Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En Guide til produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af menneskelige IKK1/α

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) er en Ser/Thr protein kinase, der er involveret i et utal af cellulære aktiviteter primært gennem aktivering af NF-κB transkriptionsfaktorer. Her beskriver vi de vigtigste trin er nødvendige for produktionen og Krystalstrukturbestemmelse af dette protein.

Abstract

En klasse af ekstracellulære stimuli kræver aktivering af IKK1/α at fremkalde generation af en NF-κB subunit, p52, gennem behandlingen af sin forløber p100. P52 fungerer som en homodimer eller heterodimer med en anden NF-κB subunit, RelB. Disse dimerer regulere igen udtryk for hundredvis af gener involveret i inflammation, celle overlevelse og celle cyklus. IKK1/α forbliver primært tilknyttet IKK2/β og NEMO som en ternær kompleks. En lille pulje af det ses også som en lavmolekylære complex(es). Det er uvist, om p100 behandlingsaktivitet udløses ved aktivering af IKK1/α inden for den større eller mindre komplekse poolen. Konstituerende aktivitet af IKK1/α er blevet opdaget i flere kræftformer og inflammatoriske sygdomme. For at forstå mekanismen for aktivering af IKK1/α, og aktivere dets anvendelse som en drug target, vi udtrykt rekombinante IKK1/α i forskellige værtssystemer, såsom E. coli, insekt, og pattedyrsceller. Det lykkedes os at give udtryk for opløselige IKK1/α i baculovirus inficeret insekt celler, at opnå mg mængder af meget ren protein, krystalliserede det i overværelse af hæmmere, og fastlægge dens X-ray krystalstruktur. Her beskriver vi de detaljerede trin til at producere det rekombinante protein, dets krystallisation og dens X-ray Krystalstrukturbestemmelse.

Introduction

Transkriptionel aktiviteter af NF-κB familien af dimerisk transkriptionsfaktorer er påkrævet for forskellige cellulære funktioner lige fra betændelse og immunitet til overlevelse og død. Disse aktiviteter er nøje kontrolleret i celler og et tab af forordning fører til forskellige patologiske tilstande, herunder autoimmune sygdomme og kræft1,2,3. I mangel af en stimulus holdes NF-κB aktiviteter hæmmet af IκB (hæmmer af - κB) proteiner4. Fosforylering af specifikke Ser rester på IκB proteiner markerer dem for ubiquitination og efterfølgende proteasomal nedbrydning eller selektiv behandling5. To meget homologe Ser/Thr kinaser, IKK2/β og IKK1/α, fungere som central regulatorer af NF-κB aktiviteter ved at gennemføre disse fosforylering begivenheder6,7.

Interaktioner mellem en ligand og en receptor transduces et signal gennem en række mæglere fører til aktivering af NF-κB faktorer. NF-κB signal processen kan groft inddeles i to forskellige veje – kanoniske og ikke-kanoniske (alternative)8. Aktiviteten af IKK2/β regulerer primært NF-κB signalering af de kanoniske pathway, som er afgørende for inflammatoriske og medfødte immunrespons9. En særskilt funktion i denne sti er en hurtig og kortvarig aktivering af IKK2/β10 inden for et hidtil biokemisk uncharacterized IKK komplekse — formodes at være sammensat af IKK1 og IKK2, samt en regulerende komponent, NEMO (NF-κB væsentlige Modulator )11,12,13. Mellem de to katalytiske IKK underenheder af IKK kompleks, IKK2 er primært ansvarlig14 for fosforylering af specifikke rester af prototypiske IκBs (α, - β, & -γ) bundet til NF-κB, og også en atypisk IκB protein, NF-κB1/p105, som er en forløberen for NF-κB p50 subunit5. Fosforylering induceret ubiquitination og proteasomal nedbrydning af IκB (eller forarbejdning af p105) fører til frigivelse og aktivering af et bestemt sæt af NF-κB dimerer15. Afvigende NF-κB aktivitet på grund af mis regulerede funktion af IKK2 er blevet observeret i mange kræftformer såvel som i autoimmune sygdomme2,3,16.

I modsætning til IKK2/β regulerer aktiviteten af IKK1/α NF-κB signalering af den ikke-kanoniske pathway, som er afgørende for udvikling og immunitet. IKK1 phosphorylates specifikke rester af NF-κB2/p100 på sine C-terminal IκBδ segment, som fører til forarbejdningen og generation af p52. Dannelsen af transcriptionally aktive p52:RelB heterodimer indleder en langsom og vedvarende reaktion på udviklingsmæssige signaler7,17,18,19,20. Interessant, er generation af den centrale NF-κB faktor p52 af denne vej helt afhængig af en anden faktor, NF-κB inducerende Kinase (NIK)21,22, men ikke på IKK2 eller NEMO. I resting celler stadig NIK lav på grund af sin konstante proteasom-afhængige nedbrydning23,24,25. Ved stimulation af celler af ikke-kanoniske ligander, og i visse maligne celler, NIK bliver stabiliseret for at rekruttere og aktivere IKK1 / α. Kinase aktiviteter både NIK og IKK1 er afgørende for effektiv behandling af p100 i p527. IKK1 og NIK phosphorylate tre serines (Ser866, 870 og 872) af NF-κB2/p100 på sine C-terminal IκBδ segment fører til forarbejdningen og generation af p52. Afvigende aktivering af de ikke-kanoniske pathway har været impliceret i mange maligniteter herunder myelomatose26,27,28.

Flere højeffektive og specifikke hæmmere for IKK2/β er kendt, selv om ingen hidtil har vist sig for at være en effektiv stof. Derimod er IKK1/α-specifikke hæmmere sparsomme. Dette kan dels skyldes vores manglende strukturelle og biokemiske oplysninger om IKK1/α, som begrænser vores forståelse af det mekanistiske grundlaget for aktivering af NF-κB af IKK1 i celler og rationel stof design. X-ray strukturer af IKK2/β forsynet os med indblik i aktivering mekanisme i IKK2/β29; men disse strukturer kan ikke afsløre hvordan forskellige opstrøms stimuli udløser aktivering af IKK1/α eller IKK2/β at regulere forskellige sæt af NF-κB aktiviteter 30,31. At forstå den mekanistiske grundlag bag de forskellige signalsystemer funktion af IKK1/α, og at etablere en platform for rationel drug design, fokuseret vi på at bestemme strukturen af IKK1/α.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af rekombinant Virus egnet til storstilet udtryk for IKK1/α

