьте осторожны, что кристалл не страдают быстрые изменения осмотического давления или обезвоживания.
  5. Повторите шаг 7.4 четыре раза медленно акклиматизировать кристалл в крио раствор.
  6. Держите 10 – 20 мкл раствора крио на данном этапе (т.е., позволяют кристалл, чтобы быть купались в около 20-25% крио Протравитель содержащих раствор). Замочите в течение различных периодов времени (5 мин до 1 часа) в крио решение.
  7. Заморозить несколько кристаллов в различные моменты времени.
  8. Тщательно выберите один кристалл от падения в соответствующей крио цикл монтируется на надлежащей базы и Плунге замораживание в жидкости N2. Выполните этот шаг, плавно и быстро чтобы избежать образования льда на кристалл.
    Примечание: Выберите кристалл, с помощью петли диаметром чуть больше, чем длинная ось кристалла, так что он может быть установлен в роботизированной гониометр, используемые в расширенный источник фотон, Аргоннской национальной лаборатории.
  9. Магазин хрусталя, содержащие крио петель шайбы, погружен в жидкость N2. Храните эти шайбы в жидкости N2 Дьюара до тех пор, пока они готовы к отгрузке для рентгеновской дифракции на синхротрона. Перейти к дифракции рентгеновских лучей сбора и обработки данных (разделы 8 и 9).
    Примечание: Дифракции данных IKK1 кристаллов из дома рентгеновских источников не были достаточно высокого разрешения для испытаний определение структуры, хотя это качество кристаллов проверяться на синхротронную. Все дифракции данные были собраны в разных излучение (преимущественно 19ID) заранее Фотон источник, Аргоннская национальная лаборатория, США.

8. рентгеновская сбора данных

  1. Сбор данных рентгеновской дифракции на ID19 излучение источника синхротронного APS, с использованием данных дистанционного сбора программного обеспечения34.
    Примечание: Свыше 100 кристаллов были протестированы для их свойств дифракции. Кристаллы обычно дифрагированных резолюции 7-11 Е, только редк кристаллы, которые дифрагированных за 5 Å были наблюдаемых и только один большой кристалл дифрагированных за 4.5 Å. Поскольку кристаллы распались быстро во время сбора данных, наборы данных в разных частях же кристалл были собраны. Это стало возможным, поскольку большие кристаллы (больше чем 400 мкм), и диаметр пучка используется 100 мкм.

9. рентгеновская обработка данных

  1. Слияние всех наборов данных, собранных на различных частях же кристалл34.
    Примечание: семь наборов данных были объединены из лучших кристалл, и полученные данные было 93% завершения. В целом я / σ ~ 6.8) и Rmerge составила 89% в высокой резолюции бин (5,4-4.5 Å).
  2. Наборы данных процесса с34 HKL2000 для получения пространства группа, размеры клеток, содержание растворителей и правдоподобными состав асимметричного подразделения.

10. Структура решение

  1. Подготовка моделей поиска
    1. На основании имеющихся структурных моделей hIKK2 (pdb идентификатор 4E3C и 4KIK35), генерировать серию димеры с различными ориентациями KD N-терминальный (что делает открытие 30 и 62 Å, между P578 два КД в димер). Ни одна из этих моделей выбраны молекулярной замена Поиск решения после обширных испытаний.
    2. Создание карты IKK1 от одной частицы крио ет данных33.
    3. Создать модель человека IKK1 от высоких резолюция структуры IKK2 (pdb id 4KIK).
    4. Закрепите отдельные домены человека IKK1 модели в крио EM плотность карта человека IKK1 с помощью ЛЫСУХА36. Это поворачивается KD ориентации около 24 градуса и изменение открытия до ~ 58 Е N-терминала.
    5. Применить KD ориентации крио ет установлены модели (мономер) для всех димеры сгенерирована 10.1.1.
  2. Молекулярные замена
    1. Использование димеры 10.1.1 и 10.1.5 как поиск моделей в программах PHASER37, MOLREP38 и39,ЦНС40.
      Примечание: Здесь, используя один из димеров от 10.1.5 (52 открытие Å) как a поиск модели, шесть димеров (два hexamers) были расположены в группе асимметричных с помощью MOLREP. 52 Å, открытие в модели поиска похож на 49-50 Å открытие димеров (все шесть димеры) в структуре изысканный.

11. Структура уточнение

  1. Процедура уточнения структуры
    1. Исправить ориентации и положения этой первоначальной модели изысканностью твердого тела в ЦНС (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Уточнение структуры, далее с помощью минимизации и имитации отжига с максимального правдоподобия целевой функции и коррекция плоской оптом растворитель, используя ЦНС системы39,40.
    3. Построить модель, основанная на 2FO-FC и Fo-ФК карты с использованием Xtalview41.
      Примечание: Применяется при содействии ден уточнение42 и NCS сдерживать во время уточнения для улучшения точности модели. Действительно ден уточнение значительно улучшились геометрии и R-факторов структуры и R-фактор составил 22,2% и бесплатные R-фактор был 27,8% для окончательной модели. Резкое улучшение бесплатные R должно быть вызвано высокой точности модели IKK1 доменов, которые были получены из модели IKK2 (4KIK).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Клонирование и выражения различных конструкций IKK1/α
Полная длина, которую человеческий IKK1/α был клонирован в pFastBacHTa вектор бакуловирусы выражение в его EcoRI и Ноти места ограничения для получения N-терминальный гекса гистидина с меткой IKK1. Тег может быть удалены ТэВ протеазы пищеварение. Так как полная длина IKK1/α содержит гибкие регионов на обоих концах, и гибкие регионы обычно обрабатывают белок сложных кристаллизуются, мы клонированные различные фрагменты усеченная IKK1/α в вышеуказанных сайтах pFastBacHTa вектора. Были созданы различные усечения мутантов IKK1/α с одичал тип (wt) и S176E, 180E магистралей (EE). IKK1/α EE относится к подражательный конститутивно активных формы фосфорилированных киназы. Производство рекомбинантных бакуловирусы и выражения протеина были проведены с использованием ранее опубликованного протокола с незначительных изменений43 (рис. 1).

Трудности в IKK1/α кристаллизации
Так как гомологичных человека IKK2/β и IKK1, и мы может кристаллизоваться различные версии человека IKK2/β в нескольких различных условиях, мы ожидали IKK1/α кристаллизоваться в аналогичных условиях, с использованием аналогичных стратегий. Однако, после обширных испытаний с несколькими различными вариантами IKK1, мы получили кристаллы с только одна усеченная конструкции (IKK1 10-667 EE) (Рисунок 2) и что только присутствии IKK ингибитор XII44 отображаемой подходит Дифракция рентгеновских лучей свойства.

Структура решения
Кристаллы IKK1/α страдал от многочисленных проблем роста, и часто отображаются данные очень высокой mosaicity. Слабых кристалл упаковки, связанные с большим содержанием растворителей и динамичный характер IKK1 мономера/димер являются скорее всего причиной этого. Чтобы обойти эти проблемы, были приняты настойчивые усилия для получения лучших возможных кристаллов, и крио сохранение процедура была выполнена с особой осторожностью при различных условиях и различные буферы крио консервант. Данные были также собраны с конечной точностью, чтобы свести к минимуму ущерб луча. Поскольку кристаллы (крупнейший крупногабаритные часто превышает 400 мкм), различные области же кристаллы были подвержены рентгеновского луча для сбора нескольких наборов данных. Это позволило различных наборов данных необходимо расширить и получить достаточно полный набор данных с более высокой избыточности и свести к минимуму ошибки. Ванну с тяжелых атомов, или тяжелые atom кластеров (например, TaBr и Тамм), вызвало кристаллов преломлять неадекватно. Хотя мы могли бы найти положение TaBr кластеров в производных данных, низкое качество данных в дополнение к не isomorphocity представили мало, если таковые имеются, фаза информацию.

Мы обработали наборов данных с HKL2000 с помощью различных доступных параметров. Дифракционный рисунок показали, что кристалл принадлежит пространства группы P21 с размерами ячейки блока, = 174.51, b = 186.94, c = 275.83 Å и β = 98.84 градусов. Мы использовали главным образом я / σ для оценки производства и испытаны различные обрезков для наборов данных. Мы получили объединенный набор данных 4.5 Å резолюции от 4 7 наборов данных дифракции, собранных на одном кристалле. Мы решили сохранить данные до 4.5 Å от визуального осмотра окончательной плотности карты. Это может быть целесообразным использовать CC1/2, поскольку мы можем аналитически оценить CC объединенного набора данных против истинный (обычно неизмеримая) света, с использованием CC *45. Из-за большой ячейки в сочетании с низкой симметрии пространства группы мы ожидали асимметричной блок содержит 12 до 24 молекул на основе с содержанием растворителей от 70% до 40%.

Совокупный эффект низкой резолюции рентгеновских данных с слабой интенсивности (например, значительные ошибки в данных) (Рисунок 3), большое количество IKK1 молекул в асимметричного и конформационные изменения мономерных/димерной модели IKK1 (12) по сравнению с известными IKK2 модели, первоначально помешало нам от получения молекулярных замена решение IKK1 и таким образом определение его структуры.

IKK1/α и IKK2/β содержат домен киназы (KD), убиквитин как домен (ULD) и домен-винтовой эшафот димеризации (SDD). Структура IKK1 показал, что он образует димеры аналогично IKK2 используя почти идентичные интерфейс между Субблок дистальной части SDD. Однако IKK1 димер отображаются значительно отличаются относительное позиционирование из N-терминальный KD относительно SDD + ULD по сравнению с известными димеры IKK2. Различные структуры IKK2 ранее указал различные intermonomer ориентации в рамках ее димеров (Рисунок 4Группа A), так что расстояния между альфа-угли P578 в двух КД в четырех различных димер моделей варьируется между 39 и 61 Å. Так как последовательности этих двух киназы очень похожи и остатков на интерфейсе димер идентичны, мы ожидали, что IKK1/α бы сформировать аналогичный димер; Однако поскольку существуют значительные различия в остатки KD-SDD интерфейса (например, W424 и F111 в IKK2 являются V и P соответственно), мы ожидали возможно еще KD ориентацию в IKK1. Действительно IKK1/α структура указал, что соответствующие ориентиры KD SDD является уникальным и отличается от всех известных моделей IKK2/β. Свыше ста димер модели были использованы как поиск моделей в программах PHASER, MOLREP и ЦНС без успеха, указывая на необходимость довольно точный поиск модели для успеха молекулярных замены судебных процессов, особенно с нашими разрешением данных. Мономер модель имеет слишком мало массы подобрать любое решение в слабых дифракции данных больших асимметричной блок, содержащий 12 мономеров. Кроме того включение или бездействие воды в модели поиска сделал никакой разницы в молекулярной замена поисков, особенно из-за слабого дифракции данных. CC1/2 и CC указывает, что данные до 4.5 Å является довольно точным. Мы использовали консервативной резолюции отсечения 4.5 Å основаны на я / σ 1,5. Наборы данных с различных резолюции обрезков не показывают Старк разница во время замены молекулярного поисковых операций, и окончательные карты, изысканные против эти наборы данных не показывать любое заметное улучшение в функции карты после расширения обрезков. Финальная сборка модели является довольно точной, больше, чем то, что может быть построен от плотности только, вероятно, поскольку первоначальный молекулярной Замена модели были построены от моделей, полученных с высоким разрешением данные, и мы использовали крио Эм карта/плотность кросс проверить функции карты, особенно в регионах, где карты были неясны.

В ретроспективе получение полезных Поиск модели можно было только из-за наличия крио EM карты низкого разрешения и довольно высокая точность модели IKK1 доменов, которые могут быть получены на основе высокого разрешения IKK2 структуру (рис. 4 Группа B). Мы могли бы закрепить IKK1 домены в крио EM карты IKK1 для получения достаточно близко димер модели. Первоначальная модель указал ориентацию KD вращается около 24 градусов по отношению к что IKK2 мономера и N-терминальный открытие 58 Å (между P578 два KDs в димер). Наши предварительного знания о различных структур димера IKK2/β (и их вариации) позволило нам совершенствовать модель поиска, изменив отверстия между 30-62 Е. Использование одного из димеров (открытие 52 Å) как a поиск модели, мы расположены шесть димеров в асимметричной устройство Программа MOLREP46. Эти шесть димеры организованы в две hexamers в группе асимметричных и рассчитанные растворитель имеет объем 68%.

Figure 1
Рисунок 1: очищение IKK1. (A) выражение из IKK1 (10-667) в клетках насекомых. (B) схема для очистки IKK1; (C) геля SDS-PAGE показаны чистоту IKK1 после шага хромотографии сродства Ni-НТА. (D) размер отчуждения Профиль указанием димера IKK1. (E) геля SDS-PAGE показаны чистоту IKK1 от пик фракций размер исключение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: морфология и размер кристаллов IKK1. (A) кристалл IKK1 построить 10-667; падение кристаллизации также показывает кристаллы другой морфологии (тонкие пластинки), которые не преломлять хорошо. (B) увеличено с учетом кристалл, который дифрагированных за 5 Å. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 :. Кристаллографическая данные, полученные из IKK1 кристаллов. (A) рентгеновской дифракции профиль IKK1 кристалла, указывающее бедных дифракционные свойства типичных IKK1 кристаллов. (B) HKL2000 масштабирования статистика объединенного набора данных, используемого для определения структуры IKK1 и избыточность данных. R линейной = SUM (ABS (I - < i >)) / сумма (I), R-квадрат = SUM ((I - < i >) ** 2) / сумма (я ** 2), Чи ** 2 = SUM ((-< i >) ** 2) / (ошибка ** 2 * N / (N-1))), CC1/2 = коэффициент корреляции, CC * = коэффициент корреляции объединенного набора данных против истинной интенсивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: подготовка моделей поиска. (A) различных моделей димера IKK2, указывающее различными ориентациями KD относительно SDD (порождает различные разделения между двумя KD); Эти модели были протестированы сначала найти решение молекулярной замена без какого-либо успеха. (B) поколения IKK1 Поиск модели - крио-Эм карта димера IKK1 на 11 Е резолюции; EM-карты установлены первоначальные модели поиска IKK1, отдельные домены основаны на модели IKK2 (4KIK); IKK1 Поиск модель дальнейшее tweaked штраф (соответствующие KD ориентации) на основе различных возможностей как рассужено от IKK2 модели описывают выше в 4а; Суперпозиция EM-карты установлены модели для модели поиска, которые принесли молекулярных замена решение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Производство, кристаллизации и структура решение двух родственных белков IKK
Мы задались целью определить рентгеновского Кристаллическая структура IKK1/α с понятием, что было бы относительно просто упражнения, учитывая наш опыт работы с IKK2/β производства белка, кристаллизации и определения структуры. Однако мы были весьма удивлены тем, что эти два родственных белков повел себя очень по-разному отношении легкость кристаллизации. Несмотря на усилия, от нескольких громких лаборатории определение структуры IKK1 занимает почти два десятилетия. Это во многом обусловлены несколько ключевых проблем.

Первая трудность заключается в том, чтобы получить форму очень чистой и растворимого белка. Выражение системы насекомых клеток позволило нам получить количество мг чистого белка, который был достаточно растворимых. В отношении уровня выражения все конструкции IKK1/α выразил на гораздо более низких уровнях, чем IKK2/β конструкций в системах выражения насекомых клеток. Следует отметить, что ни белок растворимых и функциональной, когда выражается в E. coli. В системе выражение насекомых клеток, фрагменты IKK2/β, выраженные на высоком уровне, варьировались от 10 до 30 мг/Л культуры в зависимости от конструкции. В отличие от IKK1/α конструкции могут создаваться только на 0,5-2,0 мг/Л культуры. Причина этого различия до сих пор неизвестна нам. Мы должны также попробовать выражение IKK1 в родной принимающей ячейки (то есть, млекопитающих гиперэкспрессия системы в случае млекопитающих IKK белка), особенно после столб-поступательные изменения таких авто - или транс фосфорилирование, часто встречающихся в IKK будет происходить наиболее эффективно и надлежащим образом в его родной среде. Также в настоящее время поддается очистке IKK комплексов непосредственно от крупных масштабах культуры mammalian клеток.

При работе с IKK2/β, мы заметили, что он может быть однородно auto фосфорилированных, рассматривая с СПС, и это делает белок поддаются кристаллизации. Аналогично инкубационный IKK1 белка с СПС и результирующая auto фосфорилирование, принесли активированный IKK1, который растворяется и подходит для биохимических характеристик и определения структуры кристалла.

Важным шагом для получения хорошо Дифрагирующая кристаллы был для тонкой настройки условий, кристаллизации, в частности, добавление соответствующего типа и концентрации молекул декстран сульфата. Плотность указывает связанный декстран сульфата молекул, и ее результирующий эффект на IKK1 был вероятно критических для кристаллизации.

Присущи гибкость IKK1, который часто наблюдается в киназы, является основным сдерживающим фактором для кристаллизации и часто связан с участие киназы домена с активации цикла. IKK2 с родной (S177 и S181) и phosphomimetic (EE) формы serines цикла активации может быть кристаллизуется, но мы только получили кристаллы с усеченной IKK1/α СС EE черепашки версии, и что слишком только в присутствии ингибиторов XII IKK. Эти кристаллы дифрагированных достаточно хорошо для определения структуры только тогда, когда вырос в холодной комнате (~ 4-6 ° C). Если мы сталкиваемся с аналогичным образом упорным поведение с любой гомолога IKK1 (или IKK ortholog), мы можем попробовать различные изменения позвоночника (особенно среди остатков Серина цикла активного узла, которые обычно фосфорилированных). Также мы можем попробовать совместно кристаллизации в присутствии взаимодействующих партнер белков. Многие киназы, в том числе семьи IKK, взаимодействуют с партнером белков и находятся в высок заказа комплексов.

Несколько ингибиторов помогают производить IKK2 кристаллы в различных условиях (например, с обеих высоких соли, PEG качестве осадителя), как при 18 ° C, так и в холодной комнате. Однако в аналогичных условиях и с различными ингибиторов, IKK1/α не представила каких-либо кристалл. Таким образом использование больших репертуар ингибиторов несомненно увеличит шансы найти один позволяющие кристаллизации.

Другим важным шагом в определении структуры был тщательно крио сохранение и процедура сбора данных. Слабых данных и быстрого распада кристаллов в рентгеновского пучка оправданным потребность крупных кристаллов и сбора нескольких наборов данных от же кристаллов. Без разумного полный набор данных высокой точности мы могли бы не удалось получения молекулярных замена решения.

Наконец мы не смогли определить структуру IKK1/α молекулярной замены с помощью более чем 100 моделей, созданных из известных IKK2/β структурных моделей, доступных в базе общественных. Таким образом получение соответствующей модели для молекулярной замены процедуры было необходимо. Крио Эм карта, высокая точность структурных моделей отдельных доменов, а также сравнительные исследования ранее решила, что IKK2 структур привели нас к получить модель поиска, который принес нам решение молекулярных замена.

Кристаллизации белка по своей сути случайных, так что несмотря на выше структурированных указаниями, мы может столкнуться с проблемами в кристаллизующийся другой гомолога IKK1 или другой полнометражного или усеченных конструкт человеческого IKK1. Независимо от того знание этих критических шагов позволит исследователя исследовать рациональные условия, которые увеличат шансы получения хорошо Дифрагирующая кристалл IKK.

IKK1/α и IKK2/β отображения аналогичные домена организации, но разные укорачивания Организации
Не удивительно IKK1/α и IKK2/β принять очень похожие архитектура домена, вытекающих из их высокой последовательности сходство33,43. Как указывалось ранее, IKK1/α и IKK2/β сложить в трех отдельных областях: N-концевой домен киназы, убиквитин как домен (ULD) и леска димеризации домен (SDD). IKK1/α и IKK2/β формируют стабильные димеров в котором половина SDD участвовать в димеризации C-терминала. Участвует в формировании димер остатков являются идентичными. Однако, между домена взаимодействий между SDD/ССП и KD несколько отличаются, поскольку они включают различные остатков. Также вероятно причиной относительной ориентации киназы домена SDD в IKK1/α будет отличаться от того IKK2/β. Это не было совершенно неожиданным, поскольку мы также наблюдаем различия среди доступных моделей IKK2/β димер. Интересно, что димеры IKK2/β можно организовать в тетрамера в кристаллической решетке, несмотря на то, что этот tetramerization склонность слабых в растворе. Однако IKK1/α димеры сформировали уникальный hexamers. Эти hexamers также наблюдаются в растворе, хотя лишь небольшой бассейн IKK1/α димеров существуют как hexamers. Эти показывают, что hexamerization может иметь конкретные и критические функции.

Дифференцируя функциональные отличия от структурных различий
IKK1/α и IKK2/β выполняют различные функции в клетках. Однако отношения между IKK1/α функции и структура остается недостижимой. IKK1/α явно существует в различных формах: Бесплатные димер или hexamer и в рамках ранее uncharacterized гетеро тример комплекс вместе с IKK2/β и Немо. Поскольку IKK2/β активации канонические сигнализации не требует IKK1/α, функциональная роль IKK1/α в heterotrimer (каноническое IKK-комплекс) остается неясным. Неясно также, если активация IKK1/α индуцированных неканонических сигнализации опирается на бесплатные димерной IKK1/α и/или hexameric IKK1/α. Так как мутационного эксперименты показывают, что срыв hexamer интерфейса сильно влияет на неканонических сигнализации, hexamerization скорее всего необходимо на определенном этапе во время неканонических сигнализации.

Проектирование малых молекул ингибиторов, с помощью структуры IKK1/α
Зная, что структура IKK1/α позволяет нам исследовать поверхности пятна на мономера или карманы на интерфейсы между домена или Интер мономера, которые могут быть направлены на малых молекул. IKKs уже давно считается важным лекарственных препаратов. Однако существенности этих киназ в различных функций, включая клеточного гомеостаза, научные жизнеспособность и иммунитет делает его чрезвычайно трудно ориентироваться на них. До настоящего времени не ориентированные на IKK молекулы было установлено, что может безопасно использоваться у пациентов.

IKK1/α и IKK2/β часто нацелены одновременно их ингибиторов поскольку их киназы домены очень похожи в последовательности и в структуре. Значительные исследования усилий было потрачено в поиске специфичные ингибиторы таргетинг только один из этих двух киназы. Следовательно было выявлено несколько IKK2/β-специфические ингибиторы, некоторые из которых не влияет на функции IKK1/α. Однако насколько нам известно, что нет такого соединения существует что эффективно подавляет IKK1/α без нарушается функция IKK2/β. Это отсутствие может объясняться отсутствием структурной информации о IKK1/α. Наши структурные и сотовых исследования показывают, что, хотя договоренности домена и глобального Субблок структуры очень похожи в этих двух белков, они отображения уникальные высок заказа договоренности, которые работодатели удельная поверхность патчи33. Эти различия, которые позволяют различные взаимодействия с связанных белков необходимо перевести на их функциональные различия. Мы надеемся, что эти различия выявлены между IKK1/α и IKK2/β субъединицы и внутри взаимодействия может быть использована чтобы сделать аллостерический Субблок специфичные ингибиторы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что без финансовых интересов или другие конфликты интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим сотрудников на излучение 19ID, 24ID и 13ID на расширенный источник фотон, Лемонт, Иллинойс, для поддержки во время сбора данных о различных кристаллов. Мы благодарны Lyumkis Дмитрий, Солка институт для выборки нас низким разрешением крио Эм карта на ранних стадиях Эм карта/построения модели, которая использовалась для построения начального IKK1 молекулярные замена Поиск модели. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от НИЗ грантов, AI064326, CA141722 и GM071862 гг. SP в настоящее время Добро пожаловать доверять DBT Индии промежуточных парень.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Tags

Биохимия выпуск 141 Серин-треонин протеин киназы IKK1/α NF-κB Кристаллическая структура молекулярные замена ингибитор
Руководство по продукции, кристаллизации и определения структуры человеческого IKK1/α
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Polley, S., Huang, D. B., Biswas,… More

Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter