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Biochemistry

मानव IKK1 के उत्पादन, क्रिस्टलीकरण, और संरचना निर्धारण के लिए एक गाइड α/

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

IκB कळेनासे 1/α (IKK1/α CHUK) एक Ser/... प्रोटीन कळेनासे कि मुख्य रूप से NF-κB प्रतिलेखन कारकों के सक्रियकरण के माध्यम से सेलुलर गतिविधियों के असंख्य में शामिल है । यहां, हम मुख्य उत्पादन और इस प्रोटीन के क्रिस्टल संरचना निर्धारण के लिए आवश्यक कदम का वर्णन ।

Abstract

extracellular उत्तेजनाओं के एक वर्ग के IKK1/α के एक NF-κB उपइकाई, p52, इसके अग्रदूत p100 के प्रसंस्करण के माध्यम से की पीढ़ी को प्रेरित करने के लिए सक्रियण की आवश्यकता है । p52 एक homodimer या heterodimer के साथ एक अंय NF-κB उपइकाई, RelB के रूप में कार्य करता है । बारी में इन dimers सूजन में शामिल जीन के सैकड़ों की अभिव्यक्ति को विनियमित, कोशिका अस्तित्व, और कोशिका चक्र. IKK1/α मुख्य रूप से एक त्रिगुट परिसर के रूप में IKK2/β और निमो के साथ जुड़े रहता है । हालांकि, यह एक छोटा सा पूल भी एक कम आणविक वजन जटिल (es) के रूप में मनाया जाता है । यह अज्ञात है यदि p100 संसाधन गतिविधि IKK1/α के बड़े या छोटे जटिल पूल के भीतर सक्रियण द्वारा ट्रिगर किया गया है । IKK1/α के गठन गतिविधि कई कैंसर और भड़काऊ रोगों में पाया गया है । IKK1/α के सक्रियण के तंत्र को समझने के लिए, और एक दवा लक्ष्य के रूप में इसके उपयोग को सक्षम, हम विभिंन मेजबान प्रणालियों में रिकॉमबिनेंट IKK1/α, जैसे ई. कोलाई, कीट और स्तनधारी कोशिकाओं के रूप में व्यक्त की । हम baculovirus संक्रमित कीट कोशिकाओं में घुलनशील IKK1/α व्यक्त करने में सफल रहा, अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा प्राप्त करने, यह अवरोधकों की उपस्थिति में सघन, और अपने एक्स-रे क्रिस्टल संरचना का निर्धारण । यहां, हम विस्तृत चरणों का वर्णन करने के लिए रिकॉमबिनेंट प्रोटीन, इसके क्रिस्टलीकरण, और उसके एक्स-रे क्रिस्टल संरचना निर्धारण का उत्पादन ।

Introduction

dimeric प्रतिलेखन कारकों की NF-κB परिवार के Transcriptional गतिविधियों विविध सेलुलर सूजन और प्रतिरक्षा से बचने और मौत के लिए कार्यों को लेकर कार्य के लिए आवश्यक हैं । इन गतिविधियों को इसरो कोशिकाओं में नियंत्रित कर रहे हैं और विनियमन की हानि विभिन्न रोग की स्थिति की ओर जाता है, स्व-प्रतिरक्षित विकारों सहित, और कैंसर1,2,3. एक उत्तेजना के अभाव में, NF-κB की गतिविधियों IκB द्वारा बाधित रखा जाता है (अवरोध करनेवाला-κB) प्रोटीन4. IκB प्रोटीन पर विशिष्ट Ser अवशेषों के फास्फारिलीकरण उन्हें ubiquitination और बाद में proteasomal क्षरण या चुनिंदा प्रोसेसिंग5के लिए चिह्नित करता है । दो अत्यधिक मुताबिक़ Ser/kinases, IKK2/β और IKK1/α, NF-κB गतिविधियों के केंद्रीय नियामकों के रूप में कार्य इन फास्फारिलीकरण घटनाओं6,7ले जाकर ।

एक ligand और एक रिसेप्टर के बीच बातचीत NF के सक्रियण के लिए अग्रणी मध्यस्थों की एक श्रृंखला के माध्यम से एक संकेत transduces-κB कारकों. NF-κB संकेत प्रक्रिया मोटे तौर पर दो अलग रास्ते में वर्गीकृत किया जा सकता है – विहित और गैर-विहित (वैकल्पिक)8. IKK2/β की गतिविधि मुख्य रूप से विनियमित NF-κB संकेत विहित मार्ग है कि भड़काऊ और जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं9के लिए आवश्यक है । इस मार्ग की एक विशिष्ट सुविधा एक तेजी से और कम रहता है IKK2 के सक्रियकरण/β10 एक अब तक जैव रासायनिक विलक्षण मतान्ध परिसर के भीतर — माना IKK1 और IKK2 से बना होना करने के लिए, साथ ही एक विनियामक घटक, निमो (NF-κB आवश्यक मॉडुलन )11,12,13. मतान्ध परिसर के दो उत्प्रेरक मतान्ध उपइकाईयों के बीच, IKK2 prototypical IκBs के विशिष्ट अवशेषों के फास्फारिलीकरण के लिए मुख्य रूप से14 जिंमेदार है (α,-β, &-γ) nf-κB करने के लिए बाध्य, और यह भी एक असामान्य IκB प्रोटीन, nf-κB1/p105, जो एक है NF-κB p50 उपइकाई5के प्रणेता । फास्फारिलीकरण प्रेरित ubiquitination और IκB के proteasomal क्षरण (या p105 के प्रसंस्करण) जारी है और NF के एक विशिष्ट सेट के सक्रियकरण की ओर जाता है-κB dimers15। ंयायपालिका NF-κB IKK2 के एमआईएस विनियमित समारोह के कारण गतिविधि कई कैंसर में मनाया गया है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्व-प्रतिरक्षित विकारों2,3,16।

IKK2/β, IKK1/α की गतिविधि के विपरीत NF-κB संकेत के गैर-विहित मार्ग है, जो विकास और प्रतिरक्षा के लिए आवश्यक है को नियंत्रित करता है । IKK1 phosphorylates के विशिष्ट अवशेषों NF-κB2/p100 पर अपने सी-टर्मिनल IκBδ खंड है, जो इसके प्रसंस्करण और p52 की पीढ़ी की ओर जाता है । transcriptionally सक्रिय p52 का गठन: RelB heterodimer विकास संकेतों के लिए एक धीमी और निरंतर प्रतिक्रिया शुरू7,17,18,19,20। दिलचस्प है, इस मार्ग के केंद्रीय nf-κB कारक p52 की पीढ़ी गंभीर रूप से एक और कारक पर निर्भर है, nf-κB उत्प्रेरण कळेनासे (NIK)21,22, लेकिन IKK2 या निमो पर नहीं । शेष कोशिकाओं में, NIK का स्तर अपने निरंतर proteasome-निर्भर क्षरण23,24,25के कारण कम रहता है । ' गैर ' विहित लाइगैंडों द्वारा कोशिकाओं की उत्तेजना पर, और कुछ घातक कोशिकाओं में, NIK को भर्ती करने के लिए स्थिर हो जाता है और IKK1/α. कळेनासे गतिविधियों दोनों NIK और IKK1 के p1007में p52 के कुशल प्रसंस्करण के लिए आवश्यक है सक्रिय । IKK1 और NIK phosphorylate के तीन serines (Ser866, ८७० और ८७२) NF-κB2/p100 अपने C-टर्मिनल IκBδ खंड पर अपने प्रसंस्करण और p52 की पीढ़ी के लिए अग्रणी । गैर विहित मार्ग के ंयायपालिका सक्रियण एकाधिक मायलोमा26,27,28सहित कई द्रोह में फंसाया गया है ।

कई अत्यधिक कुशल और विशिष्ट अवरोधकों IKK2/β के लिए जाना जाता है, हालांकि कोई भी अब तक निकला है एक प्रभावी दवा है । इसके विपरीत, IKK1/α-विशिष्ट अवरोधकों विरल हैं । यह आंशिक रूप से IKK1 पर संरचनात्मक और जैव रासायनिक जानकारी की हमारी कमी से स्टेम कर सकते हैं/α, जो NF के सक्रियकरण के यंत्रवत आधार की हमारी समझ सीमा-κB कोशिकाओं में IKK1 द्वारा, और तर्कसंगत दवा डिजाइन । IKK2/β के एक्स-रे संरचनाओं IKK2/β29के सक्रियकरण तंत्र में अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान की; हालांकि, इन संरचनाओं पता चलता है कि कैसे अलग ऊपर उत्तेजनाओं IKK1/α या IKK2 के सक्रियकरण को ट्रिगर नहीं कर सकता/β NF-κB गतिविधियों के विभिन्न सेट को विनियमित करने के लिए 30,31. यंत्रवत IKK1/α के विशिष्ट संकेत समारोह अंतर्निहित आधार को समझने के लिए, और तर्कसंगत दवा डिजाइन के लिए एक मंच स्थापित करने के लिए, हम IKK1/α की संरचना का निर्धारण करने पर ध्यान केंद्रित किया ।

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Protocol

1. IKK1/α की बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त रिकॉमबिनेंट वायरस की तैयारी

  1. P1 वायरस तैयारी ३२
    1. 1 दिन: प्लेट Sf9 कोशिकाओं (~ 6 X 105) (गद्यांश संख्या 10 से कम) में Sf900 III कीट कोशिका मध्यम के 2 मिलीलीटर में एक अच्छी तरह से प्लेट और 27 डिग्री सेल्सियस पर मशीन । जब वे कमजोर द्वारा सस्पेंशन में प्रति मिलीलीटर 2 से 3 एक्स 106 कोशिकाओं के घनत्व तक पहुंचने कोशिकाओं बीतने ~ 6 X 105के घनत्व पर ताजा मीडिया में ।
    2. दिन 2: पतला 8 µ एल के Sf9-अभिकर्मक रिएजेंट में १०० µ एल के Sf900 III या अनुग्रह कीट मध्यम एंटीबायोटिक और सीरम के बिना । भंवर संक्षेप में ।
    3. एक अलग ट्यूब में, किट-शुद्ध रिकॉमबिनेंट bacmid के 1 µ जी पतला (विवरण ' प्रतिनिधि परिणाम ' में प्रदान की जाती हैं)३२ एक ही माध्यम के एक और १०० µ एल में ।
    4. पतला डीएनए और अभिकर्मक रिएजेंट का मिश्रण (कुल मात्रा ~ 210-220 μL), और 15-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    5. यम को कुआं से निकाल दें । एंटीबायोटिक और सीरम के बिना ताजा मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. पतला डीएनए-अभिकर्मक एजेंट मिश्रण dropwise कोशिकाओं पर जोड़ें । ड्रॉप आकार इस तरह समायोजित करें कि यह अनुयाई कोशिकाओं को उखाड़ नहीं करता है ।
    7. ~ 6 एच के बाद, शीर्ष पर ताजा मध्यम के १.५ मिलीलीटर जोड़ें या मध्यम निकालें और ताजा माध्यम के २.५ मिलीलीटर जोड़ें । इसके अलावा पहले 25-27 ° c करने के लिए ताजा मध्यम गर्म ।
    8. 27 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन । कुओं की जांच हर समय, वायरल संक्रमण के लक्षण के लिए ~ 12 एच । 27 डिग्री सेल्सियस पर सभी Sf9 रखरखाव और अभिव्यक्ति बाहर ले ।
    9. दिन 5: बाहर कोशिकाओं 60-72 एच पोस्ट संक्रमण युक्त माध्यम ले लो । ५०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । supernatant को बचाओ; यह P1-वायरस स्टॉक है । -८० ° c पर छोटे aliquots फ्रीज ।
  2. सबसे अच्छा एक्सप्रेस P1 वायरस क्लोन का चयन ।
    1. प्लेट कोशिकाओं इसी तरह चरण १.१ में वर्णित के रूप में ।
    2. अगले दिन या ~ 6 एच पोस्ट चढ़ाना, विभिंन कुओं में कोशिकाओं पर अलग P1 वायरस क्लोन स्टॉक के 20 µ एल और ५० µ एल जोड़ें ।
    3. कोमल pipetting द्वारा अनुयाई कोशिकाओं को हटाना और संक्रमित कोशिकाओं को 60-72 एच पद संक्रमण ५०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा काटने । supernatant सहेजें । यह P2 वायरस स्टॉक है । -८० डिग्री सेल्सियस पर शेयर के छोटे aliquots की दुकान ।
    4. काटा हुआ सेल गोली करने के लिए 2x Laemmli एसडीएस बफर के १०० µ एल जोड़ें । पर हीट > 95 ° c 10 min. केंद्रापसारक के लिए (आमतौर पर > १०,००० x g) 5 मिनट के लिए ।
    5. 10-15 पर प्रत्येक नमूने के µ l रन 8-10% एसडीएस-पृष्ठ पर 120-160 वी तक डाई सामने जेल के नीचे तक पहुँच जाता है.
    6. इलेक्ट्रो-एक Nitrocellulose/PVDF झिल्ली पर मानक अर्द्ध शुष्क स्थानांतरण प्रोटोकॉल (20 वी, 30-45 मिनट) द्वारा हल प्रोटीन हस्तांतरण ।
    7. विरोधी के साथ दाग-IKK1 एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने ~ 1:2000, अनुकूलित किया जाना चाहिए) या विरोधी PentaHis एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने ~ 1:3000, अनुकूलित किया जाना चाहिए) अभिव्यक्ति के लिए ।
    8. रिकॉमबिनेंट IKK1 की अभिव्यक्ति की तुलना करके सबसे अच्छा P1 वायरस क्लोन चुनें ।
  3. बड़े पैमाने पर पी पी वायरस स्टॉक की तैयारी ।
    1. प्लेट कोशिकाओं इसी तरह के रूप में चरण १.१ में एक 15 सेमी प्लेट Sf900 III मध्यम के 25-30 मिलीलीटर युक्त में वर्णित है ।
    2. ~ 6 एच पोस्ट चढ़ाना, कोशिकाओं पर सबसे अच्छा व्यक्त P1 वायरस शेयर के 150-300 µ एल जोड़ें ।
    3. ७२ एच पोस्ट संक्रमण के बाद, एक उपयुक्त ट्यूब (बाँझ) में थाली से मध्यम ध्यान से महाप्राण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500-1000 X g पर ट्यूब केंद्रापसारक । (यदि एक का गठन किया है) सेल गोली त्यागें और supernatant बचाने के लिए । यह पी ए पी वायरस स्टॉक है ।
  4. बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम वायरस अनुमापांक का निर्धारण
    1. Sf900 III मध्यम के 2 मिलीलीटर में प्लेट कोशिकाओं, के रूप में १.१ में वर्णित है, एक 6 में अच्छी तरह से थाली ।
    2. जोड़ें 20, 30, ४०, और अलग कुओं में पी 3 वायरस स्टॉक के ५० µ एल ~ 6 एच पद चढ़ाना । किसी संक्रमित नियंत्रण को शामिल करें ।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से 48-60 एच पोस्ट संक्रमण से फसल कोशिकाओं ।
    4. 2x Laemmli एसडीएस बफर के १०० µ एल जोड़ें । पर हीट > 95 ° c 10 min. केंद्रापसारक के लिए (आमतौर पर १४,००० x g) 5 मिनट के लिए ।
    5. एक 8-10% एसडीएस-पृष्ठ जेल में प्रत्येक नमूने के 10-15 µ l को हल करें ।
    6. 1.2.6 में वर्णित के रूप में एक Nitrocellulose/PVDF झिल्ली को हल प्रोटीन स्थानांतरण ।
    7. विरोधी के साथ दाग-IKK1 एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने ~ 1:2000, अनुकूलित किया जाना चाहिए) या विरोधी PentaHis एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने ~ 1:3000, अनुकूलित किया जाना चाहिए) ।
    8. बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए सबसे अच्छा व्यक्त अनुमापांक के साथ वायरस का प्रयोग करें ।

2.6x की बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति-अपने टैग मानव IKK129,३३

  1. एक निलंबन संस्कृति में बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति ले । Sf900 III मध्यम के 1 एल में विभाजित कोशिकाओं एक 2 एल Erlenmeyer कुप्पी में एक वेंट टोपी के साथ । कोशिका घनत्व होना चाहिए ~ 5x105 कोशिकाओं/
  2. पर निलंबन में इन कोशिकाओं को विकसित ~ १०० rpm में 27 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर में ~ 2 दिन तक यह 1-2x106/mL. के एक घनत्व तक पहुंच कोशिका घनत्व 2x106/mL. से अधिक नहीं होना चाहिए
  3. पी पी वायरस की वांछित राशि जोड़ें, के रूप में १.४ में मूल्यांकन किया ।
  4. एक शेखर में 27 डिग्री सेल्सियस पर ~ १०० rpm पर 48-60 ज के लिए संक्रमित संस्कृति हो जाना ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर < 1, 500 x g पर केंद्रापसारक द्वारा फसल कोशिकाओं ।
  6. सेल गोली बचाने के लिए और मध्यम त्यागें ।
  7. प्रोटीन शुद्धि के लिए सीधे आगे बढ़ें । फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में सेल गोली फ्रीज और भविष्य में उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

3. अपने-IKK1३३ का शुद्धिकरण

  1. 1 दिन पर, Lysis बफर (25 मिमी Tris पीएच ८.०, ०.२% NP-४०, २०० मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole, 10% ग्लिसरॉल, 5 मिमी β-mercaptoethanol, और चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल) के ४० मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
    नोट: गीले सेल गोली जन निर्धारित नहीं किया गया था । आमतौर पर, ~ 2 संस्कृति के एल इस कदम के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
  2. 60-70% शुल्क चक्र पर sonication द्वारा कोशिकाओं लाइसे, 30 s अवधि के 5-10 दालों > 1 मिनट के अंतराल पर, सेल सस्पेंशन बर्फ पर ठंडा रखते हुए ।
    नोट: इस कदम sonicator के प्रत्येक मॉडल के साथ अनुकूलन की आवश्यकता है । 10 ° c से ऊपर के नमूने को गर्म न होने दें ।
  3. 4 ° c में ४५ मिनट के लिए ≥ २८,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा lysate स्पष्ट ।
  4. Equilibrate lysis बफर के साथ नी-ंत् Agarose राल के 4 मिलीलीटर, और निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद स्पष्ट lysate (supernatant) मिश्रण ।
  5. प्रोटीन एक 4 डिग्री सेल्सियस कमरे में एक रोटरी मिक्सर पर 2 एच के लिए मशीन द्वारा राल बांध करने की अनुमति दें ।
  6. 30 मिमी imidazole युक्त lysis बफर के साथ अच्छी तरह से राल धो. धोने के अंश में प्रोटीन एकाग्रता की जांच करें समय ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर । धोना जब तक धो अंश में इस प्रोटीन एकाग्रता तक पहुंचता है ०.१ मिलीग्राम/ आमतौर पर > 20 धोने बफर के बिस्तर मात्रा इस बिंदु तक पहुंचने के लिए आवश्यक है ।
  7. Elute अपने-tagged IKK1/गुरुत्वाकर्षण प्रवाह के तहत α प्रोटीन, रेफरेंस बफर के 20 मिलीलीटर का उपयोग (lysis २५० mM imidazole युक्त बफर) । 1-1.5 एमएल अंश लीजिए ।
  8. एक 8 या 10% एसडीएस पृष्ठ जेल पर eluted प्रोटीन की शुद्धता की जांच 5-10 μL Laemmli बफर के साथ मिश्रित सभी अंशों से नमूना का लोड कर रहा है ।
  9. पूल पीक अंशों (एकाग्रता ≥ 2mg/एमएल), और उपाय प्रोटीन एकाग्रता ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर ।
  10. टेव (1:30-50 (टेवe: IKK1)) के साथ डाइजेस्ट 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (≥ 12 घंटे) को छेड़ो ।
    नोट: पूरा करने के लिए आवश्यक टेव को छेड़ने की राशि का अनुकूलन (≥ ९५%) 6X के पाचन-अपने टैग एक प्राथमिकताओं। घर में टेव की शुद्धि की गई ।
  11. 2 दिन की सुबह पर, 20 मिमी MgCl2, 20 मिमी β-glycerophosphate, 10 मिमी NaF की उपस्थिति में 1 मिमी एटीपी के साथ प्रोटीन की मशीन, और 1 ज के लिए 1 मिमी सोडियम orthovanadate 27 डिग्री सेल्सियस पर.
  12. एक ०.४५ या ०.२२ माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से प्रोटीन समाधान फ़िल्टर ।
  13. एक ~ १२० मिलीलीटर preparative आकार-अपवर्जन एक स्वचालित तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली से जुड़ी कॉलम पर नमूना के 6 मिलीलीटर लोड । Equilibrate एक (20 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.५), १५० मिमी NaCl, 5 मिमी डीटीटी, 5% ग्लिसरॉल), प्रोटीन के नमूने को लागू करने से पहले एक बफर के साथ कॉलम ।
    नोट: नी-ंत् संबध शुद्धिकरण कदम के बाद प्रोटीन की पैदावार के आधार पर छोटे कॉलम का इस्तेमाल किया जा सकता है । स्तंभ वॉल्यूम का 5% होने के लिए लोड वॉल्यूम समायोजित करें/
  14. 1 एमएल/मिनट की एक प्रवाह दर पर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी चलाने के लिए, और २८० और २५४ एनएम पर निगरानी रेफरेंस । 2 मिलीलीटर आकार के अंशों को एकत्र करें ।
  15. पीक अंशों की शुद्धता की जांच करें (आमतौर पर लगभग ~ 60-70 mL) पर एक 8-10% एसडीएस-पृष्ठ जेल ।
  16. पूल शुद्ध अंश (शुद्धता ≥ ९५% ≥ की एकाग्रता के साथ ०.५ मिलीग्राम/एमएल) और एक 10 केडीए या 30 केडीए आणविक वजन कट-बंद केंद्रापसारक प्रोटीन ध्यानी निर्माता के निर्देशों के बाद में ध्यान केंद्रित ।
  17. आवधिक ब्रैडफोर्ड विधि द्वारा ध्यान केंद्रित के प्रोटीन एकाग्रता की जांच करें, और 8-12 मिलीग्राम/एमएल तक नमूना ध्यान केंद्रित ।
  18. तरल नाइट्रोजन में 25 μL aliquots और फ्लैश फ्रीज का वितरण करें । -८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में इन फ्लैश जमे हुए नमूनों की दुकान ।

4. IKK1 की क्रिस्टलीय हालत के लिए स्क्रीन

  1. नीचे वर्णित तरीकों के बाद क्रिस्टल के लिए स्क्रीन करने के लिए आवश्यक प्रोटीन की कुल राशि (मात्रा से) की गणना ।
  2. विभिन्न अवरोधकों का प्रयास करें (जेनेरिक कळेनासे अवरोधक: AMPPNP, और Staurosporine; मतान्ध-विशिष्ट अवरोधकों: MLN120B, यौगिक एक, और मतान्ध-अवरोधक बारहवीं) क्रिस्टलीकरण के लिए स्क्रीनिंग प्रदर्शन करने के लिए. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए इन यौगिकों के स्टॉक समाधान करें । सुनिश्चित करें कि अपने स्टॉक समाधान में यौगिक की अधिकतम एकाग्रता 20 माइक्रोन से अधिक नहीं है ।
  3. मतान्ध तैयार: २०० माइक्रोन अवरोध करनेवाला के साथ IKK1 के १०० माइक्रोन मिश्रण द्वारा क्रिस्टलीकरण स्क्रीन के लिए अवरोधक जटिल, और 30-40 मिनट के लिए 18-20 ° c पर मशीन, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए > 15, 000 एक्स जी पर इस मिश्रण को केंद्रापसारक । क्रिस्टलीकरण स्क्रीन के लिए supernatant बचाओ ।
  4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रिस्टलीकरण स्क्रीन का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें).
  5. पिपेट 80-100 प्रत्येक क्रिस्टलीकरण एजेंट के μL (जलाशय समाधान), एक मल्टीचैनल पिपेट या एक रोबोट का उपयोग कर, एक ९६ के जलाशय में अच्छी तरह से थाली । प्लेट अब बूंदें सेट करने के लिए तैयार है । 2 से 3 अवरोधकों एक ही थाली में दिखलाई जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित करें कि प्लेट 2 से 3 क्रिस्टलीकरण बूंदों को समायोजित करता है.
  6. एक क्रिस्टलीकरण रोबोट का उपयोग करना, वितरण और 0.2-0.25 μL IKK1 के मिश्रण: अवरोध करनेवाला जलाशय समाधान की एक ही मात्रा के साथ जटिल ।
    नोट: स्क्रीनिंग मैंयुअल रूप से बड़ा ड्रॉप खंड का उपयोग किया जा सकता है (0.5-1.0 μL के IKK1: अवरोधक जलाशय समाधान की एक ही मात्रा के साथ जटिल) । हालांकि, एक रोबोट का उपयोग मूल्यवान रिएजेंटों को बचाने में मदद मिलेगी ।
  7. तुरंत ऑप्टिकली साफ फिल्मों के साथ बूंदें वाष्पीकरण से बचने के लिए स्थापित करने के बाद प्लेटें सील । उचित applicator का प्रयोग ठीक से सील । प्रत्येक अवरोधक सेट के लिए प्रतिकृति प्लेटें बनाओ । 18 डिग्री सेल्सियस पर एक थाली मशीन, और ठंड कमरे में अन्य (तापमान रेंज ~ 4-6 डिग्री सेल्सियस). सुनिश्चित करें कि मशीन कंपन से प्रभावित नहीं कर रहे हैं ।
  8. पहले सात दिनों के लिए हर दिन प्रत्येक ड्रॉप में क्रिस्टल की उपस्थिति के लिए जाँच करने के लिए एक ध्रुवक के साथ एक stereomicroscope का प्रयोग करें, और फिर अब अंतराल पर. व्यवस्थित ध्यान दें और इन टिप्पणियों स्कोर ।
    नोट: एक ध्रुवीकरण के साथ एक stereomicroscope का प्रयोग करें ताकि क्रिस्टल में वृद्धि दोष नेत्रहीन मूल्यांकन किया जा सकता है । यहां, क्रिस्टल एक हालत में दिखाई दिया, जहां जलाशय समाधान 3% डब्ल्यू/वी Dextran सल्फेट सोडियम नमक एमआर ५,०००, ०.१ एम BICINE पीएच ८.५, 15% डब्ल्यू/ IKK1 के क्रिस्टल मतान्ध-अवरोधक बारहवीं की उपस्थिति में ही बढ़ी.

5. क्रिस्टल विकास अनुकूलन29,३३

  1. स्टॉक समाधानों की तैयारी ।
    1. अलग आणविक भार के Dextran सल्फेट के 30% w/v समाधान तैयार करें (औसत मेगावाट ५,०००, ८,०००, १५,०००, ४०,००० डीए) में2. ०.२२ माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर समाधान ।
    2. ६.५ से 9 की पीएच रेंज में अलग बफर के 1 मीटर या ०.५ मीटर स्टॉक्स तैयार करें । ०.२२ माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर समाधान.
    3. 25% या ५०% (डब्ल्यू/v) अलग आणविक वजन के खूंटी समाधान (औसत मेगावाट: 1000, १,५००, ३,३५०, ४,०००, ६,०००, ८,०००, १०,०००, १२,०००, २०,००० दा) तैयार करें । ०.२२ माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर समाधान.
    4. व्यवस्थित अलग पीएच, बफर प्रकार, एकाग्रता, और दोनों खूंटी और Dextran सल्फेट के प्रकार के द्वारा एक ग्रिड स्क्रीन प्रदर्शन करते हैं ।
  2. दोनों 18 डिग्री सेल्सियस पर, और ठंड कमरे में (तापमान रेंज ~ 4-6 डिग्री सेल्सियस) स्क्रीनिंग का अनुकूलन ।
  3. मिश्रण अच्छी तरह से समाधान और एक सील वातावरण में अच्छी तरह से समाधान पर मशीन के साथ IKK1: अवरोधक परिसर के बराबर राशि । इस कदम को मैंयुअल रूप से किया जा सकता है या एक वितरण रोबोट का उपयोग ।
    नोट: यहां, सबसे बड़ा और अच्छी तरह से परिभाषित क्रिस्टल (के रूप में ध्रुवीकरण जो संकेत समान वृद्धि के तहत वर्दी रंग द्वारा मूल्यांकन) निंनलिखित शर्तों के तहत प्राप्त किया गया: १०० मिमी BisTris पीएच ७.०, 2.8-Dextran सल्फेट के 3.5% (औसत मेगावाट 15 केडीए), 8.5-10% खूंटी 20 ठंड के कमरे में केडीए ।

6. बड़ी संख्या में क्रिस्टल बढ़ रहा है

  1. निंनलिखित शेयर समाधान तैयार है और उंहें ०.२२ माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर ।
    1. तैयार 0.5 एम BisTris पीएच ७.०, और BisTris प्रोपेन पीएच ७.० और ७.५ ।
    2. 30% (w/v) Dextran सल्फेट (औसत मेगावाट ~ 15 केडीए) तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    3. तैयार ५०% खूंटी (औसत मेगावाट ~ 12 केडीए) ।
  2. 24 अच्छी तरह से लटका ड्रॉप प्लेट का उपयोग करें ।
  3. एक अच्छी तरह से उठाया छल्ले पर सीलेंट तेल लागू करें ।
  4. इस प्रकार के रूप में अच्छी तरह से समाधान तैयार (अंतिम एकाग्रता): १०० मिमी BisTris पीएच 7.0 – 7.5, 2.8-3.5% Dextran सल्फेट ~ 15 केडीए, 8.5 – 10% खूंटी ~ 12 केडीए. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में 1 मिलीलीटर अच्छी तरह से समाधान तैयार करें ।
    नोट: क्रिस्टलीकरण हालत में एक छोटी सी भिन्नता प्रोटीन के बैच के आधार पर मनाया गया था, और/या Dextran सल्फेट, इस प्रकार एक संकीर्ण रेंज के एक परीक्षण की सिफारिश की है. दोनों BisTris और BisTris प्रोपेन एक ही पीएच रेंज उपज एकल क्रिस्टल के थें ।
  5. ठंडा कमरे में अच्छी तरह से समाधान और चिकना प्लेटें कम से 1 एच के लिए रखें ।
  6. IKK1 तैयार: अवरोध करनेवाला परिसर के रूप में ४.३ में वर्णित है । १.५ मिलीलीटर ट्यूबों से 24 खैर प्लेट के व्यक्तिगत कुओं को अच्छी तरह से समाधान स्थानांतरण ।
  7. स्वच्छ सिलिकॉन (वाणिज्यिक या घर में (siliconization/silanization)) ग्लास कवर एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछे का उपयोग कर फिसल जाता है और उच्च दबाव लागू व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एयरोसोल डस्टर का उपयोग कर हवा जेट विमानों ।
  8. 1 प्लेस-एक साफ कवर पर्ची पर अच्छी तरह से समाधान के 1.5 μL । पिपेट IKK1 के बराबर मात्रा: अवरोध करनेवाला, pipetting ऊपर और नीचे 3-4 बार से धीरे मिश्रण । संदंश के साथ संबंधित अच्छी तरह से ग्लास कवर स्लिप और जगह बारी और तेल पर दबाकर अच्छी तरह से सील ।
  9. एक 24 अच्छी तरह से थाली की सभी बूंदें स्थापित करने के बाद, अंधेरे में ठंडे कमरे में थाली मशीन । कभी कभार उपस्थिति और क्रिस्टल के विकास के लिए एक खुर्दबीन के नीचे बूंदों की जाँच करें ।
    नोट: यह परीक्षण नहीं किया गया है कि प्रकाश के तहत मशीनिंग क्रिस्टल प्लेट परिणाम बदल जाएगा । यह महत्वपूर्ण है, तथापि, कि प्लेटें एक वातावरण में ंयूनतम के साथ मशीन/

7. क्रिस्टल के क्रायो संरक्षण

  1. क्रायो समाधान की तैयारी ।
    1. तैयार क्रायो एक (~ 2% Dextran सल्फेट, ~ 10% खूंटी १२०००, ६० mM BisTris प्रोपेन (इरादा अच्छी तरह से समाधान के रूप में एक ही पीएच के), 5 मिमी Tris पीएच ७.५, 40-50 मिमी NaCl, २.५% ग्लिसरॉल) ।
    2. तैयार क्रायो बी (~ ०.३% Dextran सल्फेट, ~ 10% खूंटी १२०००, ६० mM BisTris प्रोपेन (इरादा अच्छी तरह से समाधान के रूप में एक ही पीएच के), 5 मिमी Tris पीएच ७.५, 40-50 मिमी NaCl, 20 या 25% ग्लिसरॉल या 20 या 25% ईथीलीन ग्लाइकोल) ।
      नोट: ग्लिसरॉल और ईथीलीन ग्लाइकोल के अलावा विभिन्न क्रायो-protectants का परीक्षण करें (उदा., खूंटी २००, खूंटी ४००, खूंटी MME ५५०, खूंटी १०००).
  2. धीरे गिलास कवर पर्ची क्रिस्टल युक्त निकालें और क्रिस्टल ऊपर की ओर का सामना करना पड़ ड्रॉप के साथ एक ठोस सतह पर जगह है । धीरे ड्रॉप के शीर्ष पर एक समाधान क्रायो के 10 μL जोड़ें, और धीरे pipetting द्वारा इतना मिश्रण है कि क्रिस्टल को छुआ नहीं है ।
    नोट: यह मलबे के क्रिस्टल सतह साफ और मदद के प्रारंभिक क्रायो बफर के साथ क्रिस्टल equilibrate । क्रिस्टल के लिए यांत्रिक और थर्मल तनाव से बचें । क्रिस्टल के लिए किसी भी क्षति से बचने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत सभी बाद के चरणों का प्रदर्शन ।
  3. धीरे से क्रिस्टल से कुछ तरल निकालें और समाधान के बारे में 5-8 μL रखने के लिए । क्रिस्टल के निर्जलीकरण से बचें । सभी बाद के चरणों में यांत्रिक तनाव और क्रिस्टल के निर्जलीकरण से बचने के लिए अति सावधानी बरतें ।
  4. धीरे जोड़ें 2.5-4 क्रायो बी समाधान के μL ड्रॉप पर, pipetting द्वारा बहुत धीरे मिश्रण । क्रिस्टल पर सीधे हवा के प्रवाह से बचने के लिए एक छोटे से पेट्री डिश के साथ कवर । 5 मिनट के लिए रुको । हमेशा सावधान रहना क्रिस्टल आसमाटिक दबाव या निर्जलीकरण की तेजी से परिवर्तन पीड़ित नहीं है ।
  5. दोहराएं चरण ७.४ चार बार धीरे क्रायो समाधान में क्रिस्टल acclimatize करने के लिए ।
  6. इस अवस्था में क्रायो समाधान के 10 – 20 μL रखें (अर्थात, क्रिस्टल को लगभग 20 – 25% क्रायो-बचाव युक्त घोल में स्नान करने की अनुमति दें) । अंतिम क्रायो-समाधान में समय की अलग अवधि (1 घंटे के लिए 5 मिनट) के लिए भिगोएं ।
  7. विभिन्न समय-अंक पर कई क्रिस्टल फ्रीज.
  8. ध्यान से एक उचित क्रायो में ड्रॉप से एक क्रिस्टल उठाओ-पाश तरल एन2में एक उचित आधार और डुबकी-फ्रीज पर मुहिम शुरू की । इस कदम को सुचारू रूप से और जल्दी से क्रिस्टल पर बर्फ गठन से बचने के लिए प्रदर्शन ।
    नोट: क्रिस्टल की सबसे लंबी धुरी से थोड़ा बड़ा है कि यह रोबोट उन्नत फोटॉन स्रोत, Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया goniometer में रखा जा सकता है कि एक पाश व्यास का उपयोग करते हुए.
  9. क्रायो युक्त क्रिस्टल की दुकान-तरल एन2में डूबे पक में छोरों । इन पक तरल एन2 देवर कुप्पी में स्टोर जब तक वे एक्स के लिए लदान के लिए तैयार कर रहे है सिंक्रोट्रॉन पर रे विवर्तन । एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह और प्रसंस्करण (8 वर्गों और 9) के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: होम एक्स-रे स्रोतों से IKK1 क्रिस्टल के विवर्तन डेटा संरचना निर्धारण परीक्षणों के लिए पर्याप्त उच्च संकल्प के नहीं थे, हालांकि यह क्रिस्टल की गुणवत्ता सिंक्रोट्रॉन में दिखलाई जाने का संकेत दिया । सभी विवर्तन डेटा अग्रिम फोटॉन स्रोत, Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला, संयुक्त राज्य अमेरिका के विभिन्न beamlines (मुख्य रूप से 19ID) पर एकत्र किए गए थे.

8. एक्स-रे डाटा संग्रह

  1. अनुप सिंक्रोट्रॉन स्रोत के ID19 beamline पर X-ray विवर्तन डेटा एकत्र करें, दूरस्थ डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर३४का उपयोग कर ।
    नोट: १०० क्रिस्टल के ऊपर की ओर उनके विवर्तन संपत्तियों के लिए परीक्षण किया गया । क्रिस्टल नियमित रूप से 7-11 å के एक संकल्प को diffracted, केवल शायद ही कभी क्रिस्टल कि diffracted से परे 5 å मनाया गया, और केवल एक बड़ी क्रिस्टल diffracted ४.५ å परे । के बाद से क्रिस्टल डेटा संग्रह के दौरान तेजी से खोखली, एक ही क्रिस्टल के विभिंन भागों में डेटासेट एकत्र किए गए । यह संभव था के बाद से क्रिस्टल बड़े थे (४०० µm से बड़ा), और बीम व्यास थे १०० µm ।

9. एक्स-रे डाटा प्रोसेसिंग

  1. एक ही क्रिस्टल३४के विभिंन भागों पर संग्रहीत सभी डेटासेट को मर्ज करें ।
    नोट: सात डेटासेट सबसे अच्छा क्रिस्टल से विलय कर दिया गया था और परिणामी डेटा ९३% पूरा किया गया था । कुल मिलाकर I/σ था ~ ६.८) और Rmerge ८९% उच्चतम रिज़ॉल्यूशन बिन (5.4-4.5 Å) में था ।
  2. अंतरिक्ष समूह, इकाई सेल आयाम, विलायक सामग्री, और असममित इकाई के प्रशंसनीय संरचना प्राप्त करने के लिए HKL2000३४ के साथ प्रक्रिया डेटासेट ।

10. संरचना समाधान

  1. खोज मॉडल की तैयारी
    1. hIKK2 के उपलब्ध संरचनात्मक मॉडल के आधार पर (pdb आईडी 4E3C और 4KIK३५), एन टर्मिनल केडी के विभिंन झुकाव के साथ dimers की एक श्रृंखला उत्पंन (जो P578 में दो केडी के डिमर के बीच 30 और ६२ Å के एक खोलने renders) । इन मॉडलों में से कोई भी व्यापक परीक्षणों के बाद एक आणविक प्रतिस्थापन खोज समाधान दिलवाया ।
    2. एकल-कण क्रायो-EM डेटा३३से IKK1 का एक मैप जनरेट करें ।
    3. IKK2 (pdb id 4KIK) के उच्चतम रिज़ॉल्यूशन संरचना से मानव IKK1 का एक मॉडल उत्पन्न करें ।
    4. मानव IKK1 मॉडल के व्यक्तिगत डोमेन मानव IKK1 के क्रायो EM घनत्व मानचित्र में कूट३६का उपयोग कर डॉक । यह 24 डिग्री के बारे में केडी उंमुखीकरण घुमाया और N-टर्मिनल खोलने के लिए ~ ५८ Å संशोधित ।
    5. क्रायो-EM फिट मॉडल (मोनोमर) के सभी 10.1.1 में उत्पंन dimers के लिए केडी अभिविन्यास लागू होते हैं ।
  2. आणविक प्रतिस्थापन
    1. प्रोग्राम में खोज मॉडल के रूप में 10.1.1 और 10.1.5 से dimers का उपयोग करें phaser३७, MOLREP३८ और सीएनएस३९,४०.
      नोट: यहां, एक खोज मॉडल के रूप में 10.1.5 (५२ Å खोलने) से dimers में से एक का उपयोग कर, छह dimers (दो hexamers) असममित इकाई में MOLREP का उपयोग करके स्थित थे । खोज मॉडल में ५२ å खोलने dimers के 49-50 å खोलने के समान है (सभी छह dimers) परिष्कृत संरचना में ।

11. संरचना काे

  1. संरचना शोधन प्रक्रिया
    1. (cns_solve_ 1.3)३९,४०सीएनएस में कठोर शरीर शोधन द्वारा इस प्रारंभिक मॉडल के अभिविन्यास और स्थिति को ठीक करें.
    2. और एक अधिकतम संभावना लक्ष्य समारोह और एक फ्लैट थोक विलायक सुधार सीएनएस सिस्टम३९,४०का उपयोग कर के साथ छोटा और अनुकरणीय एनीलिंग का उपयोग कर संरचना को परिष्कृत करें ।
    3. 2Fओएफसी और Xtalview४१का उपयोग कर-एफसी के नक्शे के आधार पर मॉडल का निर्माण ।
      नोट: मॉडल की बेहतर सटीकता के लिए परिशोधन के दौरान मांद-असिस्टेड४२ और एनसीएस को नियंत्रित करें । दरअसल, मांद शोधन नाटकीय रूप से सुधार geometries और संरचना के अनुसंधान कारकों, और आर फैक्टर २२.२% और नि: शुल्क आर फैक्टर था अंतिम मॉडल के लिए २७.८% था । नि: शुल्क के नाटकीय सुधार IKK1 डोमेन है कि IKK2 मॉडल (4KIK) से उत्पंन किया गया उच्च सटीकता मॉडल के कारण होना चाहिए ।

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Representative Results

क्लोनिंग और IKK1 के विभिंन निर्माणों की अभिव्यक्ति/α
पूर्ण लंबाई मानव IKK1/α अपनी EcoRI और नोति प्रतिबंध साइटों के भीतर baculovirus अभिव्यक्ति वेक्टर pFastBacHTa में क्लोन किया गया एक N-टर्मिनल हेक्सा-Histidine टैग IKK1 प्राप्त करने के लिए । टैग टेव को छेड़ो पाचन द्वारा हटाया जा सकता है । के बाद से पूरी लंबाई IKK1/α दोनों सिरों पर लचीला क्षेत्रों में शामिल है, और लचीला क्षेत्रों में आम तौर पर एक प्रोटीन मुश्किल प्रदान करने के लिए सघन, हम abovementioned वेक्टर के pFastBacHTa साइटों के भीतर IKK1/α के विभिंन टुकड़े काट दिया क्लोन । IKK1/α के विभिन्न जनचेतना म्यूटेंट दोनों वाइल्ड-टाइप (wt) और S176E, 180E (EE) की रीढ़ के साथ उत्पन्न हुए । IKK1/α EE phosphorylated कळेनासे के constitutively सक्रिय रूप के mimetic को संदर्भित करता है । रिकॉमबिनेंट baculovirus उत्पादन और प्रोटीन अभिव्यक्ति मामूली संशोधनों४३ (चित्रा 1) के साथ एक पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया ।

IKK1/α क्रिस्टलीकरण में कठिनाई
चूंकि मानव IKK2/β और IKK1 मुताबिक़ हैं, और हम कई विभिन्न स्थितियों के तहत मानव IKK2 के विभिन्न संस्करणों को सघन सकता है, हम इसी तरह की रणनीतियों का उपयोग कर समान परिस्थितियों के तहत सघन करने के लिए IKK1/α की उम्मीद है । हालांकि, कई अलग IKK1 वेरिएंट के साथ व्यापक परीक्षणों के बाद, हम केवल एक छोटा निर्माण (IKK1 10-667 EE) (चित्रा 2) के साथ क्रिस्टल प्राप्त किया, और वह भी केवल मतान्ध अवरोधक बारहवीं४४ की उपस्थिति में है कि उपयुक्त प्रदर्शित एक्स-रे विवर्तन गुण.

