Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Una guía para la producción, cristalización y determinación de la estructura de IKK1/α humano

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/56091
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

Summary

IκB cinasa 1/α (CHUK IKK1/α) es una Ser/Thr quinasa que participa en un sinnúmero de actividades celulares principalmente a través de la activación de factores de transcripción NF-κB. Aquí, describimos los principales pasos necesarios para la producción y determinación de estructura cristalina de esta proteína.

Abstract

Una clase de estímulos extracelulares requiere activación de IKK1/α para inducir la generación de una subunidad de NF-κB, p52, por medio del procesamiento de su precursor p100. p52 funciona como un homodímero o un heterodímero con otra subunidad de NF-κB, RelB. Estos dímeros a su vez regulan la expresión de cientos de genes implicados en la inflamación, la supervivencia de la célula y ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente asociado con IKK2/β y NEMO como un complejo ternario. Sin embargo, una pequeña piscina de la también se observa como un complex(es) de bajo peso molecular. Se desconoce si la actividad de procesamiento de la p100 es desencadenada por la activación de IKK1/α dentro del más grande o la más pequeña piscina complejo. Actividad constitutiva de IKK1/α se ha detectado en varios tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias. Para entender el mecanismo de activación de IKK1/α y permiten su uso como una diana farmacológica, expresamos IKK1/α recombinante en diferentes hosts, como e. coli, insectos y células de mamíferos. Hemos logrado expresar IKK1/α soluble en baculovirus infectan células de los insectos, obtener cantidades de mg de proteína de alta pureza, cristalización en presencia de inhibidores y determinar su estructura de cristal de rayos x. Aquí, describimos los pasos detallados para producir la proteína recombinante, su cristalización y su determinación de estructura cristalina por rayos x.

Introduction

Actividades transcripcionales de la familia del NF-κB de factores de transcripción dimérico son necesarias para diversas funciones celulares que van desde la inflamación y la inmunidad a la supervivencia y muerte. Estas actividades son rigurosamente controladas en las células y una pérdida de regulación conduce a diversas condiciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunes y cáncer1,2,3. En la ausencia de un estímulo, la actividad de NF-κB se mantiene inhibida de proteínas IκB (inhibidor de - KB)4. La fosforilación de residuos de Ser específicos en proteínas IκB marca por ubiquitinación y degradación proteasomal posterior o procesamiento selectivo5. Dos quinasas Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β y IKK1/α, actúan como reguladores de la central de actividades de NF-κB por llevar a cabo estos eventos de fosforilación6,7.

Interacción entre un ligando y un receptor transmite una señal a través de una serie de mediadores que conducen a la activación de factores NF-κB. El proceso de señalización de NF-κB se puede clasificar ampliamente en dos distintas vías – canónico y no canónico (alternativa)8. La actividad de IKK2/β regula principalmente la señalización de NF-κB de la vía canónica que es esencial para la respuesta inmune inflamatoria y naturales9. Una característica distintiva de esta vía es una activación rápida y de corta duración de IKK2/β10 dentro de un complejo de IKK desacostumbrado hasta entonces bioquímicamente — se presume para ser compuesto de IKK1 IKK2, como un componente regulatorio, NEMO (modulador esencial de NF-κB )11,12,13. Entre las dos subunidades catalíticas de IKK del complejo IKK, IKK2 es sobre todo responsable14 para la fosforilación de los residuos específicos del prototipo IκBs (α, - β y γ-) unido a NF-κB y también una proteína anormal de IκB, NF-κB1/p105, que es un precursor de la de subunidad p50 de NF-κB5. La fosforilación inducida por ubiquitinación y degradación proteasomal de IκB (o procesamiento de p105) conduce a la liberación y activación de un conjunto específico de NF-κB dímeros15. Actividad de NF-κB aberrante debido a función mal regulada de IKK2 se ha observado en muchos tipos de cáncer, así como en trastornos autoinmunitarios2,3,16.

A diferencia de IKK2/β, actividad de IKK1/α regula la señalización de NF-κB de la vía no canónica, que es esencial para el desarrollo y la inmunidad. IKK1 fosforila residuos específicos de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ, que conduce a su transformación y la generación de p52. La formación del heterodímero p52:RelB transcripcionalmente activo inicia una lenta y sostenida ante las señales del desarrollo7,17,18,19,20. Curiosamente, la generación de la central p52 de factor NF-κB de esta vía es críticamente dependiente de otro factor, cinasa de la inducción de NF-κB (NIK)21,22, pero no en IKK2 o NEMO. En las células de reclinación, el NIK sigue siendo bajo debido a su constante degradación dependiente del proteosoma23,24,25. Sobre el estímulo de las células por ligandos 'no canónico' y en ciertas células malignas, NIK se convierte estabilizado para reclutar y activar IKK1 / α. actividades quinasa de NIK y IKK1 son esenciales para la transformación eficiente de p100 en p527. IKK1 y NIK fosforilan tres serinas (Ser866, 870 y 872) de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ a su procesamiento y la generación de p52. Activación aberrante de la vía no canónica se ha implicado en muchas neoplasias como mieloma múltiple26,27,28.

Se conocen varios inhibidores altamente eficientes y específicos de IKK2/β, aunque ninguno hasta ahora han resultado para ser un fármaco efectivo. Por el contrario, los inhibidores específicos de IKK1/α son escasos. Esto puede deberse en parte a la falta de información estructural y bioquímica de IKK1/α, que limita nuestra comprensión de la base mecanicista de la activación de NF-κB por IKK1 en las células y el diseño racional de medicamentos. Las estructuras de rayos x de IKK2/β nos proporcionan penetraciones en el mecanismo de activación de IKK2/β29; sin embargo, estas estructuras no podían revelar cómo los diferentes estímulos arriba activar activación de IKK1/α o β/IKK2 regular conjuntos distintos de NF-κB actividades 30,31. Entender las bases mecanicistas subyacentes a la función de señalización distintiva de IKK1/α y para establecer una plataforma para el diseño racional de medicamentos, nos enfocamos en determinar la estructura de IKK1/α.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. preparación de Virus recombinante adecuado para la expresión a gran escala de IKK1/α