  1. P1 virus forberedelse 32
    1. Dag 1: Plade Sf9 celler (~ 6 X 105) (passage nummer mindre end 10) i 2 mL af Sf900 III insekt celle medium i hver godt af en 6-godt plade og inkuberes ved 27 ° C. Passage celler, når de når en massefylde på 2 til 3 X 106 celler pr. mL i suspension ved fortynding i friske medier med en tæthed på ~ 6 X 105.
    2. Dag 2: Fortynd 8 µL af Sf9-Transfektion reagens i 100 µL af Sf900 III eller nådes insekt Medium uden antibiotika og serum. Vortex kort.
    3. Fortyndes 1 µg af kit-renset rekombinante bacmid (nærmere oplysninger findes i 'Repræsentant resultater')32 ind i en anden 100 µL af den samme medium, i en separat tube.
    4. Kombinere fortyndet DNA og Transfektion reagens (samlede volumen ~ 210-220 μl), og der inkuberes ved stuetemperatur i 15-30 min.
    5. Fjern mediet fra brønden. Der tilsættes 1 mL frisk medie uden antibiotika og serum.
    6. Tilsæt fortyndede DNA-Transfektion reagens blandingen dråbevis på cellerne. Justere drop størrelse, så det ikke løsne vedhængende celler.
    7. Efter ~ 6 h, tilsættes 1,5 mL frisk medium på toppen eller fjerne medium og tilsættes 2,5 mL af frisk medium. Varm frisk medium til 25-27 ° C inden tilsætning.
    8. Inkuber celler på 27 ° C. Kontrollere brønde med jævne mellemrum hver ~ 12 h for tegn på viral infektion. Udføre alle Sf9 vedligeholdelse og udtryk på 27 ° C.
    9. Dag 5: Tegne det medium, der indeholder celler 60-72 h efter infektion. Der centrifugeres i 5 min på 500 x g og 4 ° C. Gemme supernatanten; Dette er P1-virus bestand. Fryse små prøver på-80 ° C.
  2. At vælge det bedste udtryk for P1 virus klon.
    1. Plade celler på samme måde som beskrevet i trin 1.1.
    2. Næste dag eller ~ 6 h post forkromning, tilføje 20 µL og 50 µL af forskellige P1 virus klon bestande på cellerne i forskellige brønde.
    3. Løsne de vedhængende celler af blid pipettering og høste inficerede celler 60-72 h efter infektion ved centrifugering i 5 min på 500 x g og 4 ° C. Gemme supernatanten. Dette er P2 virus bestand. Gemme små prøver af bestanden ved-80 ° C.
    4. Tilføje 100 µL af 2 x Laemmli SDS buffer til høstede celle pellet. Varme på > 95 ° C i 10 min. Centrifuge (typisk > 10.000 x g) i 5 min.
    5. Køre 10-15 µL af hver prøve på 8-10% SDS-PAGE på 120-160 V indtil farvestof foran når bunden af gelen.
    6. Electro-overførsel løst proteiner af standard semi-tør transfer protocol (20 V, 30-45 min) på en Nitrocellulose/PVDF membran.
    7. Duppes med anti-IKK1 antistof (fortynding ~ 1:2, 000, skal være optimeret) eller anti-PentaHis antistof (fortynding ~ 1:3, 000, skal være optimeret) til udtryk.
    8. Vælge den bedste P1 virus klon ved at sammenligne udtryk for rekombinante IKK1.
  3. Forberedelse af stor skala P3 virus lager.
    1. Plade celler på samme måde som beskrevet i trin 1.1 i et 15 cm plade indeholdende 25-30 mL af Sf900 III medium.
    2. ~ 6 h post plating, tilføje 150-300 µL af den bedst udtrykker P1 virus bestand på cellerne.
    3. Efter 72 timer efter infektion, Aspirér medium omhyggeligt fra pladen i et egnet tube (steril) og centrifugeres tube på 500-1000 X g i 10 min. ved 4 ° C. Kassér den celle pellet (hvis man er dannet) og gemme supernatanten. Dette er P3 virus bestand.
  4. Bestemmelse af optimal virus titeren for storstilet protein udtryk
    1. Plade celler i 2 mL af Sf900 III medium, som beskrevet i punkt 1.1, i en 6-godt plade.
    2. Tilføj 20, 30, 40 og 50 µL af P3 virus lager i separate brønde ~ 6 h indlæg plating. Omfatte ikke-inficerede kontrol.
    3. Høste celler fra hver godt 48-60 h efter infektion.
    4. Tilsæt 100 µL af 2 X Laemmli SDS buffer. Varme på > 95 ° C i 10 min. Centrifuge (typisk på 14.000 x g) i 5 min.
    5. Løse 10-15 µL af hver prøve i en 8-10% SDS-PAGE gel.
    6. Overføre løst protein til en Nitrocellulose/PVDF membran, som nævnt i 1.2.6.
    7. Duppes med anti-IKK1 antistof (fortynding ~ 1: 2000, skal være optimeret) eller anti-PentaHis antistof (fortynding ~ 1:3000, skal være optimeret).
    8. Bruge virussen med det bedste udtryk for titeren for storstilet udtryk.

2. stor skala udtryk af 6 x-hans markeret menneskelige IKK129,33

  1. Gennemføre storstilet udtryk i en suspension kultur. Opdel celler i 1 L i Sf900 III medium i en 2 L Erlenmeyerkolben med en ventileret cap. Celle tæthed bør ~ 5 x 105 celler/mL.
  2. Vokse disse celler i suspension ved ~ 100 rpm på 27 ° C i en shaker til ~ 2 dage indtil det når en densitet på 1-2 x 106/mL. Celle tæthed må ikke overstige 2 x 106/mL.
  3. Tilføj den ønskede mængde af P3 virus, som vurderes på 1,4.
  4. Vokse den inficerede kultur i 48-60 timer ved ~ 100 rpm på 27 ° C i en shaker.
  5. Høste celler ved centrifugering ved < 1.500 x g ved 4 ° C.
  6. Gemme celle pellet og kassér mediet.
  7. Fortsæt til protein oprensning direkte. Flash fryse celle pellet i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C til fremtidig brug.

3. rensning af hans-IKK133

  1. På dag 1, resuspenderes celle i 40 mL lysisbuffer (25 mM Tris pH 8,0 0,2% NP-40, 200 mM NaCl, 10 mM imidazol, 10% Glycerol, 5 mM β-mercaptoethanol, og protease hæmmer cocktail).
    Bemærk: Våd celle pellet masse blev ikke bestemt. Typisk, ~ 2 L af kultur blev brugt til dette trin.
  2. Lyse celler ved hjælp af sonikering på 60-70% duty cycles, 5-10 pulser af 30 s varighed med et interval på > 1 min, at holde cellesuspension kølet på is.
    Bemærk: Dette trin kræver optimering med hver model af sonikator. Lad ikke de prøve varm op over 10 ° C.
  3. Præcisere de lysate ved centrifugering ved ≥ 28.000 x g i 45 min. ved 4 ° C.
  4. Reagensglasset 4 mL af Ni-NTA Agarosen harpiks med lysisbuffer og bland den klarede lysate (supernatanten) efter producentens protokol.
  5. Tillad protein til at binde harpiksen af inkubere i 2 timer på en roterende mixer i en 4 ° C værelse.
  6. Vask i resin grundigt med lysisbuffer indeholdende 30 mM imidazol. Kontrollere proteinkoncentration i vask-fraktionen med jævne mellemrum ved hjælp af Bradford Assay. Vask indtil denne proteinkoncentration i vask fraktion når 0,1 mg/mL. Typisk er > 20 bed mængde vaskebuffer forpligtet til at nå dette punkt.
  7. Elueres hans markeret IKK1/α protein under tyngdekraften flow, ved hjælp af 20 mL af eluering buffer (lysisbuffer indeholder 250 mM imidazol). Indsamle 1-1,5 mL fraktioner.
  8. Tjekke renheden af elueret protein på en 8 eller 10% SDS side gel ved indlæsning af 5-10 μl af prøven fra alle fraktioner blandet med Laemmli buffer.
  9. Pool peak fraktioner (koncentration ≥ 2mg/mL), og måle proteinkoncentration ved hjælp af Bradford assay.
  10. Fordøje med TEV (1:30-50 (TEV protease: IKK1)) protease natten (≥12 h) ved 4 ° C.
    Bemærk: Optimere mængden af TEV protease kræves for at fuldføre (≥ 95%) fordøjelsen af 6 X-hans tag på forhånd. TEV protease blev renset i hus.
  11. Om morgenen den dag 2, inkuberes protein med 1 mM ATP i overværelse af 20 mM MgCl2, 20 mM β-glycerophosphate, 10 mM NaF og 1 mM natrium orthovanadate til 1 h på 27 ° C.
  12. Protein Opløsningen filtreres gennem et 0,45 eller 0,22 μm filter.
  13. Indlæse 6 mL af prøven en ~ 120 mL forberedende størrelse-udelukkelse kolonne tilknyttet en automatiseret Væskekromatografisk system. Blandingen henstår kolonnen med Buffer A (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% Glycerol), forudgående at anvende eksemplet protein.
    Bemærk: En mindre kolonne kan bruges afhængigt af udbyttet af protein efter Ni-NTA affinitet rensning trin. Justere/beregne belastning bind for at være 5% af kolonne).
  14. Køre størrelse-udelukkelse kromatografi med en væskehastighed på 1 mL/min., og overvåge eluering på 280 og 254 nm. Indsamle brøkdele af 2 mL størrelse.
  15. Tjekke renheden af peak fraktioner (typisk omkring ~ 60-70 mL) på en 8-10% SDS-PAGE gel.
  16. Pool ren fraktioner (renhed ≥95% med en koncentration af ≥0.5 mg/mL) og koncentrere sig i en 10 kDa eller 30 kDa molekylvægt cut-off centrifugal protein koncentrator efter fabrikantens anvisninger.
  17. Med jævne mellemrum kontrollere proteinkoncentration af koncentratet af metoden Bradford, og koncentrere sig prøven op til 8-12 mg/mL.
  18. Undvære 25 μL delprøver og flash fryse i flydende kvælstof. Gemme disse flash frosne prøver i-80 ° C fryser.

4. skærmen for krystallisering af IKK1

  1. Beregn det samlede beløb (volumenprocent) af protein skal screene for krystaller efter de nedenfor beskrevne metoder.
  2. Prøv forskellige hæmmere (generiske kinase hæmmere: AMPPNP og Staurosporine; IKK-specific hæmmere: MLN120B, sammensatte A og IKK-inhibitor XII) til at udføre screening for krystallisering. Gøre stamopløsninger af disse forbindelser efter fabrikantens anvisninger. Sikre, at den maksimale koncentration af stoffet i sin stamopløsning ikke overstige 20 μM.
  3. Forberede skærmbilledet krystallisering IKK:inhibitor kompleks ved at blande 100 μM af IKK1 med 200 μM hæmmer, og der inkuberes ved 18-20 ° C til 30-40 min. der centrifugeres blandingen på > 15.000 x g i 2 min. ved stuetemperatur. Gemme supernatanten for krystallisering skærmen.
  4. Bruge de kommercielt tilgængelige krystallisering skærme (Se Tabel af materialer).
  5. Tilsæt 80-100 μl af hver krystallisering reagens (reservoir løsninger), ved hjælp af en multikanalpipette eller en robot i reservoiret af en 96-brønd plade. Pladen er nu klar til at oprette dråber. Sikre, at pladen kan rumme 2 til 3 krystallisering dråber, således at 2 til 3 hæmmere kan screenes i en enkelt plade.
  6. Ved hjælp af en krystallisering robot, dispensere og bland 0,2-0,25 μL IKK1:inhibitor kompleks med den samme mængde af reservoir løsning.
    Bemærk: Screening kan udføres manuelt ved hjælp af større drop diskenheder (0,5-1,0 μL IKK1:inhibitor kompleks med den samme mængde af reservoir løsning). Brugen af en robot ville spare værdifuld reagenser.
  7. Forsegle pladerne straks efter indstilling dråber med optisk klar film at undgå fordampning. Forsegle korrekt ved hjælp af passende applikator. Lave replika plader for hver hæmmer sæt. Ruger en plade på 18 ° C, og den anden i kølerum (temperatur vifte ~ 4 – 6 ° C). Sørg for, at væksthuse ikke påvirkes af vibrationer.
  8. Bruge et stereomikroskop med en polarisator for at undersøge for forekomsten af krystaller i hver dråbe hver dag for de første syv dage, og derefter med længere intervaller. Systematisk Bemærk og score disse observationer.
    Bemærk: Brug et stereomikroskop med en polarisator, så væksten defekter i krystaller kan vurderes visuelt. Her, krystaller dukkede op i en tilstand hvor reservoir løsning indeholdt 3% w/v Dextran sulfat natrium salt Mr 5.000, 0,1 M BICINE pH 8,5, 15% w/v polyethylenglycol 20.000. Krystaller af IKK1 voksede kun ved tilstedeværelse af IKK-inhibitor XII.