संरचना समाधान
IKK1/α क्रिस्टल कई विकास समस्याओं से पीड़ित है, और डेटा अक्सर बहुत उच्च मोज़ेक प्रदर्शित । कमजोर क्रिस्टल बड़े विलायक सामग्री और IKK1 मोनोमर/डिमर के गतिशील प्रकृति के साथ जुड़े पैकिंग इस के पीछे की संभावना कारण हैं । इन समस्याओं को दरकिनार, श्रमसाध्य प्रयास के लिए सबसे अच्छा संभव क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए ले जाया गया, और क्रायो-संरक्षण प्रक्रिया विभिंन स्थितियों के तहत और विभिंन क्रायो के साथ अत्यंत देखभाल के साथ प्रदर्शन किया गया था-परिरक्षक बफ़र्स । डेटा भी अंतिम परिशुद्धता के साथ बीम क्षति को कम करने के लिए एकत्र किया गया था । के बाद से क्रिस्टल बड़े थे (सबसे बड़ा आयाम अक्सर ४०० माइक्रोन से अधिक), एक ही क्रिस्टल के विभिंन क्षेत्रों एक्स-रे बीम को उजागर किया गया एकाधिक डेटासेट इकट्ठा । यह भिंन datasets स्केल किया जा करने के लिए, और अधिक अतिरेक और छोटी की गई त्रुटि के साथ एक यथोचित पूर्ण dataset प्राप्त करने के लिए सक्षम है । भारी परमाणुओं, या भारी एटम समूहों के साथ भिगोने (जैसे, TaBr और TAMM), क्रिस्टल अपर्याप्त रूप से diffract करने के लिए कारण । हालांकि हम व्युत्पंन डेटा में TaBr क्लस्टर की स्थिति का पता लगाने सकता है, गैर के अलावा डेटा की खराब गुणवत्ता-isomorphocity प्रदान की छोटी, यदि कोई हो, चरण जानकारी ।

हम विभिंन उपलब्ध पैरामीटर का उपयोग HKL2000 के साथ डेटासेट संसाधित । विवर्तन पैटर्न से पता चला कि क्रिस्टल अंतरिक्ष समूह P21 इकाई सेल आयाम, एक = १७४.५१, b = १८६.९४, c = २७५.८३ Å और β = ९८.८४ डिग्री के साथ से संबंधित है । हम मुख्य रूप से मैं/σ कटौती का अनुमान है और डेटासेट के लिए विभिंन कट-नापसंद का परीक्षण किया । हम एक क्रिस्टल पर एकत्र विवर्तन डेटा के 7 सेट के 4 से ४.५ Å संकल्प का एक विलय डेटा सेट प्राप्त किया । हम अंतिम घनत्व नक्शे के दृश्य निरीक्षण से ४.५ Å तक डेटा रखने का फैसला किया । यह CC1/2 का उपयोग करने के लिए सार्थक हो सकता है, क्योंकि हम विश्लेषणात्मक प्रतिलिपि *४५का उपयोग करते हुए सही (आमतौर पर unmeasurable) तीव्रता के विरुद्ध मर्ज किए गए dataset का अनुमान कर सकते हैं । क्योंकि बड़ी इकाई सेल अंतरिक्ष समूह के कम समरूपता के साथ संयुक्त की, हम असममित इकाई प्रत्याशित को 12 से 24 ७०% की एक विलायक सामग्री के आधार पर अणुओं को शामिल ४०% ।

कमजोर तीव्रता के साथ कम संकल्प एक्स-रे डेटा के संयुक्त प्रभाव (यानी, डेटा में महत्वपूर्ण त्रुटियां) (चित्रा 3), बड़ी संख्या (12) असममित इकाई में IKK1 अणुओं की, और IKK1 monomeric के गठन रूपांतर/dimeric मॉडल ज्ञात IKK2 मॉडल की तुलना में, शुरू में हमें एक आणविक प्रतिस्थापन समाधान IKK1 प्राप्त करने से रोका, और इस तरह अपनी संरचना का निर्धारण ।

IKK1/α and IKK2/β दोनों एक कळेनासे डोमेन (केडी), एक ubiquitin-जैसे डोमेन (नबआं), और एक एक-पेचदार पाड़ dimerization डोमेन (SDD) होते हैं । IKK1 की संरचना से पता चला है कि यह SDD के बाहर क्षेत्र के एक लगभग समान अंतर-उप इकाई इंटरफेस का उपयोग IKK2 के लिए इसी तरह dimers रूपों । हालांकि, IKK1 डिमर SDD + नबआं के सापेक्ष एन टर्मिनल केडी की एक काफी अलग सापेक्ष स्थिति है कि ज्ञात IKK2 dimers में की तुलना में प्रदर्शित किया । विभिंन IKK2 संरचनाओं पहले अपनी dimers (चित्रा 4, पैनल ए) के भीतर अलग intermonomer उंमुखीकरण संकेत दिया है, इसलिए है कि P578 के अल्फा कार्बन के बीच चार अलग डिमर मॉडल में दो केडी में दूरी ३९ और ६१ Å के बीच विभिंन । के बाद से इन दो kinases के अनुक्रम बहुत समान है और डिमर अंतरफलक पर अवशेषों समान हैं, हम प्रत्याशित IKK1/α एक समान डिमर फार्म होगा; हालांकि, के बाद से वहां केडी के अवशेषों में महत्वपूर्ण अंतर-SDD अंतरफलक है (जैसे, W424 और IKK2 में F111 क्रमशः वी और पी रहे हैं), हम प्रत्याशित शायद अभी तक एक अलग IKK1 में केडी उंमुखीकरण । दरअसल, IKK1/α संरचना संकेत दिया कि SDD के लिए केडी के संबंधित झुकाव अद्वितीय है, और यह IKK2 के सभी ज्ञात मॉडलों से विचलित/ एक सौ डिमर मॉडल से अधिक में किसी भी सफलता के बिना प्रोग्राम phaser, MOLREP, और सीएनएस में खोज मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया, आणविक प्रतिस्थापन परीक्षणों की सफलता के लिए एक जगह सही खोज मॉडल के लिए की जरूरत का संकेत है, विशेष रूप से हमारे कम संकल्प डेटा के साथ । एक मोनोमर मॉडल बहुत कम द्रव्यमान के लिए बड़े असममित 12 मोनोमर युक्त इकाई के कमजोर विवर्तन डेटा में किसी भी समाधान लेने के लिए है । इसके अलावा, शामिल किए जाने या खोज मॉडल में पानी की चूक आणविक प्रतिस्थापन खोजों में कोई फर्क नहीं पड़ता, विशेष रूप से कमजोर विवर्तन डेटा की वजह से । CC1/2 और प्रतिलिपि * इंगित करता है कि ४.५ Å तक डेटा काफी सटीक है । हम एक रूढ़िवादी संकल्प कटौती का इस्तेमाल किया ४.५ Å के आधार पर I/σ के १.५ । अलग संकल्प कट-नापसंद के साथ डेटासेट आणविक प्रतिस्थापन खोज आपरेशनों के दौरान किसी भी स्टार्क अंतर नहीं दिखा था, और अंतिम नक्शे इन डेटासेट के खिलाफ परिष्कृत समाधान का विस्तार करने पर मानचित्र सुविधाओं में कोई विशिष्ट सुधार नहीं दिखा था कट-नापसंद । मॉडल के अंतिम निर्माण काफी सटीक है, जो अकेले घनत्व से बनाया जा सकता है, की संभावना प्रारंभिक आणविक प्रतिस्थापन मॉडल के बाद से एक उच्च संकल्प डेटा के साथ व्युत्पंन मॉडल से बनाया गया है, और हम क्रायो-EM मानचित्र का उपयोग/ नक्शे की सुविधाओं को क्रॉस-चेक करें, खासकर उन क्षेत्रों में जहां नक्शे अस्पष्ट थे ।

मसा में, एक उपयोगी खोज मॉडल के प्राप्य केवल क्योंकि कम संकल्प क्रायो EM नक्शे की उपलब्धता के संभव था, और IKK1 डोमेन के बजाय उच्च सटीकता मॉडल है कि उच्च संकल्प IKK2 संरचना के आधार पर उत्पंन किया जा सकता है (4 चित्रा , पैनल बी) । हम एक यथोचित करीब डिमर मॉडल प्राप्त करने के लिए IKK1 के क्रायो-EM मानचित्र में IKK1 डोमेन डॉक सकता है । प्रारंभिक मॉडल केडी के उंमुखीकरण एक IKK2 मोनोमर के सापेक्ष 24 डिग्री घुमाया के बारे में संकेत दिया, और N-५८ Å के टर्मिनल खोलने (एक डिमर में दो KDs की P578 के बीच) । हमारे विभिंन IKK2/β डिमर संरचनाओं के पूर्व ज्ञान (और उनके रूपांतर) हमें ठीक धुन 30-62 å. एक खोज मॉडल के रूप में dimers (५२ å खोलने) में से एक का उपयोग कर, हम असममित इकाई में छह dimers स्थित का उपयोग कर कार्यक्रम MOLREP४६. इन छह dimers असममित इकाई में दो hexamers में आयोजित कर रहे हैं, और परिकलित विलायक ६८% की एक मात्रा है ।

Figure 1
चित्रा 1: IKK1 का शुद्धिकरण । (क) कीट कोशिकाओं में IKK1 (10-667) की अभिव्यक्ति. (ख) IKK1 के शुद्धिकरण के लिए एक प्रवाह चार्ट; (ग) नी-ंत् अपनत्व क्रोमैटोग्राफी कदम के बाद IKK1 की पवित्रता दिखाते हुए एक एसडीएस-पृष्ठ जेल. (घ) आकार-अपवर्जन प्रोफ़ाइल IKK1 के डिमर का संकेत । (ङ) एसडीएस-पृष्ठ जेल पीक आकार-अपवर्जन अंशों से IKK1 की शुद्धता दिखा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: आकृति विज्ञान और IKK1 क्रिस्टल के आकार । (क) IKK1 के एक क्रिस्टल 10-667 का निर्माण; क्रिस्टलीकरण ड्रॉप भी अच्छी तरह से diffract नहीं है जो एक और आकृति विज्ञान (पतली प्लेट्स) के क्रिस्टल से पता चलता है. (ख) क्रिस्टल कि diffracted से परे 5 Å. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ज़ूम ।

Figure 3
चित्रा 3: । Crystallographic IKK1 क्रिस्टल से प्राप्त डेटा । (एक) एक IKK1 क्रिस्टल के एक एक्स-रे विवर्तन प्रोफ़ाइल ठेठ IKK1 क्रिस्टल के गरीब विवर्तन गुणों का संकेत है । (B) IKK1 संरचना निर्धारण, और डेटा के अतिरेक के लिए प्रयुक्त मर्ज किए गए डेटासेट के आंकड़े स्केलिंग HKL2000 । r रेखीय = sum (ABS (मैं-< i >))/सुँ (i), r वर्ग = sum ((मैं-< i >) * * 2)/सुँ (i * * 2), ची * * 2 = SUM ((मैं-< i >) * * 2)/(त्रुटि * * 2 * n/(n-1))), CC1/2 = सहसंबंध गुणांक, प्रतिलिपि * = सहसंबंध गुणांक के विरुद्ध मर्ज किए गए dataset सही तीव्रता । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: खोज मॉडल की तैयारी । (क) IKK2 डिमर के विभिंन मॉडलों को SDD के सापेक्ष केडी के विभिंन झुकाव का संकेत (दो केडी के बीच अलग जुदाई को जंम दे); इन मॉडलों के शुरू में परीक्षण किया गया किसी भी सफलता के बिना एक आणविक प्रतिस्थापन समाधान खोजने के लिए । (ख) IKK1 खोज मॉडल की जनरेशन-क्रायो-EM IKK1 डिमर के मानचित्र 11 Å संकल्प पर; EM-मानचित्र सज्जित प्रारंभिक IKK1 खोज मॉडल, व्यक्तिगत डोमेन IKK2 मॉडल (4KIK) पर आधारित हैं; एक IKK1 खोज मॉडल आगे ठीक-tweaked (उचित केडी अभिविंयास) IKK2 मॉडल से ंयाय के रूप में विभिंन संभावनाओं के आधार पर 4aमें ऊपर का वर्णन; Superposition EM-खोज मॉडल है कि आणविक प्रतिस्थापन समाधान उपज के लिए नक्शे फिट मॉडल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

दो संबंधित मतान्ध प्रोटीन का उत्पादन, सघनकरण और संरचना समाधान
हम बाहर सेट करने के लिए एक्स-रे क्रिस्टल संरचना IKK1/α की धारणा है कि यह एक अपेक्षाकृत सरल IKK2 के साथ हमारे अनुभव दिया जाएगा/β प्रोटीन उत्पादन, क्रिस्टलीकरण, और संरचना निर्धारण के साथ निर्धारित करने के लिए । हालांकि, हम बेहद हैरान थे कि इन दो संबंधित प्रोटीन बहुत अलग ढंग से क्रिस्टलीकरण की आसानी के बारे में व्यवहार किया । कई उच्च प्रोफ़ाइल प्रयोगशालाओं से प्रयासों के बावजूद, IKK1 संरचना का निर्धारण करीब दो दशक लग गए । यह काफी हद तक कुछ महत्वपूर्ण अड़चनों से उपजी थी ।

पहली कठिनाई एक अत्यधिक शुद्ध और घुलनशील प्रोटीन फार्म प्राप्त करने के लिए किया गया था । कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली हमें शुद्ध प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा है कि काफी घुलनशील था प्राप्त करने के लिए सक्षम होना चाहिए । अभिव्यक्ति के स्तर के संबंध में, सभी IKK1/α construction IKK2/β construction की तुलना में बहुत निचले स्तर पर व्यक्त कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणालियों में । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि न तो प्रोटीन घुलनशील है और कार्यात्मक जब ई. कोलाईमें व्यक्त की है । एक कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली में, IKK2/β टुकड़े उच्च स्तर पर व्यक्त की 10 से 30 mg/L के निर्माण पर निर्भर करता है संस्कृति. इसके विपरीत, IKK1/α constructs केवल ०.५ करने के लिए २.० मिलीग्राम/ इस अंतर के कारण अभी भी हमारे लिए अज्ञात है । हम भी देशी मेजबान कोशिकाओं में IKK1 की अभिव्यक्ति की कोशिश करनी चाहिए (यानी, एक स्तनधारी मतान्ध प्रोटीन के मामले में स्तनधारी एक्सप्रेस प्रणाली), विशेष रूप से पोस्ट के बाद से ऐसे ऑटो के रूप में अनुवाद संशोधनों या ट्रांस-फास्फारिलीकरण सामांयतः में होने वाली मतान्ध सबसे कुशलता से और उचित अपने पैतृक वातावरण में हो जाएगा । स्तनधारी कोशिकाओं की बड़े पैमाने पर संस्कृति से सीधे मतान्ध परिसरों का शुद्धिकरण भी वर्तमान में उत्तरदायी है.

IKK2/β के साथ काम करते समय, हमने देखा है कि यह homogeneously ऑटो phosphorylated एटीपी के साथ इलाज के द्वारा किया जा सकता है, और इस प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए उत्तरदायी बनाता है. इसी तरह, एटीपी के साथ IKK1 प्रोटीन की गर्मी, और परिणामी ऑटो-फास्फारिलीकरण, एक सक्रिय IKK1 जो घुलनशील था, और दोनों जैव रासायनिक लक्षण वर्णन और क्रिस्टल संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त उपज ।

अच्छी तरह से प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम-diffracting क्रिस्टल के लिए उपयुक्त प्रकार और Dextran सल्फेट अणुओं की एकाग्रता के अलावा विशेष रूप से, क्रिस्टल की स्थिति ठीक धुन था । घनत्व Dextran सल्फेट अणुओं बाध्य इंगित करता है, और इसके IKK1 पर परिणामी प्रभाव की संभावना सघन के लिए महत्वपूर्ण था ।

IKK1, जो अक्सर kinases में मनाया जाता है की अंतर्निहित लचीलापन, क्रिस्टलीकरण के लिए प्राथमिक निवारक है और अक्सर सक्रियण लूप के साथ कळेनासे डोमेन की सगाई करने के लिए जुड़ा हुआ है । IKK2 दोनों देशी (S177 और S181) और phosphomimetic (EE) सक्रियण लूप serines के रूपों के साथ सघन किया जा सकता है, लेकिन हम केवल के साथ क्रिस्टल प्राप्त IKK1/α के लिए एस ई उत्परिवर्ती संस्करण और वह भी केवल मतान्ध अवरोधक बारहवीं की उपस्थिति में । इन क्रिस्टल अच्छी तरह से संरचना दृढ़ संकल्प के लिए पर्याप्त diffracted केवल जब ठंड कमरे में हो (~ 4-6 ° c) । यदि हम किसी भी IKK1 homolog (या एक मतान्ध ortholog) के साथ इसी तरह जिद्दी व्यवहार मुठभेड़, हम विभिंन रीढ़ संशोधनों (विशेष रूप से सक्रिय साइट पाश serine अवशेषों जो आमतौर पर phosphorylated) की कोशिश कर सकते हैं । हम भी साथी प्रोटीन बातचीत की उपस्थिति में सह क्रिस्टलीकरण की कोशिश कर सकते हैं । मतान्ध परिवार के उन सहित कई kinases, साथी प्रोटीन के साथ बातचीत और उच्च क्रम परिसरों के भीतर रहते हैं ।

कई अवरोधकों में मदद की विभिंन स्थितियों में IKK2 क्रिस्टल का उत्पादन (जैसे, दोनों उच्च नमक के साथ, एक precipitant के रूप में खूंटी), दोनों में 18 डिग्री सेल्सियस, और ठंडे कमरे में । हालांकि, इसी तरह की शर्तों के तहत और अवरोधकों की एक किस्म के साथ, IKK1/α किसी भी क्रिस्टल का उत्पादन नहीं किया । इस प्रकार, अवरोधकों की एक बड़ी प्रदर्शनों का उपयोग निश्चित रूप से एक है कि क्रिस्टलीकरण सक्षम खोजने की संभावना में वृद्धि होगी ।

संरचना निर्धारण में एक और महत्वपूर्ण कदम सावधान क्रायो संरक्षण और डेटा संग्रह प्रक्रिया थी । कमजोर डेटा और एक्स-रे बीम में क्रिस्टल के तेजी से क्षय बड़ा क्रिस्टल और एक ही क्रिस्टल से एकाधिक डेटा सेट के संग्रह के लिए की आवश्यकता वारंट । उच्च सटीकता की एक उचित पूरा डेटासेट के बिना, हम एक आणविक प्रतिस्थापन समाधान प्राप्त करने में सफल नहीं हो सका ।

अंत में, हम आण्विक प्रतिस्थापन द्वारा IKK1/α की संरचना का निर्धारण करने में विफल से अधिक १०० ज्ञात IKK2/β संरचनात्मक मॉडल सार्वजनिक डेटाबेस में उपलब्ध से बनाया गया मॉडल का उपयोग कर । इस प्रकार, एक आणविक प्रतिस्थापन प्रक्रिया के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्राप्त करना चाहिए था । क्रायो उंहें नक्शा, उच्च सटीकता व्यक्तिगत डोमेन के संरचनात्मक मॉडल, साथ पहले से निर्धारित IKK2 संरचनाओं के तुलनात्मक अध्ययन के साथ हमें एक खोज मॉडल है कि हमें आणविक प्रतिस्थापन समाधान दिलवाया प्राप्त करने के लिए नेतृत्व किया ।

एक प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण स्वाभाविक यादृच्छिक है, तो ऊपर संरचित मार्गदर्शन के बाद के बावजूद, हम एक और IKK1 homolog या एक और पूर्ण लंबाई या काट मानव IKK1 के निर्माण सघन में समस्याओं का सामना हो सकता है । बावजूद, इन महत्वपूर्ण चरणों का ज्ञान एक शोधकर्ता को तर्कसंगत स्थिति है कि एक अच्छी तरह से diffracting मतान्ध क्रिस्टल प्राप्त करने की संभावना में वृद्धि होगी का पता लगाने के लिए सक्षम हो जाएगा ।

IKK1/α और IKK2/β प्रदर्शन समान डोमेन संगठन लेकिन भिन्न डोमेन संगठन
आश्चर्य की बात नहीं, दोनों IKK1/α और IKK2/β अपनाने एक उच्च समान डोमेन वास्तुकला उनके ऊंचे अनुक्रम समानता३३,४३से उपजी है । जैसा कि पहले दर्शाया गया है, IKK1/α और IKK2/β तीन अलग डोमेन में गुना: एन-टर्मिनल कळेनासे डोमेन, ubiquitin जैसे डोमेन (नबआं), और पाड़ dimerization डोमेन (SDD) । IKK1/α और IKK2/β form स्थिर dimers जिसमें सी-टर्मिनल हाफ SDD के dimerization भाग लेते हैं । डिमर गठन में शामिल अवशेष समान हैं । हालांकि, अंतर SDD/नबआं और केडी के बीच डोमेन बातचीत के बाद से इन विभिंन अवशेषों को शामिल कुछ अलग हैं । यह भी संभावना है कि IKK2/β से अलग करने के लिए IKK1/α में SDD करने के लिए कळेनासे डोमेन के सापेक्ष ओरिएंटेशन के कारण है । यह पूरी तरह से अप्रत्याशित नहीं था क्योंकि हम भी उपलब्ध IKK2/β डिमर मॉडल के बीच मतभेदों का पालन । मजे की बात है, IKK2/β dimers क्रिस्टल जाली में tetramers में व्यवस्थित कर सकते हैं भले ही इस tetramerization प्रवृत्ति समाधान में कमजोर है । तथापि, IKK1/α dimers गठन गरिएको अद्वितीय hexamers । इन hexamers भी समाधान में मनाया जाता है, हालांकि केवल IKK1/α dimers के एक छोटे से पूल hexamers के रूप में मौजूद हैं । ये सुझाव है कि hexamerization एक विशिष्ट और महत्वपूर्ण समारोह की संभावना है ।

कार्यात्मक अंतर संरचनात्मक मतभेदों से अंतर
IKK1/α और IKK2/β कक्षों में विशिष्ट फ़ंक्शंस निष्पादित करें । हालांकि, IKK1/α फ़ंक्शन और संरचना के बीच संबंध मायावी बनी हुई है । IKK1/α स्पष्ट रूप से विभिन्न रूपों में मौजूद है: मुक्त डिमर या hexamer के रूप में, और hetero के साथ एक अब तक विलक्षण IKK2-ट्रिमर परिसर के भीतर/β और निमो. चूंकि IKK2/β सक्रियण विहित संकेत द्वारा IKK1/α की आवश्यकता नहीं है, IKK1 में α/heterotrimer की कार्यात्मक भूमिका (विहित मतान्ध-परिसर) अस्पष्ट बनी हुई है । यह भी स्पष्ट नहीं है अगर IKK1/α के सक्रियकरण गैर द्वारा प्रेरित-विहित संकेत पर निर्भर करता है नि: शुल्क dimeric IKK1/α और/या hexameric IKK1/α । उत्परिवर्तन प्रयोगों से पता चलता है कि व्यवधान hexamer इंटरफ़ेस की दृढ़ता से गैर-विहित संकेत को प्रभावित करता है, hexamerization गैर-विहित संकेत के दौरान कुछ स्तर पर आवश्यक होने की संभावना है ।

IKK1/α संरचना का उपयोग छोटे अणु अवरोधकों डिजाइनिंग
IKK1/α की संरचना को जानते हुए हमें एक मोनोमर पर सतह पैच की जांच करने के लिए अनुमति देता है या अंतर-डोमेन या अंतर मोनोमर इंटरफेस है, जो छोटे अणुओं द्वारा लक्षित किया जा सकता है पर जेब । IKKs लंबे समय महत्वपूर्ण दवा लक्ष्य माना गया है । तथापि, सेलुलर homeostasis, जीव व्यवहार्यता, और प्रतिरक्षा सहित कार्यों की एक किस्म में इन kinases की अनिवार्यता यह बेहद मुश्किल है उंहें निशाना बनाता है । अब तक, कोई मतान्ध-लक्षित अणु पाया गया है कि रोगियों में सुरक्षित रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

IKK1/α और IKK2/β अक्सर उनके अवरोधकों द्वारा एक साथ लक्षित कर रहे हैं के बाद से उनके कळेनासे डोमेन अनुक्रम में और संरचना में अत्यधिक समान हैं । काफी अनुसंधान प्रयास विशिष्ट इन दो kinases में से केवल एक को लक्षित अवरोधकों को खोजने में खर्च किया गया है । फलस्वरूप, कई IKK2/β-विशिष्ट अवरोधों की खोज की गई है, जिनमें से कुछ IKK1/α फ़ंक्शन को प्रभावित नहीं करते । हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए कोई ऐसी यौगिक मौजूद है कि प्रभावी रूप से IKK1/α perturbing IKK2/β समारोह के बिना रोकता है । इस अनुपस्थिति IKK1/α पर संरचनात्मक जानकारी की कमी के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । हमारे संरचनात्मक और सेलुलर अध्ययन से संकेत मिलता है कि, हालांकि डोमेन व्यवस्था और वैश्विक उपइकाई संरचनाओं अत्यधिक इन दो प्रोटीन में समान हैं, वे अद्वितीय उच्च आदेश विशिष्ट सतह पैच३३रोजगार की व्यवस्था प्रदर्शित करते हैं । इन मतभेदों कि जुड़े प्रोटीन के साथ अलग बातचीत सक्षम उनके कार्यात्मक मतभेदों में अनुवाद करना चाहिए । हमें उंमीद है कि इन भेद IKK1 के बीच पता चला/α और IKK2/β अंतर और अंतर-उप इकाई बातचीत उपइकाई-विशिष्ट allosteric अवरोधकों बनाने के लिए शोषण किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अंय संघर्ष की घोषणा ।

Acknowledgments

हम विभिंन क्रिस्टल पर डेटा संग्रह के दौरान समर्थन के लिए उंनत फोटॉन स्रोत, Lemont, आईएल पर beamlines 19ID, 24ID, और 13ID में कर्मचारियों को धंयवाद । हम दिमित्री Lyumkis, सॉल्क संस्थान के लिए आभारी है उंहें कम संकल्प क्रायो em मानचित्र के प्रारंभिक दौर में उंहें मानचित्र/मॉडल निर्माण, जो प्रारंभिक IKK1 आणविक प्रतिस्थापन खोज मॉडल बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान NIH अनुदान AI064326, CA141722, और GM071862 से जीजी को धन प्राप्त हुआ है । एसपी का फिलहाल वेलकम ट्रस्ट डीबीटी इंडिया इंटरमीडिएट फेलो है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

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जैव रसायन १४१ अंक Serine-Threonine प्रोटीन कळेनासे IKK1/α NF-κB क्रिस्टल संरचना आणविक प्रतिस्थापन अवरोध करनेवाला
मानव IKK1 के उत्पादन, क्रिस्टलीकरण, और संरचना निर्धारण के लिए एक गाइड α/
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Polley, S., Huang, D. B., Biswas,… More

Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

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