Summary
קינאז IκB 1/α (IKK1/α CHUK) הוא חלבון Ser/חמישי קינאז מעורב מספר עצום של פעילויות הסלולר בעיקר באמצעות הפעלה של גורמי שעתוק NF-κB. כאן, אנו מתארים את השלבים העיקריים הדרושים כדי להפוך את ייצור מכשור לקביעת קשיות ומבנה הגביש של חלבון זה.
Abstract
מחלקה של גירויים חוץ-תאית מחייב הפעלה של IKK1/α לזירוז דור של יחידת משנה NF-κB, p52, דרך עיבוד p100 קודמן שלו. פונקציות p52 homodimer או heterodimer עם יחידת משנה נוספת של NF-κB, RelB. הדימרים הללו בתורו לווסת את הביטוי של מאות גנים מעורבים דלקת, הישרדות cell ו מחזור התא. IKK1/α בעיקר נשאר משויך IKK2/β, נמו כמו קומפלקס ternary. עם זאת, בריכה קטנה של זה הוא ציין גם בתור complex(es) נמוך משקל מולקולרי. זה לא ידוע אם הפעילות עיבוד p100 המופעלת על-ידי הפעלה של IKK1/α במרחק גדול יותר או של הבריכה מורכבת קטנים יותר. פעילות המכונן של IKK1/α זוהתה במספר סוגי סרטן ומחלות דלקתיות. כדי להבין את המנגנון של הפעלה של IKK1/α, ולאפשר את השימוש בו כמטרה סמים, אנחנו הביע IKK1 רקומביננטי/α במערכות מארח שונים, כגון e. coli, חרקים, ואת תאי יונקים. שהצלחנו להביע מסיסים IKK1 α ב baculovirus נגוע תאים חרקים, קבלת mg כמויות של פרוטאין טהור מאוד, אך איבדו מחוזקן. בנוכחות מעכבי, וקביעת מבנה שלה. כאן, אנו מתארים את השלבים המפורטים כדי לייצר חלבון רקומביננטי להתגבשותו, נחישותה מבנה הגביש רנטגן.
Introduction
פעילות גנים ברמת השעתוק NF-κB משפחתו של גורמי שעתוק dimeric נדרשים לפונקציות הסלולר מגוונות, החל דלקת וחסינות הישרדות ומוות. פעילויות אלה נשלטים והטכני תאים, לאובדן של רגולציה מוביל מצבים פתולוגיים שונים, כולל הפרעות אוטואימוניות וסרטן1,2,3. בהיעדר גירוי, הפעילות של NF-κB נשמרים עכבות על ידי חלבונים IκB (מעכב של - κB)4. זירחון של שאריות Ser ספציפי על חלבונים IκB מסמן אותם ubiquitination, proteasomal הבאים השפלה או עיבוד סלקטיבי5. Kinases שני Ser/חמישי מאוד הומולוגיים, IKK2/β, IKK1/α, לשמש הרגולטורים המרכזי של NF-κB פעילויות על-ידי ביצוע אלה זרחון אירועים6,7.
אינטראקציות בין ליגנד קולטן transduces אות דרך סדרה של מתווכים מובילים לקראת הפעלת גורמי NF-κB. באופן כללי ניתן לסווג תהליך האיתות NF-κB שני מסלולים נפרדים – ואמנות קאנונית (אלטרנטיבית)8. הפעילות של IKK2/β בעיקר מסדיר את NF-κB איתות של הנתיב הקנוני חיונית תגובות חיסוניות דלקתיות, מולדת9. תכונה ברורים של מסלול זה היא הפעלה של מהיר ולא קצרת ימים של IKK2/β10 בתוך IKK עד כה מבחינה ביוכימית uncharacterized מורכבות – אוכל מורכב IKK1, IKK2, כמו גם רכיב תקינה, נמו (NF-κB חיוני אפנן )11,12,13. בין שני קטליטי IKK subunits של המתחם IKK, IKK2 הוא בעיקר אחראי14 עבור זירחון של שאריות ספציפית של IκBs טיפוסית (α, - β, & - γ) קשורה NF-κB, וגם של החלבון IκB טיפוסיות, NF-κB1/p105, אשר הוא קודמן של יחידת משנה p505NF-κB. זרחון המושרה ubiquitination ומוביל proteasomal השפלה של IκB (או עיבוד של p105) שחרור, הפעלה של קבוצה ספציפית של NF-κB הדימרים15. פעילות חריגה NF-κB בשל הפונקציה מוסדר בצורה שגויה של IKK2 נצפתה ב סרטן רבים כמו גם כמו הפרעות אוטואימוניות2,3,16.
בניגוד IKK2/β, מווסת פעילות של IKK1/α NF-κB איתות של מסלול קאנונית, שהיא הכרחית עבור פיתוח חסינות. IKK1 phosphorylates שאריות ספציפי של NF-κB2/p100 שלה קטע C-terminal IκBδ, מה שמוביל את העיבוד שלו, את הדור של p52. היווצרות של heterodimer p52:RelB transcriptionally פעיל יוזם תגובה איטית ומתמשכת אותות התפתחותית7,17,18,19,20. מעניין, הדור של p52 גורם מרכזי NF-κB של מסלול זה תלויה באופן ביקורתי גורם נוסף, NF-κB גרימת קינאז (NIK)21,22, אבל לא על IKK2 או נמו. בתאים resting, הרמה של ניק נשאר נמוך עקב שלה24,23,השפלה מתמדת פרוטאוזום תלוית25. על גירוי של תאים על-ידי ליגנדים 'קאנונית' ולאחר בתאים ממאירים מסוימים, ניק הופך התייצב לגייס ולהפעיל IKK1 / α. פעילות קינאז של ניק וגם IKK1 הם חיוניים עבור עיבוד יעיל של p100 לתוך p527. IKK1, ניק phosphorylate serines 3 (Ser866, 870, 872) של NF-κB2/p100 בקטע שלה-IκBδ C-מסוף המוביל את העיבוד שלו את הדור של p52. ההפעלה aberrant של השביל קאנונית היה מעורב ממאירות רבות כולל מיאלומה26,27,28.
מספר מעכבי מאוד יעילה, מדויקת עבור IKK2/β ידועים, למרות אף אחד עד כה יש התברר להיות תרופה יעילה. לעומת זאת, מעכבי IKK1/α-ספציפיות הם דלילים. זה עשויה לנבוע בחלקה שלנו חוסר מידע ביוכימי מבניים על IKK1/α, אשר מגביל את ההבנה שלנו של הבסיס מכניסטית של הפעלה של NF-κB מאת IKK1 תאים, תכנון תרופות רציונלי. המבנים רנטגן של IKK2/β סיפק לנו תובנות לגבי מנגנון ההפעלה של IKK2/β29; עם זאת, מבנים אלה לא יכלו לחשוף כמה שונה לגירויים במעלה להפעיל הפעלה של IKK1/α או IKK2/β להסדיר סטים ברורים של NF-κB פעילויות 30,31. כדי להבין את הבסיס מכניסטית שבבסיס הפונקציה האיתות מובהק של IKK1/α, וכדי ליצור פלטפורמה עבור תכנון רציונלי תרופות, התמקדנו לקביעת המבנה של IKK1/α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת וירוס רקומביננטי מתאים לביטוי בקנה מידה גדול של IKK1/α
-
הכנת וירוס P1 32
- יום 1: צלחת Sf9 תאים (~ 6 X 105) (פסקה מספר פחות מ 10) ב 2 מ של Sf900 השלישי תא חרקים בינוני בכל טוב של צלחת 6-ובכן, דגירה ב-27 º C מעבר תאים כאשר הם מגיעים צפיפות של 2-3 X 106 תאים לכל מ ל השעיה על-ידי דילול לתוך המדיה טריים-צפיפות של ~ 6 X 105.
- יום 2: לדלל 8 µL של ריאגנט Sf9-תרביות תאים ב- 100 µL Sf900 III או של גרייס חרקים בינוני ללא אנטיביוטיקה, סרום. מערבולת בקצרה.
- למהול 1 µg של ערכת טיהור bacmid רקומביננטי (פרטים הינם מסופקים בחדרי 'נציג תוצאות')32 לתוך עוד 100 µL של המדיום אותו, צינור נפרדים.
- לשלב DNA מדולל ו ריאגנט תרביות תאים (הנפח הכולל ~ 210-220 μL), דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות.
- הסר את המדיום של הבאר. להוסיף 1 מ"ל בינוני טריים ללא אנטיביוטיקה, סרום.
- להוסיף את התערובת ריאגנט מדולל DNA-תקנים dropwise אל התאים. להתאים את גודל טיפה כזאת זה לא לסלק תאים חסיד.
- לאחר ~ 6 h, להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני טריים מלמעלה או להסיר את המדיום ולהוסיף 2.5 מ ל בינוני טריים. חם בינוני טריים עד 25-27 מעלות צלזיוס לפני חיבור.
- דגירה התאים ב-27 º c בדוק את בארות מעת לעת בכל ~ 12 h סימנים של זיהום ויראלי. לבצע את כל Sf9 תחזוקה, ביטוי ב-27 º c
- יום 5: להוציא את המדיום המכיל תאים 60-72 h פוסט זיהום. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. להציל את תגובת שיקוע; זה המניה P1-וירוס. להקפיא aliquots קטן ב- 80 ° c
-
בחירת הטוב ביותר להביע P1 וירוס שיבוט.
- צלחת תאים באופן דומה כפי שמתואר בשלב 1.1.
- פוסט יום או h ~ 6 הבא יופיצ, מוסיפים 20 µL µL 50 מניות שיבוט וירוס P1 שונה על גבי התאים בבארות שונים.
- לסלק את תאים חסיד מאת pipetting עדין ולקצור הזיהום פוסט 60-72 h תאים נגועים על ידי צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. שמור את תגובת שיקוע. זהו וירוס P2 המניה. Aliquots חנות קטנה של המניה ב- 80 ° c
- להוסיף 100 µL 2 x Laemmli מרחביות מאגר בגדר תא שנקטפו. מחממים > 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות צנטריפוגה (בדרך כלל > 10,000 x g) במשך 5 דקות.
- לרוץ 10-15 µL של כל מדגם מרחביות-עמוד 8-10%-V 120-160 עד לחזית צבע מגיע התחתון של הג'ל.
- אלקטרו-העברת החלבונים נפתרה על ידי תקן יבש למחצה להעביר פרוטוקול (20 V, 30-45 דקות) על קרום ניטרוצלולוזה/PVDF.
- כתם עם נוגדן anti-IKK1 (דילול ~ 1:2, 000, חייב להיות מותאם) או נוגדן anti-PentaHis (דילול ~ 1:3, 000, חייב להיות מותאם) לביטוי.
- לבחור השיבוט וירוס P1 הטוב ביותר על-ידי השוואת הביטוי של IKK1 רקומביננטי.
-
הכנת בקנה מידה גדול P3 וירוס מניות.
- צלחת תאים באופן דומה כפי שמתואר בשלב 1.1 לתוך צלחת 15 ס מ המכיל 25-30 מ של Sf900 השלישי בינוני.
- ~ 6 h פוסט יופיצ, להוסיף 150-300 µL של המניה ביותר לביטוי של וירוס P1 אל התאים.
- לאחר 72 h פוסט זיהום, תשאף האמצעי בזהירות לצלחת בשפופרת המתאים (סטרילי), centrifuge את הצינור ב 500-1000 g X 10 דקות ב 4 º C. למחוק בגדר תא (אם אחד נוצר) ולשמור את תגובת שיקוע. זה מניות וירוס P3.
-
לקבוע את titre וירוס האופטימלי עבור ביטוי חלבונים בקנה מידה גדול
- צלחת תאים ב- 2 מ של Sf900 השלישי בינוני, כפי שמתואר ב 1.1, בצלחת 6-. טוב.
- הוסף 20, 30, 40 ו- 50 µL של P3 וירוס מניות נפרדים בארות ~ 6 h פוסט ציפוי. כוללות פקד נגוע.
- קציר תאים מפני הידבקות פוסט כל טוב h 48-60.
- להוסיף 100 µL 2 X Laemmli מרחביות המאגר. מחממים > 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות צנטריפוגה (בדרך כלל ב 14,000 x g) במשך 5 דקות.
- לפתור 10-15 µL של כל מדגם ג'ל מרחביות-דף 8-10%.
- העברה נפתרה חלבון קרום ניטרוצלולוזה/PVDF כאמור 1.2.6.
- כתם עם נוגדן anti-IKK1 (דילול ~ 1:2000, חייב להיות מותאם) או נוגדן anti-PentaHis (דילול ~ 1: 3000, חייב להיות מותאם).
- השתמש הנגיף עם הטוב ביותר להביע titre עבור ביטויים בקנה מידה גדול.
2. בקנה מידה גדול ביטוי של 6 x-שלו מתויג האנושי IKK129,33
- לבצע את הביטוי בקנה מידה גדול בתרבות ההשעיה. פצל תאים 1 ליטר של Sf900 השלישי בינוני בבקבוקון Erlenmeyer L 2 עם כובע פרקו. צפיפות התא צריך להיות ~ 5 x5 10 תאים/מ.
- לגדל תאים אלה ההשעיה-~ 100 סל ד ב 27 ° C ב שייקר ~ 2 ימים עד שיגיע צפיפות של 1-2 x 106/mL. צפיפות התא אינו יכול לחרוג 2 x 106/mL.
- להוסיף את הכמות הרצויה של וירוס P3, כפי מוערך ב- 1.4.
- לגדול התרבות הנגועים במשך 48-60 h-~ 100 סל ד ב 27 ° C ב שייקר.
- קציר תאים על ידי צנטריפוגה-< 1,500 x ג'י ב- 4 מעלות צלזיוס.
- להציל את צניפה תא ולמחוק את המדיום.
- המשך חלבון טיהור ישירות. פלאש להקפיא בגדר תא חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
3. טיהור של שלו-IKK133
- יום 1, resuspend בגדר תא ב- 40 מ של פירוק מאגר (25 מ מ טריס pH 8.0, 0.2% NP-40, 200 מ"מ NaCl, imidazole 10 מ מ, 10% גליצרול, 5 מ מ β-mercaptoethanol ומעכב פרוטאז קוקטייל).
הערה: בגדר רטובים מסה לא נקבע. בדרך כלל, ~ 2 L של תרבות שימשה בשלב זה. - Lyse התאים על ידי sonication-60-70% מחזורי, 5-10 פולסים של משך s 30 במרווח של > 1 דקות, שמירה על התליה תא מקורר על קרח.
הערה: שלב זה דורש אופטימיזציה עם כל דגם של sonicator. אל תתנו את הדגימה לחמם מעל 10 מעלות צלזיוס. - להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה ב g 28,000 x ≥ למשך 45 דקות ב 4 º C.
- Equilibrate 4 מ"ל של ני-נ Agarose שרף עם פירוק מאגר, לערבב שקופה lysate (תגובת שיקוע) ע פ הפרוטוקול של היצרן.
- לאפשר החלבון לאגד השרף על-ידי המקננת כבר שעתיים על מערבל רוטרי בחדר 4 ° C.
- לשטוף ביסודיות השרף עם המאגר פירוק המכיל 30 מ מ imidazole. בדוק ריכוז חלבון השבר שטיפת מעת לעת באמצעות שיטת ברדפורד. לשטוף עד זה ריכוז חלבון השבר שטיפת מגיע 0.1 מ"ג/מ"ל. בדרך כלל מיטה > 20 נפח מאגר שטיפת נדרש כדי להגיע לנקודה זו.
- Elute חלבון IKK1/α שלו מתויג תחת זרימת הכבידה, באמצעות 20 מ"ל • תנאי מאגר (המאגר פירוק המכיל 250 מ מ imidazole). לאסוף את השברים 1-1.5 מ.
- בדוק את הטוהר של חלבון eluted על ג'ל מרחביות דף 8 או 10% על-ידי טעינת μL 5-10 מדגם של שברים כל מעורבב עם מאגר Laemmli.
- בריכה שיא שברים (ריכוז ≥ 2 מ"ג/מ"ל), למדוד ריכוז חלבון באמצעות וזמינותו ברדפורד.
- לעכל עם אס (1:30-50 (אס פרוטאז: IKK1)) פרוטאז בן לילה (≥12 h) ב 4 º C.
הערה: למטב את כמות אס פרוטאז נדרש להשלים עיכול (≥ 95%) התג שלו-X 6 א-פריורי. פרוטאז אס היה טהור בבית. - בבוקרו של יום 2, דגירה החלבון עם 1 מ מ ATP בנוכחות 20 מ מ MgCl2, β-glycerophosphate 20 מ מ, 10 מ מ NaF 1 מ"מ orthovanadate נתרן עבור h 1 ב-27 º c
- לסנן את הפתרון חלבון דרך מסנן μm 0.45 או 0.22.
- לטעון 6 מ של המדגם אל ~ 120 מ"ל מפוח הוצאת גודל עמודה מחוברת מערכת ממוכנת כרומטוגרפיה נוזלית. Equilibrate את העמודה עם מאגר A (20 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 150 מ מ NaCl, 5 מ מ DTT, 5% גליצרול), לפני החלת המדגם חלבון.
הערה: עמודה קטנים יותר ניתן להשתמש בהתאם התשואה של חלבון לאחר השלב טיהור זיקה Ni-נ. ת. התאם/לחשב נפח 5% נפח עמודה). - להפעיל את גודל-הדרה כרומטוגרפיה בספיקה של 1 מ"ל/min, ולעקוב אחר • תנאי-280, 254 ננומטר. לאסוף את השברים בגודל 2 מ.
- לבדוק את טוהר שברים שיא (בדרך כלל סביב ~ 60-70 מ ל) על ג'ל מרחביות-דף 8-10%.
- בריכה שברים טהור (טוהר ≥95% עם ריכוז של ≥0.5 מ"ג/מ"ל) ותתרכזו 10 kDa או 30 kDa משקל מולקולרי ניתוק החלבון צנטריפוגלי רכז ההוראות של היצרן.
- מפעם לפעם לבדוק ריכוז חלבון מרוכז שיטת ברדפורד, ותתרכזי הדגימה עד 8-12 מ"ג/מ"ל
- לוותר על 25 μL aliquots, הקפאת פלאש בחנקן נוזלי. חנות הדגימות פלאש קפואים במקפיא-80 ° C.
4. מסך עבור תנאי התגבשות של IKK1
- לחשב את הסכום הכולל (לפי נפח) של חלבון הדרוש על המסך עבור גבישים הבאים השיטות המתוארות להלן.
- נסה מעכבי שונים (מעכבי קינאז כלליים: AMPPNP, Staurosporine; IKK-specific מעכבי: MLN120B, מתחם A ו- IKK-מעכב XII) לבצע סינון עבור התגבשות. להפוך פתרונות מניות של תרכובות אלו ההוראות של היצרן. ודא כי הריכוז המרבי של המתחם בפתרון מניות שלה לא יעלה על 20 μM.
- להכין את IKK:inhibitor מורכבים עבור מסך התגבשות על ידי ערבוב 100 μM של IKK1 עם 200 μM מעכב, דגירה ב 18-20 מעלות צלזיוס במשך 30-40 דקות Centrifuge תערובת זו-> g 15,000 x למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. שמור את תגובת שיקוע התגבשות למסך.
- השתמש המסכים התגבשות זמינים מסחרית (ראה את הטבלה של חומרים).
- Pipette μL 80-100 של כל ריאגנט התגבשות (מאגר פתרונות), באמצעות פיפטה רב-ערוצי או רובוט, לתוך המאגר של צלחת 96-ובכן. הצלחת עכשיו הוא מוכן להגדיר טיפות. ודא כי הצלחת להכיל התגבשות 2-3 טיפות כך מעכבי 2-3 יכול להיות מוקרן בצלחת אחת.
- באמצעות רובוט התגבשות, לוותר על ומערבבים 0.2 – 0.25 μL של IKK1:inhibitor מורכבים באותו אמצעי אחסון של מאגר פתרון.
הערה: הקרנה יכול להתבצע באופן ידני באמצעות אחסון טיפה גדולים יותר (0.5-1.0 μL של IKK1:inhibitor מורכבים באותו אמצעי אחסון של מאגר פתרון). עם זאת, השימוש רובוט יעזור להציל ריאגנטים יקרי ערך. - חותם את הצלחות מיד לאחר הגדרת את הטיפות עם סרטים ברור שטיחות כדי למנוע התאיידות. חותם כראוי באמצעות המוליך המתאים. לעשות צלחות משוכפל עבור כל ערכת מעכב. דגירה לוח אחד 18 ° C, והשני בחדר הקר (טמפרטורה טווח ~ 4-6 ° C). ודא כי חממות אינם מושפעים רטט.
- השתמש stereomicroscope עם מקטב כדי לבדוק אם המראה של גבישים כל טיפה כל יום במשך שבעת הימים הראשונים, ולאחר מכן במרווחי זמן ארוך יותר. באופן שיטתי הערה וציון תצפיות אלה.
הערה: השתמש של stereomicroscope עם מקטב כך יכול להיות מוערך באופן חזותי הצמיחה פגמים בגבישים. כאן, קריסטלים הופיע במצב שבו הפתרון מאגר הכילה 3% w/v לתוספי סולפט נתרן מלח Mr 5,000, 0.1 M BICINE pH 8.5, 15% w/v פוליאתילן גליקול 20,000. גבישים של IKK1 גדל רק בנוכחות XII IKK-מעכב.
5. קריסטל צמיחה אופטימיזציה29,33
-
הכנת מלאי פתרונות.
- הכנת 30% פתרונות w/v של סולפט לתוספי משקל מולקולרי שונה (ממוצע MW 5,000, 8,000, 15,000, דא כ-40,000) יונים H2פתרון סינון או באמצעות מסננים μm 0.22.
- להכין את מניות 1 מ' או 0.5 M של מאגרים שונים בטווח ה-pH של 6.5 עד 9. סנן פתרונות באמצעות מסננים μm 0.22.
- להכין 25% או 50% (w/v) יתד פתרונות משקל מולקולרי שונה (ממוצעת של MW:1000, 1,500, 3,350, 4,000, 6,000, 8,000, 10,000, 12,000, 20,000 Da). סנן פתרונות באמצעות מסננים μm 0.22.
- לבצע מסך רשת על ידי באופן שיטתי שינוי pH, מאגר, ריכוז, וסוג של פג והן לתוספי סולפט.
- למטב את ההקרנה ב 18 ° C, והן בחדר הקר (טמפרטורה טווח ~ 4-6 ° C).
- מערבבים כמות שווה IKK1:Inhibitor מורכבים עם פתרון טוב, דגירה על הפתרון טוב בסביבת אטום. שלב זה יכול להתבצע באופן ידני או באמצעות רובוט שחולק.
הערה: כאן, הקריסטלים הגדולה, מוגדרים היטב (כפי מוערך על ידי צבע אחיד מתחת מקטב אשר ציין צמיחה אחידה) התקבלו בתנאים הבאים: 100 מ מ BisTris pH 7.0, 2.8-3.5% לתוספי סולפט (kDa ממוצע של 15 מגוואט), 8.5-10% יתד 20 kDa בחדר הקר.
6. גידול גבישים במספרים גדולים
-
להכין את הפתרונות הבאים מניות ולסנן אותם דרך מסנן μm 0.22.
- להכין 0.5M BisTris pH 7.0, ו BisTris פרופאן pH 7.0 ו- 7.5.
- הכנת 30% (w/v) לתוספי סולפט (ממוצע MW ~ 15 kDa). חנות ב 4 º C.
- הכנת 50% פג (ממוצע MW ~ 12 kDa).
- שימוש 24 טוב תלוי טיפה צלחות.
- למרוח משחה איטום בטבעות מורמות של כל טוב.
- להכין את הפתרון טוב כדלקמן (ריכוז סופי): 100 מ מ BisTris pH 7.0-7.5, 2.8-3.5% לתוספי סולפט ~ 15 kDa, 8.5-10% יתד ~ 12 kDa. להכין פתרון טוב 1 מ"ל ב 1.5 mL צינורות.
הערה: וריאציה משנית במצב התגבשות נצפתה בהתאם האצווה של חלבון, ו/או לתוספי סולפט, לכן גירסת ניסיון של טווח קצר מומלץ. הן BisTris והן BisTris פרופאן מאגרים של אותו טווח pH תשואות קריסטלים יחיד. - לשמור על צלחות שמנונית והפתרונות טוב בחדר קר לפחות שעה.
- להכין IKK1:Inhibitor מורכבים כמתואר ב- 4.3. העבר את הפתרונות טוב משפופרות 1.5 mL הבארות בודדים של צלחת טוב 24.
- נקי siliconized (מסחרי או ללא צורך במיקור חוץ (siliconization/silanization)) זכוכית שער גולשת באמצעות מגבונים נטולת ולהחיל סילוני אוויר בלחץ גבוה הצביעו באמצעות מטלית תרסיס זמינים מסחרית.
- מקום 1 – 1.5 μL של פתרון טוב על דף שער נקי. פיפטה שווה נפח IKK1:inhibitor מורכבים, לערבב בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 3 - 4 פעמים. להפוך את תלוש כיסוי זכוכית במקום על בהתאמה עם מלקחיים, לאטום היטב על-ידי לחיצה על השמן.
- לאחר הגדרת כל הטיפות של צלחת 24-ובכן, דגירה הלוח בחדר הקר בחושך. בדוק מדי פעם את טיפות תחת מיקרוסקופ על המראה ועל התפתחות הגבישים.
הערה: זה לא נבדק אם המקננת קריסטל צלחות תחת האור לשנות את התוצאה. . זה קריטי, עם זאת, כי הצלחות מודגרת סביבה בעלת מינימום/לא רטט
7. הקפאה הגנה של גבישים
-
הכנת פתרונות הקפאה.
- להכין הקפאה A (~ 2% לתוספי חומצה גופרתית, ~ 10% יתד 12000, 60 מ מ BisTris פרופאן (של אותו pH כפתרון טוב המיועד), 5 מ מ טריס pH 7.5, 40-50 מ מ NaCl, 2.5% גליצרול).
- להכין הקפאה B (~0.3% לתוספי סולפט, ~ 10% יתד 12000, 60 מ מ BisTris פרופאן (של אותו pH כפתרון טוב המיועד), 5 מ מ טריס pH 7.5, 40-50 מ מ NaCl, 20 או 25% גליצרול או 20 או 25% אתילן גליקול).
הערה: הבדיקה הקפאה שונים-protectants בנוסף גליצרול ו אתילן גליקול (למשל, פג 200, 400 פג, 550 גברת פג, 1000 פג).
- בעדינות הסר תגית כיסוי זכוכית המכיל את הקריסטל והנח אותו על משטח יציב עם המרחק קריסטל כלפי מעלה. בעדינות מוסיפים 10 μL של פתרון A הקפאה על הירידה ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting כך הקריסטל לא נגע.
הערה: זה מנקה את השטח קריסטל של פסולת, לעזור equilibrate את הקריסטל עם המאגר הקפאה ראשונית. למנוע מתח מכני, תרמי על הגביש. בצע את כל השלבים הבאים מתחת למיקרוסקופ כדי למנוע נזק הקריסטל. - אט-אט להסיר נוזל מן הגביש ולשמור על 5-8 μL של הפתרון. למנוע התייבשות של הגביש. . תשמרי על קיצוניים כדי להימנע מכאניים והתייבשות של הקריסטל בתוך כל והשלבים הבאים
- בעדינות להוסיף 2.5 – 4 μL של הפתרון B הקפאה על הטיפה, לערבב בעדינות על ידי pipetting. מכסים עם צלחת פטרי קטן כדי למנוע זרימת אוויר ישירה מעל הקריסטל. מחכים 5 דק תמיד להיות זהיר שהקריסטל לא תסבול שינויים מהירים של לחץ אוסמוטי או התייבשות.
- חזור על שלב 7.4 ארבע פעמים להתאקלם לאט את הקריסטל בתוך תמיסת הקפאה.
- לשמור 10 – 20 μL של הפתרון הקפאה בשלב זה (כלומר, לאפשר את הקריסטל שאתה רוחץ בו כ- 20 – 25% הקפאה-תרכובת המכילה פתרון). משרים למשך תקופות שונות של זמן (5 דקות כדי 1 h) הקפאה-הפתרון הסופי.
- להקפיא ריבוי הגבישים בנקודות זמן שונות.
- לבחור בקפידה גביש יחיד מהמסירה בלולאה המתאים הקפאה-רכוב על בסיס נאות עם מים עמוקים-הקפאת נוזלי N2. יש לבצע פעולה זו בצורה חלקה ומהירה כדי למנוע היווצרות קרח על הגביש.
הערה: לבחור את הקריסטל באמצעות לולאה בקוטר מעט גדול יותר מאשר הציר הארוך של הגביש כך זה שניתן להציב את מד זווית רובוטית בשימוש מתקדם הפוטון מקור, Argonne National Laboratory. - אחסן את הקריסטל המכיל הקפאה-לולאות בדיסקיות שקוע בתוך נוזל N2. לאחסן דיסקיות אלו נוזלי N2 דיואר את הבקבוק עד שיהיו מוכנים למשלוח עבור רנטגן עקיפה-סינכרוטרון. המשך איסוף נתונים של קרני רנטגן ועיבוד (סעיפים 8 ו-9).
הערה: הנתונים עקיפה של גבישים IKK1 ממקורות רנטגן הביתה היו לא ברזולוציה גבוהה מספיק עבור מבנה נחישות ניסויים, למרות אותו שצוינו. האיכות של גבישים כדי באולמות ההקרנה סינכרוטרון. כל נתוני דיפרקציה נאספו ב beamlines שונים (בעיקר 19ID) של מקור פוטון מראש, Argonne National Laboratory, ארה ב.
8. איסוף נתונים של רנטגן
- איסוף נתונים קרני רנטגן-הפרעות לקרן החלקיקים ID19 של מקור סינכרוטרון APS, באמצעות תוכנות אוסף נתונים מרחוק34.
הערה: למעלה מ- 100 קריסטלים נבדקו עבור מאפייניהם עקיפה. הקריסטלים באופן שגרתי diffracted ברזולוציה של 7-11, רק לעתים רחוקות קריסטלים כי diffracted אל מעבר 5 Å היו שנצפו, ורק אחד גדול קריסטל diffracted מעבר 4.5 Å. מאז הקריסטלים מתנוונים במהירות במהלך איסוף הנתונים, נאספו נתונים (datasets) על חלקים שונים של אותו הגביש. זה היה אפשרי מאז הגבישים היו גדולים (גדול יותר מ 400 מיקרומטר), והיה קוטר הקרן משמש 100 מיקרומטר.
9. רנטגן עיבוד נתונים
- מיזוג כל datasets שנאסף על חלקים שונים קריסטל באותו34.
הערה: datasets שבע מוזגו מן הגביש הטוב ביותר, תוצאות הנתונים היה 93% ביצוע. הכולל אני / σ היה ~ 6.8) והיה Rmerge 89% בסל ברזולוציה הגבוהה ביותר (5.4-4.5 Å). - תהליך datasets עם HKL200034 כדי לקבל שטח הקבוצה, מידות תא יחידה, תוכן ממס ו הלחנה מתקבל על הדעת של היחידה אסימטרי.
10. מבנה הפתרון
-
הכנת חיפוש דוגמניות
- מבוסס על מודלים מבניים זמין של hIKK2 (pdb מזהה 4E3C ו- 4KIK35), ליצור סדרה של הדימרים עם נטיות שונות של KD N-מסוף (זה הופך את הפתיחה של 30 ו-62, בין P578 של שני KD ב דיימר). אף אחד המודלים האלה הובאו פתרון חיפוש תחליף מולקולרית לאחר ניסויים נרחבים.
- ליצור מפה של IKK1 מתוך נתונים יחיד-חלקיקים הקפאה-EM33.
- ליצור מודל של האדם IKK1 מן המבנה ברזולוציה הגבוהה ביותר של IKK2 (4KIK מזהה pdb).
- עגן את התחומים הבודדים של המודל IKK1 האנושי לתוך הקפאה EM צפיפות מפת IKK1 האנושי באמצעות הנרגן36. זה לסובב את כיוון KD בערך 24 מעלות, ששינה את N-מסוף לפתיחת ~ 58 Å.
- כיוון KD של המודל הקפאה-EM מצויד (מונומר) חלות על כל הדימרים המופקים 10.1.1.
-
החלפת מולקולרית
- השתמש הדימרים 10.1.1 ו 10.1.5 כמודלים חיפוש תוכניות הפייזר37, MOLREP38 , CNS39,40.
הערה: כאן, באמצעות אחד הדימרים של 10.1.5 (פתיחה Å 52) כמודל חיפוש, הדימרים 6 (2 hexamers) היו ממוקמים בתוך היחידה אסימטרי באמצעות MOLREP. Å 52 פתיחת במודל חיפוש דומה 49-50 Å פתיחת הדימרים (הדימרים שש כל) במבנה מעודן.
- השתמש הדימרים 10.1.1 ו 10.1.5 כמודלים חיפוש תוכניות הפייזר37, MOLREP38 , CNS39,40.
11. מבנה עידון
-
מבנה עידון הליך
- לתקן את הכיוון ואת המיקום של המודל הראשוני הזה על-ידי עידון של גוף קשיח ב- CNS (cns_solve_1.3)39,40.
- לחדד את מבנה נוסף באמצעות שיטות מינימיזציה וכסויים חישול מדומה עם פונקציה היעד נראות מקסימלית, תיקון במול בצובר ממיס בעזרת ה CNS מערכת39,40.
- לבנות את המודל מבוסס על 2FO-FC ומפות Fo-Fc באמצעות Xtalview41.
הערה: החל בסיוע DEN עידון42 , רכיבי NC לרסן במהלך ליטושים דיוק טוב יותר של המודל. אכן, עידון DEN השתפרו באופן דרמטי ורשתות R-גורמים של המבנה, הגורם R היה 22.2%, גורם R חינם היה 27.8% עבור המודל הסופי. שיפור דרמטי של ה-R חינם חייב להיות בגלל המודל רמת דיוק גבוהה של תחומים IKK1 היינו שהפיק מן המודל IKK2 (4KIK).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיבוט וביטוי של מבנים שונים של IKK1/α
אורך מלא ש-ikk1 האנושי/α היה משובטים לתוך הביטוי baculovirus וקטור pFastBacHTa בתוך למושבכם ההגבלה EcoRI ו- NotI להשיג של N-מסוף hexa-היסטידין מתויגות IKK1. היתה אפשרות להסיר את התג על ידי אס פרוטאז עיכול. כיוון אורך מלא IKK1/α מכיל אזורים גמישים בשני הקצוות, אזורים גמישים בדרך כלל לעיבוד חלבון קשה להתגבש, שיבטנו שונים קטום שברי IKK1/α בתוך האתרים הנ של וקטור pFastBacHTa. מוטציות שונות לחיתוך של IKK1/α נוצרו עם פראי-סוג (wt) וגם S176E, 180E (EE) עמוד השדרה. IKK1/α EE מתייחס מימטי של הטופס צורונים פעילים של קינאז phosphorylated. ייצור baculovirus רקומביננטי וביטוי חלבונים בוצעו באמצעות פרוטוקול שפורסמו בעבר עם שינויים מזעריים43 (איור 1).
הקושי IKK1/α התגבשות
כיוון IKK2/β ואנושי IKK1 הם הומולוגיים, אנחנו יכולים להתגבש גירסאות שונות של האדם IKK2 β בתנאים שונים מספר, ציפינו IKK1/α להתגבש תנאים דומים באמצעות אסטרטגיות דומות. עם זאת, לאחר ניסויים נרחבים עם גרסאות IKK1 שונות, השגנו קריסטלים עם הבונה קטום אחד בלבד (IKK1 10-667 EE) (איור 2), גם זה רק בנוכחות IKK מעכב XII44 מוצגים מתאימים מאפייני קרני רנטגן.
מבנה הפתרון
IKK1/α קריסטלים סובל מבעיות גדילה רבים, הנתונים מוצגים לעתים קרובות mosaicity גבוהה מאוד. קריסטל חלש אריזה המשויך תוכן גדול ממס, באופי הדינמי של מונומר/דימר IKK1 הסיבה כנראה מאחורי זה. כדי לעקוף בעיות אלה, נלקחו מאמציו להשיג את הקריסטלים האפשרי הטוב ביותר, ההליך שימור-הקפאה בוצעה ש"צריך בתנאים שונים ועם מאגרי הקפאה-משמר שונים. הנתונים נאספו גם עם דיוק האולטימטיבי כדי למזער נזק הקורה. מאז הגבישים היו גדולים (הגדול ממד לעיתים קרובות העולה על 400 מיקרון), אזורים שונים של הקריסטלים באותו נחשפו קרן רנטגן כדי לאסוף נתונים (datasets) מרובים. זה ממוזער שגיאה וההגדרה datasets שונים כדי להיות קנה המידה, וכדי להשיג dataset. למדי להשלים עם יתירות גבוה יותר. השריה עם אטומים כבדים, או אטום כבד אשכולות (למשל, טאבר, סובייטי), גרם לגבישים מכמותה כראוי. למרות לאתר את המיקום של טאבר אשכולות נתונים נגזרות, האיכות הירודה של הנתונים בנוסף הלא-isomorphocity סיפקו מידע שלב קצת, אם בכלל.
עיבדנו datasets עם HKL2000 באמצעות פרמטרים שונים זמינים. התבנית עקיפה חשף כי הגביש שייך החלל קבוצה P21 עם מידות תא יחידה, = 174.51, b = 186.94, c = 275.83 Å וβ = 98.84 מעלות. נהגנו בעיקר אני / σ להעריך שרשם ונבדק גזור-offs שונים עבור קבצי הנתונים. השגנו ערכת נתונים הממוזג של 4.5 Å ברזולוציה של 4 מתוך 7 ערכות נתונים עקיפה שנאסף על גביש אחד. החלטנו לשמור נתונים עד 4.5 Å בדיקה ויזואלית של מפת צפיפות סופית. זה יכול להיות כדאי להשתמש CC1/2, מאז אנחנו יכולים להעריך בצורה אנליטית CC ערכת הנתונים הממוזגים נגד עוצמות (בדרך כלל שישנן) נכון באמצעות CC *45. בגלל תא היחידה גדול בשילוב עם הסימטריה נמוכה של קבוצת מרחב, צפינו את יחידת אסימטרי מכילים מולקולות 12 עד 24 בהתבסס על תוכן ממס של 70%-40%.
ההשפעה המשולבת של רזולוציה נמוכה רנטגן נתונים עם עוצמות חלש (קרי, שגיאות משמעותיות בנתוני) (איור 3), (12) מספר רב של מולקולות IKK1 יחידת אסימטרי ולאחר הסתגלותי וריאציה של דגם monomeric/dimeric IKK1 בהשוואה IKK2 ידוע מודלים, מנע בתחילה אותנו להשגת פתרון חלופי מולקולרית IKK1, ובכך לקבוע את המבנה שלה.
IKK1/α, IKK2/β מכילים תחום קינאז (KD) תחום כמו אוביקוויטין (היטס), תחום dimerization לגרדום-הסליל (SDD). המבנה של IKK1 גילה כי טפסים הדימרים באופן דומה כדי IKK2 ניצול ממשק יחידה הבין-משנית כמעט זהה של האזור דיסטלי של המפגין. עם זאת, דימר IKK1 מוצג במיקום יחסי שונה באופן משמעותי של KD N-מסוף ביחס המפגין + היטס לעומת זאת ידוע הדימרים IKK2. מבנים IKK2 שונים ציינו קודם לכן כיוון intermonomer שונים בתוך שלו הדימרים (איור 4פאנל A), כך המרחקים בין ההעתק אלפא של P578 ב KD שני דגמים שונים דיימר ארבע מגוונים בין 39 ו- 61 Å. כיוון הרצף של kinases שני אלה דומים מאוד שאריות-הממשק דיימר זהים, אנו צפויים ש-ikk1/α היו מהווים דיימר דומה; עם זאת, מכיוון שיש הבדלים משמעותיים בין שאריות של הממשק KD-המפגין (למשל, W424, F111, IKK2 הם V ו- P בהתאמה), אנו צפויים אולי עדיין KD כיוון שונה ב- IKK1. אכן, מבנה IKK1/α ציינו כי כיוונים הקשורים של KD כדי המפגין הוא ייחודי, זה סוטה מדגמי ידוע לכל IKK2/β. מעל מאה דיימר מודלים שימשו כמודלים חיפוש בתוכניות הפייזר, MOLREP ו- CNS ללא הצלחה, המציין את הצורך מודל חיפוש מדויק למדי עבור ההצלחה של ניסויים החלפת מולקולרית, במיוחד עם נתונים ברזולוציה נמוכה שלנו. מודל מונומר יש מסה קטנה מדי כדי לאסוף את כל פתרון נתוני דיפרקציה חלש של היחידה אסימטרי גדול המכיל 12 מונומרים. גם הכללתו או העדרו של מים במודל חיפוש לא משנה החלפת מולקולרית בחיפושים, במיוחד בגלל הנתונים עקיפה חלש. CC1/2 ו- CC * מציין נתונים עד 4.5 Å הוא מדויק למדי. . היינו על ניתוק רזולוציה השמרני של 4.5 Å בהתאם אני / σ של 1.5. Datasets עם רזולוציה אחרת גזור-offs לא הראה שום הבדל סטארק במהלך החלפת המולקולרי פעולות חיפוש, מפות סופי מעודן נגד אלה datasets לא הראה שום שיפור מובהק מפה תכונות על הרחבת רזולוציה גזור-offs. הבנייה הסופית של המודל הוא די מדויק יותר מה יכול להיבנות מן הצפיפות לבד, נגזר כנראה מאז הדגמים החלפת המולקולרית הראשונית נבנו דגמים עם נתונים ברזולוציה גבוהה, אנחנו מנוצל הקפאה-EM המפה/הצפיפות כדי תצליבו התכונות של המפה, בעיקר באזורים שבהם מפות אינן ברורות.
במבט לאחור, הקניית מודל חיפוש שימושי היה אפשרי רק בשל הזמינות של המפה הקפאה-EM ברזולוציה נמוכה, מודל דיוק גבוהה למדי של IKK1 תחומים שעשויה להיווצר בהתבסס על רזולוציה גבוהה IKK2 מבנה (איור 4 פאנל B). אנחנו יכול המזח על התחומים IKK1 במפת הקפאה-EM IKK1 להשיג דגם דיימר קרובים למדי. המודל הראשוני המצוין אוריינטציה של KD מסובב בערך 24 מעלות ביחס של מונומר IKK2, ו- N-מסוף הפתיחה של 58 Å (בין P578 של שני KDs ב דיימר). שלנו ידע מוקדם של מבנים שונים של דימר IKK2/β (והגיוון שלהם) אפשרו לנו לכוונן את מודל חיפוש על-ידי שינוי הפתחים בין 30-62 Å. שימוש אחד הדימרים (52 Å פתיחה) כמודל חיפוש, איתרנו הדימרים שש ביחידת אסימטרי באמצעות תוכנית MOLREP46. הדימרים שש אלה מאורגנות hexamers שני ביחידה אסימטרי, הממס מחושב יש נפח של 68%.
איור 1: טיהור של IKK1. (א) הביטוי של IKK1 (10-667) בתאי חרקים. (B) תרשים זרימה לטיהור של IKK1; (ג) ג'ל מרחביות-דף מציג טוהר IKK1 לאחר השלב כרומטוגרפיה של זיקה Ni-נ. ת. (ד) הוצאת גודל הפרופיל המציין דימר של IKK1. (ה) ג'ל מרחביות-דף מציג טוהר IKK1 של השברים בגודל-הדרה שיא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מורפולוגיה וגודל הגבישים IKK1. (א) גביש של IKK1 לבנות 10-667; הירידה התגבשות מציג גם גבישים של מורפולוגיה אחר (לוחות דק) אשר מכמותה היטב. (B) שהתצוגה לאור הקריסטל diffracted אל מעבר 5 Å. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3:. נתונים לחקר הגבישים המתקבל IKK1 קריסטלים. (א) דמות של עקיפה של הרנטגן קריסטל IKK1 המציין המסכן עקיפה מאפיינים של גבישים IKK1 טיפוסית. (B) HKL2000 סטטיסטיקה של שינוי קנה מידה של ערכת הנתונים הממוזגים להשתמש IKK1 מכשור לקביעת קשיות ומבנה של יתירות של הנתונים. R ליניארי = SUM (ABS (I - < I >)) / SUM (I), מרובע R = SUM ((I - < I >) * * 2) / לסכם (אני * * 2), צ'י * * 2 = SUM ((I - < I >) * * 2) / (שגיאה * * 2 * N / (N-1))), CC1/2 = מקדם המתאם, CC * = מקדם המתאם של הנתונים (dataset) הממוזג מול עוצמות נכון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הכנת חיפוש דוגמניות. (א) מודלים שונים של דימר IKK2 המציין נטיות שונות של ק. ד ביחס המפגין (והוליד הפרדה שונה בין שני KD); מודלים אלה נבדקו בתחילה למצוא פתרון חלופי מולקולרית ללא הצלחה. (B) דור של IKK1 חיפוש דוגמניות - הקפאה-EM מפת דימר IKK1 ברזולוציה Å 11; EM-מפת מצויד דגם ראשוני של חיפוש IKK1, תחומים בודדים מבוססים על מודל IKK2 (4KIK); IKK1 חיפוש מודל נוסף פיין-באפו (תצורת KD המתאים) בהתבסס על אפשרויות שונות כמו נשפט IKK2 דגמים נמסרים מעל 4A; סופרפוזיציה של EM-מפת מצויד דגם לדגם החיפוש הניב את הפתרון החלופי מולקולרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פתרון ייצור, התגבשות, מבנה של שני חלבונים IKK קשורים
. יצאנו כדי לקבוע את המבנה של IKK1/α עם הרעיון שיהיה זה תרגיל פשוט למדי בהתחשב בניסיון שלנו עם ייצור החלבון IKK2/β, התגבשות ונחישות מבנה... עם זאת, היינו מאוד מופתעים כי אלה שני חלבונים הקשורים התנהגו אחרת לגבי הקלות של התגבשות. למרות המאמצים של מספר מעבדות פרופיל גבוה, הקביעה של מבנה IKK1 לקח כמעט שני עשורים. זה נבעה במידה רבה כמה צווארי בקבוק מפתח.
הקושי הראשון הוא לקבל טופס חלבון מסיס וטהור מאוד. מערכת ביטוי תא חרקים אפשרה לנו להשיג כמויות מ ג של פרוטאין טהור זה היה סביר מסיסים. לגבי הרמה של הביטוי, כל המבנים IKK1/α לידי ביטוי ברמות נמוכות הרבה יותר IKK2/β בונה במערכות ביטוי תא חרקים. יצוין, כי גם חלבון הוא מסיס ופונקציונליים כשאני לידי ביטוי e. coli. בכל מערכת ביטוי תא חרקים, שברי IKK2/β בא לידי ביטוי ברמה גבוהה, נע בין 10 ל 30 מ ג/ליטר של תרבות בהתאם המבנים. לעומת זאת, IKK1/α בונה יכולים להיווצר רק ב- 0.5 עד 2.0 mg/L של תרבות. הסיבה להבדל היא עדיין לא ידוע לנו. כדאי שננסה גם ביטוי של IKK1 בתאי המארח מקורי (קרי, ביטוי בתרבית של המערכת במקרה של חלבון IKK יונקים), במיוחד מאז השינויים post-translational כגון auto - או טרנס-זרחון המתרחשים בדרך כלל IKK הצפויה ביותר ביעילות, בהתאם לסביבתם הטבעית. טיהור של מתחמי IKK ישירות מתרבות בקנה מידה גדול של תאי יונקים הוא גם כיום קלה.
בעת עבודה עם IKK2/β, הבחנו כי זה יכול להיות homogeneously phosphorylated אוטומטית על ידי טיפול עם ATP, זה הופך את החלבון נוטה התגבשות. באופן דומה, הדגירה של חלבון IKK1 עם ATP, זירחון-האוטומטי תוצאות, הניב של IKK1 מופעל שהיה מסיסים, ומתאים איפיון ביוכימי וגם קביעת מבנה הגביש.
שלב קריטי כדי להשיג קריסטלים היטב diffracting היה עדין לכוונן התגבשות התנאים, במיוחד התוספת של הסוג המתאים וריכוז של מולקולות סולפט לתוספי. הצפיפות מציין מאוגד לתוספי סולפט מולקולות, השפעתו תוצאות על IKK1 היה סביר קריטי עבור התגבשות.
הגמישות של IKK1, אשר לעיתים קרובות נצפית ב- kinases, הוא גורם הרתעה העיקרי עבור התגבשות ומקושרת לעיתים קרובות אל האירוסין של התחום קינאז עם הלולאה הפעלה. יכול להיות גיבש IKK2 עם מקורי (S177 ו- S181) וגם phosphomimetic (EE) צורות של הפעלת לולאה serines, אבל אנחנו מושגת רק קריסטלים עם קטום IKK1 α האס גירסה מוטציה הנדסת חשמל וזה גם רק בנוכחות של מעכב IKK XII. גבישים אלו diffracted מספיק טוב בשביל מכשור לקביעת קשיות ומבנה רק כאשר גדל בחדר הקר (~ 4-6 ° C). אם אנחנו נתקלים התנהגות עקשנית באופן דומה עם כל homolog IKK1 (או ortholog של IKK), אפשר לנסות שינויים שונים עמוד השדרה (במיוחד של אתר פעיל לולאה סרין משקעי אשר נמצאים בדרך כלל phosphorylated) אנחנו יכולים גם לנסות התגבשות שיתוף בנוכחותו של חלבונים שותף אינטראקציה. Kinases רבים, כולל אלה של משפחת IKK, אינטראקציה עם השותף חלבונים והם שוכנים בתוך מתחמי גבוהים.
מעכבי מספר עזר לייצר גבישים IKK2 בתנאים שונים (למשל, עם שני מלח גבוהה, פג כמו precipitant), ב 18 ° C, והן בחדר הקר. עם זאת, בתנאים דומים, עם מגוון של מעכבי, IKK1/α לא לייצר כל גביש. לפיכך, השימוש של רפרטואר גדול של מעכבי בהחלט יגביר הסיכויים למצוא אחד המאפשרים התגבשות.
עוד צעד קריטי בקביעת המבנה היה זהיר שימור-הקפאה הליך איסוף נתונים. חלשה והנתונים דעיכה מהירה של הקריסטלים ב קרן רנטגן מוצדקת את הצורך קריסטלים ואוסף גדול של סדרות נתונים מרובות מהגבישים באותו. בלי dataset מלאה סבירה של דיוק גבוהה, יכול לא הצלחנו בהשגת פתרון חלופי מולקולרית.
בסופו של דבר, אנחנו נכשלה לקבוע את המבנה של IKK1/α על ידי החלפת מולקולרית באמצעות יותר מ-100 דגמים שנוצרו זמינים במסד הנתונים הציבורי ידוע IKK2/β מבניים מודלים. לפיכך, קבלת את מודל המתאים עבור הליך חלופי מולקולרית היתה חובה. המפה הקפאה-EM, רמת דיוק גבוהה מודלים מבניים של קבוצות מחשבים בודדים, יחד עם מחקרים השוואתיים של נקבעת בעבר מבנים IKK2 הוביל אותנו כדי להשיג דגם חיפוש והנצנוץ לנו הפתרון החלופי מולקולרית.
התגבשויות של חלבון הוא אקראי מטבעו, ולכן למרות ביצוע הפעולות הנ ל מובנית, ייתכן בפנינו בעיות התגבשות homolog IKK1 אחר או הבונה באורך מלא או אחר של IKK1 האנושית. ללא קשר, הידע על שלבים קריטיים אלה יאפשר חוקר לחקור את התנאים רציונלית כי יגדיל את סיכויי קבלת גביש IKK היטב diffracting.
IKK1/α ו- IKK2/β הצגת הארגון תחום דומה אבל שונה הארגון עיבד
באופן לא מפתיע, IKK1/α ו- IKK2/β לאמץ ארכיטקטורת מחשבים דומים מאוד הנובעות33,הדמיון שלהם גבוהה רצף43. כפי שצוין קודם לכן, IKK1/α ו- IKK2/β לקפל לתוך שלושה תחומים נפרדים: N-מסוף קינאז דומיין, אוביקוויטין כמו תחום (היטס), תחום dimerization לגרדום (SDD). IKK1/α ו- IKK2/β טופס הדימרים יציב שבו הטרמינל-ג' חצי המפגין להשתתף dimerization. שאריות מעורב היווצרות דיימר זהים. עם זאת, האינטראקציות הבין-תחום בין המפגין/היטס KD הם שונה במקצת מאז אלה כוללות שאריות שונות. זה גם צפוי שנגרם הכיוון היחסי של התחום קינאז המפגין ב IKK1/α יהיו שונות זה ב IKK2/β. זה היה לא צפוי לחלוטין מאז אנו לבחון גם הבדלים בין דגמים דימר IKK2/β זמינים. מעניין, IKK2/β הדימרים באפשרותך לארגן tetramers בתוך סריג הגביש למרות הנטייה tetramerization הזה חלש בפתרון. עם זאת, IKK1/α הדימרים הקימו hexamers ייחודי. Hexamers אלה הם נצפו גם בפתרון, למרות רק בריכה קטנה של IKK1/α הדימרים קיימות כמו hexamers. אלה מציעים ש-hexamerization הזה סביר שיש פונקציה ספציפית וביקורתי.
הבדלים תפקודיים המבדילים בין הבדלים מבניים
IKK1/α ו- IKK2/β לבצע פונקציות שונות בתאים. עם זאת, הקשר בין מבנה ותפקוד IKK1/α נותר חמקמק. IKK1/α בבירור קיים בצורות שונות: דימר חינם או hexamer, וגם בתוך מתחם הטרו-trimer עד כה uncharacterized יחד עם IKK2/β, נימו. מאז IKK2/β להפעלה באמצעות איתות הקנוני אינה דורשת IKK1/α, תפקיד פונקציונלי IKK1/α ב heterotrimer (IKK הקנוני-מתחם) עדיין לא ברור. גם לא ברור אם ההפעלה של IKK1/α המושרה על ידי איתות קאנונית מסתמך על IKK1 dimeric חינם/α ו/או hexameric IKK1/α. מאחר ניסויים mutational מגלים כי הפרעה של הממשק hexamer מאוד משפיע איתות קאנונית, hexamerization הוא עשוי להיות חיוני בשלב כלשהו במהלך קאנונית איתות.
תכנון מעכבי מולקולה קטנה באמצעות מבנה IKK1/α
להכיר שהמבנה של IKK1/α מאפשר לנו לחקור את השטח טלאים של מונומר או כיסים-ממשקים בין התחום או הבין-מונומר, אשר ניתן לפלח על ידי מולקולות קטנות. IKKs היה נחשב זמן תרופה חשובה מטרות. עם זאת, essentiality של אלה kinases במגוון רחב של פונקציות כולל הומאוסטזיס הסלולר, הכדאיות organismal חסינות שמקשה מאוד למקד אותם. עד כה, אין מולקולה, ממוקדות IKK נמצא כי ניתן להשתמש בבטחה בחולים.
IKK1/α ו- IKK2/β לעיתים קרובות מיועדים בו-זמנית על-ידי מעכבי שלהם מאז חזקותיה קינאז דומים מאוד ברצף, במבנה. מחקר ניכר מאמץ בילה למציאת מעכבי ספציפי מיקוד רק באחד kinases שני אלה. כתוצאה מכך, התגלו מספר מעכבי IKK2/β-ספציפיות, שחלקם אינם משפיעים על תפקוד IKK1/α. עם זאת, לידע שלנו אין מתחם כזה קיים זה ביעילות מעכב IKK1/α ללא perturbing IKK2/β פונקציה. חוסר זה עלול לייחס חוסר מידע מבניים על IKK1/α. המחקרים שלנו הסלולר מבניים מציינים כי למרות תחום סידור ומבנים גלובלית יחידה משנית דומים מאוד בחלבונים שני אלה, הם מציגים ייחודי סידורים גבוהים משטח מסוימות שמעסיקה טלאים33. הבדלים אלה המאפשרים אינטראקציות שונות עם חלבונים הקשורים חייב לתרגם הבדלים תפקודיים שלהם. אנו תקווה כי אפשר לנצל הבחנות אלו חשפו בין IKK1/α IKK2/β אינטר - ו "אינטרה"-יחידה משנית אינטראקציות כדי להפוך מעכבי allosteric יחידת משנה ספציפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים הצוות beamlines 19ID, 24ID, ו 13ID מתקדם פוטון במקור, Lemont, איל, לתמיכה במהלך איסוף נתונים על קריסטלים שונים. אנחנו מודים דמיטרי Lyumkis, מכון סאלק להבאה אותנו על המפה הקפאה-EM ברזולוציה נמוכה בשלבים המוקדמים של EM מפה/דגם בניין, אשר שימש כדי לבנות את הדגם הראשוני של חיפוש תחליף מולקולרית IKK1. המחקר שהוביל את התוצאות הללו זכה למימון מענקים NIH AI064326, CA141722 ו- GM071862 כדי GG. SP הוא כעת Wellcome אמון DBT הודו ביניים עמית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
| Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
| SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
| anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
| anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
| Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
| Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
| Compound A | Bayer | ||
| Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
| Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
| MLN120B | Millenium | Gift item | |
| AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
| Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
| Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
| PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
| Crystallization Screens | |||
| Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
| Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
| PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
| SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
| Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
| Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |
References
- Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
- Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
- Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
- Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
- Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
- Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
- DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
- Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
- Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
- Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
- Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
- Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
- Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
- Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
- Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
- Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
- Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
- Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
- Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
- Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
- Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
- Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
- Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
- Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
- Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
- Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
- Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
- Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
- Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
- Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
- Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
- McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
- Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
- Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
- Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
- Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