5. krystal vækst optimering29,33

  1. Forberedelse af stamopløsninger.
    1. Forberede 30% w/v løsninger af Dextran sulfat med forskellige molekylevægt (Avg. MW 5.000, 8.000, 15.000, 40.000 Da) i ionbyttet H2O. Filter løsning ved hjælp af 0,22 μm filtre.
    2. Forberede 1 M eller 0,5 M bestande af forskellige buffere i pH vifte af 6,5 til 9. Filtrer løsninger ved hjælp af 0,22 μm filtre.
    3. Forberede 25% eller 50% (w/v) PIND løsninger med forskellige molekylevægt (Avg. MW:1000, 1.500, 3.350, 4.000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, 20.000 Da). Filtrer løsninger ved hjælp af 0,22 μm filtre.
    4. Udføre et gitter skærmen med systematisk varierende pH, buffer type, koncentration og typen af PIND og Dextran sulfat.
  2. Optimere screeningen både ved 18 ° C, og i det kolde rum (temperatur vifte ~ 4-6 ° C).
  3. Bland en lige stor del af den komplekse IKK1:Inhibitor med godt løsning og Ruger over godt løsningen i et lukket miljø. Dette trin kan udføres manuelt eller ved hjælp af en udlevering robot.
    Bemærk: Her, de største og veldefinerede krystaller (som vurderet af ensartet farve under polarisator, hvoraf det fremgik, ensartet vækst) blev fremstillet på følgende betingelser: 100 mM BisTris pH 7,0, 2.8-3,5% af Dextran sulfat (gennemsnitlig MW 15 kDa), 8,5-10% PLØK 20 kDa i det kolde rum.

6. voksende krystaller i stort tal

  1. Forbered de følgende stamopløsninger og filtreres 0,22 μm filter.
    1. Forbered 0,5 M BisTris pH 7,0 og BisTris propan pH 7,0 og 7,5.
    2. Forberede 30% (w/v) Dextran sulfat (gennemsnitlig MW ~ 15 kDa). Opbevares ved 4 ° C.
    3. Forberede 50% PIND (gennemsnitlig MW ~ 12 kDa).
  2. Brug 24 godt hængende drop plader.
  3. Anvendelse fugemasse fedt på hævet ringene i hver brønd.
  4. Forberede den godt løsning som følger (endelig koncentration): 100 mM BisTris pH 7,0-7,5, 2.8-3,5% Dextran sulfat ~ 15 kDa, 8,5-10% PLØK ~ 12 kDa. Forberede 1 mL godt løsning i 1,5 mL rør.
    Bemærk: En mindre variation i krystallisering betingelse blev observeret afhængigt af batch af protein, og/eller Dextran sulfat, således en prøveversion af et snævert interval anbefales. Både BisTris og BisTris propan buffere af samme pH interval give enkelte krystaller.
  5. Holde godt løsninger og smurte plader i det kolde rum i mindst 1 time.
  6. Forberede IKK1:Inhibitor kompleks som beskrevet i 4.3. Overføre de løsninger, der godt fra 1,5 mL rør til de enkelte brønde af 24 godt plade.
  7. Ren Silikoniseret (kommercielle eller in-house (siliconization/silanisering)) glas dækning følgesedler ved hjælp af fnugfri klude og anvende højtryk peget air jets ved hjælp af kommercielt tilgængelige aerosol duster.
  8. Placer 1 – 1,5 μL af godt løsning på en ren dække slip. Afpipetteres lige saa stort volumen af IKK1:inhibitor komplekse, bland forsigtigt af pipettering op og ned 3 - 4 gange. Drej glas dækning slip og sted på de respektive godt med pincet og forsegle godt ved at trykke på fedt.
  9. Når du har oprettet alle dråber af en 24-godt plade, Ruger plade i det kolde rum i mørke. Lejlighedsvis check dråber under et mikroskop for udseende og vækst af krystaller.
    Bemærk: Det er ikke blevet testet om inkubere krystal plader under lys ville ændre resultatet. Det er dog afgørende, at Pladerne inkuberes i et miljø med minimum/nej vibrationer.

7. Cryo beskyttelse af krystaller

  1. Forberedelse af cryo løsninger.
    1. Forberede Cryo A (~ 2% Dextran sulfat, ~ 10% PLØK 12000, 60 mM BisTris propan (af samme pH som den tilsigtede godt løsning), 5 mM Tris pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 2,5% Glycerol).
    2. Forberede Cryo B (~0.3% Dextran sulfat, ~ 10% PLØK 12000, 60 mM BisTris propan (af samme pH som den tilsigtede godt løsning), 5 mM Tris pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 20 eller 25% Glycerol eller 20 eller 25% ethylenglycol).
      Bemærk: Teste forskellige cryo-protectants Glycerol og ethylenglycol (f.eks.PLØK 200, PLØK 400, PLØK MME 550, PIND 1000).
  2. Forsigtigt fjerne glas dækning slip indeholdende krystal og placere den på en solid overflade med krystal dråbe vender opad. Forsigtigt tilføje 10 μL af Cryo A opklaring oven på henlægge, og forsigtigt mix af pipettering så at Krystallen ikke er rørt.
    Bemærk: Dette renser krystal overfladen af vragrester og hjælpe reagensglasset krystal med indledende cryo buffer. Undgå mekanisk og termisk stress krystal. Udfør alle efterfølgende trin under mikroskop for at undgå enhver skadelig krystal.
  3. Langsomt fjerne nogle væske fra krystal og holde om 5-8 μl af opløsningen. Undgå dehydrering af krystal. Tage ekstrem forsigtighed for at undgå mekanisk stress og dehydrering af krystal i alle de efterfølgende trin.
  4. Forsigtigt tilføje 2,5-4 μL af Cryo B løsning på drop, bland meget forsigtigt af pipettering. Dække med en lille petriskål at undgå direkte luftstrøm over krystal. Vent 5 min. være altid forsigtig, krystal ikke lide hurtige ændringer af osmotisk tryk eller dehydrering.
  5. Gentag trin 7.4 fire gange til langsomt akklimatisere krystal i cryo-løsning.
  6. Hold 10 – 20 μL af cryo løsning på dette stadium (dvs., tillade krystal at blive badet i ca 20-25% cryo-protectant indeholdende løsning). Lægges i blød i forskellige perioder af tid (5 min til 1 time) i den endelige cryo-løsning.
  7. Fryse flere krystaller på forskellige tidspunkter.
  8. Omhyggeligt vælge en enkelt krystal fra drop i en passende cryo-loop monteret på en ordentlig base og springet-freeze i flydende Nielsen2. Udføre dette trin hurtigt og problemfrit at undgå is dannelse på krystal.
    Bemærk: Pick krystal med en loop diameter lidt større end den længste akse af krystal, så det kan monteres i den robot goniometer bruges i avancerede Photon kilde, Argonne National Laboratory.
  9. Gemme crystal indeholdende cryo-sløjfer i puck nedsænkes i væske Nielsen2. Gemme disse puck i flydende N2 Dewar kolbe, indtil de er klar til overførsel for røntgen diffraktion på synkrotron. Fortsæt til røntgen diffraktion dataindsamling og -behandling (punkt 8 og 9).
    Bemærk: Diffraktion data af IKK1 krystaller fra hjem X-ray kilder var ikke af høj nok opløsning til struktur bestemmelse forsøg, selv om det indiceret kvaliteten af krystaller at blive screenet på synkrotron. Alle diffraktion data blev indsamlet på forskellige beamlines (primært 19ID) af Advance Photon kilde, Argonne National Laboratory, USA.

8. X-ray dataindsamling

  1. Indsamle røntgen diffraktion data på ID19 beamline APS synkrotron kilde, bruger remote data collection software34.
    Bemærk: Op mod 100 krystaller blev testet for deres egenskaber, diffraktion. Krystallerne rutinemæssigt diffrakteres til en opløsning på 7-11 Å, kun sjældent krystaller, der diffrakteres til ud over 5 Å blev observeret, og kun én stor krystal diffrakteres ud over 4.5 Å. Da krystaller henfaldet hurtigt under dataindsamlingen, blev datasæt på forskellige dele af den samme krystal indsamlet. Dette var muligt, da krystallerne var stor (større end 400 µm), og lysbundtets diameter anvendes var 100 µm.

9. X-ray databehandling

  1. Flette alle datasæt indsamlet på forskellige dele af den samme krystal34.
    Bemærk: syv datasæt blev sammenlagt fra de bedste krystal og den deraf følgende data var 93% fuldført. Samlet jeg / σ var ~ 6,8) og Rmerge var 89% i den højeste opløsning bin (5.4-4.5 Å).
  2. Processen datasæt med HKL200034 at opnå plads gruppe, enhed celle dimensioner, opløsningsmiddel indhold og plausible sammensætning af den asymmetriske enhed.

10. struktur løsning

  1. Forberedelse af Søg modeller
    1. Baseret på tilgængelige strukturelle modeller af hIKK2 (pdb id 4E3C og 4KIK35), generere en serie af dimerer med forskellige retningslinjer for den N-terminale KD (der gengiver en åbning af 30 og 62 Å, mellem P578 af to KD i dimer). Ingen af disse modeller hentet en molekylær udskiftning søgeløsning efter omfattende forsøg.
    2. Generere et kort over IKK1 fra enkelt-partikel cryo-EM data33.
    3. Generere en model af menneskelig IKK1 den højeste opløsning af IKK2 struktur (pdb id 4KIK).
    4. Forankre de enkelte domæner af den menneskelige IKK1 model i cryo EM tæthed kortet over menneskelige IKK1 ved hjælp af BLISHØNE36. Denne roterede KD orientering omkring 24 grader og ændret den N-terminale åbning til ~ 58 Å.
    5. Gælde alle dimerer genereret i 10.1.1 KD orientering af cryo-EM monteret model (monomer).
  2. Molekylær udskiftning
    1. Bruge dimerer fra 10.1.1 og 10.1.5 som Søg modeller i programmer PHASER37, MOLREP38 og CNS39,40.
      Bemærk: Her, ved hjælp af en af dimerer fra 10.1.5 (52 Å åbning) som en søgning model, seks dimerer (to hexamers) var placeret i den asymmetriske enhed ved hjælp af MOLREP. De 52 Å åbning i søgemodel ligner 49-50 Å åbningen af dimerer (alle seks dimerer) i den raffinerede struktur.

11. struktur raffinement

  1. Struktur raffinement procedure
    1. Fix orientering og holdning af denne første model af stiv krop raffinement i CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Forfine strukturen yderligere ved hjælp af minimering og Simuleret udglødning med en maksimal risiko target funktion og en flad bulk-opløsningsmiddel korrektionen ved hjælp af CNS system39,40.
    3. Bygge modellen baseret på 2FO-FC og Fo-Fc kort ved hjælp af Xtalview41.
      Bemærk: Anvend DEN-bistået raffinement42 og NCS dy under forbedringer for bedre nøjagtighed af modellen. Faktisk, DEN raffinement forbedret dramatisk geometrier og R-faktorer i strukturen, og R faktor var 22,2% og gratis R faktor var 27,8% for den endelige model. Dramatisk forbedring af den frie R skal være på grund af den høje præcision model af IKK1 domæner, der blev genereret fra modellens IKK2 (4KIK).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kloning og udtryk for forskellige konstruktioner af IKK1/α
Fuld længde menneskelige IKK1/α er klonet i baculovirus udtryk vektor pFastBacHTa inden for dens EcoRI og opdag begrænsning steder at få en N-terminale hexa-histidin markeret IKK1. Tag kunne fjernes ved TEV protease fordøjelsen. Da fuld længde IKK1/α indeholder fleksible regioner i begge ender, og fleksible regioner normalt gøre et protein vanskeligt at krystallisere, klonet vi forskellige afkortet fragmenter af IKK1/α inden for de ovennævnte steder af pFastBacHTa vektor. Forskellige trunkering mutanter af IKK1/α blev genereret med både wild-type (wt) og S176E, 180E (EE) rygbenet. IKK1/α EE refererer til den mimetiske af constitutively aktive form af fosforyleres kinase. Rekombinante baculovirus produktion og protein udtryk blev udført ved hjælp af en tidligere offentliggjort protokol med mindre ændringer43 (figur 1).

Vanskeligheder i IKK1/α krystallisering
Eftersom menneskelige IKK2/β og IKK1 er homologe, og vi kan krystallisere forskellige versioner af menneskelige IKK2/β under flere forskellige forhold, forventede vi IKK1/α at krystallisere under tilsvarende betingelser ved hjælp af lignende strategier. Men efter omfattende forsøg med flere forskellige IKK1-varianter, vi opnåede krystaller med kun én afkortet konstruktion (IKK1 10-667 EE) (figur 2), og som også kun i overværelse af IKK hæmmer XII44 , vises egnet Røntgen diffraktion egenskaber.

Struktur løsning
IKK1/α krystaller lidt fra talrige vækst problemer, og dataene, der ofte vises meget høj mosaicity. Svage krystal pakning forbundet med stort indhold af opløsningsmidler og den dynamiske karakter af IKK1 monomer/dimer er sandsynligvis grunden til dette. For at omgå disse problemer, omhyggelige indsats blev taget for at opnå de bedst mulige krystaller, og proceduren cryo-bevarelse blev udført med største omhu under forskellige forhold og med forskellige cryo-konserveringsmiddel buffere. Dataene blev også indsamlet med ultimativ præcision at minimere beam skader. Da krystaller var stor (største dimension ofte overstiger 400 mikron), blev forskellige områder af de samme krystaller udsat for X-ray stråle til at indsamle flere datasæt. Dette aktiveret forskellige DataSet skaleres og opnå et rimeligt komplet datasæt med højere redundans og minimeret fejl. Iblødsætning med tunge atomer, eller tunge atom klynger (f.eks.TaBr og TAMM), forårsagede krystaller til diffract utilstrækkeligt. Selv om vi kunne finde placeringen af TaBr klynger i afledte data, forudsat den dårlige kvalitet af dataene ud over den ikke-isomorphocity lidt, hvis nogen, fase oplysninger.

Vi behandlet datasæt med HKL2000 ved hjælp af forskellige tilgængelige parametre. Diffraktionsmønster afslørede at Krystallen tilhører plads gruppe P21 med enhed celle dimensioner, en = 174.51, b = 186.94, c = 275.83 Å og β = 98.84 grader. Vi brugte hovedsagelig jeg / σ til at anslå cut-off og testet forskellige cut-offs for DataSet. Vi opnåede en flettede data sæt 4.5 Å beslutning fra 4 af 7 sæt af diffraktion data indsamlet på en krystal. Vi besluttede at holde data indtil 4,5 Å fra besigtigelse af endelige tæthed kort. Det kan være værd at bruge CC1/2, da vi kan analytisk anslår CC af flettede datasættet mod de sande (normalt umålelige) intensitet ved hjælp af CC *45. På grund af den store enhed celle kombineret med lav symmetri af gruppen rum, forventede vi de asymmetriske enhed til at indeholde 12 til 24 molekyler baseret på en solvent indhold på 70% til 40%.

Den kombinerede effekt af lav opløsning X-ray data med svag intensitet (dvs., væsentlige fejl i data) (figur 3), store tal (12) af IKK1 molekyler i asymmetriske enhed og konformationelle variation af IKK1 monomere/dimerisk model i forhold til kendte IKK2 forhindret modeller, i første omgang os fra at opnå en molekylær udskiftning løsning IKK1, og således at fastlægge dets struktur.

IKK1/α og IKK2/β indeholder en kinase domæne (KD), en ubiquitin-lignende domæne (ULD) og en en spiralformet stillads dimerization domæne (SDD). Strukturen af IKK1 viste, at det danner dimerer ligeledes til IKK2 udnytter en næsten identisk Inter subunit grænseflade i den distale region SDD. IKK1 dimer vises dog en væsentligt anderledes relative placering af den N-terminale KD i forhold til SDD + ULD sammenlignes i kendte IKK2 dimerer. Forskellige IKK2 strukturer er tidligere angivet forskellige intermonomer orientering inden for dens dimerer (figur 4bedømmelseskomite A), således at afstande mellem P578 i de to KD i fire forskellige dimer modeller alpha kulstofatomer varierede mellem 39 og 61 Å. Da sekvenser af disse to kinaser ligner hinanden meget og restkoncentrationer på grænsefladen dimer er identiske, forventede vi IKK1/α ville danne en lignende dimer; men da der er betydelige forskelle i restkoncentrationer af KD-SDD grænseflade (f.eks.W424 og F111 i IKK2 er V P henholdsvis), vi forventede måske en endnu forskellige KD orientering i IKK1. Faktisk, IKK1/α struktur viste, at de relaterede retningslinjer af KD til SDD er unikke og det afviger fra alle kendte modeller af IKK2/β. Over hundrede dimer blev modeller brugt som Søg modeller i programmer PHASER, MOLREP og CNS uden succes, der viser behovet for en temmelig præcis søgning model for succes af molekylære udskiftning forsøg, især med vores lav opløsning data. En monomer model har for lidt masse til at afhente nogen løsning i den svage diffraktion data af den store asymmetriske enhed med 12 monomerer. Også, integration eller undladelse af vand i søgemodel gjorde ingen forskel i molekylær udskiftning søgninger, især på grund af den svage diffraktion data. CC1/2 og CC * angiver, at data op til 4,5 Å er helt præcise. Vi brugte en konservativ opløsning cut-off af 4.5 Å baseret på jeg / σ 1,5. Datasæt med forskellige beslutningsforslag cut-offs viste ikke nogen grel forskel under molekylære udskiftning søgning operationer, og endelige kort raffineret mod disse datasæt udviste ikke en klar forbedring i kortfunktioner på udvide opløsning cut-offs. Den endelige build af modellen er helt nøjagtig, mere end hvad kunne bygges fra tæthed alene, sandsynligvis siden de indledende molekylære udskiftning modeller blev bygget fra modeller stammer med en høj opløsning data, og vi udnyttede cryo-EM kort/tæthed til Cross-check funktioner af kort, især i regioner hvor kort var uklart.

Set i bakspejlet var opnåelse af en nyttig søgemodel muligt kun på grund af tilgængeligheden af lav opløsning cryo-EM kort, og en temmelig høj nøjagtighed model af IKK1 domæner, der kan genereres baseret på høj opløsning IKK2 struktur (figur 4 bedømmelseskomite B). Vi kunne forankre IKK1 domæner i cryo-EM kort af IKK1 at opnå en rimelig tæt dimer model. Den første model er angivet en orientering af KD roteret omkring 24 grader i forhold til, af en IKK2 monomer, og N-terminale åbning af 58 Å (mellem P578 af to KDs i en dimer). Vores forudgående kendskab til forskellige IKK2/β dimer strukturer (og deres variation) gjort det muligt at finjustere søgning-model ved at ændre åbninger mellem 30-62 Å. ved hjælp af en af dimerer (52 Å åbning) som en søgning model, vi placeret seks dimerer i asymmetriske enheden ved hjælp af programmet MOLREP46. Disse seks dimerer er organiseret i to hexamers i den asymmetriske enhed, og den beregnede opløsningsmiddel har en volumen på 68%.

Figure 1
Figur 1: rensning af IKK1. (A) udtryk af IKK1 (10-667) i insekt celler. (B) et flowdiagram til rensning af IKK1; (C) en SDS-PAGE gel viser renheden af IKK1 efter Ni-NTA affinitet kromatografi trin. (D) størrelse-udelukkelse profil med angivelse af dimer af IKK1. (E) SDS-PAGE gel viser renheden af IKK1 fra peak størrelse-udelukkelse fraktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: morfologi og størrelsen af IKK1 krystaller. (A) en krystal af IKK1 konstruere 10-667; krystallisering drop viser også krystaller af en anden morfologi (tynde plader), som ikke diffract godt. (B) zoomet på baggrund af krystal, der diffrakteres til ud over 5 Å. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3:. Krystallografiske data indhentet fra IKK1 krystaller. (A) en røntgen diffraktion profil af en IKK1 krystal med angivelse af fattige diffraktion egenskaber af typiske IKK1 krystaller. (B) HKL2000 skalering statistik over den flettede datasæt anvendes til IKK1 struktur beslutsomhed og dublering af data. R lineær = SUM (ABS (jeg - < i >)) / SUM (I), R kvadrat = SUM ((jeg - < i >) ** 2) / SUM (jeg ** 2), Chi ** 2 = SUM ((jeg - < i >) ** 2) / (fejl ** 2 * N / (N-1))), CC1/2 = korrelationskoefficienten, CC * = korrelationskoefficienten af flettede datasæt mod sand intensiteter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: forberedelse af Søg modeller. (A) forskellige modeller af IKK2 dimer angiver forskellige orienteringer af KD i forhold til SDD (giver anledning til forskellige adskillelse mellem to KD); disse modeller blev testet i første omgang for at finde en molekylær udskiftning løsning uden succes. (B) Generation af IKK1 søgning modeller - Cryo-EM kort over IKK1 dimer med 11 Å opløsning; EM-kort monteret indledende IKK1 søgemodel, enkelte domæner er baseret på IKK2 model (4KIK); En IKK1 søgemodel yderligere bøde-tweaked (passende KD orientering) baseret på forskellige muligheder, som bedømt ud fra IKK2 modeller beskrive ovenfor i 4A; Superposition af EM-kort monteret model til den søgemodel, der gav den molekylære udskiftning løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Produktion, krystallisering og struktur løsning af to relaterede IKK proteiner
Vi satte sig for at bestemme X-ray krystalstruktur af IKK1/α med forestillingen om, at det ville være en relativt enkel øvelse givet vores erfaring med IKK2/β protein produktion, krystallisering og struktur beslutsomhed. Men vi var meget overrasket over, at disse to relaterede proteiner opførte sig meget anderledes med hensyn til lethed af krystallisering. Trods indsats fra flere højt profilerede laboratorier tog bestemmelse af IKK1 struktur næsten to årtier. Dette skyldtes hovedsagelig et par centrale flaskehalse.

Den første vanskelighed var at opnå en meget ren og opløseligt protein form. Insekt celle ekspressionssystem lykkedes os at opnå mg mængder af ren protein, der var rimeligt opløselig. Med hensyn til niveauet for udtryk, alle IKK1/α konstruktioner udtrykt på et langt lavere niveau end IKK2/β konstruktioner i insekt celle udtryk systemer. Det skal bemærkes, at hverken protein er opløselige og funktionelle udtrykt i E. coli. I et insekt celle ekspressionssystem, IKK2/β fragmenter udtrykt på et højt niveau varierede fra 10 til 30 mg/L af kultur afhængigt af konstruktioner. Derimod kunne IKK1/α konstruktioner genereres kun på 0,5 til 2,0 mg/L af kultur. Årsagen til denne forskel er stadig ukendt for os. Vi skal også prøve udtryk for IKK1 i native værtsceller (dvs., pattedyr overekspression system i tilfælde af et pattedyr IKK protein), især siden de posttranslationelle modifikationer såsom auto - eller trans-fosforylering almindeligt forekommende i IKK vil forekomme mest effektivt og hensigtsmæssigt i sit oprindelige miljø. Rensning af IKK komplekser direkte fra store skala kultur i pattedyrceller er også i øjeblikket medgørlige.

Mens du arbejder med IKK2/β, bemærket vi, at det kan være homogent auto-fosforyleret ved at behandle med ATP, og dette gør proteinfraktionen imødekommenhed over for krystallisering. På samme måde, inkubation af IKK1 protein med ATP og den deraf følgende auto-fosforylering, givet en aktiveret IKK1, der var opløselig og velegnet til både biokemiske karakterisering og Krystalstrukturbestemmelse.

Et afgørende skridt til at opnå godt diffracting krystaller var hen til nobel indstille krystallisering betingelserne, især tilføjelsen af den rigtige type og koncentration af Dextran sulfat molekyler. Tæthed angiver bundne Dextran sulfat molekyler, og dens deraf følgende indvirkning på IKK1 var sandsynligvis kritisk for krystallisering.

Den iboende fleksibilitet af IKK1, som er ofte observeret i kinaser, er den primære hindring for krystallisering og er ofte knyttet til engagement af domænet kinase med aktivisering sløjfen. IKK2 med både indfødte (S177 og S181) og phosphomimetic (EE) former for aktivering loop serines kunne være krystalliseret, men vi kun opnået krystaller med afkortede IKK1/α af SS EE mutant version og som også kun i tilstedeværelse af IKK hæmmer XII. Disse krystaller diffrakteres godt nok for struktur bestemmelse kun når der dyrkes i det kolde rum (~ 4-6 ° C). Hvis vi støder på en tilsvarende stædig adfærd med enhver IKK1 homolog (eller en IKK ortholog), kan vi prøve forskellige backbone ændringer (især i de aktive site loop Serin rester, som er almindeligt fosforyleret). Vi kan også prøve Co krystallisering i tilstedeværelse af interagerende partner proteiner. Mange kinaser, herunder familien IKK interagere med partner proteiner og opholde sig høje komplekser.

Flere hæmmere hjalp producere IKK2 krystaller under forskellige forhold (f.eks.med både højt saltindhold, PIND som en fældningsmiddel), både ved 18 ° C, og i det kolde rum. Dog producerer under lignende betingelser og med en bred vifte af hæmmere, IKK1/α ikke nogen krystal. Således vil brug af en større repertoire af hæmmere helt sikkert øge chancerne for at finde en, der aktiverer krystallisering.

En anden kritisk trin i struktur bestemmelse var omhyggelig cryo-bevarelse og dataindsamlingsprocedure. Svage data og hurtige henfald af krystaller i X-ray stråle berettiget behovet for større krystaller og samling af flere datasæt fra de samme krystaller. Uden en rimelig komplet datasæt af høj nøjagtighed, kunne det ikke lykkedes at opnå en molekylær udskiftning løsning.

Endelig lykkedes det os at bestemme strukturen af IKK1/α af molekylære udskiftning ved hjælp af mere end 100 modeller lavet fra kendte IKK2/β strukturelle modeller fås i den offentlige database. Således, at opnå en passende model for en molekylær udskiftning procedure var et must. Cryo-EM kort, høj nøjagtighed strukturelle modeller af enkelte domæner, sammen med sammenlignende studier af på forhånd fastlagt IKK2 strukturer førte os til at opnå en søgemodel, der hentede os den molekylære udskiftning løsning.

Krystalliseringen af et protein er i sagens natur tilfældige, så trods efter ovenstående struktureret vejledning, vi måske står over for problemer i crystallizing en anden IKK1 homolog eller en anden fuld længde eller afkortede konstruktion af den menneskelige IKK1. Uanset hvad, vil viden om disse kritiske trin aktiverer en forsker til at udforske rationelle betingelser, der vil øge chancerne for at opnå et godt diffracting IKK krystal.

IKK1/α og IKK2/β viser lignende domæne organisation men anden interdomain organisation
Ikke overraskende er vedtage både IKK1/α og IKK2/β en meget lignende domænearkitektur stammer fra deres høje sekvens lighed33,43. Som tidligere nævnt både IKK1/α og IKK2/β fold i tre forskellige domæner: N-terminale kinase domæne, ubiquitin som domæne (ULD) og stillads dimerization domæne (SDD). Både IKK1/α og IKK2/β danner dimere forbindelser, stabil, den C-terminale halvdelen af SDD deltage i dimerization. Restkoncentrationer involveret i dimer dannelsen er identiske. Inter domæne interaktioner mellem SDD/ULD og KD er dog noget anderledes, da disse indebærer forskellige restkoncentrationer. Dette sandsynligvis også forårsaget den relative orientering af domænet kinase til SDD i IKK1/α er forskelligt fra det i IKK2/β. Dette var ikke helt uventet, da vi også observere forskelle blandt IKK2/β-dimer modeller. Interessant, kan IKK2/β dimerer organisere i tetramers i krystalgitter, selv om denne tetramerization tilbøjelighed er svag i løsning. Men IKK1/α dimerer dannet unikke hexamers. Disse hexamers er også observeret i løsning, selv om kun en lille pulje af IKK1/α dimerer findes som hexamers. Disse tyder på, at hexamerization er tilbøjelige til at have et bestemt og afgørende funktion.

Differentiere funktionelle forskelle fra strukturelle forskelle
IKK1/α og IKK2/β udføre forskellige funktioner i celler. Forholdet mellem IKK1/α funktion og struktur er imidlertid forblev undvigende. IKK1/α klart findes i forskellige former: som gratis dimer eller hexamer, og inden for et hidtil uncharacterized hetero-trimer kompleks sammen med IKK2/β og NEMO. Da IKK2/β aktivering af canonical signalering ikke kræver IKK1/α, uklart IKK1/α funktionelle rolle i heterotrimer (canonical IKK-komplekset). Det er også uklart, om aktivering af IKK1/α induceret af ikke-kanoniske signalering bygger på gratis dimerisk IKK1/α og/eller hexameric IKK1/α. Da mutationsmønstre eksperimenter viser, at afbrydelse af grænsefladen hexamer stærkt påvirker ikke-kanoniske signalering, er hexamerization sandsynligvis vil være af afgørende betydning på et tidspunkt under ikke-kanoniske signalering.

Designe lille molekyle hæmmere ved hjælp af IKK1/α struktur
Kendskab til strukturen af IKK1/α gør det muligt for os at undersøge overflade pletter på en monomer eller lommer på Inter domæne eller Inter monomer grænseflader, som kan blive ramt af små molekyler. IKKs har længe været betragtet som vigtigt stof mål. Væsentlighed af disse kinaser i en bred vifte af funktioner, herunder cellulære homøostase, kropsligt levedygtighed og immunitet gør det imidlertid særdeles vanskeligt at målrette dem. Hidtil, har ingen IKK-målrettet molekyle fundet at kunne anvendes sikkert i patienter.

IKK1/α og IKK2/β er ofte målrettet samtidig af deres hæmmere da deres kinase domæner er meget ens i sekvens og struktur. Betydelig forskningsindsats har været brugt til at finde specifikke hæmmere målretning kun én af disse to kinaser. Derfor flere IKK2/β-specifikke hæmmere er blevet opdaget, hvoraf nogle påvirker ikke IKK1/α funktion. Dog, at vores viden ikke sådanne sammensatte findes der effektivt hæmmer IKK1/α uden forstyrrende IKK2/β funktion. Dette fravær kunne tilskrives manglen strukturelle oplysninger om IKK1/α. Vores strukturelle og cellular undersøgelser tyder på, at selvom domænet arrangement og globale subunit strukturer er meget ens i disse to proteiner, de viser unikke high-ordre ordninger anvender specifikke overflade patches33. Disse forskelle, der aktiverer forskellige interaktioner med tilhørende proteiner skal oversætte til deres funktionelle forskelle. Vi er håbefuld at disse sondringer afslørede mellem IKK1/α og IKK2/β inter - og intra-subunit interaktioner kan udnyttes til at gøre subunit-specifikke allosteriske hæmmere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takke personalet på beamlines 19ID, 24ID og 13ID på avanceret Photon kilde, Lemont, IL, for støtte under dataindsamling på forskellige krystaller. Vi er taknemmelige for Dmitry Lyumkis, Salk Institute til at hente os lav opløsning cryo-EM kort på tidlige stadier af EM kort/model bygning, som blev brugt til at bygge den første IKK1 molekylære udskiftning søgemodel. Forskning fører til disse resultater har modtaget midler fra NIH tilskud AI064326, CA141722 og GM071862 til GG. SP er i øjeblikket en Wellcome Trust DBT Indien mellemliggende fyr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Tags

Biokemi sag 141 Serin-Threonin protein Kinase IKK1/α NF-κB krystalstruktur Molekylær udskiftning hæmmer
En Guide til produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af menneskelige IKK1/α
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Polley, S., Huang, D. B., Biswas,… More

Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter