Summary
הנפוץ ביותר ניתוח תוכן הבטן של macroinvertebrates הם חזותיים. הדורשים ידע אינטנסיבי ונעשית מורפולוגי של אורגניזמים טרף, הם מתגעגעים טרף גוף רך, בשל comminution חזקה של טרף, הם כמעט בלתי אפשרית עבור אורגניזמים מסוימים, כולל amphipods. אנו מספקים נתונים היסטוריים, רומן גישות גנטיות עבור macroinvertebrate טרף זיהוי בתזונה של amphipods.
Abstract
ניתוח במארג המזון חיוני לצורך הבנה טובה יותר של מערכות אקולוגיות. לדוגמה, אינטראקציות מארג מזון יכול עוברים שינויים חמורה נגרמת על ידי הפלישה של מינים-ילידים. עם זאת, זיהוי מדויק של שדה טורף-טרף אינטראקציות קשה במקרים רבים. ניתוחים אלה לעיתים קרובות מבוססות על בדיקה חזותית של תוכן הבטן או הניתוח של יחסי איזוטופ יציב (אלפא15N ואלפא13ג). שיטות כאלה דורשים ידע מקיף, בהתאמה, גיוון מורפולוגיות או חתימה איזוטרופי של אורגניזמים טרף בודדים, שמוביל מכשולים הזיהוי המדויק של אורגניזמים טרף. ניתוח תוכן ויזואלי הבטן במיוחד לזלזל אורגניזמים טרף גוף רך, כי השרייה, שאורכה, בליעה, העיכול של אורגניזמים טרף להקשות זיהוי של מין מסוים. לפיכך, פולימראז תגובת שרשרת (PCR) המבוסס על אסטרטגיות, למשל השימוש של קבוצה ספציפית פריימר מגדיר, לספק כלי רב עוצמה עבור החקירה של אינטראקציות מארג מזון. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט כדי לחקור את תכולת הבטן הצרכנים macroinvertebrate מן השדה באמצעות פריימר המיועדות לקבוצות ערכות עבור גרעיני חומצה deoxyribonucleic 30s ריבוזומלי (rDNA). דנ א יכול להיות חילוץ או כל דגימות (במקרה של taxa קטנה) או מתוך הבטן התוכן של דגימות שנאספו בשטח. נוכחות ויעילות פונקציונלי של תבניות DNA צריך לאשר ישירות מן הפרט נבדק באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר פילוח של יחידת משנה בהתאמה של ה-DNA. אנחנו גם להוכיח כי טרף נצרך יכול להיקבע נוספת לרמה מינים באמצעות PCR עם תחל המיועדות לקבוצות שלא שונתה בשילוב עם גדיל אחד העוקבים קונפורמציה פולימורפיזם (SSCP) ניתוחים באמצעות ג'ל לזיהוי. יתר על כן, אנו מראים כי השימוש שונים צבעי פלורסנט כתוויות מאפשר הקרנה מקבילים של שברי DNA של קבוצות שונות טרף מדגימות מרובים בטן תוכן באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס.
Introduction
אינטראקציות טורף-טרף, המהווים את רוב האינטראקציות עם מחלות ואת הדינמיקה מארג מזון, הם היבטים מרכזיים כדי לאפיין את פלקסים של חומר ואנרגיה ברחבי במארג המזון בתוך ובין מערכות אקולוגיות, אשר אחת ממטרותיה העיקריות של אקולוגיה 1. קביעת מקור וזרימה של פחמן וחומרים מזינים היא בהבנה של קישוריות אקולוגית בין מערכות אקולוגיות2. עם זאת, מערכות אקולוגיות, כגון נהרות, catchments שלהם, לא רק מקושרים על ידי פלקסים של חומר אורגני וחומרים מזינים, אלא גם על ידי התנועות של אורגניזמים3. לפיכך, שינויים הגידול מפריע לזרם של משאבים לקשר מערכות אלה יכול בחום לשנות מזון באתרי אינטרנט של שתי מערכות אקולוגיות, לא רק ישירות אלא בעקיפין גם על-ידי שינוי ההרכב בהתאמה של קהילות טורף-טרף. למשל, שינויים של במארג המזון הוכחו להיות מקושר התנועות של מינים (למשל, פורל הקשת בענן) טורף יחיד4. שינויים כאלה שעלולים לאיים על המגוון הביולוגי לבין תפקוד המערכת האקולוגית הימית. לפיכך, ניתוח אינטראקציות טורף-טרף בשדה חיונית כדי לקבוע את ההשפעה של האדם-induced שינויים סביבתיים, כגון שיטות ניהול מים, על המגוון הביולוגי מקורית של המערכת האקולוגית הימית.
מאחר מעקב אחר קישורים עם מחלות קשות במערכות מורכבות, מספר גישות הוקמו המאפשרים את ההערכה של האכלה אינטראקציות שדה5. באופן מסורתי, חקירות של האכלה אינטראקציות בשדה מבוססים על זיהוי חזותי שרידי טרף במעיים ביתור ודורשים ידע נרחב על הטרף מורפולוגיות הגיוון. ניתוח תוכן ויזואלי בטן סיפקו תובנות על השימוש במשאבים של מספר קבוצות של צרכנים (למשל, וריאציה עונתיים בתזונה של לובסטר6 דגים7,8 או האכלה והעדפות של משטרגליים). עם זאת, התהליך הפיזי של מערכת העיכול מקשה על ניתוח תוכן ויזואלי בטן ומתגעגעת בדרך כלל גוף רך טרף-אורגניזמים9. עבור מינים האכלה דרך בליעה נוזלי או כמה צרכני הגעה באופן אינטנסיבי comminute את האוכל שלהם לפני בליעה, כמו amphipods, זיהוי חזותי של הטרף מינים בתוכן הבטן הוא בלתי אפשרי10. בשל מגבלות אלו, אנליזה מולקולרית מספק אלטרנטיבה מבטיחה.
ניתוחים מולקולריים הפכו עתה כלי משותף המאפשר זיהוי מהיר ומדויק טרף בתכולת מעיים. מגוון טכניקות אלה הוא מגוונים: אסטרטגיות בהתבסס על נוגדנים חד-שבטיים או תגובות שרשרת של פולימראז (PCR) משמשים לעתים קרובות, בגלל שלהם גבוהה ירידה לפרטים ורגישות11. הפיתוח של נוגדנים חד-שבטיים החדש ואת עלות-אינטנסיבית, לכן, היישום של טכניקות מולקולריות אחרות הוא יותר שימושי כאשר נוגדנים אינם קיימים כבר11. גישה נפוצה אחרת היא ההגברה של מחוזות חומצה deoxyribonucleic (DNA), כמו חומצה ריבונוקלאית 30s ריבוזומלי (RNA) גנים נוכח רוב המינים, באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר12,13. בעת שימוש בטכניקה זו, הוא לעתים קרובות לא ניתן לזהות מגוון רחב של אורגניזמים טרף בתוך מקורות מעורבות של הדנ א14. גישה יעילה כדי להימנע כזה חיסרון הוא להשתמש המיועדות לקבוצות פריימר מגדיר עבור ניתוח תוכן הבטן גנטי. שנועד להגביר רק DNA אזורים של קבוצות יעד מסוים או לא לכלול כל שאר המינים15,16, המיועדות לקבוצות תחל להפעיל זיהוי של אורגניזמים טרף ברמה טקסונומי של הקבוצות שצוין ללא ניתוחים משניים של עלות-אינטנסיבית. עם זאת, כמו כל בטן ניתוח תוכן, ניתוח כזה מספקים רק תמונה של האכלה התנהגות. לכן, שילוב של ניתוח תוכן הבטן מולקולרית עם ניתוחים של שילוב זמן המשדרים טבעי (למשל, איזוטופים היציבים) נחשב מועיל1,2.
כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת חקירות מבוסס ה-PCR של טורף-טרף אינטראקציות באמצעות פריימר המיועדות לקבוצות ערכות עבור גרעיני ribosomal DNA (rDNA) אזורים להיות משולבת עם איזוטופ יציב ניתוחים של הדגימה זהה. אנו מתארים את הגילוי של ה-DNA של קבוצות טרף יחיד באמצעות agarose בג'ל. בנוסף, אנו מציגים הזדמנות נוספת במורד הזרם ניתוחים של מוצרי ה-PCR תחל המיועדות לקבוצות כזה ישים בכל פעם בטקסונומיה ברזולוציה גבוהה יותר מאשר ירידה לפרטים תחל נדרש. כי הדנ א נטושים יחיד (ssDNA) קטעים טופס שלישוני הייצורים החיים שנקבעות על-ידי רצף העיקרי שלהם17, וריאציות קטנות בתוך שברי מוגבר על ידי תחל המיועדות לקבוצות כאלה להוביל שינויים הסתגלותי. שינויים כאלה יכולים יזוהו על-ידי צירוף יחיד קונפורמציה פולימורפיזם (SSCP) ניתוחים עם ג'לים לזיהוי17,18, מתן אפשרות של זיהוי מדויק יותר של הטרף אורגניזמים (עד לרמת מינים).
בעוד agarose בג'ל הוא כלי נפוץ וזול כדי להמחיש שברי DNA ולקבוע שלהם אורך משוער19, הרזולוציה תלוי בכמות ה-DNA ומשמש לצבוע מכתימים20. בדרך כלל, הפריט החזותי הוא ישר קדימה בעת עבודה עם דגימות דנ א טהור, אבל כמויות נמוכות באופן פוטנציאלי של הטרף DNA בתוכן הבטן של הצרכנים יכול לסבך על מניה של agarose ג'ל אלקטרופורזה תוצאות. עדיין, זיהוי שיטה זו אפשרית על המסך מספר נמוך של הצרכן דגימות מן השדה עבור אחד או כמה טרף קבוצות, אך סיבוך על מניה גורם ההקרנה של מספר רב של דוגמאות taxa טרף מרובות מאוד זמן אינטנסיבית ובכך אכן. שיטת זיהוי רגיש יותר הוא ניתוח אוטומטיות של קטעים באמצעות אלקטרופורזה נימי, אשר בנוסף מאפשר קביעת האורך המדויק של שברי21. מספר microsatellite המבוסס על מחקרים הראו כי באמצעות צבעי פלורסנט שונים כמו תוויות, זה אפשרי ויוכל לקבוע שברים שונים של אורך דומות על ידי אוטומטיות רסיס ניתוח22,23, 24. לכן, אנו מציגים גם פרוטוקול מפורט לצורך זיהוי מקבילים של ה-DNA של הטרף מרובים באמצעות PCR עם תוויות ייחודיות לקבוצה פריימר ערכות זיהוי באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס עם ברצף אוטומטיות קבוצות. בנוסף, אנו מציגים תוצאות של חקר מקרה הממחיש זיהוי ה-DNA טרף באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס היא גישה המאפשרת גם על כימות היחסי של הטרף בלע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לאסוף Macroinvertebrates מהשדה ולהכין את הדגימות ניתוח תוכן הבטן גנטי.
Macroinvertebrates- לאסוף בכל אתר, למיין ליחידים של הצרכן מין עניין לתוך צינורות יחיד, ומקפיאים ישירות חנקן נוזלי או קרח יבש כדי למנוע בטן סיווג והשפלה של דנ א.
הערה: הימנע משמירת דגימות של האלכוהול, macroinvertebrates מסוימים נוטים להקיא לפני האלכוהול יהרוג אותם. - להשתמש רק את מערכת העיכול של בינוניים וגדולים (כ > 3 מ מ) macroinvertebrate מינים עבור ניתוח תוכן הבטן גנטי כך העניין הנותרים של הדגימה יכול לשמש עבור הליכים אחרים (למשל, יציב איזוטופ ניתוח). שים לב כי זה לא רלוונטי כאשר חוקרים taxa קטן מאד כמו קרדית מים. לכן, ניתן לדלג שלבים 1.2.1 ו- 1.2.2.
- להפשיר מעט הפרט ומנתחים בקפידה את מערכת העיכול שלה תחת stereomicroscope באמצעות מלקחיים נירוסטה משובחים. הקפד לא לנקב את מערכת העיכול כדי למנוע אובדן של חומר. מלקחיים
- נקיים באמצעות פתרון טיהור להסיר מציג DNA ו- RNA לאחר הכנת כל מערכת העיכול. לכן, דגירה מלקחיים 10 דקות בפתרון טיהור. לאחר מכן, לשטוף אותם במים סטריליים כדי להסיר שאריות עקבות ולמחוק אותם עם מגבת נייר נטולת מוך.
- העברה מערכת העיכול ביתור ריאקציה מנעול כספת 2.0 mL צינור המכיל מאגר הפקת מלח µL (450 µL אפשרי לשימוש של פיפטה חוזרות) 440 [SEB; 0.4 מ' נתרן כלורי (NaCl), 10 מ מ טריס (hydroxymethyl)-aminomethane הידרוכלוריד (טריס-HCl) pH 8.0, ו- 2 מ מ ethylenediaminetetraacetic ניתרן חומצת מלח מייבשים (EDTA) pH 8.0]. חנות הכין דגימות-− 20 ° C מיד עד החילוץ של ה-DNA. ודא כי ה-DNA יחולצו בתוך כמה ימים.
- להשתמש של פרוטוקול ששונה הפקת מלח גבוהה 25 כדי לחלץ את הדנ א.
- לקחת דגימות מהמקפיא. להשתמש מלקחיים להוספת חרוז אחד של נירוסטה 5 מ מ כל שפופרת מדגם והשאר דגימות קפוא על הספסל בטמפרטורת החדר (RT) להפשיר. להשתמש טחנת חרוז homogenize דוגמאות עבור 1 דקות בהרץ 15.
- ספין למטה דגימות עם ריצה קצרה של צנטריפוגה. השתמש microliter פיפטות כדי להוסיף 90 µL (100 µL אפשרי לשימוש של פיפטה חוזרות) 10% נתרן dodecyl סולפט הפתרון (מרחביות) ו- 5 µL של 10 מ"ג/מ"ל proteinase ק
- מערבולת דגימות ביסודיות, דגירה תערובות h 1 ב 60 מעלות צלזיוס ברעידות קבוע ב 400 סל ד ב thermomixer. בנוסף, ביסודיות מערבולת דגימות בכל 10 דקות כדי לקדם פירוק.
- ספין למטה דגימות עם ריצה קצרה של צנטריפוגה, להוסיף 350 µL של NaCl 5 מ' עם microliter פיפטה, מערבולת ביסודיות לדוגמאות כ 0.5 - 1 דקות צנטריפוגה למשך 40 דקות ב g x והוא מעסיק 16,200-5 מעלות צלזיוס
הערה: אם קבוצות מרובות בשורה צריכים להיעשות, הגדרת טמפרטורה לצנטריפוגה צריך להיות מעט העלו (לא יותר גבוה מ- 10 ° C) כי מרחביות נוטה flocculate אם הטמפרטורה נמוכה מדי. - שימוש microliter סיליקון להעביר כ 600 µL supernatant לתוך צינור 1.5 mL התגובה. להיזהר לא להסיר משהו בגדר.
- פלדת אל-חלד עצה חרוזים מתוך הצינורות התגובה לתוך מסננת תה פלדת אל-חלד, לנקות אותם עם מים זורמים, דגירה אותם בצלחת פטרי עם הפתרון טיהור עבור 10 דקות לשטוף ביסודיות הפתרון טיהור עם סטרילי מים ולאחסן חרוזים נקי אתנול (> 99%, כריזה כיתה) או יבש עד חוזר.
הערה: ניקוי של חרוזים אינו צריך להיעשות בשלב זה ישירות, אך מעדיפה יכול להיעשות בכל פעם שיש זמן ההמתנה בשלבים הבאים- - 600 להוסיף µL של קרח אלכוהול איזופרופיל (כיתה כריזה) תגובת שיקוע עם microliter פיפטה, להפוך בזהירות הצינור כמה פעמים. לאחסן דגימות בן לילה ב-20 מעלות צלזיוס
- לקחת דגימות מהמקפיא, centrifuge אותם עבור 20 דקות והוא מעסיק 16,200 × g, בטמפרטורת החדר. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע ויבש ברכבת התחתית היטב עם נייר טישו נטולת מוך. שימו לב כי אם טמפרטורת הסביבה גבוהה (יותר מ 25 ° C), צנטריפוגה ב 5 ° C כדי להימנע כדורי גולשות תוך השמטת את תגובת שיקוע.
- שטיפת גללים המכילה DNA עם 70% אתנול. כדי לבצע זאת, הוסף 200 µL קר כקרח אתנול (70%, כריזה כיתה) באמצעות פיפטה microliter צנטריפוגה דגימות 10 דקות ב 16,200 x g ו בטמפרטורת החדר (או 5 ° C, במידת הצורך). בזהירות למחוק את תגובת שיקוע ויבש ברכבת התחתית היטב עם נייר טישו נטולת מוך. שימוש פיפטה µL 10 להתאים ל- µL כ 8 כדי בקפידה פיפטה הנחה תגובת שיקוע הנותרים. ודא שלא להפריע בגדר.
- יבש בגדר במשך כ 5-20 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, או בטמפרטורת החדר הספסל עד כל האתנול הוא התאדה.
- צנפה התמוססות ב- 50-100 µL נטולת נוקלאז (אדים מחוטא, DEPC התייחסו) מים (ddH 2 O), להמתין לפחות 1 h (אם כי ניתן להשיג תוצאות טובות יותר ללון ב 4 ° C).
- למדוד את כמות הדנ א הכלולות בכל מדגם עם ספקטרופוטומטרים מיקרו נפח, על פי היצרן ' s הוראות. לגרום לדילול לעבוד כל מדגם המכיל כ 2-10 ng DNA / µL. לשמור את הפתרון מניות במקפיא. לשמור את הפתרון עובד במקרר ולהבטיח הדגימה נוספת העיבוד נעשה זמן קצר.
2. ודא יעילות תפקודית של ה-DNA-תמציות לגילוי עוקבות של טרף בלע לאחרונה.
- על מנת להבטיח הנוכחות ואת יעילות תפקודית של תבניות, לבחון כל תמצית ה-DNA (שלבים 1.1 כדי 1.3.11) באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר מתאים למקור המזון המתאימים (למשל, חסרי חוליות 16 , 26) כי הם המיקוד של יחידת משנה גרעיני אותו בתור פריימר קבוצה ספציפית, המשמש לצורך זיהוי עוקבות של הטרף 25 , 27. השלבים הבאים מתייחסים לשימוש של ערכות פריימר אוניברסלי NSF1419/20 ו- NSR1642/16 16 ו LSU D1, D2 fw1 ו LSU D1, D2 rev2 או LSU D1, D2 rev4 26. כדי להוכיח כי התגובה PCR הייתה מוצלחת, כי אין חשש לזיהום התרחשה, להשתמש בקרה חיובית המכיל DNA זה היה כבר היה מוגבר בהצלחה ודגימת פקד אחד המכיל ddH 2 O במקום DNA בתוך כל PCR לרוץ.
- להכין פריימר פתרונות עבודה מכילים של הריכוז הסופי 10 מיקרומטר של מאיץ, pipette את הכמות המתאימה של פריימר בהתאמה המניות פתרון ו- ddH 2 O (בהתאם הריכוז של הפתרון מניות) לתוך mL 1.5 טריים תגובת הצינור באמצעות micropipettes.
- להוסיף תערובת זו תחל, deoxynucleotide מיקס (dNTPs), תגובת מאגר, Taq DNA פולימראז ו ddH צינור תגובה 2 O mL 1.5 או 2.0 (תלוי במספר הדגימות להיות מעובד), ואז מערבולת. אמצעי אחסון נתונים היסטוריים עבור תערובת התגובה לתגובה PCR 10 µL מקבלים טבלה 1 (עבור פרטים של כימיקלים בשימוש, ראו טבלה של חומרים). פיפטות
- שימוש microliter להעביר כל µL 1 של ה-DNA לחלץ לתוך µL 9 של thתערובת התגובה השגרתית e בתוך צינור ה-PCR (או טוב של צלחת PCR). סגירת הצינור התגובה או הבארות התגובה של הצלחת (עם כובע פסים).
- לתכנת את thermocycler: הוא הפרוטוקול הסטנדרטי עבור ערכת פריימר 16 NSF1419/20 ו- NSR1642/16: 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות (דנטורציה), ואחריו מחזורים של 94 ° C ל 30 s, 50 ° C (חישול טמפרטורה) ב-30 s, 72 ° C 90 s, ואת סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות. עבור ומהצמיגים LSU מגדיר 26, השתמש בהבא: 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואחריו 45 מחזורי 94 ° C עבור 20 s, 52.5 ° C עבור 20 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 90 s, ועם סיומת הסופי ב 72 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות
- המבחנות המקום או צלחות לתוך thermocycler, סגור את המכסה של הצנטרפוגה ולאחר הפעלת התוכנית בהתאמה.
- הכנת agarose 1.5% ג'ל באמצעות של בופר טריס הבסיס המכיל חומצה בורית, EDTA (מאגר TBE), agarose. עבור הכנת ג'ל agarose 1.5%, באמצעות מגש הליהוק ג'ל עם הממדים הכולל של 10 ס"מ × 7.5 ס"מ × 3 ס"מ, שוקלת agarose 0.45 g לתוך בקבוקון חרוט, השתמש צילינדר מדידה לאמוד 30 מ של x TBE 1 מאגר (89 מ מ טריס pH 7.6, חומצה בורית 89 מ מ ו- 2 מ מ EDTA, pH 8.0) וממלא הבקבוקון חרוט. מחממים את התערובת בעזרת מיקרוגל. להפסיק את המיקרוגל מתי יש בועות אוויר גדולים ו מערבולת בקפידה את הבקבוק עד הפתרון יש שלב אחד בלבד-
- להתקרר לפתרון כ 60 ° C, מערבולת את הבקבוק בתוך אמבט מים. במהירות שופכים את הפתרון לתוך מגש הליהוק ג'ל, להסיר בועות אוויר, והכנס מסרקים. המתן כ- 20 דקות עד ג'ל הוא התקשה.
- מילוי אלקטרופורזה יחידה עם 0.5 x TBE, הוסף ג'ל הליהוק מגש המכיל את הג'ל agarose. ודא החריצים ג'ל ללא בועות אוויר.
- ספין למטה המוצרים PCR באמצעות האפשרות ריצה קצרה של צנטריפוגה מיני (צלחת). להשתמש על פיפטה microliter כדי לערבב כל µL 3 של מוצר ה-PCR עם µL 1 של 6 x טוען צבען (40% סוכרוז ו- 0.25% bromophenol כחול) לטעון אותו לתוך החריצים ג'ל של הג'ל agarose. פיפטה 1.5 µL של סולם הדנ א bp 100 לתוך חריץ אחד בכל שורה עם פיפטה microliter כמו גודל סטנדרטי. להחליף את המכסה של היחידה אלקטרופורזה כראוי וחבר מוביל ספק כוח. להפעיל את הג'ל 100 V/cm מינימלית 35
- להכין אמבט מוכתמים, יוצקים 1,000 מ של 1 x TBE לתוך מרובע בצורת קופסת פלסטיק אטום לאור. להוסיף 50 µL של אתידיום ברומיד עם פיפטה microliter, סגור את המכסה של תיבת פלסטיק ולנער אותו כדי להבטיח חלוקה שוויונית של אתידיום ברומיד.
- להסיר את הג'ל מיחידת אלקטרופורזה ולמקם אותו לאמבטיה מכתימים כ 10 דקות. . ואז, בג'ל מהאמבטיה מוכתמים, להניחה על גבי מערכת תיעוד ג'ל, לדמיין. את זה לפי ספר ההוראות.
- לנתח דגימות היחידה שהראו תוצאות חיוביות (שברים בגודל הולם חזותית ב agarose ג'ל) מבחינת נוכחות, יעילות תפקודית של תבניות לגילוי עוקבות של טרף בלע לאחרונה.
| ה-PCR-מיקס | הפתרון עובד ריכוז | מיקס 10 התגובה PCR µl | הריכוז הסופי ב- PCR |
| תחל FW | 10 מיקרומטר | 0.5 μl | 0.5 מיקרומטר |
| RW תחל | 10 מיקרומטר | 0.5 & #956 ; l | 0.5 מיקרומטר |
| התגובה מאגר (20 מ מ טריס-HCl, pH 8.55, 16 מ מ (NH4) 2SO4 וריכוזי 2 מ מ MgCl2 הסופי) | מיקרומטר 1 | 1 μl | 1 מיקרומטר |
| dNTP | 10 מ מ | < t d > 0.25 μl0.25 mM | |
| אנזימים | 5 U | 0.1 μl | 0.05 U |
| ddH 2 0 | 6.65 μl | ||
| < לתזמורת כלי קשת ng > סה כ כמות תערובת התגובה | 9 μl | ||
| דנ א | 1 μl | ||
טבלה 1: מפורט פרוטוקול עבור הכנת התערובת התגובה לתגובה PCR 10 µL-
3. לזהות טרף בלע לאחרונה/מזון פריטים עם פריימר המיועדות לקבוצות קובע באמצעות אלקטרופורזה בג'ל.
- PCR לנהל באמצעות שהפתרון העבודה של ה-DNA תמציות (המוכנים לפי השלבים 1.1 כדי 1.3.11) ולהגדיר את ייחודיות לקבוצה פריימר (ללא תווית, קרי, ללא שינוי) המתאימות עבור הקבוצה טרף ממוקד כמו שמתואר צעדים 2.1.1 כדי 2.1.3 (וריאציות בתערובת תגובה עבור ערכת פריימר בהתאמה, ראה טבלה 2). להפעיל את ה-PCR באמצעות פרוטוקול סטנדרטי בהתחשב בשלב 2.1.4 (עבור חישול טמפרטורות עבור ערכת פריימר בהתאמה, ראה טבלה 2).
- השתמש בפקד אחד עם דנ א טהור מאחד השייכים אוכלוסיית היעד המתאים (בקרה חיובית) ושליטה שלילי אחד עם דנ א טהור מן המינים לצרכן ב- PCR כל לרוץ.
- לבדוק את ההצלחה של התגובה PCR שימוש בג'ל agarose תיאר בשלבים 2.1.6 כדי 2.1.11. התגובה PCR היה מוצלח אם קטע באורך המתאים (ראה טבלה 2) גלוי עבור הפקד חיובי אך לא עבור הפקד שלילי. אם אחד או שני קריטריונים אלה לא התגשמו, חזור על ה-PCR-
- שימוש agarose ג'ל אלקטרופורזה, כמתואר בצעדים 2.1.6 כדי 2.1.11, כדי לזהות הקבוצה טרף ממוקד היה כבר מעוכל על ידי דגימות ביתיים שונים שנבדקו (דרך לשפוט אם הרסיס של אורך המתאים הוא גלוי או לא). ודא לא לפספס שברים עם רזולוציה נמוכה חזותי.
- מוצרי החנות PCR ב 4 ° C, אם עוד ניתוחים תהיה מוכנה בתוך ה 24 הבא, או ב-20 ° C, אם הבדיקות שיבוצעו מאוחר יותר.
4. לאחר מכן לקבוע נצרך הטרף נוסף במורד הזרם באמצעות ניתוח SSCP באמצעות ג'ל לזיהוי.
- להתכונן אקרילאמיד 9% ג'ל אלקטרופורזה SSCP. להכין את הפתרונות עובדים בשכונה מעבדה.
- כדי להכין הפתרון עובד אקרילאמיד 200 מ ל, מילוי גליל מדידה עם 20 מיליליטר 10 x TBE (109 גרם של בסיס טריס, 55 גרם של חומצה בורית, 40 מ של 0.50 מ' EDTA, pH 8.0 מומס 1000 מ ל- ddH 2 O) ועוד אחת עם 45 מ של 40% (29:1) שילוב אקרילאמיד. למזוג TBE, אקרילאמיד לערבב לתוך בקבוקון בוגר (בקבוק זכוכית בוגר עם סימן 200 מ ל, היא מתאימה גם כאן) ולהוסיף ddH 2 O עד כדי לסמן 200 מ. . פתרון במקרר (4 ° C) עד הצורך. אל תשתמש הפתרון עובד מבוגר יותר שבוע אחד.
- שוקל 0.1 גר' קירור (APS; שימוש באיזון לפחות 0.01 גרם דיוק) לתוך 1 מ"ל סטריליות להמיס אותו על ידי הוספת ddH 2 O עד טקס הסיום לסמן להכין פתרון מניות של APS 10%. להעביר aliquots (כ-350 µL) לתוך צינורות התגובה טריים.
הערה: אחד aliquot נדרש עבור כל ג'ל לזיהוי. חנות aliqu הנותריםפאלו ורדה ב-20 ° C, רק להפשיר aliquots זמן קצר לפני הם נדרשים. - להרכיב קלטת ג'ל בסכנה של שתי צלחות זכוכית, ריק אחד לוח הזכוכית מחורץ אחד (כל 20 ס"מ על 20 ס"מ), עם מפרידי (1.5 מ מ עבה) ביניהם מפעיל את הצדדים של הזכוכית. להשתמש בכל קיפול גב 3 קליפים (32 מ מ) בצד שמאלה וימינה להתקבע ג'ל קלטת ( איור 1).
- מיקס 5 גרם של agarose, 250 מ של מאגר x TBE 1 בבקבוקון חרוט להכין פתרון agarose 2% ג'ל. חום, לאחר מכן לקרר תערובת כפי שתואר בשלבים 2.1.6 ו 2.1.7. שופכים את הפתרון במהירות לתוך קופסת פלסטיק מרובע בצורת (21 ס"מ x 6.5 ס"מ x 5 ס מ), למקם את הקצה התחתון של קלטת ג'ל (שלב 4.1.3) הפתרון agarose. להתאים את הקליפים קיפול-בחזרה בסוף הקלטת ג'ל לגובה נמוך יותר כך הם יושבים על שפת בתיבת פלסטיק בצורת ריבוע ( איור 1). המתן כ- 20-30 דקות עד התקע agarose לחלוטין שנוקשה.
- מילוי של 100 מ ל מדידת גליל עם הפתרון עובד אקרילאמיד (שלב 4.1.1) עד הסימן 60 מ ל ויוצקים פתרון לתוך גביע. השתמש micropipette כדי להוסיף 300 µL של aliquot אחד של הפתרון מניות APS (שלב 4.1.2) וכדי להוסיף לאחר מכן 37.5 µL של tetramethylethylenediamine (TEMED). במהירות, שופכים את הפתרון בין צלחות זכוכית בקלטת ג'ל. לחלופין, להזריק את הפתרון בין צלחות זכוכית עם מזרק חד פעמיות 100 מ עם טיפ פיפטה 1,000 µL מותאם לראש הזרקה במזרק.
- להוסיף בזהירות מסרק סטנדרטיים בעובי 1.5 מ מ בקצה העליון בין הזכוכיות. המסרק חייב להיות מוקף הפתרון לזיהוי. המתן כ 1 h עד לזיהוי הג'ל הוא polymerized. להימנע אוורור בזמן הפילמור ככל האפשר כי זה מגדיל את הזמן הדרוש עבור הג'ל פולימריזציה.
הערה: זה אפשרי לאחסן ג'לים casted בתוך שקיות אטומות עם ממחטה רטובה במקרר עד 3 ימים.
איור 1: התמונות המדגימה בנייה לשפוך ג'ל לזיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- מקום בקלטת ג'ל, המכיל את הג'ל לזיהוי מוכן, לתוך יחידה אנכית אלקטרופורזה. מילוי יחידת אלקטרופורזה עם הסכום המתאים (בהתאם לסוג יחידת אלקטרופורזה) של 0.5 x TBE וקריר יחידת ל 10 ° C באמצעות סירקולטור בקירור של.
- עבור ה-DNA דנטורציה, מחממים תרמי-לחסום /-הצנטרפוגה ל 96 ° C. הכן מאגר דנטורציה עם 95% formamide (99.5% כריזה כיתה), 5% תמיסה מימית המכילה bromophenol 0.25% כחול וסוכרוז 40% (w/v).
- לקחת את המוצרים PCR על המקרר או המקפיא, להפשיר אותם. ספין למטה המוצרים PCR באמצעות האפשרות ריצה קצרה של צנטריפוגה מיני (צלחת). לאחר מכן, מערבבים כל µL 4 של מוצר ה-PCR עם 4 µL מאגר דנטורציה. מחממים תערובות 5 דקות ב 96 ° C ומיד אחריו צעד קירור במים קר למשך 10 דקות
הערה: דוגמאות צריך לטעון את הג'ל לזיהוי (שלב 4.5) מיד אחרי זה. - המסרק להסיר הג'ל לזיהוי (שלב 4.1.6) ולהשתמש micropipette עם לגמרי לטעון כל מדגם לתוך חריץ ג'ל. הפעל אלקטרופורזה בשמונה W לכל ג'ל בזמן קירור ללא הרף את יחידת אלקטרופורזה 10 ° C. פועל הזמן הנדרש תלוי בגודל של קטע להפרידם. עבור קטע בגדלים כ 210 bp, זמן ריצה של-3.5 שעות נחשבת המתאים.
- להכין אמבט מוכתמים, יוצקים 1,000 מ ל 1 x TBE לתוך פלסטיק מרובע בצורת תיבת אטום לאור, להוסיף 30 µL של צביעת צבע (מתאים כתם DNA נטושים יחיד) עם פיפטה microliter. סגור את המכסה של תיבת פלסטיק ומנערת כדי להבטיח חלוקה שוויונית של לצבוע מכתימים.
- להסיר את הקלטת ג'ל מן החדר אלקטרופורזה, הפרד בזהירות את לוח הזכוכית מחורץ של הג'ל. החלק את הג'ל לזיהוי של לוח הזכוכית ריק לאמבטיה מוכתמים. במקום האמבטיה מכתימים על גבי ג'ל פלטפורמת ואת כתם חזק למשך 20-30 דקות עם טלטול מתמיד.
- בג'ל בקפידה מהאמבטיה מכתימים ומניחים אותו על השולחן UV של מערכת תיעוד.
הערה: עקב חוסר היציבות של הג'ל מומלץ להתמודד את צעד קודם עם שני אנשים. אדם אחד צריך להחזיק את האמבטיה מכתימים ליד השולחן UV, עוד אחד צריך להושיט יד אל מתחת הג'ל עם שתי הידיים, תוציא את זה, והחלק אותו על השולחן UV. - לסגור את המכסה או את הדלת של מערכת תיעוד ואני רוצה לצלם כמה תמונות על פי היצרן ' ההדרכה s.
5. לזהות מרובות בלע לאחרונה טרף קבוצות במקביל באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס.
- ניתוח תוכן הבטן DNA תמציות באמצעות ומהצמיגים המיועדות לקבוצות 16 מגדיר נתון בטבלה מס ' 2, עם פריימר אחד של ערכת מתויג עקב שינוי עם צבע מכתימים (ראה עמודה בטבלה 2 שכותרתה השינוי), ולהשתמש בשיטות זיהוי מקבילי של הרצפים (sequencer) האוטומטי.
- שימוש הפתרון עובד של תמציות דנ א (המוכנים לפי השלבים 1.1 כדי 1.3.11) והתנהגות להפריד מותני עבור כל פריימר כמו שמתואר צעדים 2.1.1 כדי 2.1.5 (וריאציות של התערובת מקבלים טבלה 2). השתמש בפקד אחד לפחות עם דנ א טהור מאחד השייכים אוכלוסיית היעד המתאים (בקרה חיובית) ושליטה שלילי אחד עם דנ א טהור מן המינים לצרכן ב- PCR כל לרוץ.
- מותני לרוץ ב thermocycler באמצעות פרוטוקול ה-PCR סטנדרטי בהתחשב בשלב 2.1.4, התרגלו טמפרטורה מחזק בהתאמה (, מספר מחזורי) עבור כל פריימר להגדיר נתון בטבלה מס ' 2-
הערה: השתמש בהקצאת דנ א באותה התגובה בארות PCR עם כל אחד 16 ערכות פריימר שונים כדי לפשט באגירת עוקבות של PCR מוצרים עבור לקישוט אוטומטיות רסיס ניתוחים. - PCR חנות מוצרים ב-20 ° C עד מותני כל השייכים אצווה אחת עבור הניתוחים אוטומטיות רסיס (ראה טבלה 2) סיים. לשמור על מוצרי ה-PCR בחושך, אין לאחסן אותם יותר מ 1 שבוע לפני ניתוח שבר.
בטבלה 2: פרטים של 2 אצוות של 15 זוגות קבוצה ספציפית פריימר שנקבעו על-ידי. Koester et al. (2013), הזוג החדש תוכנן של פריימר Jae28S הגברה מחוזות rDNA 18S או 28S מקבוצות היעד 16 של macroinvertebrates הימית. f, תחל קדימה; r, תחל הפוכה; 18S, פריימר מטרות 18S rDNA יחידה משנית; 28S, פריימר מטרות 28S rDNA יחידה משנית. " Hydrobiologia, הוא Dikerogammarus villosus (צוות, Gammaridae) ' שרימפסים ' במערכת נהר הריין?, 768, 2016, טבלה S1, חומר משלים page 2, Koester Meike, בסטיאן באייר, רנה Gergs, (© ספרינגר הבינלאומי פרסום שוויץ 2015) " עם אישור של שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של השולחן הזה.
- כדי לזהות הרסיסים מוגבר של כל ערכות פריימר 16 לערוך ניתוח אוטומטיות רסיס 2 אצוות נתון בטבלה מס ' 2. השתמש תקן גודל פנימי (דנ א גודל ערכה - 400 [אצווה B] ו- 600 [אצווה A], בהתאמה) כדי לקבוע את אורך קטע. להכין את צלחת רצף הרצפים (sequencer) אוטומטית כפי שתואר בשלבים הבאים. הערה הליך זה יתכן יותאם אם באמצעות פלטפורמה עוד יותר בהתחשב בטבלת חומרים.
- כדי להפעיל כל אצווה-דגימה, להכין תערובת המכילה פתרון טעינה הדגימה (SLS) ואת גודל בהתאמה סטנדרטי. פיפטה 21.6 µL של SLS ו- 0.4 µL של ה-DNA בגודל סטנדרטי ערכת - 600 לכל דגימה של אצווה A, בהתאמה, µL 21.7 של SLS ו- 0.3 µL של ה-DNA בגודל סטנדרטי ערכת- 400 לדגימה של אצווה בי
- לקחת את המוצרים ה-PCR של מותני 8 השייכים אצווה המתאימים מהמקפיא, להפשיר אותם. להבטיח כי הם נשמרים עדיין בחושך.
- השתמש על פיפטה microliter כדי לטעון את מספר בארות של צלחת רצף הצורך (מספר דוגמאות כדי להיות מנותח) עם כל µL 22 של תערובת בהתאמה שמתואר בשלב 5.2.1. ספין למטה המוצרים ה-PCR של כל אחד מותני 8 באמצעות האפשרות ריצה קצרה של צנטריפוגה מיני (צלחת). להעביר את כל µL 1 לכל מוצר ה-PCR של כל אחד מותני 8 לתוך הבארות בהתאמה של רצף לצלחת עם פיפטה microliter.
- בקפידה ספין למטה תערובת זו בתוך רצף לצלחת עם ריצה קצרה של צנטריפוגה צלחת מיני, כיסוי כל הבארות המשמשות עם טיפה אחת של שמן מינרלי. למלא את התגובה המתאימים בארות של צלחת מאגר 250-300 µL מאגר ההפרדה דנ א.
- להשתמש בתוכנה על נימי ברצף כדי ליצור מלכודת דגימה לפי היצרן ' s הוראות. הקצה את שיטות כדי לשלוט מדגם ערכות לקבוע את הרצף של שיטות כדי לשמש כדי לעבד נתונים (ראו טבלה 3 להפעלת תנאים נאותים לשימוש עם תקן גודל נתון בטבלה חומרים). שימו לב: חשוב כי ההקצאה של דגימות בתוך הגדרת מדגם תואם את הקצאת מדגם בצלחת רצף (כולל פקדים חיוביים ושליליים, ראה שלב 5.1.1) וניתוחים כי השיטה נאותה שבר עם בהתאמה גודל סטנדרטי נבחר.
- למלא מגש הרטבה במים יונים והכנס את רצף צלחת, צלחת מאגר ומגש הרטבה לתוך נימי ברצף. הכנס מחסנית ג'ל המכיל כמות מספקת של טרי ג'ל ההפרדה דנ א הנדרש עבור הדגימה להפעיל. הפעל את הצלחת רצף באמצעות הגדרת מדגם מוכן.
| denature | נפרד | צינור קפילר | מזריקים | ||||
| טמפרטורה | בזמן | מתח | זמן | מתח | זמן | ||
| בגודל 600 רגיל | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 דקות | 50 מעלות ולחכות Temp: כן | 2.0 kV | 30 s |
| בגודל 400 רגיל | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 min | 50 מעלות ולחכות Temp: כן | 2.0 kV | 30 s |
טבלה 3: תנאים מסוימים עבור ניתוח שבר על הרצפים (sequencer) אוטומטית באמצעות הסטנדרטים גודל נתון בטבלה חומרים.
- לנתח את התוצאות לייצא נתונים גולמיים ולהעלות אותם נתונים לתוכנית ניתוח שבר. לבחור צבע רגיל במצוות צבע ליצרן המתאימים כדי להגדיר ערוצי צבע לצבוע.
- צור לוח חלוקה לרמות לטווח הצפוי של אורך קטע מוגבר על ידי ומהצמיגים ייחודיות לקבוצה אחת מגדיר בתוך אצווה על פי המדריך למשתמש של התוכנית.
- לעיבוד הנתונים, בחר את לוח בהתאמה, תקן בגודל המתאים, הצבע הרגיל ואת סוג של ניתוח, להפעיל שגרת. בחר באפשרות electropherogram להצגת אותות פלואורסצנט עוצמות של מכשירי אלקטרופורזה נימי עקבות שורה אחת עבור כל צבע לצבוע. סמני/פריימר ערכות יוצג המציין את הטווח פרגמנט בהתאמה, האורך המדויק של השבר זוהה המזוהים עם המרכז של כל שיא הנקרא יודגשו (רוב התוכניות על ידי צבע או פיזור ובועות) באופן אוטומטי.
- עבור כל דגימה, לחשב כמה קרוב הדגימה ' s פנימי בגודל סטנדרטי תואם התקן בגודל שנבחר כדי להרגיע את ההצלחה של דה קולינג גודל. רוב התוכניות ניתוחי שבר יש אפשרות לחשב והמחש במשחק הזה באופן אוטומטי. אם דה קולינג גודל נכשלה, חזור על מקטע ניתוח עבור הדגימות.
- חזותי לבדוק שוב את electropherogram של כל דגימה, לאשר/unconfirm כל שיא קרא כל סמן/פריימר להגדיר בנפרד. פסגות לא במקום להתאים את הקריטריונים של ערכת סמן/פריימר או למחוק הלא נכונות על פי המדריך למשתמש של התוכנה ששימשה הוספה ידנית. להחיל על זוג בסיסים גודל או סל השם ' אלל התווית '. לחישוב והצגה שיא במפרט ' שיא שולחן '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השתמשנו בהצלחה את השלבים המתוארים בפרק זה פרוטוקול דיאטה ניתוחים במסגרת מחקרים שונים. בחלק זה, אנו מציגים דוגמאות המתארות את הישימות של הסעיפים השונים של הפרוטוקול.
לדוגמה, כדי להדגים את היעילות של קבוצות ייחודיות לקבוצה פריימר נוסדה על ידי מחברים28 , הפוטנציאל של נוסף במורד הזרם ניתוחים של מוצרי ה-PCR על ידי ניתוחים SSCP, ניסוי האכלה נערך. יחידים של Dikerogammarus villosus כמו טורפים וזחלים spp. Caenis כמו טרף נלכדו נהר הריין, נידחים ליד קרלסרוהה (גרמניה). במעבדה, taxa הטורף והטרף הוחזקו בנפרד במים מסוננים זרם ב- 20 ° C, הורעב 36 שעות. לניסוי, דגימות amphipod היו ממוקמים בתוך בקבוקונים עם זרם מסונן מים (100 מ ל) האכיל בנפרד, עם שלושה הזחלים Caenis במשך 30 דקות, לאחר מכן קופאת חנקן נוזלי. מערכת העיכול של כל villosus ד היה גזור, דנ א נעקר כפי שמתואר פרוטוקול 1. ה-DNA תמציות נבדקו עם ומהצמיגים Caep28S סט לזהות spp. Caenis באמצעות פרוטוקול ה-PCR המתאים28 כפי שמתואר פרוטוקול 3. כדי לוודא את ההבדלים בין שברי מוגבר של מינים שונים של Caenis , PCR נערך עם דוגמאות תוכן הבטן, טהור דגימות די אן איי של שלושה מינים הפניה Caenis . Agarose בג'ל הוביל להקות יחיד של DNA כפול נטושים, אשר לא ניתן להבחין בין בין המינים Caenis שונים עם סוג זה של אלקטרופורזה (איור 2 א). לעומת זאת, על-ידי SSCP בג'ל, כפי שמתואר פרוטוקול 4, ניתן היה לזהות טרף אורגניזמים לרמה מינים על-ידי השוואת הדגימות תוכן הבטן עם הדגימות הפניה (איור 2B). SSCP תבנית שבר של שלושת הפניה taxa Caenis beskidensis (איור 2B, ליין 1), Caenis horaria (איור 2B, ליין 2), , Caenis luctuosa (איור 2B, ליין 3) כללה ארבע להקות עם דפוסים דיפרנציאבילית. שני מדגמים תוכן הבטן (איור 2B, ליין 4 ו-5) היה תבנית שבר שווה לזה של luctuosa ג (איור 2B, ליין 3). התבנית המקטע השלישי בטן תוכן המדגם (איור 2B, ליין 6) היה זהה לזה של horaria ג (איור 2B, ליין 2). ניתוחים רצף של השני בטן תוכן דגימות מזוהות luctuosa ג ו horaria ג (איור 2B, ליין 4 ו- 6) ולאמת הזן הפניה בהתאמה תוצאה זו (ראה תוספת electronical יישור fasta קובץ).
איור 2: התמונה המקורית של (A) agarose בג'ל וניתוח SSCP (B) של ה-PCR קטעי תוכן הבטן, דוגמיות מוגבר מוגדר פריימר Caep28S. מסלולים 1-3 הצג את הדוגמיות של המין Caenis beskidensis (1), Caenis horaria (2) ו- Caenis luctuosa (3). נתיבים 4-6, מוצגים הדפוס רסיס של דוגמאות תוכן הבטן שונים amphipod Dikerogammarus villosus . ליין 7 מציג את תבנית שבר של סולם הדנ א bp 100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
יתר על כן, נערך ניסוי מעבדה מים קרדית השייכים המין Hygrobates fluviatilis ניזון chironomid הזחלים לא רק לקבוע אם ניתן להבחין דנ א של אנשים chironomid נצרך ב קרדית מים, אבל גם כדי לבדוק אם כמות ה-DNA מזוהה תלוי הזמן שחלף מאז הצריכה של הטרף29. לאחר כמהים קרדית כשבוע, הוצע קרדית כל אחד זחל chironomid מזון. יחידים קרדית מים כל 3-4 היו קבוע אתנול (המוחלט) עבור ניתוח גנטי באמצעות ערכת פריימר Chiro18S מסוים dipteran המשפחה ימשושיים28 -1, 2, 3, 7, 9, 24, 32, 50 ח אחרי שמאכילים29. כמו תואר של הצריכה על ידי יחידים קרדית מים, אנשים טרף בהתאמה סווגו לקטגוריות האכלה חמש הבאות: 1 = בעור לחלוטין נשאב החוצה, רוקן לחלוטין (> 90%), 2 = כמעט לחלוטין נשאב החוצה (> 75-90%), 3 = חצי נשאב החוצה (> 50-75%), 4 = רק חלקית נשאב החוצה (> 5-50%), 5 = אין שינוי נראה לעין של הטרף הגוף מבנה (≤5%)29. דנ א היה שחולצו מן קרדית מים כפי שמתואר פרוטוקול 1 (ללא שלבים 1.2.1 ו- 1.2.2), הנוכחות של 18S rDNA תמצית ואת היעילות פונקציונלי של התבנית אומתו כפי שמתואר פרוטוקול 2. זיהוי של טרף DNA בוצעה על פי פרוטוקול 4 רק את Chiro18S באמצעות פריימר לשדך את פריימר לפנים עם תוויות פלורסנט לצבוע (ראה טבלה 2) ו- DNA גודל ערכה - 400. כדי לאפשר השוואות בין דגימות מנותח בתוך הפעלות שונות של הרצפים (sequencer) אוטומטיים, היחס בין מדגם שיא גובה שיא גובה הקרוב תקן פנימי (כלומר, 360 bp במקרה זה) של כל מדגם היו מחושבים ומשמש פרוקסי עבור כמות ה-DNA מזוהה. תוצאות המחקר הראו כי ה-DNA chironomid היה לזיהוי אצל אנשים כמעט כל Hygrobates fluviatilis ניזונו הזחלים chironomid29. מן המרווח הקצר (1h לאחר האכלה) ועד התקופה הארוכה ביותר לאחר האכלה (50 ח) את החלק היחסי של הטרף שזוהו DNA היה משמעותי מופחתת (איור 3 א)29. יתר על כן, היחס בין הזמן לאחר האכלה הסיווג טרף כמדד עבור הסכום בלע טרף שדנ א יכול להיות אישר (איור 3B)29. ההפחתה של טרף DNA מזוהה עם הגדלת זמן לאחר האכלה היה סביר לחלוטין לידי ההשפלה של ה-DNA, עיכול הטרף, כי egestion של טרף הדנ א הוא מאוד בלתי סביר בשל היעדר פי-טבעת מים קרדית29. תוצאות אלו מאשרים את התאמתו של גישה זו עבור כימות של הטרף בלע.
איור 3: קשרי גומלין בין לאומי ln-יחס (לדוגמה-לשיא לגבהים ותנאי360 שיא גובה) ו (א) זמן לאחר האכלה של קרדית וקטגוריה האכלה (B) (n = 23). "ניסיונית, Acarology חלה, הגילוי הראשון של טרף דנ א ב Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): גישה חדשה לקביעת היחסים טורף-טרף מים קרדיות, 67, 376, מרטין פ מ Koester, ל' Schynawa, ר' Gergs, (© ספרינגר הבינלאומי פרסום Switzerlו 2015) "עם אישור של שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
כדי לחקור את החשיבות של טריפה על ידי פולשני amphipod villosus ד ב הניתוחים איזוטופ יציב שדה, אינטנסיבי של אלפא13C ואלפא15N villosus ד ומשאבי מזון פוטנציאלי היו קידם מאת מולקולרית הזיהוי של טרף בלע לאחרונה בתוך תוכן הבטן של האנשים באותו המדויק. בסך הכל, villosus ד 206, מיחידים אתרים שונים היו שנאספו מערכת העיכול של כל אדם היה גזור, DNA שהופק על-פי פרוטוקול 1. הנוכחות ואת יעילות תפקודית של התבניות בשימוש היה סמוך ובטוח כפי שמתואר פרוטוקול 2. האחרונות טריפה על ידי אנשים villosus ד על מספר macroinvertebrate טרף taxa נבחנה כפי שמתואר פרוטוקול 4. בסך הכל, רק 16% של תוכן הבטן villosus ד נבחנה חיובית עבור DNA השייכות לכל אחד taxa טרף macroinvertebrate יישוב 16, ונתמך ולכן התוצאות של הבדיקות איזוטופ יציב שציינה התנהגות האכילה predacious נמוך של amphipod פולשנית שדה27. בזמן, במסגרת הבדיקות גנטי, הדנ א של 12 taxa קורבן שנבדקה נמצאה בדוגמת תוכן הבטן לפחות 1, ה-DNA של 4 אחרים טרף taxa מעולם לא היה שזוהו (איור 4)27.
איור 4: היסטוגרמה הממחישות המספר בהתאמה של יחידים villosus ד מכל אתרי עשר שתוכנו בטן נבחנה חיובית עבור macroinvertebrate טרף דנ א. PCR בוצע עם 16 קבוצות ייחודיות לקבוצה פריימר כמצוין. "Hydrobiologia, הוא Dikerogammarus villosus (צוות, Gammaridae) 'שרימפס רוצח' במערכת נהר הריין?, 768, 2016, 310, Koester Meike, בסטיאן באייר, רנה Gergs, (©) 2015 שוויץ הפרסום הבינלאומי ספרינגר" עם אישור של שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
קובץ משלים. Sequence_alignement_feeding_trial.fasta אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה קלה וחסכונית עבור נחישות מבוססי ה-PCR של טורף-טרף אינטראקציות מדגימות שדה באמצעות תחל קבוצה ספציפית עבור אזורים rDNA, אשר יכול להיות משולב עם אחרים ניתוחים שאינם-מולקולרית של דגימות באותו. עם זאת, ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, שמבטיח יחודיות של תחל שימוש חיוני. שנית, זה הכרחי למנוע זיהום ואובדן של חומר תוכן הבטן במהלך ההכנה של דרכי העיכול, את מיצוי הבאים של ה-DNA. בזמן זיהום קרוס-sample יכול להוביל זיהוי חיובי כוזב של הטרף DNA, אובדן של הבטן תוכן החומר עלול להוביל חסר לעתים נדירות צרך טרף מינים. אימות של הנוכחות של rDNA השייכים את יחידת משנה בהתאמה ואת היעילות פונקציונלי של תבניות המשמשות הניתוחים (סעיף 2 לפרוטוקול) חיונית לאיסוף נציג מידע על הטרף הנצרכת. זה במיוחד קריטית, אם אין דנ א של קבוצות טרף שהצרכן אמור ניזונים יכול להיות שזוהו25,27. יתר על כן, בעת הכנת את מותני (שלבים 3.1, 5.1.1 ו- 5.1.2) חשוב כי התערובת ואת פרוטוקול המשמש בדיוק להתאים את הקריטריונים שבהם מן המפתח בהתאמה צוינה לקבוצה מסוימת של taxa. אחרת, הגברה של דנ א בתוך התגובה PCR עשוי להיכשל לחלוטין או ה-DNA של taxa לא ממוקד אולי הגברה גם כן. לכן, חובה להשתמש חיובי והפעלת פקדי שלילי בתוך כל PCR כדי להבטיח כי התגובה PCR עבדו ללא זיהום אירעה. בנוסף, יש צורך כי המערך של הדגימות עבור כל הפעלה PCR מתועדת בדיוק כדי לאפשר את ההקצאה הנכון של הטרף נצרך כדי הדגימה הצרכן בהתאמה. עבור משימה זו, זהירות מסוים צריך להילקח תוך איגום מוצרי ה-PCR לזיהוי במקביל של מספר קבוצות טרף באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס (שלב 5.2.3).
איתור של קטעים מוגבר באמצעות agarose ג'ל אלקטרופורזה (שלבים 3.2 ו- 3.3) agarose ג'לים צריך להיות דק ככל האפשר, הטיפול צריכה להילקח במהלך הבדיקה החזותית של התמונה כדי למנוע חסרים קטעים עם רזולוציה ויזואלית נמוכה. לקבלת תוצאות של המסקנה המתאימה על הטרף הצריכה על ידי הצרכן, חשוב אפילו לעתים רחוקות נצרך טרף taxa מזוהים. Agarose עבה ג'לים להפחית הניראות של כמויות פוטנציאל נמוך של הטרף DNA, וכך להפחית את ההסתברות מתגעגע טרף נצרך לעיתים רחוקות ולהציג הוודאות ב מסקנות מניתוח. יתר על כן, מבחינת בריאות, באמצעות חלופה פחות - או רעיל מאשר אתידיום ברומיד עבור מכתימה את ג'ל יכול להיות מומלץ. הפרוטוקול עבור הבאים במורד הזרם ניתוח נוסף של קטעים מוגבר באמצעות ניתוחים SSCP באמצעות ג'ל לזיהוי כוללת כמה שלבים צריך להתבצע בזהירות מסוימת. זה חשוב כי קלטת ג'ל התאספו עמיד בפני נזילה (שלב 4.1.3), הפתרון לזיהוי ניתנת מספיק זמן פולימריזציה לחלוטין (שלב 4.1.6). פתיחת בקלטת מוקדם מדי תוביל דולף אקרילאמיד נוזלי פתרון ו, למרות העובדה כי ההכנה יש להתחיל מההתחלה, מקיף לנקות צריך להיעשות גם כן. יתר על כן, מעביר את הג'ל לזיהוי לאמבטיה מכתימים (שלב 4.7) ומשם אל הצרכים טבלה (שלב 4.8) UV להיעשות בזהירות רבה עקב חוסר היציבות של ג'לים כאלה. אחרת, הג'ל עלולה להיקרע, שברי יכול להיות משובשות, מה שמוביל הצורך לחזור על התהליך.
דרישה גדולה אחת בהצלחה עיבוד נתונים שהתקבלו מניתוחי אוטומטיות רסיס הוא תקן גודל פנימי של המדגם תתאם את התבנית בגודל סטנדרטי שניתנו על ידי היצרן (שלב 5.3.3) כדי לאפשר קביעת אורך המקטע המתאימה. דבר זה חיוני במיוחד כי אחרת, שברים שונים, בלוחיות של פלורסנט באותו צבע, צביעת יכול להיות מוקצה כדי taxa הטרף הלא נכון, ולכן להוביל משפח מלאה של אינטראקציות טורף-טרף. יתר על כן, electropherograms לעתים קרובות להציג את רעשי הרקע. כדי ליצור ביטחון של פרשנות, זה חיוני כי הפסגות של תקן גודל פנימי הם גבוה בהרבה רעש רקע של המדגם. כתוצאה מכך, פסגות עבור כל סמן/פריימר צריך להיות ספרתי רק אם הם גבוהה בצורה משמעותית מזו רעשי הרקע.
פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לזהות מספר קבוצות של הטרף taxa עניין בתוך צרכנים שונות של עניין. אמנם, המיועדות לקבוצות תחל ייתכן לא כבר זמין עבור כל טקסון טרף פוטנציאלי של עניין. למרות זאת, המיועדות לקבוצות תחל זמינים רק עבור מספר macroinvertebrate מים מתוקים taxa28, אלא גם עבור מגוון רחב של taxa אחרים (למשל, מספר ימיים macroinvertebrate taxa16,30 ו נפוץ taxa מעופפים חרקים31). ובכך, הבחירה של קבוצה ספציפית פריימר קובע מתאימים להגביר את ה-DNA של כל המין הטרף של טקסון נתון, אך לא הצליחו ההגברה של ה-DNA של מינים לא שייך זה טקסון, היא חיונית32. צוינו תחל המיועדות לקבוצות רבות אשר זמינות כעת עבור טווח נתון של taxa (למשל, taxa 130 של מים מתוקים macroinvertebrates נפוצות מערכת של נהר הריין28). לכן, כדי למנוע תוצאות false-שלילי או חיובי-false, יחודיות של תחל כזה צריך להיבדק עבור טווח משותף של המערכת האקולוגית של עניין לפני היישום שלהם עבור היעד taxa הצרכנים אינו נכלל בטווח של taxa עבור taxa אשר תחל הוקם. יתר על כן, אם לא ניתוחים מולקולריים האלו ישולב עם ניתוחים אחרים של ניתוח בודדים, באותו המדויק מערכת העיכול שאולי ניתן לדלג.
ובכל זאת, לנתח את מערכת העיכול של דגימות גדולה יותר גם מונע כשל של מיצוי DNA בגלל יותר מדי חומר, מפחית את הנוכחות של הצרכן-DNA תמצית מדגם. עם זאת, מחקרים הראו כי באמצעות תחל חסימה ספציפית, אשר לצרף הדנ א של הצרכן, ובכך לחסום אותה, עבור התגובה PCR יכול ביעילות לשפר ההגברה של רצפים נדירים ב דגימות מעורב33. לכן, ניתוח מערכת העיכול יכול להימנע, אפילו בעת התמודדות עם דגימות הצרכן גדול יותר, על ידי שימוש תחל חסימה ספציפית. לצורך זיהוי מקבילי של amplicons נגזר קבוצות ייחודיות לקבוצה פריימר מרובות באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס, להקפיד בבחירת מכתים לצבוע כתווית. ובכך, צריך יהיה מתויג פריימר מערכות הגברה שברי באותו האורך עם צבעי פלורסנט ניתן להבחנה ברורה. יתר על כן, יש מגוון של מערכות אלקטרופורזה נימי זמינים של יצרנים שונים. כמה מהמערכות הללו כביכול לאפשר הקביעה של שברים מרובים אפילו באמצעות צבעי לא ספציפי. פרוטוקול המובאת כאן בקלות יכולה להיות מכוונת לאיתור שברי מוגבר עם כל מערכות אלה. מלבד זאת, כדי לצמצם את הזמן הדרוש עבור tהוא מנתח, זה יהיה אפשרי למטב את מבחני מולטיפלקס יחיד-PCR כדי להגביר את ה-DNA של הטרף קבוצות של אצווה ניתוח שבר אחד בו זמנית (למשל, בו-זמנית הגברה של אורגניזמים טרף 12 של חיפושיות34 או עד שישה המעופף חרק taxa31).
חיסרון פוטנציאלי של המעיים תוכן באופן כללי, ועל כן גם הבדיקות המתוארות פרוטוקול זה, הפתרון הזמני נמוכה. שיטות כאלה, זה רק ניתן לזהות אורגניזמים בלע לאחרונה, ואשר עלולה להוביל אי ודאות, חשיבותה של אורגניזמים טרף יחידה2. עם זאת, אנחנו הראו כי ניתוח גנטי לפי פרוטוקול זה יכול בקלות להיות משולב עם ניתוח של איזוטופים יציבים (אלפא15N ואלפא13C) של המדויק אותו הצרכן דגימות25,27. מכשיר זמן-שילוב טבעי מעקב של אינטראקציות טורף-טרף, איזוטופ יציב ניתוחים משמשים לעתים קרובות כדי לאפיין מארג מזון מבנים1, אלא פוטנציאל ערכים חופפים איזוטרופי ממינים שונים טרף לעיתים קרובות לעכב המדויק הגדרה של טורף-טרף אינטראקציות2. לכן, שימוש בפרוטוקול זה עבור ניתוחים גנטית בשילוב עם ניתוח איזוטופ יציב להתגבר החסרונות של כל יכולה שיטה נוספת הבנתנו במארג המזון והקשר שלהן כדי פלקסים מזין או אנרגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים שערותיו ארוכות ואפורות Classen ממכון המחקר על המערכת האקולוגית ניתוח והערכה (gaiac), RWTH אאכן על הסיוע בהקמת קבוצות ייחודיות לקבוצה פריימר בשימוש בפרוטוקול זה. אנו מודים גם פיטר מרטין, לורה Schynawa מ אוניברסיטת קיל עבור שיתוף הפעולה בניסויים של קרדית מים. אנו מודים גם את אסיסטנטים טכני לצורך שמירת למעבדה תקינה והכנת הקופה של חברות ושל מספרי קטלוג. עבודה זו נתמכה על ידי קרן מחקר גרמני (DFG; פרוייקט ג ' נרל אלקטריק 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
- Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
- Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
- Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
- Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
- Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
- Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
- Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
- Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
- Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
- Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
- Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
- Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
- Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
- Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
- Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
- Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
- Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
- Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
- Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
- Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
- Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6 (2007).
- Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
- Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
- Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
- Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831 (2007).
- Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).
- Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
- Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12 (2008).
- Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).