  1. Preparación de virus de P1 32
    1. Día 1: Las células Sf9 placa (~ 6 X 105) (paso número menos de 10) en 2 mL de medio de insectos celular de III Sf900 en cada pozo de una placa de 6 pozos e incubar a 27 ° C. Las células de paso al llegar a una densidad de 2 a 3 X 106 células / mL en suspensión diluyendo en medio fresco con una densidad de ~ 6 X 105.
    2. Día 2: Diluir 8 μl de reactivo de transfección Sf9 en 100 μl de medio de insecto Sf900 III o de gracia sin antibiótico y suero. Vortex brevemente.
    3. Diluir 1 μg de bacmid recombinante purificada kit (los detalles se proporcionan en 'Resultados del representante')32 en otro 100 μl del medio mismo, en un tubo separado.
    4. Combinar ADN diluido y el reactivo de transfección (μL volumen total ~ 210-220) e incube a temperatura ambiente durante 15-30 min.
    5. Retire el medio del pozo. Añadir 1 mL de medio fresco sin antibióticos y suero.
    6. Agregar la mezcla de reactivo de transfección de ADN diluida gota a gota en las células. Ajustar el tamaño de gota que Desaloje las células adherentes.
    7. Después de ~ 6 h, agregar 1,5 mL de medio fresco en la parte superior o quitarlo del medio y añadir 2,5 mL de medio fresco. Cálido medio fresco a 25-27 ° C antes de la adición.
    8. Incubar las células en 27 ° C. Compruebe los pozos periódicamente cada h ~ 12 signos de la infección viral. Llevar a cabo todos los mantenimiento Sf9 y expresión a 27 ° C.
    9. Día 5: Extraer el medio que contiene la infección de células 60-72 h post. Centrifugar durante 5 minutos a 500 x g a 4 ° C. Guarde el sobrenadante; se trata de la acción P1-virus. Congelación de pequeñas alícuotas a-80 ° C.
  2. Selección de la mejor expresión de clone de virus de P1.
    1. Células de la placa del mismo modo como se describe en el paso 1.1.
    2. Siguiente día o ~ 6 h post chapado, añadir 20 μl y 50 μl de los diferentes stocks de clon P1 virus en las células en diferentes pozos.
    3. Desalojar las células adherentes mediante pipeteo suave y cosecha la infección de las células infectadas 60-72 h post por centrifugación durante 5 min a 500 x g a 4 ° C. Guarde el sobrenadante. Se trata de la acción de virus P2. Almacenar pequeñas alícuotas del stock a-80 ° C.
    4. Añadir 100 μl de buffer de x Laemmli SDS 2 al precipitado de células cosechadas. Calor en > 95 ° C durante 10 minutos la centrifugadora (típicamente > 10.000 x g) durante 5 minutos.
    5. Ejecutar 10-15 μl de cada muestra en 8-10% SDS-PAGE en 120-160 V hasta que el frente de tinte alcanza la parte inferior del gel.
    6. Electro-transfiera las proteínas resueltas por estándar semi seco transferencia protocolo (20 V, 30 a 45 min.) sobre una membrana de nitrocelulosa/PVDF.
    7. Blot con anticuerpos anti-IKK1 (dilución ~ 1:2, 000, debe ser optimizada) o anticuerpos anti-PentaHis (dilución ~ 1:3, 000, debe ser optimizada) para la expresión.
    8. Elegir el mejor clon de virus P1 comparando la expresión de IKK1 recombinante.
  3. Preparación de la acción de virus de P3 a gran escala.
    1. Células de la placa semejantemente como se describe en el paso 1.1 en una placa de 15 cm que contiene 25-30 mL de medio de Sf900 III.
    2. ~ 6 h post chapado, añadir 150-300 μL del stock de virus P1 mejor expresión en las células.
    3. Después de 72 h post infección, aspirar el medio cuidadosamente de la placa en un tubo adecuado (estéril) y centrifugar el tubo a 500-1000 X g por 10 min a 4 ° C. Descarte el precipitado de células (si uno es formado) y guarde el sobrenadante. Se trata de acciones de virus P3.
  4. Determinar el título de virus óptima para la expresión de proteínas a gran escala
    1. Células en 2 mL de medio de Sf900 III, como se describe en 1.1, en una placa de 6 pozos en la placa.
    2. Añadir 20, 30, 40 y 50 μl de P3 stock de virus en separado pozos ~ 6 h post chapado. Incluir un control no infectado.
    3. Cosechar las células de cada infección de post bien 48-60 h.
    4. Añada 100 μl de Tampón Laemmli SDS de X 2. Calor en > 95 ° C durante 10 minutos, centrifugar (típicamente a 14.000 x g) durante 5 minutos.
    5. Resolver 10-15 μl de cada muestra en un gel de SDS-PAGE 8-10%.
    6. Transferencia de proteínas resuelta a una membrana de nitrocelulosa/PVDF como se menciona en 1.2.6.
    7. Blot con anticuerpos anti-IKK1 (dilución ~ 1: 2000, debe ser optimizada) o anticuerpos anti-PentaHis (dilución ~ 1: 3000, debe optimizarse).
    8. Usar el virus con el mejor expresar el título de expresiones de gran escala.

2. escala expresión de 6 x su etiquetado IKK1 humana29,33

  1. Llevar a cabo la expresión a gran escala en una cultura de la suspensión. Dividir celdas en 1 L de medio Sf900 III en un matraz de Erlenmeyer de 2 L con tapa de ventilación. La densidad de células debe ser ~ 5 x 105 células/mL.
  2. Crecer estas células en suspensión a ~ 100 rpm a 27 ° C en un agitador durante 2 días hasta alcanzar una densidad de 1-2 x 106/ml. Densidad celular no debe exceder 2 x 106/ml.
  3. Agregue la cantidad deseada de virus P3, evaluada en 1.4.
  4. Crecer la cultura infectada por 48-60 h a ~ 100 rpm a 27 ° C en un agitador.
  5. La cosecha de las células por centrifugación a < 1.500 x g a 4 ° C.
  6. Guarde el precipitado de células y descartar el medio.
  7. Proceder a la purificación de la proteína directamente. Flash freeze el precipitado de células en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C para su uso futuro.

3. purificación de su IKK133

  1. El día 1, Resuspender el precipitado de células en 40 mL de tampón de lisis (25 mM Tris, pH 8.0, de 0.2% NP-40, 200 mM NaCl, imidazol de 10 mM, 10% glicerol, 5 mM β-mercaptoetanol y cóctel del inhibidor de la proteasa).
    Nota: El líquido precipitado masa no fue determinada. Por lo general, L ~ 2 de cultura fue utilizado para este paso.
  2. Lyse las células por sonicación en ciclos de trabajo de 60-70%, 5-10 pulsos de 30 duración de s en un intervalo de > 1 minuto, manteniendo la suspensión de células enfriada en hielo.
    Nota: Este paso requiere optimización con cada modelo del sonicador. No permita que la muestra caliente por encima de 10 ° C.
  3. Aclarar el lisado por centrifugación a ≥ 28.000 x g durante 45 minutos a 4 ° C.
  4. Equilibre los 4 mL de agarosa Ni-NTA resina con tampón de lisis y mezcla el clarificado lisado (sobrenadante) siguiendo el protocolo del fabricante.
  5. Permiten que la proteína atar la resina por incubar por 2 h en un mezclador rotatorio en una habitación de 4 ° C.
  6. Lave bien la resina con el tampón de lisis que contienen imidazol de 30 mM. Compruebe la concentración de proteína en la fracción de lavado periódicamente con análisis de Bradford. Lavar hasta que la concentración de proteína en la fracción de lavado llega a 0.1 mg/mL. Generalmente > 20 volumen de cama de tampón de lavado es necesaria para llegar a este punto.
  7. Eluir la proteína de su etiquetado IKK1/α bajo flujo por gravedad, utilizando 20 mL de tampón de elución (el tampón de lisis que contienen imidazol de 250 mM). Recoger fracciones de 1-1.5 mL.
  8. Compruebe la pureza de proteínas eluídas en un gel de SDS PAGE 8 o 10% por la carga de 5-10 μL de muestra de todas aquellas fracciones mezclados con Tampón Laemmli.
  9. Piscina fracciones de pico (concentración ≥ 2mg/mL) y medir la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford.
  10. Digestión con TEV (1:30-50 (TEV proteasa: IKK1)) proteasa durante la noche (≥12 h) a 4 ° C.
    Nota: Optimizar la cantidad de proteasa TEV necesario para completar la digestión (≥ 95%) del tag X su 6 a priori. Proteasa TEV fue purificada en casa.
  11. En la mañana del día 2, incubar la proteína, con 1 mM ATP en presencia de 20 mM de MgCl2, glicerofosfato-β de 20 mM, 10 mM NaF y 1 mM ortovanadato de sodio por 1 h a 27 ° C.
  12. Filtrar la solución de la proteína a través de un filtro de 0.45 o 0.22 μm.
  13. Carga de 6 mL de la muestra en una columna preparativa de exclusión de tamaño ~ 120 mL conectada a un sistema automatizado de la cromatografía líquida. Equilibrar la columna con tampón A (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 5% glicerol), previo a la aplicación de la muestra de proteína.
    Nota: Podría utilizarse una columna más pequeña dependiendo de la producción de la proteína después del paso de purificación Ni-NTA afinidad. Ajuste/calcular el volumen de la carga para ser el 5% de volumen de columna).
  14. Ejecutar la cromatografía por exclusión de tamaño en un caudal de 1 mL/min y monitorear la elución a 280 y 254 nm. Recoger fracciones de tamaño de 2 mL.
  15. Compruebe la pureza de las fracciones de pico (típicamente alrededor de ~ 60-70 mL) en un gel de SDS-PAGE 8-10%.
  16. Piscina las fracciones puras (pureza ≥ 95% con una concentración de ≥0.5 mg/mL) y se concentran en un kDa 10 o 30 kDa peso molecular de corte proteína centrífugos concentrador de oxígeno siguiendo las instrucciones del fabricante.
  17. Periódicamente Compruebe la concentración de proteína del concentrado por el método de Bradford y concentrar la muestra hasta 8-12 mg/mL.
  18. Dispensar 25 alícuotas μL y flash congelación en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras congeladas flashes en el congelador de-80 ° C.

4. pantalla para la condición de la cristalización de IKK1

  1. Calcular la cantidad total (en volumen) de la proteína necesaria para la pantalla de cristales siguiendo los métodos descritos a continuación.
  2. Probar diferentes inhibidores (inhibidores de la cinasa genérico: AMPPNP y estaurosporina; IKK-specific inhibidores: MLN120B, compuesto A y XII IKK-inhibidor) para realizar la proyección para la cristalización. Hacer soluciones de estos compuestos siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que la máxima concentración del compuesto en la solución no exceda de 20 μM.
  3. Preparar el IKK:inhibitor complejo para la pantalla de la cristalización de mezcla 100 μM de IKK1 con inhibidor μM 200 e incubar a 18-20 ° C por 30-40 min centrifugar esta mezcla en > 15.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Guarde el sobrenadante para pantalla de cristalización.
  4. Utilice las pantallas de cristalización comercialmente disponibles (véase la Tabla de materiales).
  5. Pipetee 80-100 μL de cada reactivo de la cristalización (soluciones de depósito), utilizando una pipeta multicanal o un robot, en el depósito de una placa de 96 pocillos. La placa está lista para configurar gotas. Asegúrese de que la placa contiene cristalización de 2 a 3 gotas para que inhibidores de 2 a 3 pueden ser examinados en una sola placa.
  6. Usando un robot de cristalización, dispensar y mezclar 0,2 – 0,25 μL de IKK1:inhibitor complejo con el mismo volumen de solución de reserva.
    Nota: Proyección puede realizarse manualmente con volúmenes de gota más grandes (0.5-1.0 μL de IKK1:inhibitor complejo con el mismo volumen de solución de depósito). Sin embargo, el uso de un robot ayudaría a ahorrar reactivos valiosos.
  7. Sellar las placas inmediatamente después de fijar las gotas con películas ópticamente transparente para evitar la evaporación. Sellar correctamente con aplicador apropiado. Hacer placas de réplica para cada conjunto de inhibidor. Incubar una placa en 18 ° C y el otro en la cámara fría (temperatura ~ 4 – 6 ° C). Asegúrese de que las incubadoras no son afectadas por vibraciones.
  8. Utilice un estereomicroscopio con un polarizador para verificar la aparición de cristales en cada gota cada día durante los primeros siete días y luego en intervalos más largos. Sistemáticamente en cuenta y anotar estas observaciones.
    Nota: Use un estereomicroscopio con un polarizador para que puedan evaluarse visualmente los defectos de crecimiento de cristales. Aquí, cristales aparecieron en una condición donde la solución de depósito contenía 3% w/v Dextran sulfato sódico sal Mr 5.000, 0.1 M pH BICINA 8.5, 15% p/v polietilenglicol 20.000. Cristales de IKK1 creció solamente en presencia de inhibidor de la IKK XII.

5. cristal crecimiento optimización29,33

  1. Preparación de soluciones madre.
    1. Preparar 30% w/v soluciones de sulfato de dextrán de diferente peso molecular (promedio MW 5.000, 8.000, 15.000, 40.000 Da) desionizada H2solución O. filtro 0,22 μm filtros.
    2. Preparar las acciones 1 M y 0,5 M de buffers diferentes en el rango de pH de 6.5 a 9. Filtro de 0,22 micras filtros soluciones.
    3. Preparar 25% o 50% (w/v) soluciones de PEG de diferente peso molecular (promedio MW:1000, 1.500, 3.350, 4.000, 6.000, 8.000, 10.000, 12.000, 20.000 Da). Filtro de 0,22 micras filtros soluciones.
    4. Realizar una pantalla de la rejilla variando sistemáticamente pH, buffer tipo, concentración y tipo de clavija y sulfato de dextrano.
  2. Optimizar la proyección a 18 ° C tanto en la cámara fría (temperatura ~ 4-6 ° C).
  3. Mezclar una cantidad igual de la IKK1:Inhibitor complejo con solución bien e incubar en la solución bien en un ambiente sellado. Este paso puede realizarse manualmente o usando un robot de dispensación.
    Nota: Aquí, los cristales más grandes y bien definidos (según lo determinado por el color uniforme bajo el polarizador que indica un crecimiento uniforme) se obtuvieron las siguientes condiciones: 100 mM BisTris pH 7.0, 2.8-3.5% de sulfato de dextrano (promedio MW 15 kDa), 8.5-10% PEG 20 kDa en la cámara fría.

6. crecimiento de cristales en grandes cantidades

  1. Preparar las siguientes soluciones stock y filtrar a través de 0.22 μm filtro.
    1. Preparar BisTris de 0,5 M pH 7.0 y BisTris propano pH 7.0 y 7.5.
    2. Preparar el 30% (p/v) sulfato de dextrán (promedio MW ~ 15 kDa). Almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar 50% PEG (promedio MW ~ 12 kDa).
  2. Uso bien de 24 placas de gota colgantes.
  3. Aplique grasa sellante en los anillos de levantado de cada pozo.
  4. Preparar la solución bien como sigue (concentración final): 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2.8 – 3.5% sulfato de dextrán ~ 15 kDa, 8,5 – 10% PEG ~ 12 kDa. Preparar 1 mL de solución bien en tubos de 1,5 mL.
    Nota: Se observó una menor variación en condiciones de cristalización dependiendo de la cantidad de proteína, o sulfato de dextrano, así un ensayo de un margen estrecho es recomendable. BisTris y BisTris búferes de propano de la misma gama de pH producción de solos cristales.
  5. Mantener las soluciones bien y placas engrasadas en la cámara fría durante al menos 1 h.
  6. Preparar IKK1:Inhibitor complejo como se describe en 4.3. Transferir las soluciones bien de tubos de 1,5 mL a los pozos individuales de la placa de la pozo 24.
  7. Limpia siliconado (comercial o interno (siliconization/silanización)) vidrio cubreobjetos usando trapos libres de pelusa y aplicar chorros de aire de alta presión localizada con plumero aerosol disponibles en el mercado.
  8. Coloque 1 – 1,5 μL de solución bien en un cubreobjetos limpio. Pipeta un volumen igual de complejo de IKK1:inhibitor, mezcle suavemente mediante pipeteo arriba y abajo 3 - 4 veces. Gire el vidrio cubreobjetos y colocar en el respectivo bien con pinzas y sellar el pozo presionando en la grasa.
  9. Después de configurar todas las gotas de una placa de 24 pocillos, Incube la placa en la cámara fría en la oscuridad. Verifique ocasionalmente las gotas bajo un microscopio para el aspecto y crecimiento de cristales.
    Nota: no se ha sido probado si incubar las placas de cristal a la luz cambiaría el resultado. Sin embargo, es fundamental que las placas se incuban en un medio ambiente con la vibración mínima/no.

7. crio protección de cristales

  1. Preparación de soluciones de cryo.
    1. Preparar A Cryo (~ 2% Dextran Sulfato, ~ 10% PEG 12000, BisTris propano (del mismo pH la solución bien previsto), de 60 mM 5 mM Tris, pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 2.5% glicerol).
    2. Preparar B Cryo (~0.3% sulfato de dextrán, ~ 10% PEG 12000, BisTris propano (del mismo pH la solución bien previsto), de 60 mM 5 mM Tris, pH 7,5, 40-50 mM NaCl, 20 o 25% glicerol o 20 o 25% glicol de etileno).
      Nota: Pruebe diferentes cryo-protectores además de glicerina y glicol de etileno (por ejemplo, PEG 400, PEG 200, PEG 1000, PEG MME 550).
  2. Suavemente Retire los cubreobjetos de vidrio que contiene el cristal y coloque sobre una superficie sólida con la gota de cristal hacia arriba. Suavemente agregar 10 μL de solución de Cryo A encima de la gota y suavemente mezclar mediante pipeteo para que no se toca el cristal.
    Nota: Esto limpia la superficie de cristal de escombros y ayudar a equilibrar el cristal con el buffer inicial crio. Evitar el estrés mecánico y térmico del cristal. Realice todos los pasos subsiguientes bajo el microscopio para evitar daños en el cristal.
  3. Lentamente retire un poco de líquido de cristal y mantener sobre 5-8 μL de la solución. Evitar la deshidratación del cristal. Tenga mucho cuidado para evitar estrés mecánico y deshidratación del cristal en todos los pasos posteriores.
  4. Suavemente agregar 2.5 – 4 μL de la solución de Cryo B sobre la gota, suavemente mezclar mediante pipeteo. Cubrir con una pequeña placa de Petri para evitar corrientes de aire sobre el cristal. Espere 5 minutos siempre asegúrese de que el cristal no sufre rápidos cambios de presión osmótica o la deshidratación.
  5. Repita el paso 7.4 cuatro veces para aclimatarse lentamente el cristal en la solución de cryo.
  6. Mantener 10-20 μL de la solución de crio en esta etapa (es decir, permitir que el cristal a ser bañado en un 20-25% solución con crio-protector). Remoje durante diferentes periodos de tiempo (5 min a 1 h) en el cryo-la solución final.
  7. Congelación de múltiples cristales en diferentes puntos del tiempo.
  8. Cuidadosamente escoge un solo cristal de la gota en un crio-bucle adecuado montado sobre una base adecuada y congelación de inmersión en líquido N2. Realizar este paso sin problemas y rápidamente para evitar la formación de hielo en el cristal.
    Nota: Escoger el cristal con un diámetro de lazo ligeramente más grande que el eje mayor del cristal por lo que puede ser montado en el goniómetro robótico utilizado en avanzada del fotón fuente, laboratorio nacional de Argonne.
  9. Almacenar el cristal que contiene bucles de crio en discos sumergidos en líquido N2. Guardar estos discos en líquido N2 matraz Dewar hasta que estén listos para su envío por difracción de rayos x en el sincrotrón. Proceder a la recogida de datos de difracción de rayos x y procesamiento (secciones 8 y 9).
    Nota: Datos de difracción de cristales IKK1 de casa fuentes de rayos x no fueron de resolución lo suficientemente alta para ensayos de determinación de estructura, aunque se indica la calidad de los cristales para ser proyectada en el sincrotrón. Todos los datos de difracción se recolectaron en diferentes líneas (principalmente 19ID) del avance del fotón fuente, laboratorio nacional de Argonne, Estados Unidos.

8. rayos x recolección de datos

  1. Recopilar datos de difracción de rayos x en la línea ID19 de la fuente del sincrotrón APS, con datos remotos colección software34.
    Nota: Más de 100 cristales fueron probados por sus propiedades de difracción. Los cristales difractada rutinariamente a una resolución de 7-11 Å, solamente raramente cristales difractada a más allá de 5 Å fueron observado y sólo un gran cristal difractado más allá de 4.5 Å. Puesto que los cristales decayeron rápidamente durante la recolección de datos, se recolectaron datos en diferentes partes del mismo cristal. Esto fue posible ya que los cristales eran grandes (mayor a 400 μm), y el diámetro de la viga utilizado fue 100 μm.

9. radiografía de procesamiento de datos

  1. Combinar los conjuntos de datos recogidos en diferentes partes del mismo cristal34.
    Nota: siete conjuntos de datos fueron combinadas de cristal mejor y los datos resultantes fueron 93% completado. El general fue de σ ~ 6.8) y Rmerge fue de 89% en el compartimiento de resolución más alta (4.5 5.4 Å).
  2. Conjuntos de datos de proceso con HKL200034 grupo espacio, dimensiones de la celda unidad, contenido solvente y plausible composición de la unidad asimétrica.

10. estructura solución

  1. Preparación de modelos de búsqueda
    1. Basado en modelos estructurales de hIKK2 (pdb id 4E3C y 4KIK35), genera una serie de dímeros con diferentes orientaciones del KD del N-terminal (que representa una apertura de 30 y 62 Å, entre P578 de dos KD en el dímero). Ninguno de estos modelos trae una solución de búsqueda de reemplazo molecular después de pruebas extensivas.
    2. Generar un mapa de IKK1 de la solo-partícula cryo-EM datos33.
    3. Generar un modelo de IKK1 humano de la más alta estructura de resolución de IKK2 (pdb id 4KIK).
    4. Muelle los dominios individuales del modelo humano de IKK1 en el crio EM mapa de densidad de IKK1 humano con FOCHA36. Esto gira la orientación de KD aproximadamente 24 grados y había modificado el N-terminal de apertura a ~ 58 Å.
    5. La orientación de KD del modelo cryo-EM equipada (monómero) se aplican a todos los dímeros en 10.1.1.
  2. Reemplazo molecular
    1. Uso de dímeros de 10.1.1 y 10.1.5 como modelos de búsqueda en programas PHASER37, MOLREP38 y39,de CNS40.
      Nota: Aquí, utilizando uno de los dímeros de 10.1.5 (52 apertura de Å) como un modelo de búsqueda, seis dímeros (dos hexamers) fueron situados en la unidad asimétrica utilizando MOLREP. El 52 Å en el modelo de búsqueda es similar a la apertura de Å de 49-50 de dímeros (todos seis dímeros) en la estructura refinada.

11. refinamiento de la estructura

  1. Procedimiento de refinamiento de estructura
    1. Fijar la orientación y posición de este modelo inicial por refinamiento de cuerpo rígido en el CNS (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Refinar la estructura más lejos usando minimización y recocido simulado con una función de objetivo de máxima verosimilitud y rectificación plana a granel-solvente el CNS sistema39,40.
    3. Construir el modelo basado en 2FO-FC y Fo-Fc mapas usando Xtalview41.
      Nota: Se aplican DEN-asistida refinamiento42 y NCS restringir durante los refinamientos para mayor precisión del modelo. De hecho, refinamiento DEN mejoró dramáticamente geometrías y R-factores de la estructura y el factor R fue del 22.2% y factor R libre fue de 27,8% para el modelo final. La mejora dramática de la R libre debe ser debido al modelo de alta precisión de IKK1 dominios que se generaron a partir del modelo de IKK2 (4KIK).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Clonación y expresión de diferentes construcciones de IKK1/α
Longitud total que ikk1/α humana fue clonada en el pFastBacHTa de vector de expresión de baculovirus en sus sitios de restricción EcoRI y NotI para obtener un N-terminal hexa-histidina tagged IKK1. La etiqueta podría ser quitada por la digestión de proteasa TEV. Longitud total IKK1/α contiene regiones flexibles en ambos extremos, y regiones flexibles generalmente representar una proteína difícil de cristalizar, nos clonaron varios fragmentos truncados de IKK1/α dentro de los sitios mencionados de pFastBacHTa vector. Se generaron varios mutantes de truncamiento de IKK1/α con wild-type (wt) y S176E, 180E backbones (EE). EE de IKK1/α se refiere a la mimética de la forma constitutivamente activa de la quinasa fosforilada. Producción de baculovirus recombinantes y expresión de la proteína se realizaron utilizando un protocolo previamente publicado con modificaciones menores43 (figura 1).

Dificultad en la cristalización de IKK1/α
Humanos IKK2/β y IKK1 son homólogas, y pudimos cristalizar diferentes versiones de IKK2/β humana en diferentes condiciones diferentes, esperábamos IKK1/α a cristalizar en condiciones similares utilizando estrategias similares. Sin embargo, después de ensayos extensos con varias variantes de IKK1, se obtuvieron cristales con sólo un constructo truncada (IKK1 10-667 EE) (figura 2) y que también sólo en presencia de la IKK inhibidor XII44 que muestra adecuada Propiedades de difracción de rayos x.

Solución de la estructura
Cristales IKK1/α sufrieron de muchos problemas de crecimiento, y los datos muestran a menudo mosaicity muy alta. Embalaje de cristal débiles asociados con gran contenido de solvente y la naturaleza dinámica del monómero IKK1/dimer son la probable razón de esto. Para evitar estos problemas, laboriosos esfuerzos fueron tomados para obtener los cristales mejor posible, y el procedimiento de criopreservación fue realizado con mucho cuidado bajo diversas condiciones y con varios búferes de cryo-conservante. Los datos también fueron recogidos con máxima precisión para minimizar el daño de rayo. Puesto que los cristales eran grandes (mayor dimensión a menudo superior a 400 micras), diferentes áreas de los cristales de la misma fueron expuestas al haz de rayos x para recoger múltiples conjuntos de datos. Esto permitió diferentes conjuntos de datos para escalar y obtener un conjunto de datos razonablemente completa con mayor redundancia y minimiza el error. Remojo con átomos pesados, o átomo pesado racimos (por ejemplo, Tabris y TAMM), causado los cristales para difractar inadecuadamente. Aunque podríamos localizar la posición de Tabris racimos en datos derivados, la mala calidad de los datos además de la no-isomorphocity proporciona poca, o ninguna, información de fase.

Procesan conjuntos de datos con HKL2000 usando varios parámetros disponibles. El patrón de difracción reveló que el cristal pertenece al espacio grupo P21 con dimensiones de la celda unidad un = 174.51, b = 186.94, c = 275.83 Å y β = 98,84 grados. Utilizamos principalmente I / σ para estimar el corte y probar diferentes cortes para las bases de datos. Se obtuvieron un conjunto de datos combinado de 4.5 Å resolución de 4 de los 7 conjuntos de datos de difracción recogido en un cristal. Decidimos mantener los datos hasta 4.5 Å de inspección visual del mapa de densidad final. Puede ser que vale la pena utilizar CC1/2, ya que se puede estimar analíticamente CC del conjunto combinado de datos contra las intensidades (generalmente inapreciable) verdadero usando CC *45. Debido a la gran unidad celda combinada con la baja simetría del grupo espacial, previmos la unidad asimétrica para contener 12 a la 24 moléculas basadas en un contenido solvente de 70% a 40%.

El efecto combinado de baja resolución, datos de rayos x con intensidades débiles (es decir, errores significativos en los datos) (figura 3), gran cantidad (12) de las moléculas de IKK1 en la unidad asimétrica y la variación conformacional de IKK1 monomérica/dimérico modelo Comparado con el conocido IKK2 modelos, impidió inicialmente obtener una solución de recambio molecular IKK1, y determinando su estructura.

IKK1/α y β/IKK2 contienen un dominio de la cinasa (KD), un dominio de ubiquitin-like (ULD) y un dominio de dimerización de andamio a-helicoidal (SDD). La estructura de IKK1 reveló que forma dímeros semejantemente a IKK2 utilizando una interfaz de la subunidad casi idéntica de la región distal de la SDD. Sin embargo, dímero de IKK1 muestra un posicionamiento relativo significativamente diferente del KD N-terminal en relación con SDD + ULD comparado con en dímeros de IKK2 conocidos. Diferentes estructuras de IKK2 antes indican diferente orientación intermonomer dentro de sus dímeros (figura 4panel A), por lo que las distancias entre los carbonos alfa de P578 en el KD dos en cuatro modelos diferentes dimer variaron entre 39 y 61 Å. Puesto que las secuencias de estas dos kinasas son muy similares y residuos en la interfaz de dimer son idénticos, previmos que ikk1/α forma un dímero similar; sin embargo, puesto que existen diferencias significativas en los residuos de la interfaz de KD-SDD (p. ej., W424 y F111 en IKK2 es V y P respectivamente), prevé tal vez una pero diferente orientación de KD en IKK1. De hecho, estructura de IKK1/α indica que las orientaciones relacionadas de KD a SDD es única, y se desvía de los modelos conocidos de IKK2/β. Más de cien dímero se utilizaron modelos como modelos de búsqueda en programas de PHASER, MOLREP y CNS sin éxito, lo que indica la necesidad de un modelo de búsqueda bastante exacta para el éxito de los ensayos de reemplazo molecular, especialmente con nuestros datos de baja resolución. Un modelo de monómero tiene muy poca masa para recoger cualquier solución en los datos de difracción débiles de la gran unidad asimétrica que contiene 12 monómeros. Además, la inclusión o la omisión de agua en el modelo de búsqueda no hecho ninguna diferencia en las búsquedas de reemplazo molecular, especialmente debido a los datos de difracción débiles. CC1/2 y CC * indica que datos hasta 4.5 Å están bastante precisos. Se utilizó un corte conservador resolución de 4.5 Å basado en I / σ de 1.5. Los conjuntos de datos con cortes de diferente resolución no mostraron ninguna diferencia marcada durante operaciones de búsqueda de reemplazo molecular y mapas finales refinados contra estos conjuntos de datos no mostró ninguna mejora distinto en características de mapa en extender la resolución recortes de madera. La versión final del modelo es bastante exacta, más de lo que podría ser construido desde la densidad sola, derivado probable puesto que fueron construidos los modelos de reemplazo molecular inicial de modelos con una alta resolución de datos y utilizamos el mapa densidad cryo-EM a verificación de las características del mapa, sobre todo en regiones donde los mapas eran poco claros.

En retrospectiva, la obtención de un modelo de búsqueda fue posible sólo debido a la disponibilidad del mapa de cryo-EM de baja resolución y un modelo de más alta exactitud de IKK1 dominios que podrían generarse basado en alta resolución IKK2 estructura (figura 4 panel B). Podríamos atracar los dominios IKK1 en el mapa de cryo-EM de IKK1 obtener un modelo razonablemente cerca dimer. El modelo inicial indica una orientación de KD gira alrededor de 24 grados en relación con la de un monómero de IKK2 y N-terminal apertura de 58 Å (entre P578 de dos KDs en un dimer). Nuestro conocimiento previo de diversas estructuras de dímero de IKK2/β (y su variación) nos permitieron afinar el modelo de búsqueda cambiando las aberturas entre 62 30 Å. usando uno de los dímeros (52 Å abertura) como un modelo de búsqueda, localizamos seis dímeros en la unidad asimétrica con Programa de MOLREP46. Estos seis dímeros están organizadas en dos hexamers en la unidad asimétrica, y el disolvente calculado tiene un volumen de 68%.

Figure 1
Figura 1: purificación de IKK1. (A) expresión de IKK1 (10-667) en células de los insectos. (B) un diagrama de flujo para la purificación de IKK1; (C) gel de un SDS-PAGE que muestra la pureza de IKK1 después del paso de cromatografía de afinidad Ni-NTA. Perfil de exclusión de tamaño (D) que indica dímero de IKK1. (E) gel de SDS-PAGE con pureza de IKK1 de las fracciones de tamaño-exclusión de pico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: morfología y tamaño de los cristales de IKK1. (A) un cristal de IKK1 construir 10-667; la disminución de cristalización también muestra cristales de otra morfología (placas delgadas) que difractan no bien. (B) el zoom a la vista el cristal que difractada a más allá de 5 Å. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3:. Datos cristalográficos obtenidos de IKK1 cristales. (A) Perfil de difracción de radiografía de un cristal de IKK1 indicando propiedades pobre difracción de cristales IKK1 típicos. (B) HKL2000 una escala estadística del combinado conjunto de datos utilizado para la determinación de estructura de IKK1 y redundancia de los datos. R lineal = suma (ABS (-< i >)) / suma (I), Plaza de R = suma ((I - < i >) ** 2) / SUM (me ** 2), Chi ** 2 = suma ((I - < i >) ** 2) / (Error ** 2 * N / (N-1))), CC1/2 = coeficiente de correlación, CC * = coeficiente de correlación de dataset combinado contra la verdadera intensidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: preparación de modelos de búsqueda. (A) diferentes modelos de dímero de IKK2 indicando diferentes orientaciones del KD en relación con SDD (dando lugar a diferentes de separación entre dos KD); Estos modelos fueron probados inicialmente para encontrar una solución de recambio molecular sin ningún éxito. (B) generación de IKK1 modelos búsqueda - mapa de Cryo-EM del dimer de IKK1 11 resolución Å; EM-mapa equipado modelo inicial de búsqueda de IKK1, dominios individuales se basan en modelo de IKK2 (4KIK); Un IKK1 búsqueda modelo más ajustado de Bellas (orientación apropiada del KD) basado en varias posibilidades como juzgado de IKK2 modelos descritos arriba en 4A; Superposición de mapa EM dispone de modelo al modelo de búsqueda que cedió a la solución de reemplazo molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Solución de producción, estructura y cristalización de dos proteínas relacionadas de IKK
Nos propusimos para determinar la estructura de cristal de rayos x de IKK1/α con la idea de que sería un ejercicio relativamente sencillo dado nuestra experiencia con la producción de proteínas, cristalización y determinación estructural de IKK2/β. Sin embargo, nos quedamos muy sorprendidos que estas dos proteínas relacionadas se comportaron muy diferentemente con respecto a la facilidad de cristalización. A pesar de los esfuerzos de varios laboratorios de alto perfil, la determinación de la estructura de IKK1 tomó casi dos décadas. Esto en gran parte surgió de unos cuellos de botella claves.

La primera dificultad fue obtener un formulario de alta pureza y solubilidad de la proteína. El sistema de expresión celular de insectos nos permitió obtener cantidades de mg de proteína pura que fue razonablemente soluble. En relación con el nivel de expresión, todas las construcciones IKK1/α expresan en niveles mucho más bajos de IKK2/β construye en sistemas de expresión de células de insecto. Cabe señalar que ni la proteína es soluble y funcionales cuando se expresan en e. coli. En un sistema de expresión celular de insectos, fragmentos de IKK2/β expresados en altos niveles entre 10 y 30 mg/L de cultivo dependiendo de las construcciones. En contraste, se pudieran generar construcciones IKK1/α sólo en el 0.5 a 2.0 mg/L de la cultura. La razón de esta diferencia es todavía desconocida para nosotros. También debemos tratar de expresión de IKK1 en células nativas de host (es decir, sistema de sobreexpresión mamíferos en el caso de una mamífera proteína IKK), especialmente a partir de las modificaciones post-traduccionales como auto - o trans-la fosforilación que ocurre comúnmente en IKK se producirá más eficaz y adecuadamente en su ambiente nativo. Purificación de complejos IKK directamente del cultivo a gran escala de células de mamífero también es actualmente favorable.

Mientras trabaja con IKK2/β, nos dimos cuenta de que puede ser homogéneo auto-phosphorylated por el tratamiento con ATP, y esto hace que la proteína sea favorable a la cristalización. Del mismo modo, la incubación de la proteína IKK1 con ATP y la auto-fosforilación resultante, rindieron un IKK1 activado soluble y adecuado para la caracterización bioquímica y determinación de estructura cristalina.

Un paso crítico para obtener cristales bien diffracting era ajustar las condiciones de cristalización, en particular la adición del tipo apropiado y concentración de moléculas de sulfato de dextrano. Indica que la densidad de moléculas de sulfato de dextrano enlazadas, y su efecto resultante sobre IKK1 era probable crítica para la cristalización.

La flexibilidad inherente de IKK1, que se observa a menudo en quinasas, es el impedimento principal para la cristalización y a menudo está vinculada a la contratación del dominio quinasa con el bucle de activación. IKK2 con nativos (S177 y S181) y phosphomimetic (EE) formas de serinas de bucle de activación podría ser cristalizado, pero sólo se obtuvieron cristales truncado IKK1/α de los SS a la versión mutante de EE y también sólo en presencia de inhibidor de la IKK XII. Estos cristales difractados lo suficientemente bien como para la determinación de la estructura sólo cuando se cultiva en la cámara fría (~ 4-6 ° C). Si nos encontramos con un comportamiento igualmente obstinado con cualquier homólogo IKK1 (o un ortólogo IKK), podemos probar diferentes modificaciones de la columna vertebral (especialmente de los residuos activos del sitio lazo serina que son fosforilados comúnmente). También podemos tratar la cristalización en presencia de interacción socio proteínas. Muchas quinasas, los de la familia IKK, incluyendo interactúan con las proteínas de la pareja y residan en complejos de orden superior.

Varios inhibidores ayudó a producir IKK2 cristales en distintas condiciones (por ejemplo, con tanto sal alta PEG como un precipitado), a 18 ° C tanto en la cámara fría. Sin embargo, en condiciones similares y con una variedad de inhibidores, IKK1/α no produjo cualquier cristal. Así, el uso de un repertorio más grande de los inhibidores de la sin duda aumentará las posibilidades de encontrar uno que permitan la cristalización.

Otro paso crítico en la determinación estructural era el cuidado de crio-preservación y procedimiento de recogida de datos. Los datos débiles y la rápida desintegración de los cristales en el haz de rayos x justifica la necesidad de grandes cristales y colección de múltiples conjuntos de datos de los mismos cristales. Sin un razonable conjunto de datos completo de alta precisión, nosotros podríamos no han logrado obtener una solución de reemplazo molecular.

Finalmente, no pudimos determinar la estructura de IKK1/α por reemplazo molecular con más de 100 modelos creados a partir de conocidas modelos estructurales de IKK2/β en la base de datos pública. Así, obtener un modelo apropiado para un procedimiento de reemplazo molecular era una necesidad. El mapa de cryo-EM, modelos estructurales de alta precisión de dominios individuales, junto con estudios comparativos de determinado previamente las estructuras IKK2 nos llevaron a obtener un modelo de búsqueda que nos trae la solución de reemplazo molecular.

La cristalización de una proteína es intrínsecamente aleatoria, así que a pesar de seguir la guía estructurada anterior, podríamos enfrentan problemas en cristalización de otro homólogo IKK1 u otra construcción completo o truncado de IKK1 humana. Cueste lo que cueste, conocimiento de estos pasos críticos permitirá a un investigador explorar las condiciones racionales que aumentarán las posibilidades de obtener un cristal IKK bien diffracting.

IKK1/α y β/IKK2 Mostrar la organización de dominio similar pero diferente organización entre dominios
No en vano, IKK1/α y β/IKK2 adoptan una arquitectura de dominio muy similar de su secuencia alta semejanza33,43. Como se indicó anteriormente, IKK1/α y β/IKK2 doblan en tres dominios diferenciados: dominio de la cinasa N-terminal, ubiquitina como dominio (ULD) y el dominio de dimerización de andamio (SDD). IKK1/α y β/IKK2 forman dímeros estables en los que el C-terminal de la mitad del SDD participa en la dimerización. Residuos implicados en la formación de dímeros son idénticos. Sin embargo, las interacciones entre dominios entre SDD/ULD y KD son algo diferentes puesto que estos implican diferentes residuos. También es probable que la causa la orientación relativa del dominio quinasa al SDD en IKK1/α a diferir en IKK2/β. Esto no fue totalmente inesperado ya que también observamos diferencias entre los modelos disponibles de dímero de IKK2/β. Curiosamente, dímeros de IKK2/β pueden organizar tetrámeros en enrejado cristalino aunque esta propensión de tetramerización es débil en la solución. Sin embargo, dímeros de IKK1/α forman única hexamers. Estos hexamers también se observan en la solución, aunque sólo una pequeña piscina de dímeros de IKK1/α existe como hexamers. Éstos sugieren que hexamerization es probable que tenga una función específica y crítica.

Distinguir las diferencias funcionales de diferencias estructurales
IKK1/α y β/IKK2 realizan distintas funciones en las células. Sin embargo, la relación entre estructura y función de IKK1/α ha permanecido elusiva. IKK1/α claramente existe en diferentes formas: como dimer libre o hexamer y dentro del complejo no caracterizado hasta ahora hetero trímero IKK2/β y NEMO. Puesto que la activación de IKK2/β por señalización canónica no requiere IKK1/α, el papel funcional de IKK1/α en heterotrimer (complejo IKK canónico) sigue siendo confuso. Tampoco está claro si la activación de IKK1/α inducida por el no-canónico de señalización se basa en la libre dimérico IKK1/α o hexamérica IKK1/α. Desde mutacionales experimentos revelan que la interrupción de la interfaz de hexamer afecta fuertemente de señalización no-canónico, hexamerization es probable que sea esencial en algún momento durante la señalización no canónico.

Diseño de inhibidores de molécula pequeña con estructura IKK1/α
Conocer que la estructura de IKK1/α nos permite investigar manchas superficiales en un monómero o bolsillos en interfaces interdominios o monómeros entre, que puede ser objetivo de moléculas pequeñas. IKKs largo se han considerado objetivos de medicamentos importantes. Sin embargo, la esencialidad de estas quinasas en una variedad de funciones incluyendo la homeostasis celular y la viabilidad inmunidad dificulta a les. Hasta ahora, ninguna molécula orientada a IKK se ha encontrado que puede ser utilizado con seguridad en pacientes.

IKK1/α y β/IKK2 están a menudo dirigidas simultáneamente por sus inhibidores desde sus dominios de cinasa son altamente similares en secuencia y estructura. Esfuerzo considerable de investigación se ha gastado en la búsqueda de inhibidores específicos dirigidos a sólo uno de estos dos quinasas. En consecuencia, se han descubierto varios inhibidores de IKK2/β-específicos, algunos de los cuales no afectan la función de IKK1/α. Sin embargo, a nuestro conocimiento que no existe ningún tal compuesto efectivamente inhibe IKK1/α sin perturbar la función de IKK2/β. Esta ausencia podría atribuirse a la falta de información estructural en IKK1/α. Nuestros estudios estructurales y celulares indican que, aunque el dominio arreglo y estructuras globales de la subunidad son muy similares en estas dos proteínas, Mostrar únicos disposiciones de orden superior superficie específica utilizando parches33. Estas diferencias que permiten diversas interacciones con las proteínas asociadas deben traducir sus diferencias funcionales. Confiamos en que estas distinciones reveladas entre los IKK1/α y las interacciones inter y intra-subunidad de IKK2/β pueden ser explotadas para hacer inhibidores alostéricos específicos de la subunidad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran no intereses financieros que compiten u otros conflictos de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos al personal de las líneas 19ID, 24ID y 13ID en avanzada fuente de fotones, Lemont, Illinois, para apoyo en la recopilación de datos sobre varios cristales. Agradecemos a Dmitry Lyumkis, Salk Institute para nosotros obtener el mapa de cryo-EM de baja resolución en las primeras etapas del EM mapa/modelo del edificio, que fue utilizado para construir el modelo inicial de búsqueda de recambio molecular de IKK1. La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación de subvenciones de NIH AI064326, CA141722 y GM071862 a GG. SP es actualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109 (2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581 (2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581 (2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Tags

Bioquímica número 141 proteína serina-treonina quinasa IKK1/α NF-κB estructura cristalina reemplazo molecular inhibidor de la
Una guía para la producción, cristalización y determinación de la estructura de IKK1/α humano
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Polley, S., Huang, D. B., Biswas,… More

Polley, S., Huang, D. B., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter