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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Eine Anleitung zur Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von menschlichen IKK1/α

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

IκBα Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) ist ein Ser/Thr-Proteinkinase, die in einer Vielzahl von zellulären Aktivitäten in erster Linie durch Aktivierung von NF-κB Transkriptionsfaktoren beteiligt ist. Hier beschreiben wir die wichtigsten Schritte für die Produktion und Kristall Strukturbestimmung dieses Proteins notwendig.

Abstract

Eine Klasse von extrazellulären Reize erfordert die Aktivierung von IKK1/α induzieren eine NF-κB-Untereinheit, p52, durch Verarbeitung von seinen Vorläufer-p100-Generation. P52 Funktionen als Homodimer oder Heterodimer mit einem anderen NF-κB-Untereinheit, RelB. Diese Dimere Regeln wiederum den Ausdruck von Hunderten von Genen beteiligt sind Entzündungen, Zelle überleben und Zellzyklus. IKK1/α bleibt in erster Linie als ternäre Komplex IKK2/β und NEMO zugeordnet. Ein kleiner Pool es wird jedoch auch als eine niedermolekulare complex(es) beobachtet. Es ist unbekannt, ob die p100-Verarbeitung-Aktivität durch Aktivierung der IKK1/α innerhalb der größeren oder kleineren komplexen Pool ausgelöst wird. Konstitutive Aktivität von IKK1/α wurde in verschiedenen Krebsarten und entzündlichen Erkrankungen erkannt. Um den Mechanismus der Aktivierung von IKK1/α zu verstehen, und seine Verwendung als Medikament Ziel, ausgedrückt wir rekombinanten IKK1/α in anderen Host-Systemen, wie E. Coli, Insekt und Säugerzellen. Uns gelungen, mit dem Ausdruck lösliche IKK1/α in Baculovirus Insektenzellen, mg-Mengen an hoch reines Protein zu erhalten, in Anwesenheit von Inhibitoren kristallisieren und Bestimmung der Röntgen-Kristallstruktur infiziert. Hier beschreiben wir die einzelnen Schritte um das rekombinante Protein, die Kristallisation und seine x-ray Kristall Strukturbestimmung zu produzieren.

Introduction

Transkriptionelle Aktivitäten der NF-κB-Familie von dimeres Transkriptionsfaktoren sind erforderlich für verschiedene Zellfunktionen Entzündung und Immunität bis hin zu überleben und sterben. Diese Aktivitäten werden in Zellen und einem Verlust der Verordnung führt zu verschiedenen pathologischen Bedingungen, einschließlich der Autoimmun-Krankheiten und Krebs1,2,3streng kontrolliert. In Ermangelung eines Reizes sind die Aktivitäten der NF-κB gehemmt durch IκBα (Inhibitor - κB) Proteine4gehalten. Die Phosphorylierung des spezifischen Ser Rückstände auf IκBα Proteine markiert diese für Ubiquitination und anschließende proteasomalen Abbau oder selektive Verarbeitung5. Zwei hochgradig homologe Ser/Thr-Kinasen, IKK2/β und IKK1/α, fungieren als zentrale Regulatoren des NF-κB-Aktivitäten durch die Durchführung diese Phosphorylierung Veranstaltungen6,7.

Wechselwirkungen zwischen einem Ligand und Rezeptor transduces ein Signal durch eine Reihe von Mediatoren führt zur Aktivierung von NF-κB-Faktoren. Der NF-κB-Signalisierung-Prozess kann grob in zwei unterschiedliche Wege – kanonischen und nicht-kanonischen (alternative)8aufgeteilt werden. Die Aktivität der IKK2/β regelt in erster Linie die NF-κB Signalisierung der kanonischen Weges, der für entzündliche und angeborene Immunantwort9unerlässlich. Ein besonderes Merkmal dieser Weg ist eine schnelle und kurzlebigen Aktivierung von IKK2/β10 innerhalb einer komplexen bisher biochemisch Fußgelenkes IKK – vermutet, bestehend aus IKK1 und IKK2 sowie eine regulatorische Komponente, NEMO (NF-κB wesentliche Modulator )11,12,13. Zwischen den zwei katalytische IKK Untereinheiten des IKK-komplexes, IKK2 ist in erster Linie verantwortlich14 für die Phosphorylierung von spezifischen Rückständen von prototypischen IκBs (α, β- und γ-) verpflichtet, NF-κB, und auch eine atypische IκBα Protein NF-κB1/p105 ist ein Vorläufer des NF-κB p50 Untereinheit5. Phosphorylierung induzierten Ubiquitination und proteasomalen Abbau von IκBα (oder Verarbeitung von p105) führt zur Freisetzung und Aktivierung eines bestimmten Satzes von NF-κB Dimere15. Aberrante NF-κB-Aktivität durch MIS geregelte Funktion des IKK2 ist bei vielen Krebsarten, wie Autoimmun-Krankheiten2,3,16beobachtet worden.

Im Gegensatz zu IKK2/β reguliert die Aktivität von IKK1/α NF-κB Signalisierung des nicht-kanonischen Weges, die wesentlich für die Entwicklung und Immunität. IKK1 phosphorylates bestimmte Rückstände des NF-κB2/p100 auf Segment C-terminalen IκBδ, führt zu deren Verarbeitung und die Generierung von p52. Die Bildung von transcriptionally aktiv P52:RelB Heterodimer initiiert eine langsame und nachhaltige Antwort auf Entwicklungsstörungen Signale7,17,18,19,20. Interessanterweise ist die Generation der zentralen NF-κB Faktor p52 dieses Pfades ein weiterer Faktor, NF-κB induzierende Kinase (NIK)21,22, aber nicht auf IKK2 oder NEMO kritisch abhängig. Ruhende Zellen bleibt das Niveau der NIK aufgrund seiner konstanten Proteasom-abhängige Abbau23,24,25. Nach Stimulation der Zellen durch "nicht-kanonischen" Liganden und in bestimmten malignen Zellen NIK wird stabilisiert, um zu rekrutieren und aktivieren IKK1 / α-Kinase die Tätigkeit der NIK und IKK1 sind wesentlich für die effiziente Verarbeitung der p100 zu p527. IKK1 und NIK phosphorylieren drei Serine (Ser866, 870 bis 872) des NF-κB2/p100 auf seinem C-terminalen IκBδ Segment führt zu deren Verarbeitung und die Generierung von p52. Aberrante Aktivierung der nicht-kanonischen Weg hat in vielen Malignome einschließlich Multiples Myelom26,27,28verwickelt.

Einige höchst effiziente und spezifische Hemmstoffe für IKK2/β sind bekannt, obwohl keines bisher erwies haben sich als um ein wirksames Medikament zu sein. Im Gegensatz dazu sind IKK1/α-spezifische Inhibitoren spärlich. Dies kann stammen teilweise aus unser Mangel an strukturelle und biochemische Informationen über IKK1/α, das unser Verständnis der mechanistischen Grundlagen der Aktivierung von NF-κB von IKK1 in den Zellen und rationalen Wirkstoffdesign einschränkt. Die Röntgen-Strukturen der IKK2/β hat uns Einblicke in den Aktivierungsmechanismus von IKK2/β-29; Diese Strukturen könnten zeigen jedoch nicht wie andere vorgelagerte Reize auslösen Aktivierung des IKK1/α oder IKK2/β, verschiedene Gruppen von NF-κB Aktivitäten 30,31zu regulieren. Die mechanistische Grundlage zugrunde liegenden unterschiedlichen Signalfunktion von IKK1/α zu verstehen und eine Plattform für rationale Wirkstoffdesign etablieren, konzentrierten wir uns auf die Struktur von IKK1/α.

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Protocol

1. Vorbereitung des rekombinanten Virus geeignet für großflächige Ausdruck der IKK1/α

  1. P1-Virus-Vorbereitung 32
    1. Tag 1: Platte Sf9 Zellen (~ 6 X 105) (Durchgang Nummer weniger als 10) in 2 mL Sf900 III Insekt Zelle Medium in jedem der 6-Well-Platte und Inkubation bei 27 ° C. Durchgang Zellen, wenn sie eine Dichte von 2 bis 3 X 106 Zellen pro mL in der Schwebe zu erreichen durch Verdünnung in frische Medien bei einer Dichte von ~ 6 X 105.
    2. 2. Tag: Verdünnen Sie 8 µL Sf9-Transfection Reagens in 100 µL Sf900 III oder Graces Insekt Medium ohne Antibiotikum und Serum. Vortex kurz.
    3. Verdünnen Sie 1 µg der Kit-gereinigte rekombinante Bacmid (Angaben in "Vertreter Ergebnisse")32 in einem anderen 100 µL des gleichen Mediums, in einem separaten Rohr.
    4. Kombinieren Sie verdünnte DNA und Transfection Reagens (Gesamtvolumen ~ 210-220 μL) und bei 15-30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen. Fügen Sie 1 mL frisches Medium ohne Antibiotikum und Serum.
    6. Fügen Sie die verdünnte DNA-Transfection Reagens Mischung tropfenweise auf die Zellen. Passen Sie die Tropfengröße, so dass es nicht adhärente Zellen verdrängen wird.
    7. Nach ~ 6 h 1,5 mL frisches Medium an der Spitze oder entfernen Sie das Medium zu und fügen Sie 2,5 mL frisches Medium hinzu. Warme frische Mittel-bis 25-27 ° C vor der Addition.
    8. Inkubation der Zellen bei 27 ° C. Überprüfen Sie die Brunnen in regelmäßigen Abständen alle ~ 12 h auf Anzeichen einer Virusinfektion. Führen Sie alle Sf9 Wartung und Ausdruck bei 27 ° C.
    9. Tag 5: Nehmen Sie die Zellen 60-72 h Post Infektion-haltigem Medium. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g und 4 ° C. Den Überstand zu retten; Dies ist die P1-Virus bestand. Einfrieren von kleinen Aliquote bei-80 ° C.
  2. Auswahl der besten P1 Virus Klon zum Ausdruck zu bringen.
    1. Platte Zellen ähnlich wie in Schritt 1.1 beschrieben.
    2. Nächsten Tag oder ~ 6 h Post Plattieren, fügen Sie 20 µL und 50 µL der verschiedenen P1 Virus Klon Bestände auf die Zellen in verschiedene Brunnen.
    3. Verdrängen Sie adhärenten Zellen durch sanfte Pipettieren zu und ernten Sie die infizierten Zellen 60-72 h Post Infektion durch Zentrifugieren für 5 min bei 500 x g und 4 ° C. Den Überstand zu retten. Dies ist der P2 Virus bestand. Shop kleine Aliquote des Bestands bei-80 ° C.
    4. Die geernteten Zelle Pellet 100 µL 2 X Laemmli SDS Puffers hinzufügen. Wärme auf > 95 ° C für 10 min. Zentrifugieren (in der Regel > 10.000 x g) für 5 Minuten.
    5. Laufen Sie 10-15 µL jeder Probe auf 8-10 % SDS-PAGE bei 120-160 V, bis die Farbstoff Front Ende des Gels erreicht.
    6. Elektro-Übertragung die aufgelöste Proteine von standard semi-Dry transfer Protokoll (20 V, 30-45 min) auf eine Nitrocellulose/PVDF-Membran.
    7. Blot mit Anti-IKK1 Antikörper (Verdünnung ~ 1:2, 000, muss optimiert werden) oder Anti-PentaHis Antikörper (Verdünnung ~ 1:3, 000, muss optimiert werden) für den Ausdruck.
    8. Wählen Sie die beste P1 Virus Klon durch den Vergleich der Expression von rekombinanten IKK1.
  3. Vorbereitung der großen Skala P3 Virus bestand.
    1. Platte Zellen ähnlich wie in Schritt 1.1 in einer 15 cm Platte mit 25-30 mL Sf900 III Medium beschrieben.
    2. ~ 6 h post Beschichtung, 150-300 µL der am besten mit dem Ausdruck ihrer P1 Virus bestand auf die Zellen hinzufügen.
    3. Nach 72 h post-Infektion, Aspirieren des Mediums sorgfältig aus der Platte in einem geeigneten Rohr (steril) und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 500-1000 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen der Zelle Pellet (wenn man ausgebildet ist) und Speichern des Überstands. Dies ist P3 Virus bestand.
  4. Bestimmung der optimalen Virus-Titer für groß angelegte Proteinexpression
    1. Platte Zellen in 2 mL Sf900 III Medium, wie unter 1.1, in einem 6-Well-Platte.
    2. Fügen Sie 20, 30, 40 und 50 µL P3 Virus bestand in separaten ~ 6 h post Plattieren Brunnen. Gehören Sie einer nicht infizierten Kontrolle.
    3. Zellen von jeder gut 48-60 h Post Infektion zu ernten.
    4. Fügen Sie 100 µL 2 X Laemmli SDS Puffers. Wärme auf > 95 ° C für 10 min. Zentrifuge (in der Regel bei 14.000 x g) für 5 Minuten.
    5. Lösen Sie 10-15 µL jeder Probe in ein ca. 8-10 % SDS-PAGE Gel.
    6. Übertragen Sie aufgelöst Protein auf eine Nitrocellulose/PVDF-Membran, wie in 1.2.6 erwähnt.
    7. Blot mit Anti-IKK1 Antikörper (Verdünnung ~ 1: 2000, muss optimiert werden) oder Anti-PentaHis Antikörper (Verdünnung ~ 1:3000, muss optimiert werden).
    8. Verwenden Sie das Virus mit den besten Titer für groß angelegte Ausdrücke zum Ausdruck zu bringen.

(2) groß angelegte Ausdruck von 6 X-HSI Verschlagwortet mit menschlichen IKK129,33

  1. Groß angelegte Ausdruck in einer Suspensionskultur durchführen. Teilen von Zellen in 1 L des Sf900 III Medium in einem 2 L Erlenmeyer-Kolben mit einer belüftete Kappe. Die Zelldichte sollte ca. 5 x 105 Zellen/mL.
  2. Wachsen Sie diese Zellen in Suspension bei ~ 100 u/min bei 27 ° C in einem Shaker für ~ 2 Tage, bis es eine Dichte von 1-2 x 106/mL erreicht. Zelldichte darf 2 x 106/mL nicht überschreiten.
  3. Fügen Sie die gewünschte Menge an P3-Virus, wie in 1,4 bewertet.
  4. Wachsen Sie die infizierten Kultur 48-60 Stunden bei ~ 100 u/min bei 27 ° C in einen Shaker geben.
  5. Ernten von Zellen durch Zentrifugation bei < 1.500 x g bei 4 ° C.
  6. Speichern der Zelle Pellet und entsorgen Sie das Medium.
  7. Gehen Sie direkt zum Proteinreinigung. Flash Einfrieren der Zelle Pellet in flüssigem Stickstoff und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung speichern.

3. Reinigung von seinem IKK133

  1. Am 1. Tag, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 40 mL Lyse-Puffer (25 mM Tris pH 8.0, 0,2 % NP-40, 200 mM NaCl 10 mM Imidazol, 10 % Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol und Protease-Inhibitor cocktail).
    Hinweis: Die Nasszelle Pellet Masse wurde nicht ermittelt. ~ 2 L Kultur war in der Regel für diesen Schritt verwendet.
  2. Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung bei 60-70 % Einschaltdauer, 5-10 Impulse von 30 s Dauer im Abstand von > 1 min, halten die Zellsuspension auf Eis gekühlt.
    Hinweis: Dieser Schritt erfordert Optimierung mit jedem Modell von Sonikator. Lassen Sie sich nicht die Probe Aufwärmen über 10 ° C.
  3. Klären Sie die lysate durch Zentrifugation bei ≥ 28.000 x g 45 min bei 4 ° c
  4. Equilibrate 4 mL Ni-NTA Agarose Harz mit Lyse-Puffer und Mischung der geklärte lysate (überstand) nach der Hersteller-Protokolls.
  5. Lassen Sie das Protein, das Harz durch Inkubation für 2 h auf einem Drehrührwerk in einem Raum von 4 ° C zu binden.
  6. Waschen Sie das Harz mit der Lyse-Puffer mit 30 mM Imidazol. Proteinkonzentration in der Wasch-Fraktion in regelmäßigen Abständen mit Bradford-Test zu überprüfen. Waschen Sie, bis dieser Proteinkonzentration in der Wasch-Fraktion 0,1 mg/mL erreicht. In der Regel ist > 20 Bett Volumen von Waschpuffer erforderlich, um diesen Punkt zu erreichen.
  7. Eluieren Sie His-Tag IKK1/α Proteins unter Schwerkraft fließen, mit 20 mL Elution Puffer (die Lyse-Puffer mit 250 mM Imidazol). Sammeln Sie 1-1,5 mL-Fraktionen.
  8. Überprüfen Sie die Reinheit des eluierten Proteins auf eine 8 oder 10 % SDS-PAGE-Gel von 5-10 μl Probe aus allen Fraktionen, gemischt mit Laemmli-Puffer laden.
  9. Pool Peak Brüche (Konzentration ≥ 2mg/mL), und Proteinkonzentration mit der Bradford-Test zu messen.
  10. Verdauen Sie mit TEV (01:30-50 (TEV Protease: IKK1)) Protease über Nacht (≥12 h) bei 4 ° C.
    Hinweis: Optimieren Sie die Menge der TEV Protease erforderlich für komplette Verdauung (≥ 95 %) von der a-priori6 X-His-Tag. TEV Protease wurde im Haus gereinigt.
  11. Am Morgen des 2. Tag Bebrüten Sie das Protein mit 1 mM ATP in Gegenwart von 20 mM MgCl2, β-Glycerophosphat 20 mM und 10 mM NaF 1 mM Natrium Orthovanadate für 1 h bei 27 ° C.
  12. Filtern Sie die Proteinlösung durch einen 0,45 oder 0,22-μm-Filter.
  13. 6 mL der Probe auf eine ~ 120 mL präparative Größe-Ausschluss Säule angebracht zu einem automatisierten Flüssigchromatographie-System zu laden. Equilibrate die Spalte mit Puffer A (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM DVB-t, 5 % Glycerin), vor der Anwendung der Protein-Probe.
    Hinweis: Eine kleinere Spalte könnte je nach Ausbeute an Protein nach dem Ni-NTA Affinität Reinigungsschritt verwendet werden. Anpassen/Ladevolumen um 5 % der Spalte Volumen zu berechnen).
  14. Führen Sie die Größe-Exclusion Chromatography bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min, und überwachen Sie Elution bei 280 und 254 nm. Sammeln Sie Bruchteile von 2 mL Größe.
  15. Reinheit der Peak Fraktionen zu überprüfen (in der Regel rund ~ 60-70 mL) auf einem ca. 8-10 % SDS-PAGE Gel.
  16. Sortenreine Fraktionen (Reinheit ≥95 % mit einer Konzentration von ≥0.5 mg/mL) zu bündeln und konzentrieren Sie sich in einem 10 kDa oder 30 kDa Molekulargewicht Cut-off zentrifugale Protein Konzentrator nach den Anweisungen des Herstellers.
  17. In regelmäßigen Abständen überprüfen Sie Proteinkonzentration des Konzentrats nach der Methode von Bradford und konzentrieren Sie die Probe bis zu 8-12 mg/mL.
  18. 25 μL Aliquote und Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff zu verzichten. Diese Flash-gefrorenen Proben im-80 ° C Gefrierschrank aufbewahren.

4. Bildschirm für Kristallisation Zustand des IKK1

  1. Berechnen Sie den Gesamtbetrag (nach Volumen) des Proteins erforderlich für Kristalle nach unten beschriebenen Methoden auf den Bildschirm.
  2. Probieren Sie verschiedene Inhibitoren (generische Kinase-Inhibitoren: AMPPNP und Staurosporine; IKK-specific Inhibitoren: MLN120B, Verbindung A und IKK-Inhibitor XII) Screening für Kristallisation durchführen. Stammlösungen dieser Verbindungen nach den Anweisungen des Herstellers zu machen. Stellen Sie sicher, dass die maximale Konzentration der Verbindung in der Stammlösung 20 μm nicht überschreitet.
  3. Komplexe IKK:inhibitor für die Kristallisation Bildschirm vorbereiten, indem mischen 100 μM von IKK1 mit 200 μM-Inhibitor und brüten bei 18-20 ° C für 30-40 min. Zentrifugieren Sie diese Mischung auf > 15.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Den Überstand für Kristallisation Bildschirm zu speichern.
  4. Verwenden Sie die im Handel erhältlichen Kristallisation Bildschirme (siehe die Tabelle der Materialien).
  5. Pipette 80-100 μL jeder Kristallisation Reagenz (Reservoir Solutions), mit einer Mehrkanal-Pipette oder einen Roboter in das Reservoir einer 96-Well-Platte. Die Platte ist nun bereit, um Tropfen einzurichten. Sicherstellen Sie, dass die Platte Kristallisation von 2 bis 3 Tropfen beherbergt, so dass 2 bis 3 Inhibitoren in einer einzigen Platte gezeigt werden können.
  6. Mit Hilfe eines Roboters Kristallisation, verzichten und mischen 0,2 – 0,25 μl der IKK1:inhibitor Komplex mit dem gleichen Volumen Behälter-Lösung.
    Hinweis: Screening erfolgt manuell über größere Tropfen Mengen (0,5 bis 1,0 μL der IKK1:inhibitor Komplex mit dem gleichen Volumen Tank-Lösung). Einsatz eines Roboters würde jedoch wertvolle Reagenzien retten.
  7. Versiegeln Sie die Platten sofort nach dem Einstellen der Tropfen mit optisch klare Filme um Verdunstung zu vermeiden. Richtig mit geeigneten Applikator zu versiegeln. Replik-Platten für jede Inhibitor zu machen. Inkubieren Sie eine Platte bei 18 ° C, und die andere in den kalten Raum (Temperatur Bereich ~ 4 – 6 ° C). Stellen Sie sicher, dass Inkubatoren Vibrationen nicht betroffen sind.
  8. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einem Polarisator für Darstellung von Kristallen in jedem Tropfen jeden Tag für die ersten sieben Tage, und dann in längeren Abständen zu überprüfen. Systematisch beachten und Ergebnis dieser Beobachtungen.
    Hinweis: Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einem Polarisator, damit die Wachstumsstörungen in Kristallen visuell beurteilt werden können. Hier erschien Kristalle in einem Zustand wo enthalten die Reservoir-Lösung 3 % w/V Dextran Sulfat Natrium Salz MR 5.000, 0,1 M BICINE pH 8,5, 15 % w/V Polyethylenglykol 20.000. Kristalle von IKK1 wuchs nur in Anwesenheit von IKK-Inhibitor XII.

5. die Kristallzüchtung Optimierung29,33

  1. Vorbereitung der Stammlösungen.
    1. Bereiten Sie 30 % w/V-Lösungen von Dextran Sulfat von unterschiedlichem Molekulargewicht (ø MW 5.000, 8.000, 15.000, 40.000 Da) in entionisiertem H2O. Filterlösung 0,22-μm-Filter verwenden.
    2. Bereiten Sie 1 M oder 0,5 M Aktien von verschiedenen Puffern im pH-Bereich von 6,5 bis 9. Filtern Sie Lösungen mit 0,22-μm-Filter.
    3. Vorbereiten von 25 % oder 50 % (w/V) PEG-Lösungen von unterschiedlichem Molekulargewicht (AVG MW:1000 1.500 3.350, 4.000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, 20.000 Da). Filtern Sie Lösungen mit 0,22-μm-Filter.
    4. Führen Sie eine Rasterbildschirm durch systematische Variation, pH-Wert, Puffer, Konzentration und Art der PEG und Dextran Sulfat.
  2. Screening bei 18 ° C und in den kalten Raum (Temperatur Bereich ~ 4-6 ° C) zu optimieren.
  3. Eine gleiche Menge von komplexen IKK1:Inhibitor mit gut Lösung mischen und über die gut Lösung in einer geschlossenen Umgebung inkubieren. Dieser Schritt kann manuell erfolgen oder mit Hilfe eines Roboters Abgabe.
    Hinweis: Hier die größten und klar definierte Kristalle (wie einheitliche Farbe unter den Polarisator die gleichmäßige Wachstum angegeben bewertet) wurden unter folgenden Bedingungen erhalten: 100 mM BisTris pH 7,0, 2,8-3,5 % Dextran Sulfat (durchschnittliche MW 15 kDa), 8,5-10 % PEG 20 kDa in den kalten Raum.

(6) wachsenden Kristalle in großer Zahl

  1. Bereiten Sie die folgenden Stammlösungen und durch 0,22-μm-Filter filtern.
    1. Bereiten Sie 0,5 M BisTris pH 7.0 und BisTris Propan pH 7,0 und 7,5.
    2. 30 % (w/V) Dextran Sulfat (durchschnittliche MW ~ 15 kDa) vorzubereiten. Shop bei 4 ° C.
    3. Bereiten Sie 50 % PEG (durchschnittliche MW ~ 12 kDa).
  2. Einsatz 24 gut hängenden Tropfen Platten.
  3. Die erhabene Ringe des jedes gut fetten Sie Dichtstoff ein.
  4. Auch diese Lösung wie folgt (Endkonzentration) zubereiten: 100 mM BisTris pH-Wert 7,0-7,5, 2,8-3,5 % Dextran Sulfat ~ 15 kDa, 8,5-10 % PEG ~ 12 kDa. Bereiten Sie gut Lösung 1 mL in 1,5 mL-Tuben.
    Hinweis: Eine geringfügige Änderung in Kristallisation Zustand abhängig von der Charge des Proteins und/oder Dextran Sulfat beobachtet wurde, ist also eine Testversion von einem engen Bereich empfohlen. BisTris und BisTris Propan Puffer von der gleichen pH-Bereich ergeben Einkristallen.
  5. Halten Sie die gut Lösungen und gefettete Platten in den kalten Raum für mindestens 1 h.
  6. Bereiten Sie IKK1:Inhibitor komplex wie in 4.3 beschrieben vor. Übertragen Sie auch Lösungen von 1,5 mL Röhrchen in die einzelnen Vertiefungen der 24-well-Platte.
  7. Saubere silikonisiert (kommerzielle oder Inhouse (Silikonisierung/Silanisierung)) Glas Deckel rutscht mit fusselfreien Wischtücher und Hochdruck lokalisiert Luftdüsen mit im Handel erhältlichen Aerosol Duster anwenden.
  8. Platz 1 – 1,5 μL gut Lösung auf einem sauberen Deckglas. Pipette gleiches Volumen an IKK1:inhibitor Komplex, vorsichtig von oben und unten Pipettieren mischen 3-4 Mal. Drehen Sie das Glas Deckglas und legen auf den jeweiligen gut mit der Pinzette und verschließen den Brunnen durch Drücken auf das Fett.
  9. Nach dem Einrichten der Tropfen von einer 24-Well-Platte, inkubieren Sie die Platte in den kalten Raum im Dunkeln. Überprüfen Sie gelegentlich die Tropfen unter dem Mikroskop aussehen und Wachstum von Kristallen.
    Hinweis: Es wurde nicht getestet ob Inkubation Kristall Platten unter dem Licht würde das Ergebnis zu ändern. Es ist wichtig, jedoch, dass die Platten in einer Umgebung mit Minimum/keine Vibration ausgebrütet werden.

(7) Cryo Schutz der Kristalle

  1. Vorbereitung der Cryo-Lösungen.
    1. Bereiten Sie Cryo A (~ 2 % Dextran Sulfat, ~ 10 % PEG 12000, 60 mM BisTris Propan (von den gleichen pH-Wert als die beabsichtigte gut Lösung), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 2,5 % Glycerin).
    2. Cryo B vorbereiten (~0.3% Dextran Sulfat, ~ 10 % PEG 12000, 60 mM BisTris Propan (von den gleichen pH-Wert als die beabsichtigte gut Lösung), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 mM NaCl, 20 oder 25 % Glycerin oder 20 oder 25 % Ethylenglykol).
      Hinweis: Testen Sie verschiedene Cryo-restriktiv neben Glycerin und Ethylenglykol (z. B.PEG 200, PEG 400, MME 550 PEG, PEG 1000).
  2. Vorsichtig entfernen Sie, das mit dem Kristall Glas-Deckglas und platzieren Sie es auf einer festen Oberfläche mit dem Kristalltropfen nach oben. Sanft fügen 10 μL Cryo A-Lösung auf den Tropfen, und vorsichtig mischen durch pipettieren, so dass der Kristall nicht berührt wird.
    Hinweis: Dies reinigt die Kristalloberfläche von Schutt und helfen den Kristall mit dem ersten Cryo-Puffer equilibrate. Vermeiden Sie mechanische und thermische Beanspruchung auf den Kristall. Führen Sie die nachfolgenden Schritte unter dem Mikroskop zu Schäden an den Kristall zu vermeiden.
  3. Langsam etwas Flüssigkeit aus den Kristall nehmen und halten über 5-8 μL der Lösung. Austrocknung des Kristalls zu vermeiden. Extreme Vorsicht zur Vermeidung von mechanischer Belastung und Austrocknung des Kristalls in den nachfolgenden Schritten.
  4. Sanft fügen Sie 2,5 – 4 μL der Cryo B-Lösung auf den Tropfen, mischen Sie sehr leicht durch pipettieren. Decken Sie mit einer kleine Petrischale, direkten Luftstrom über den Kristall zu vermeiden. Warten Sie 5 min. sein immer vorsichtig, der Kristall nicht rasche Veränderungen des osmotischen Drucks oder Dehydrierung leidet.
  5. Wiederholen Sie Schritt 7.4 viermal langsam akklimatisieren den Kristall in die Cryo-Lösung.
  6. Halten Sie 10 – 20 μL der Cryo-Lösung in diesem Stadium (d.h., ermöglichen den Kristall in ca. 20 – 25 % gebadet werden Cryo-Schutzmittel enthaltenden Lösung). Für verschiedene Zeiträume (5 min bis 1 h) in der endgültigen Cryo-Lösung tränken.
  7. Frieren Sie mehrere Kristalle zu verschiedenen Zeitpunkten.
  8. Wählen Sie sorgfältig einen Einkristall aus dem Drop-in einem entsprechenden Cryo-Schleife auf einem richtigen Boden und Sprung-Freeze in Flüssigkeit N2montiert. Führen Sie diesen Schritt schnell und reibungslos zu Eisbildung auf dem Kristall zu vermeiden.
    Hinweis: Wählen Sie den Kristall mit einem Loop Durchmesser etwas größer als die längste Achse des Kristalls, so dass es kann, in der Roboter-Goniometer verwendet in Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory angebracht werden.
  9. Speichern Sie den Kristall mit Cryo-Schleifen in Pucks eintauchen in Flüssigkeit N2. Speichern Sie diese Pucks in Flüssigkeit N2 Dewar Kolben, bis sie bereit sind für den Versand für Röntgenbeugung an der Synchrotron. Fahren Sie mit x-ray Diffraction Datenerhebung und Verarbeitung (§ § 8 und 9).
    Hinweis: Beugung von IKK1 Kristallen aus dem Hause Röntgenquellen lagen keine Daten hoch genug Auflösung für Struktur Entschlossenheit Studien, obwohl dies die Qualität der Kristalle am Synchrotron untersucht werden. Alle Beugung an verschiedenen Beamlines (hauptsächlich 19ID) Daten der Advance-Photon-Quelle, Argonne National Laboratory, USA.

(8) x-ray Datenerfassung

  1. X-ray Diffraction Datenerhebung auf das ID19-Strahlrohr für die APS-Synchrotron-Quelle, mit remote-Daten Sammlung Software34.
    Hinweis: Mehr als 100 Kristalle wurden für ihre Beugung Eigenschaften getestet. Die Kristalle gebeugt routinemäßig auf eine Auflösung von 7-11 Å nur selten Kristalle, die zu über 5 hinaus gebeugt Å wurden beobachtet, und nur einen großen Kristall gebeugt über 4.5 Å. Da die Kristalle schnell während der Datenerfassung verfiel, wurden Datensätze an verschiedenen Stellen des gleichen Kristalls gesammelt. Dies war möglich, da die Kristalle groß waren (größer als 400 µm), und der Strahldurchmesser verwendet wurde 100 µm.

9. x-ray Datenverarbeitung

  1. Verschmelzen Sie alle Datensätze auf verschiedene Teile der gleichen Kristall34gesammelt.
    Hinweis: sieben Datensätze wurden aus den besten Kristall zusammengelegt und die daraus resultierenden Daten waren 93 % abgeschlossen. Die gesamte ich / σ war ~ 6,8) und Rmerge lag bei 89 % in der höchsten Auflösung bin (5.4-4.5 Å).
  2. Prozess-Datasets mit HKL200034 , Raumgruppe, Zelle Abmessungen, Lösemittelgehalt und plausible Zusammensetzung der asymmetrische Einheit zu erhalten.

10. Struktur Lösung

  1. Vorbereitung der Suche Modelle
    1. Basierend auf vorhandenen strukturellen Modelle von hIKK2 (Pdb Id 4E3C und 4KIK35), erzeugen eine Reihe von Dimeren mit unterschiedlichen Ausrichtungen der N-terminalen KD (macht eine Öffnung von 30 und 62 Å, zwischen P578 von zwei KD in der Dimer). Keines dieser Modelle holte eine molekulare Ersatzlösung für die Suche nach umfangreichen versuchen.
    2. Generieren Sie eine Karte von IKK1 aus Einzel-Teilchen Cryo-EM Daten33.
    3. Generieren eines Modells der menschlichen IKK1 von der höchsten Auflösung Struktur des IKK2 (Pdb-Id 4KIK).
    4. Docken Sie die einzelnen Domänen des menschlichen IKK1 Modells an Cryo EM Dichtekarte des menschlichen IKK1 mit COOT36. Das KD-Ausrichtung ca. 24 Grad gedreht und modifiziert die N-terminale für ~ 58 Å zu öffnen.
    5. Alle Dimere 10.1.1 erwirtschaftete zuweisen Sie die KD-Orientierung des Modells Cryo-EM ausgestattet (Monomer).
  2. Molekulare Ersatz
    1. Verwenden Sie Dimere von 10.1.1 und 10.1.5 als Suche Modelle in Programme PHASER37, MOLREP38 und39,-CNS40.
      Hinweis: Hier, unter Verwendung eines der Dimere aus 10.1.5 (52 Å Öffnung) als A Suchmodell, sechs Dimere (zwei Hexamers) in der asymmetrischen Einheit befanden sich mithilfe von MOLREP. Die 52 Å Eröffnung in das Suche-Modell ist ähnlich wie die 49-50 Å Eröffnung der Dimere (alle sechs Dimere) in die feine Struktur.

11. Struktur Raffinesse

  1. Struktur-Veredelung-Verfahren
    1. Beheben Sie Ausrichtung und Position des ursprünglichen Modells durch Festkörper Verfeinerung in CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Verfeinern des Schachts weitere Minimierung und simulierten Glühen mit einer maximum-Likelihood-Zielfunktion und eine flache Masse-Lösungsmittel-Korrektur mit CNS-System39,40.
    3. Bauen Sie das Modell basierend auf 2FO-FC und Fo-Fc Karten mit Xtalview41.
      Hinweis: Wenden Sie DEN unterstützt Verfeinerung42 und NCS zurückhalten, während die Raffinessen für eine höhere Genauigkeit des Modells. In der Tat DEN Verfeinerung dramatisch verbessert, Geometrien und R-Faktoren von der Struktur und der R-Faktor war 22,2 % und freien R-Faktor war 27,8 % für das endgültige Modell. Die dramatische Verbesserung der R frei muss aufgrund der hohen Genauigkeit Modell IKK1 Domains, die aus dem IKK2-Modell (4KIK) generiert wurden.

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Representative Results

Klonierung und Expression von verschiedenen Konstrukte der IKK1/α
Voller Länge, die, den menschliche IKK1/α in das Baculovirus Ausdruck Vektor pFastBacHTa innerhalb seiner EcoRI und NotI Restriktionsschnittstellen zu einer N-terminalen Hexa-Histidin geklont wurde, gekennzeichnet IKK1. Der Tag könnte von TEV Protease Verdauung entfernt werden. Da IKK1/α in voller Länge flexible Regionen an beiden Enden enthält und flexible Regionen in der Regel ein Protein erschweren zu kristallisieren, geklont wir verschiedene abgeschnittene Fragmente von IKK1/α innerhalb der oben genannten Websites des pFastBacHTa Vektors. Verschiedenen Trunkierung durch Mutation entstehende Variationen von IKK1/α mit Wildtyp (wt) und S176E, 180E generiert wurden (EE)-Backbones. IKK1/α EE bezieht sich auf die mimetische konstitutiv aktive Form von phosphorylierten Kinase. Rekombinante Baculovirus Produktions- und Proteinexpression wurden durchgeführt mit einem zuvor veröffentlichten Protokoll mit geringfügigen Änderungen43 (Abbildung 1).

Schwierigkeiten bei der IKK1/α Kristallisation
Da menschliche IKK2/β und IKK1 homologe sind, und wir konnten verschiedene Versionen des menschlichen IKK2/β unter mehreren verschiedenen Bedingungen kristallisieren, erwarteten wir IKK1/α unter ähnlichen Bedingungen mit ähnlichen Strategien zu kristallisieren. Jedoch erhalten wir nach umfangreichen versuchen mit mehreren unterschiedlichen IKK1 Varianten, Kristalle mit nur einem abgeschnittenen Konstrukt (IKK1 10-667 EE) (Abbildung 2), und das auch nur im Beisein der IKK Inhibitor XII44 , die geeignete angezeigt X-ray Diffraction Eigenschaften.

Struktur-Lösung
IKK1/α Kristalle litt unter zahlreichen Wachstumsprobleme, und die Daten angezeigt häufig sehr hohe Mosaicity. Schwache Kristall Verpackung mit großen Lösemittelgehalt und die dynamische Natur der IKK1 Monomer/Dimer sind wahrscheinlich Grund dafür. Um diese Probleme zu umgehen, sorgfältige Bemühungen wurden ergriffen, um die best mögliche Kristalle zu erhalten, und das Verfahren der Kryokonservierung erfolgte mit größter Sorgfalt unter verschiedenen Bedingungen und mit verschiedenen Cryo-Konservierungsmittel-Puffer. Die Daten wurden auch bei höchster Präzision Strahl Schaden gering zu halten. Da die Kristalle groß (größte Abmessung oft mehr als 400 µm) waren, wurden verschiedene Bereiche der gleichen Kristalle der Röntgenstrahl, mehrere Datasets zu sammeln ausgesetzt. Dies ermöglicht verschiedene Datasets skaliert werden, und eine einigermaßen vollständige Dataset mit höhere Redundanz zu erhalten und Fehler minimiert. Einweichen mit schweren Atomen oder schweren Atom Cluster (z. B.TaBr und TAMM), verursacht die Kristalle nicht ausreichend beugen. Obwohl wir die Position des TaBr Cluster in abgeleiteten Daten nachweisen konnte, informierte die schlechte Qualität der Daten zusätzlich zu den nicht-Isomorphocity wenig, wenn überhaupt, Phase.

Wir verarbeiteten Datensätze mit HKL2000 anhand verschiedener Parameter zur Verfügung. Die Beugungsmuster ergab, dass der Kristall den Raum Gruppe P21 mit Zelle Abmessungen, gehört ein = 174.51, b = 186.94, C = 275.83 Å und β = 98,84 Grad. Wir vor allem habe ich verwendet / σ, der Cut-off zu schätzen und verschiedenen Trenngrenzen für die Datasets getestet. Wir erhalten einen zusammengeführten Datensatz von 4.5 Å Auflösung von 4 der 7 Beugung Datensätze auf einen Kristall gesammelt. Wir beschlossen, Daten bis 4.5 Å aus Sichtprüfung der endgültigen Dichtekarte zu halten. Es kann sich lohnen, CC1/2 zu verwenden, da wir analytisch CC von der zusammengeführten Datensatz gegen die wahre (in der Regel nicht messbaren) Intensitäten mit CC *45einschätzen können. Wegen der großen Elementarzelle in Kombination mit der niedrigen Symmetrie der Raumgruppe erwarteten wir die asymmetrische Einheit um 12 bis 24 Moleküle basierend auf einem Lösemittelgehalt von 70 % bis 40 % enthalten.

Die kombinierte Wirkung von niedriger Auflösung Röntgendaten mit schwacher Intensität (d.h. erhebliche Fehler in den Daten) (Abbildung 3), große Anzahl von IKK1 Molekülen in die asymmetrische Einheit und Konformationsänderungen Variation von IKK1 Monomere/dimeres Modell (12) im Vergleich zu bekannten IKK2 hinderte Modelle, zunächst uns vom Erhalt einer molekularen Ersatzlösung IKK1 und somit bestimmen, seine Struktur.

IKK1/α und IKK2/β enthalten eine Kinase-Domäne (KD), ein Ubiquitin-ähnliche Domäne (ULD) und eine eine spiralförmige Gerüst Dimerisierung Domäne (SDD). Die Struktur der IKK1 ergab, dass es Dimere ähnlich wie bei IKK2 Verwendung eine nahezu identische Inter Untereinheit Schnittstelle der distalen Region SDD bildet. IKK1 Dimer angezeigt jedoch eine deutlich unterschiedliche relative Positionierung von der N-terminalen KD relativ SDD + ULD im Vergleich zu bekannten IKK2 Dimere. Unterschiedliche IKK2 Strukturen angegeben früher verschiedenen intermonomer Orientierung innerhalb der Dimere (Abbildung 4Gruppe A), so dass die Abstände zwischen der alpha Kohlenstoffe des P578 in die zwei KD in vier verschiedenen Dimer Modellen zwischen 39 und 61 Å variiert. Da die Sequenzen von diesen beiden Kinasen sehr ähnlich sind und Rückstände an der Dimer-Schnittstelle identisch sind, erwarten wir, dass IKK1/α eine ähnliche Dimer bilden würde; aber da gibt es erhebliche Unterschiede in den Rückständen der KD-SDD-Schnittstelle (z. B.W424 und F111 in IKK2 sind V und P), vielleicht eine noch andere KD-Ausrichtung in IKK1 erwartet. In der Tat, zufolge IKK1/α-Struktur der entsprechenden Ausrichtung der KD, SDD ist einzigartig, und es von allen bekannten Modelle von IKK2/β abweicht. Mehr als hundert Dimer dienten Modelle als Suchmodelle in Programmen PHASER, MOLREP und CNS ohne Erfolg, die Notwendigkeit für eine ziemlich genaue Suche Modell für den Erfolg der molekularen Ersatz Studien, vor allem mit unseren niedrig aufgelöste Daten angibt. Ein Monomer-Modell hat zu wenig Masse keine Lösung in die schwache Beugung-Daten der großen asymmetrische Einheit mit 12 Monomere abholen. Auch die Aufnahme oder Wegfall des Wassers in das Suchmodell machte keinen Unterschied in den molekularen Ersatz suchen, vor allem durch die schwache Beugung-Daten. CC1/2 und CC * bedeutet, dass Daten bis 4.5 Å ganz präzise ist. Wir verwendeten eine konservative Auflösung-Cut-off von 4.5 Å basierend auf I / σ von 1,5. Die Datensätze mit unterschiedlichen Auflösungen Trenngrenzen zeigte kein krassen Unterschied während der molekularen Ersatz Suchaktionen und Finale Karten gegen diese Datasets verfeinert nicht zeigen deutliche Verbesserung im Karten-Features auf Verlängerung Auflösung Cut-Offs. Die endgültige Version des Modells ist ganz richtig, mehr als was von der Dichte allein gebaut werden könnte wahrscheinlich, da die erste molekulare Ersatzmodelle von Modellen gebaut wurden abgeleitet mit einem hochauflösenden Daten und wir nutzten die Cryo-EM Karte/Dichte Cross-Check die Features der Karte, vor allem in Regionen, wo Karten unklar waren.

Im Nachhinein war die Erlangung eines nützlichen Suche Modells möglich nur aufgrund der Verfügbarkeit der niedrig auflösenden Cryo-EM-Karte und eine eher hohe Genauigkeit-Modell von IKK1 Domänen, die generiert werden konnte, basierend auf hoher Auflösung IKK2 Struktur (Abbildung 4 " zentrale B). Wir konnten dock IKK1 Domänen in der Cryo-EM-Karte von IKK1, ganz in der Nähe Dimer Modell zu erhalten. Das ursprüngliche Modell angegeben eine Orientierung der KD gedreht ca. 24 Grad im Verhältnis zu derjenigen einer IKK2 Monomer und N-terminale Öffnung von 58 Å (zwischen P578 von zwei KDs in ein Dimer). Unsere vorherige Kenntnis der unterschiedlichen IKK2/β Dimer Strukturen (und deren Variationen) konnten wir das Suchmodell Feinabstimmung durch die Öffnungen zwischen 30-62 Å. unter Verwendung eines Dimere (52 Å öffnen) als A Suchmodell ändern, wir sechs Dimere in der asymmetrischen Einheit mit Programm MOLREP46. Diese sechs Dimere gliedern sich in zwei Hexamers in der asymmetrischen Einheit, und die berechneten Lösungsmittel hat ein Volumen von 68 %.

Figure 1
Abbildung 1: Reinigung von IKK1. (A) Ausdruck des IKK1 (10-667) in Insektenzellen. (B) ein Flussdiagramm für die Reinigung der IKK1; (C) eine SDS-PAGE Gel zeigt Reinheit des IKK1 nach dem Ni-NTA Affinität Chromatographie Schritt. (D) Größe-Ausschluss Profil Dimer IKK1. (E) SDS-PAGE Gel zeigt Reinheit des IKK1 aus Spitze Größe-Ausschluss Brüche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Morphologie und Größe der Kristalle IKK1. (A) ein Kristall von IKK1 konstruieren 10-667; die Kristallisation Drop zeigt auch Kristalle von einem anderen Morphologie (dünne Platten), die nicht gut beugen zu tun. (B) im Hinblick auf den Kristall, der auf über 5 hinaus gebeugt gezoomt Å. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3:. Kristallographische Daten IKK1 Kristalle. (A) eine Röntgen-Beugung Profil eines IKK1-Kristalls zeigt schlechte Beugung Eigenschaften des typischen IKK1 Kristalle. (B) HKL2000 Skalierung Statistik des zusammengeführten Datasets für IKK1 Strukturaufklärung und Redundanz der Daten verwendet. Linear R = Summe (ABS (I - < i >)) / Summe (I), R-Quadrat = Summe ((I - < i >) ** 2) / Summe (ich ** 2), Chi ** 2 = Summe ((ich - < i >) ** 2) / (Fehler ** 2 * N / (n-1))), CC1/2 = Korrelationskoeffizient, CC * = Korrelationskoeffizient der zusammengeführten Datensatz gegen wahre Intensitäten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Vorbereitung der Suchmodelle. (A) verschiedene Modelle von IKK2 Dimer zeigt verschiedene Ausrichtungen der KD im Vergleich zu SDD (was zu verschiedenen Trennung zwischen zwei KD); Diese Modelle wurden zunächst getestet, um eine molekulare Ersatzlösung ohne Erfolg zu finden. (B) Erzeugung von IKK1 Suchmodelle - Cryo-EM-Karte von IKK1 Dimer mit 11 Å Auflösung; EM-Karte ausgestattet IKK1 Suche Einstiegsmodell, einzelne Domains basieren auf IKK2 Modell (4KIK); Eine IKK1 Suche Modell weiter bildenden gezwickt (entsprechende KD Orientierung) basierend auf verschiedene Möglichkeiten, wie aus IKK2 Modelle beurteilt beschreiben oben 4a; Überlagerung von EM-Karte ausgestattet, Modell, das Suche-Modell, das die molekulare Ersatz-Lösung ergab. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Produktion, Kristallisation und Struktur Lösung zweier verwandter IKK-Proteine
Wir wollten die Röntgen-Kristallstruktur des IKK1/α mit dem Begriff feststellen, dass es eine relativ einfache Übung, die aufgrund unserer Erfahrungen mit IKK2/β Proteinproduktion, Kristallisation und Strukturaufklärung wäre. Allerdings waren wir sehr überrascht, dass diese zwei verwandte Proteine über die Leichtigkeit der Kristallisation sehr unterschiedlich Verhalten. Trotz der Bemühungen von mehreren hochkarätigen Labors nahm die Bestimmung der IKK1 Struktur fast zwei Jahrzehnten. Dies ergab sich weitgehend aus ein paar wichtige Engpässe.

Die erste Schwierigkeit bestand darin eine hochreines, lösliches Protein Form zu erhalten. Das Insekt Zelle Ausdruck System ermöglichte es uns mg Mengen reines Protein zu erhalten, die einigermaßen löslich war. In Bezug auf der Ebene des Ausdrucks alle IKK1/α-Konstrukte ausgedrückt bei viel niedrigeren als IKK2/β in Insekten Zelle Expressionssysteme konstruiert. Es sei darauf hingewiesen, dass weder Protein ist wasserlöslich und funktionale ausgedrückt in E. Coli. In ein Insekt Ausdruck Zellsystem, IKK2/β-Fragmente auf einem hohen Niveau reichte von 10 bis 30 mg/L Kultur abhängig von der Konstrukte ausgedrückt. Im Gegensatz dazu konnte IKK1/α Konstrukte nur bei 0,5 bis 2,0 mg/L Kultur generiert werden. Der Grund für diesen Unterschied ist uns noch unbekannt. Wir sollten auch versuchen Ausdruck des IKK1 in native Wirtszellen (d.h. Säugetier-Überexpression System im Falle eines Säugetiers IKK-Proteins), zumal die post-translationalen Modifikationen wie Auto - oder Trans-Phosphorylierung häufig auftretenden IKK treten die meisten effizient und angemessen in ihrer natürlichen Umgebung. Reinigung der IKK komplexe direkt von der groß angelegte Kultur von Säugerzellen ist auch derzeit zugänglich.

Beim Arbeiten mit IKK2/β, bemerkten wir, dass es kann durch die Behandlung mit ATP werden homogen Auto phosphoryliert, und das macht das Protein Kristallisation zugänglich. In ähnlicher Weise ergab die Inkubation von IKK1 Protein mit ATP und die daraus resultierende Auto-Phosphorylierung, eine aktivierte IKK1 löslich und eignet sich für biochemische Charakterisierung und Kristall Strukturbestimmung war.

Ein entscheidender Schritt, gut diffracting Kristalle zu erhalten war den Kristallisation Bedingungen, insbesondere die Zugabe des entsprechenden Typs und Konzentration von Dextran Sulfat Moleküle feineinstellen. Die Dichte gibt gebundene Dextran-Sulfat-Moleküle und seine daraus resultierende Wirkung auf IKK1 war wahrscheinlich für die Kristallisation von entscheidender Bedeutung.

Die Flexibilität der IKK1, die oft in Kinasen beobachtet wird, ist die primäre Abschreckung für Kristallisation und ist oft mit Engagement der Kinase-Domäne mit der Aktivierungsschleife verknüpft. IKK2 mit Native (S177 und S181) und Phosphomimetic (EE) Formen der Aktivierung Schleife Serine kristallisiert werden konnten, aber wir erhalten nur Kristalle mit abgeschnittenen IKK1/α der SS mutierte EE-Version und das auch nur in Anwesenheit von IKK-Inhibitor XII. Diese Kristalle gebeugt gut genug für die Strukturaufklärung nur, wenn Sie in den kalten Raum angebaut (ca. 4-6 ° C). Wenn wir eine ebenso stur Verhalten mit jedem IKK1 Homolog (oder eine IKK Ortholog) auftreten, können wir versuchen, verschiedene Rückgrat Modifikationen (insbesondere der aktiven Seite Schleife Serin Rückstände die häufigsten phosphoryliert sind). Wir können auch Co-Kristallisation in Anwesenheit der interagierenden Partner Proteine versuchen. Viele Kinasen, einschließlich derjenigen der IKK-Familie, mit Partner Proteine interagieren und befinden sich in höherwertigen komplexe.

Mehreren Inhibitoren geholfen IKK2 Kristalle unter verschiedenen Bedingungen zu produzieren (z.B.mit beiden hohen Salz PEG als ein Fällungsmittel), sowohl bei 18 ° C, und in den kalten Raum. Jedoch produzieren unter ähnlichen Bedingungen und mit einer Vielzahl von Inhibitoren, IKK1/α keiner Kristall. So wird die Verwendung von einem größeren Repertoire von Inhibitoren sicherlich die Chancen auf eine erhöhen, die Kristallisation zu ermöglichen.

Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Strukturaufklärung war die sorgfältige Kryokonservierung und Datenübernahmeverfahren. Die schwachen Daten und raschen Verfall der Kristalle in den Röntgenstrahl gewährleistet die Notwendigkeit für größere Kristalle und Sammlung von mehreren Datensätzen aus der gleichen Kristalle. Ohne eine angemessene komplette Dataset mit hoher Genauigkeit könnten wir nicht gelungen eine molekulare Ersatzlösung.

Wir konnten schließlich bestimmen die Struktur der IKK1/α durch molekulare Ersatz mit mehr als 100 Modelle von bekannten IKK2/β strukturelle Modelle in die öffentliche Datenbank erstellt. So war erhalten ein geeignetes Modell für eine molekulare Austauschverfahren ein muss. Die Cryo-EM-Karte, hohe Genauigkeit Strukturmodelle aus einzelnen Domänen zusammen mit vergleichenden Studien bestimmt vorher IKK2 Strukturen führte uns ein Suchmodell zu erhalten, die uns die molekularen Ersatzlösung geholt.

Die Kristallisation eines Proteins ist von Natur aus zufällig, also trotz die oben genannten strukturierten Anleitung folgend wir Probleme bei der Kristallisation ein weiteres IKK1 Homolog oder ein anderes in voller Länge oder abgeschnittene Konstrukt des menschlichen IKK1 gegenüberstellen könnte. Unabhängig davon, wird wissen dieser kritischen Schritte ein Forschers zu vernünftigere Bedingungen zu untersuchen, die Chancen auf einen gut diffracting IKK-Kristall erhöhen können.

IKK1/α und IKK2/β zeigen ähnliche Domäne Organisation aber andere domänenübergreifendes Organisation
Es überrascht nicht, annehmen IKK1/α und IKK2/β eine sehr ähnliche Domänenarchitektur aufgrund ihrer hohen Reihenfolge Ähnlichkeit33,43. Wie bereits erwähnt, IKK1/α und β-IKK2/Falten in drei unterschiedliche Bereiche: N-Terminal Kinase Domain, Ubiquitin wie (ULD), und Gerüst Dimerisierung Domäne (SDD). IKK1/α und β-IKK2/stabile Dimere bilden, in dem die C-terminale Hälfte der SDD Dimerisierung teilnimmt. Rückstände an der Dimer-Bildung beteiligt sind identisch. Die domänenübergreifenden Wechselwirkungen zwischen SDD/ULD und KD sind jedoch etwas anders, da diese unterschiedliche Rückstände beinhalten. Dies verursacht wahrscheinlich auch die relative Orientierung der Kinase-Domäne der SDD in IKK1/α, von der im IKK2/β abweichen. Dies war nicht ganz unerwartet, da wir auch Unterschiede zwischen den verfügbaren IKK2/β Dimer Modelle beobachten. Interessanterweise können IKK2/β-Dimeren in Tetramers im Kristallgitter organisieren, obwohl dieser Tetramerization Hang in Lösung schwach ist. Jedoch bildeten IKK1/α Dimere einzigartige Hexamers. Diese Hexamers sind auch in Lösung, beobachtet, obwohl nur ein kleiner Pool von IKK1/α Dimere existieren als Hexamers. Diese empfehlen, dass Hexamerization eine spezifische und wichtige Funktion haben dürfte.

Differenzierenden Funktionsunterschiede aus strukturellen Unterschiede
IKK1/α und β-IKK2/Funktionen verschiedene in den Zellen. Die Beziehung zwischen IKK1/α-Funktion und Struktur blieb jedoch schwer. IKK1/α deutlich gibt es in verschiedenen Formen: als kostenlose Dimer oder Hexamer und innerhalb von ein bis dahin Fußgelenkes Hetero-Trimer Komplex zusammen mit IKK2/β und NEMO. Da IKK2/β-Aktivierung durch kanonische Signalisierung nicht IKK1/α erfordert, bleibt die funktionale Rolle der IKK1/α in Heterotrimer (kanonische IKK-Komplex) unklar. Es ist auch unklar, ob die Aktivierung des IKK1/α induziert durch nicht-kanonischen Signalisierung kostenlose dimeres IKK1/α und/oder Hexameric IKK1/α abhängt. Seit seiner Experimente zeigen, dass Störungen der Hexamer Schnittstelle stark beeinflusst nicht-kanonischen Signalisierung, dürfte Hexamerization zu irgendeinem Zeitpunkt während der nicht-kanonischen Signalisierung unabdingbar.

Entwicklung niedermolekularer Hemmer mit IKK1/α-Struktur
Wissen, dass die Struktur des IKK1/α erlaubt, Füllflächen auf einem Monomer oder Taschen an Inter-Domain oder Inter Monomer Schnittstellen zu untersuchen, die durch kleine Moleküle ausgerichtet sein. IKKs haben lang wichtige Drogeziele gegolten. Allerdings erschwert die Wesentlichkeit der diese Kinasen in einer Vielzahl von Funktionen, einschließlich zelluläre Homöostase, organismal Lebensfähigkeit und Immunität zum Ziel. Bisher wurde keine IKK gezielt Molekül gefunden, dass sicher bei Patienten verwendet werden könnte.

IKK1/α und IKK2/β sind oft gleichzeitig durch ihre Inhibitoren ausgerichtet, da ihre Kinase-Domains nacheinander und Struktur sehr ähnlich sind. Erhebliche Forschungsanstrengungen wurden in die Suche nach spezifischen Inhibitoren gezielt nur eines dieser beiden Kinasen ausgegeben. Infolgedessen wurden mehrere IKK2/β-spezifische Inhibitoren entdeckt, von denen einige haben keinen Einfluss auf IKK1/α-Funktion. Jedoch unseres Wissens, dass keine solche Verbindung existiert hemmt, die effektiv IKK1/α ohne IKK2/β-Funktion stören. Dieser Mangel könnte auf den Mangel an strukturellen Informationen über IKK1/α zugeschrieben werden. Unsere Struktur- und zellulären Studien zeigen, dass obwohl Anordnung der Domäne und globalen Untereinheit Strukturen in diesen beiden Proteinen sehr ähnlich sind, sie zeigen einzigartige höchstwertige Arrangements beschäftigen spezifische Oberfläche33Patches. Diese Unterschiede, die verschiedenen Interaktionen mit assoziierten Proteinen ermöglichen müssen in ihrer funktionalen Unterschiede übersetzen. Wir sind zuversichtlich, dass diese Unterscheidungen zwischen den IKK1/α und β-IKK2/Inter- und Intra-Untereinheit Interaktionen offenbart ausgenutzt werden können, um spezifische Untereinheit allosterische Inhibitoren zu machen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte oder andere Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir bedanken uns bei die Mitarbeiter an die Beamlines 19ID, 24ID-Chek und 13ID bei Advanced Photon Source, Lemont, Illinois, für die Unterstützung während der Datenerfassung auf verschiedenen Kristalle. Wir sind dankbar, Dmitry Lyumkis, Salk Institute für das Abrufen von uns der niedrige Auflösung-Cryo-EM-Karte in frühen Stadien der EM Karte/Modellbau, die verwendet wurde, um das ursprüngliche IKK1 molekulare Ersatz Suche Modell zu bauen. Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell vom NIH-Stipendien, AI064326, CA141722 und GM071862, GG. SP ist zurzeit Wellcome Trust DBT Indien Intermediate Fellow.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

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Biochemie Ausgabe 141 Serin-Threonin Protein Kinase IKK1/α NF-κB Kristallstruktur molekulare Ersatz Hemmer
Eine Anleitung zur Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von menschlichen IKK1/α
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Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

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