Summary
无脊椎动物最常见的肠道成分分析是可视的。由于需要对猎物生物体的形态多样性有强烈的了解, 他们会想念身体柔软的猎物, 由于对猎物的强烈粉碎, 对包括片在内的一些生物体来说几乎是不可能的。我们提供了详细的, 新的遗传方法, 动物猎物识别在饮食中的片。
Abstract
分析食物网对于更好地了解生态系统是至关重要的。例如, 食物网络的相互作用可能会因非土著物种的入侵而发生严重的变化。然而, 在许多情况下, 对场捕食者-食饵相互作用的精确识别是困难的。这些分析通常是基于对肠道内容的视觉评估或稳定同位素比率的分析 (δ15N 和δ13C)。这些方法需要对个别捕食生物体的形态多样性或同位素特征进行全面的了解, 从而导致对猎物生物体的准确识别的障碍。视觉肠道内容分析, 特别是低估了软体的猎物有机体, 因为浸泡, 摄食和消化的猎物有机体, 使鉴定的特定物种很难。因此, 聚合酶链反应 (PCR) 为基础的策略, 例如使用组特定的入门集, 提供了一个强大的工具, 调查食物网络互动。在这里, 我们描述了详细的协议, 以调查的肠道内容的动物消费者从现场使用的组特定的入门套核核糖体脱氧核糖核酸 (rDNA)。DNA 可以从整个标本中提取 (在小分类群的情况下), 或者从野外采集的标本的肠道内容。dna 模板的存在和功能的效率需要直接从被测试的个体中得到确认, 使用针对各自 dna 亚基的通用引物集。我们还证明, 被消耗的猎物可以进一步确定的物种水平通过 PCR 与未修改的组特异性引物结合随后单链构象多态性 (SSCP) 分析使用聚丙烯酰胺凝胶。此外, 我们还表明, 使用不同的荧光染料作为标签, 可以通过自动片段分析从多个肠道含量样本中对不同猎物群的 DNA 片段进行平行筛选。
Introduction
捕食-食饵的相互作用, 构成了大多数的营养相互作用和食物网络动力学, 是关键的方面, 以表征物质和能量的通量在整个食物链内和之间的生态系统, 这是生态学的主要目标之一1. 碳和养分的来源和流动的确定是进一步了解生态系统之间的连通性2。然而, 生态系统, 如河流及其汇水区, 不仅与有机物和养分的通量有关, 而且还由生物体的运动3。因此, 生境的改变中断了与这些系统挂钩的资源流动, 这不仅直接而且间接地改变了捕食者-猎物群落的组成, 从而极大地改变了这两个生态系的食物网。例如, 食物网的变化已经被证明与单一捕食物种 (例如, 虹鳟鱼)4的移动有关。这种变化可能威胁生物多样性和水生生态系统的运作。因此, 分析这一领域中的捕食者与猎物的相互作用, 对于确定人类引起的环境变化 (如水管理做法) 对水生生态系统当地生物多样性的影响至关重要。
由于在复杂的系统中跟踪营养关联是困难的, 因此已经建立了几种方法来评估在5字段中的喂养交互。传统上, 在田间觅食相互作用的研究是基于对猎物遗骸的视觉识别在解剖内脏和需要广泛的知识关于形态学猎物多样性。视觉肠内容分析提供了一些消费者群体的资源使用的洞察力 (例如,龙虾的饮食的季节性变化6和鱼7,8或喂养偏好的桡足类)。然而, 消化的物理过程使视觉肠内容分析变得困难, 通常会漏掉软体的猎物-有机体9。对于以液体摄取为食的物种或某些无脊椎动物的消费者, 在进食前密集粉碎他们的食物, 如片, 在肠道内容中对猎物种类的视觉识别是不可能的10。由于这些限制, 分子分析提供了一个有希望的选择。
分子分析现在已经成为一种常见的工具, 允许快速和精确的猎物检测肠道内容。这种技术的范围多种多样: 基于单克隆抗体或聚合酶链反应 (PCR) 的策略经常被使用, 因为它们具有高特异性和敏感性11。开发新的单克隆抗体是时间和成本密集型, 因此, 当抗体不存在11时, 其他分子技术的应用就更有用了。另一种常见的方法是放大脱氧核糖核酸 (脱氧核糖核酸) 的区域, 象核糖体核糖核酸 (RNA) 基因存在于多数种类, 使用普遍引物设置12,13。在使用这种技术时, 通常不可能在混合来源的 DNA14中确定整个捕食生物体的范围。有效的方法, 以避免这种缺点是使用组特定的入门集的遗传肠道内容分析。设计为只放大特定目标群的 DNA 区域并排除所有其他物种15,16, 组特定的引物可在指定组的分类级别上识别捕食生物体, 而无需时间和成本密集型的二次分析。然而, 像所有的肠道内容分析, 这种分析只提供了一个喂养行为的快照。因此, 结合分子肠含量分析与时间自然示踪剂 (例如,稳定同位素) 的分析被认为是有益的1,2。
在这里, 我们描述了一个详细的方法, pcr 调查的捕食-猎物的相互作用使用组特定的引物的核核糖体 DNA (rDNA) 地区与稳定同位素分析的同一标本。我们描述了通过琼脂糖凝胶电泳检测单个猎物群的 DNA。此外, 我们还提供了一个机会, 进一步下游分析 PCR 产品的这种特定的群体特异性底漆适用于任何时候更高的分类分辨率比底漆的特异性是必需的。由于单股 DNA (ssDNA) 片段形成了由其主序17确定的三级构象, 因此由这种基团特异的引物放大的片段的微小变化会导致构象变化。这种变化可以检测到单链构象多态性 (SSCP) 分析与聚丙烯酰胺凝胶17,18, 使更精确的识别猎物生物体 (下至物种水平)。
虽然琼脂糖凝胶电泳是一个常见的和廉价的工具, 可视化 dna 片段和确定其近似长度19, 分辨率取决于 dna 的数量和染色染料使用20。通常, 在使用纯 DNA 样本时, 可视化是直接的, 但是在消费者的肠道中潜在的少量的猎物 dna 可能会使琼脂糖凝胶电泳结果的评分复杂化。尽管如此, 这种检测方法是可行的, 以筛选少量的消费样本从外地的一个或几个猎物群, 但复杂的评分, 使筛选的大量样本的多个猎物群非常时间密集, 从而不切实际.更灵敏的检测方法是通过毛细管电泳自动分析碎片, 另外还允许确定片段的确切长度21。一些微卫星研究表明, 通过使用不同的荧光染料作为标签, 可以通过自动片段分析22,23来检测和确定可比较长度的不同片段. 24。因此, 我们还提出了一个详细的协议, 并行检测 DNA 从多个猎物群使用 PCR 与标记组特定的底漆集和检测通过自动片段分析与自动排序器。此外, 我们提出的案例研究的结果表明, 通过自动片段分析检测猎物的 DNA 是一种方法, 也使相对量化的摄入猎物。
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Protocol
1. 收集和 #160; 从田间无脊椎动物, 并准备样本进行遗传肠道含量分析.
- 在每个站点收集无脊椎动物, 将个人感兴趣的个体分类为单管, 并将其直接冷冻在液氮或干冰中, 以防止肠道间隙和 DNA 降解.
注意: 避免在酒精中储存样品, 因为一些无脊椎动物倾向于在酒精杀死它们之前反刍. - 仅使用中等大小的胃肠道 (大约和 #62; 3 mm) 动物种用于遗传肠道含量的分析因此, 样品的剩余物质可以用于其他程序 ( 例如, 稳定同位素分析)。请注意, 这是不适用的调查非常小类群, 如水螨。因此, 可以跳过1.2.1 和1.2.2 的步骤.
- 稍微解冻一个人, 并仔细解剖其胃肠道下的显微镜使用精细不锈钢钳。确保不要刺穿胃肠道以避免物质丢失.
- 清洁钳使用净化解决方案, 以消除 DNA 和 RNA 污染后, 每个胃肠道准备。因此, 在去污液中孵育镊子10分钟。之后, 用无菌水冲洗, 去除残留痕迹, 用无毛纸巾擦拭.
- 将解剖过的胃肠道转移到2.0 毫升的安全锁反应管中, 其中含有440和 #181; l (450 和 #181; l 可能使用重复吸管) 盐萃取缓冲 [萨博; 0.4 M 氯化钠 (氯化钠), 10 毫米三羟甲基氨基盐酸盐 (三盐酸) ph 值 8.0, 2 毫米乙酸酸二钠盐脱水 (EDTA) ph 值 8.0]。存储准备好的样品在和 #8722; 20 和 #176; C 立即直到 DNA 的提取。确保 DNA 将在几天内提取.
- 使用修改后的盐提取协议 25 来提取 DNA.
- 从冰箱取出样本。用镊子将一个5毫米的不锈钢珠加到每个样品管上, 并将冷冻样品放在室温 (RT) 的长凳上解冻。使用珠磨质样品1分钟, 在15赫兹.
- 用离心机的短期运行来旋转样品。使用升管添加90和 #181; l (100 和 #181; l 可能使用重复吸管) 10% 十二烷基硫酸钠溶液 (SDS) 和5和 #181; 10 毫克/毫升蛋白酶 K.
- 涡旋样品彻底和孵化混合物为1小时在60和 #176; C 以恒定的震动在400转每分钟在 thermomixer。此外, 彻底涡旋样品每10分钟进一步促进裂解.
- 用离心机的短期运行来旋转样品, 增加350和 #181; 5 米氯化钠与升吸管和漩涡彻底地大约 0.5-1 min. 离心机样品40分钟 16200 x g at 5 和 #176; C.
注: 如果有多组在一排必须做, 离心机的温度设置需要稍微提高 (不高于10和 #160; 和 #176; C), 因为 SDS 倾向于絮, 如果温度过低. - 使用升管传输大约600和 #181; L 上清成一个新的1.5 毫升反应管。#160; 小心不要从小球上移除任何东西.
- 将不锈钢珠从反应管中取出, 放入不锈钢茶叶过滤器中, 用自来水清洗, 并在培养皿中将其孵化为10分钟, 用消毒液彻底冲洗消毒液。水和商店清洁珠在乙醇 (和 #62; 99%, 等级) 或干, 直到重用.
注意: 在这一步中不需要直接对珠子进行清洗, 而是可以在下列步骤中等待时间时完成. - 添加600和 #181; 用升吸管将 ice-cold 异丙醇 (a 级) 升至上清液, 并小心地倒置管几次。在-20 和 #176 过夜储存样品; C.
- 从冰箱取出样品, 并将其离心20分钟, 在16200和 #215; g 和室温。小心地丢弃上清液, 并小心地用无绒布的纸巾把管子擦干。请注意, 如果周围温度高 (超过25和 #160; 和 #176; c), 离心机在5和 #160; #176; c. 避免颗粒在丢弃上清液时打滑.
- 用70% 乙醇清洗含有 DNA 的颗粒。为此, 添加200和 #181; ice-cold 乙醇 (70%、C 级) 使用升吸管和离心机样品10分钟, 在 16200 x g 和室温 (或5和 #176; 如果需要)。小心地丢弃上清液, 并小心地用无绒布的纸巾把管子擦干。使用10和 #181; l 吸管调整到大约8和 #181; 我要小心地移开剩余的上清液。确保不要扰乱小球.
- 在60和 #176 ° C 或室温下将颗粒干燥约5-20 分钟, 直到所有乙醇蒸发.
- 将颗粒溶于50-100 和 #181; 无核酸 (蒸汽灭菌和 DEPC 处理) 水 (ddH 2 O), 等待至少1小时 (虽然在晚上4和 #176; C) 将获得更好的结果. 根据制造商和 #39 的说明,
- 测量每个样品中含有的 DNA 的数量, 并采用微量分光光度计。对含有大约 2-10 ng DNA/和 #181 的样品进行稀释处理; 把库存溶液放在冰箱里。保持工作的解决方案在冰箱, 并确保进一步的样品处理很快完成.
2。验证 DNA 提取物的功能效率, 以便随后检测最近摄入的猎物.
- 要确保模板的存在和功能效率, 请使用适用于相应食物来源的通用入门集 ( (如 无脊椎动物 16 ) 测试每个 DNA 提取物 (步骤1.1 到 1.3.11) 26 ), 目标与特定于组的初级引物相同的核亚基, 用于后续检测猎物 25 , 27 。以下步骤是指使用通用入门集 NSF1419/20 和 NSR1642/16 16 和 #160;D 1、D2 和 #160; fw1 和路易斯安那州立 #160;D 1, D2 和 #160; rev2 或路易斯安那州立 #160;D 1, D2 和 #160; rev4 26 。为了证明 pcr 反应是成功的, 并没有发生污染, 使用一个积极的控制, 其中含有 dna 已经被放大成功, 一个控制样本含有 ddH 2 O 而不是 dna 在每个 pcr 运行.
- 准备入门工作解决方案, 其中包含最后的浓度10和 #181; M 的底漆, 吸管适当数量的相关底漆的解决方案和 ddH 的 2 O (取决于库存溶液的浓度) 成新鲜1.5 毫升反应管使用 micropipettes.
- 添加底漆, 核苷酸混合 (dNTPs), 反应缓冲, Taq DNA 聚合酶和 ddH 2 O 在一个1.5 或2.0 毫升 (取决于样品数要处理) 反应管, 然后漩涡这种混合物。10和 #160 的标准反应混合物的详细容积. 和 #181. PCR 反应在 表 1 中给出 (有关所用化学品的详细信息, 请参阅 材料表 ).
- 使用升管将每个1和 #181 的 DNA 提取物转移到9和 #181 中; le 标准反应混合物在 pcr 管之内 (或 pcr 板材的井)。关闭反应管或板的反应井 (带帽条纹).
- 程序 thermocycler: NSF1419/20 和 NSR1642/16 的标准协议 16 入门集是:94 和 #176; c 为4分钟 (变性), 后跟30循环94和 #176; c 为三十年代, 50 和 #176; c (退火温度) 为三十年代, 72和 #176; c 为九十年代, 并且最后的引伸在72和 #176; c 为 10 min。对于路易斯安那州立会入门集 26 , 使用以下方法:94、#176; c 为4分钟, 后跟45循环94和 #176; c 为二十年代、52.5 和 #176; c 为二十年代, 72 和 #176; c 为九十年代, 最后的扩展在72和 #176; c 为 8 min.
- 将 PCR 管或板放入 thermocycler, 关闭循环的盖子, 然后启动相应的程序.
- 用含有三碱、硼酸和 EDTA (缓冲) 的缓冲液和琼脂糖制备1.5% 琼脂糖凝胶。用于制备1.5% 琼脂糖凝胶, 使用具有 10 cm 和 #215 的整体尺寸的凝胶铸造托盘; 7.5 厘米和 #215; 3 厘米, 称0.45 克琼脂糖为圆锥烧瓶, 使用测量缸, 以衡量30毫升的1x 的缓冲区 (89 和 #160; 毫米和 #160;、#160;p #160; 7.6、89、#160、毫米、#160、硼酸、#160、酸、2、#160、#160 #160 h 和;p; 8.0) 倒入圆锥烧瓶中。用微波炉加热混合物。当有大气泡时, 请停止微波, 小心地旋转烧瓶, 直到溶液只有一个阶段.
- 将解决方案冷却到大约60和 #176; C, 在水浴中旋转烧瓶。将溶液迅速倒入凝胶铸造托盘中, 除去气泡, 并插入梳子。等待约20分钟, 直到凝胶硬化.
- 用0.5x 填充电泳装置, 插入含有琼脂糖凝胶的凝胶铸造托盘。确保胶槽没有气泡.
- 使用迷你 (平板) 离心机的短时选择来旋转 PCR 产品。使用升吸管混合每3和 #181; PCR 和 #160;p 产品与1和 #181; l 6x 装载染料 (40% 蔗糖和0.25% 溴蓝色) 和装载它入琼脂糖凝胶的胶凝体插槽。吸管1.5 和 #181; L 100 bp DNA 梯到每条线的一个插槽中, 升吸管作为尺寸标准。正确更换电泳装置的盖子, 并将导线连接到电源。运行凝胶在100伏/cm 为35分钟.
- 要准备一个染色浴, 倒入1000毫升的1x 到一个方形的塑料盒不透水的光。添加50和 #181; 溴和 #160; 溴化物用升吸管, 关上塑料盒的盖子, 摇动它以确保溴和 #160 的均匀分布; 溴化.
- 从电泳装置中取出凝胶, 并将其放入染色槽中约10分钟。然后, 从染色液中取出凝胶, 并将其放到凝胶文件系统中, 并根据手册进行可视化.
- 仅分析显示阳性结果的样本 (在琼脂糖凝胶中有足够大小可视的碎片), 以用于随后检测最近摄入的猎物的模板的存在和功能效率.
| PCR-混合 | 集中工作解决方案 | 混合10和 #181; pcr 反应 | 在 pcr 的最终浓度|
| 0.5 和 #956; l | 0.5 #181; m | 入门 RW | 10 和 #181; m | 0.5 和 #181; M |
| 反应缓冲区 (20 毫米三-HCl, pH 值 8.55, 16 毫米 (NH4) 2SO4 和2毫米 MgCl2 最终浓度) | 1 和 #181; m | 1 和 #956; l | 1 和 #181; m |
| 10 mm | 0.25 和 #956; l | 0.25 mM | |
| Taq 聚合酶 | 5 u | 0.1 和 #956; l | 0.05 u |
| ddH 2 0 | 6.65 和 #956; l | 9 和 #956; l | |
| DNA | 1 和 #956; l |
表 1: 用于制备10和 #181 的标准反应混合物的详细协议......
3. 使用凝胶电泳检测最近摄入的猎物/食品与组特定的底漆.
- 使用 DNA 提取的工作解决方案 (根据步骤 1.1 1.3.11) 和特定于组的入门集 (未标记的, 即没有修改的 ) 进行 PCR, 该方法适用于目标群, 如所述步骤2.1.1 到 2.1.3 (为各自底漆集合的反应混合物的变化, 参见表 2)。使用步骤2.1.4 中给出的标准协议运行 PCR (对于各自底漆的退火温度, 见表 2).
- 使用一个具有纯 dna 的控件, 从属于各自目标群 (正向控制) 的样本和一个在每个 PCR 运行中的来自消费物种的纯 dna 的负控制.
- 检查 PCR 反应的成功使用琼脂糖凝胶电泳描述的步骤 2.1.6 2.1.11。PCR 反应是成功的, 如果适当长度的片段 (参见 表 2 ) 是可看见的为正面控制, 但不为阴性控制。如果其中一个或两个标准未实现, 重复 PCR.
- 使用琼脂糖凝胶电泳, 如2.1.6 至2.1.11 的步骤所述, 用来检测目标的猎物群是否已被测试过的不同的消费者样本所消耗 (通过判断适当长度的片段是否可见)。请确保不要错过具有低视觉分辨率的片段.
- 将 PCR 产品存储在4和 #176; c, 如果进一步分析将在未来24小时内进行, 或在-20 和 #176; 如果分析将在以后进行.
4。随后通过聚丙烯酰胺凝胶 SSCP 分析确定了下游消耗的猎物.
- 为 SSCP 电泳准备9% 丙烯酰胺凝胶。在实验室中准备工作解决方案.
- 准备200毫升丙烯酰胺工作溶液, 用20毫升的 10x (三基109克, 硼酸和 #160, 55 克的酸和40毫升的 EDTA, pH 0.50 溶解于1000年毫升的 ddH 8.0 O) 和另一个2毫升 45 (40%)丙烯酰胺混合。将和丙烯酰胺混合成一个毕业的烧瓶 (一个200毫升标记的毕业玻璃瓶也适合在这里), 并添加 ddH 2 O 到 200 ml 标记。在需要时, 在冰箱 (4 和 #176 C) 中保持工作解决方案。不要使用早于一周的工作解决方案.
- 称过硫酸铵 (aps; 使用至少0.01 克精确度的平衡) 为1毫升的体积烧瓶, 并通过添加 ddH 2 O 达到毕业标记, 以准备 10% aps 的库存解决方案。将等分 (大约350和 #181; L) 转化为新鲜的反应管.
注: 每个聚丙烯酰胺凝胶需要一个分。存储剩余的 aliqu在-20 和 #176; C 和只有解冻等分不久才需要. - 组装一个胶盒, 两个玻璃板, 一个空白和一个缺口玻璃板 (每20厘米 x 20 厘米), 与间隔 (1.5 毫米厚) 之间, 他们运行的玻璃的两侧。使用右侧和左侧的每三折回夹 (32 mm) 固定的凝胶盒 ( 图 1 ).
- 在圆锥烧瓶中混合5克琼脂糖和250毫升1x 的缓冲液, 为2% 琼脂糖凝胶制备溶液。加热和事后冷却的混合物, 在步骤2.1.6 和2.1.7 描述。将溶液迅速倒入方形塑料盒 (21 #160; cm 和 #160; x 6.5 和 #160; cm 和 #160; x 5 和 #160; cm), 并将胶盒 (步骤 4.1.3) 的下端放入琼脂糖溶液中。将胶盒下端的折边夹调整到高度, 使它们坐在方形塑料盒的边缘 ( 图 1 )。等待约20-30 分钟, 直到琼脂糖插头完全硬化.
- 用丙烯酰胺工作溶液 (步骤 4.1.1) 填充100毫升测量缸, 直到60毫升的标记和倒入烧杯中的溶液。使用微添加300和 #181; l 的一个分的 APS 股票解决方案 (步骤 4.1.2), 并随后添加37.5 和 #181; l tetramethylethylenediamine (TEMED)。迅速, 倒在凝胶盒的玻璃板之间的解决方案。或者, 在玻璃板与100毫升一次性注射器之间注入1000和 #181 的溶液; 在注射器的注射头上调整吸管尖.
- 小心地在玻璃板的上端插入一个1.5 毫米厚的标准梳。梳子必须被聚丙烯酰胺溶液包围。等待约1小时, 直到聚丙烯酰胺凝胶聚合。尽量避免在聚合过程中的通风, 因为这会增加凝胶聚合的时间.
注: 有可能储存在密封塑料袋内的凝胶与湿纸巾在冰箱长达3天.
图 1: 图片演示施工中倒入聚丙烯酰胺凝胶. 请单击此处查看此图的较大版本.
- 将含有聚丙烯酰胺凝胶的凝胶盒放入垂直电泳装置中。将所需量 (视电泳装置的类型) 的 0.5x, 冷却至10和 #176; C 使用冷冻循环器.
- 对于 DNA 变性, 预热一个热块/-循环到96和 #176; c. 用95% 甲酰胺 (99.5% 级) 和5% 含0.25% 溴蓝和 40% (w/v) 蔗糖的水溶液制备变性缓冲器.
- 将 PCR 产品从冰箱或冰箱中取出并解冻。使用迷你 (平板) 离心机的短时选择来旋转 PCR 产品。然后, 将每4和 #181 的 PCR 产品与4和 #181 的 l 进行混合, 进行变性缓冲。热混合物为5分钟在96和 #176; C 紧接着冷却一步在结冰的水中为 10 min.
注: 样品应立即加载到聚丙烯酰胺凝胶 (步骤 4.5) 在此之后. - 从聚丙烯酰胺凝胶 (步骤 4.1.6) 中取出梳子, 并使用微将每个样品完全加载到凝胶槽中。运行电泳 8 W 每凝胶, 而不断冷却电泳单位到10和 #176; c. 所需的运行时间取决于要分离的片段的大小。对于大约 210 bp 的片段大小, 大约 3.5 h 的运行时间被认为是适当的.
- 要准备一个染色浴, 倒入1000毫升的1x 到一个方形的塑料盒不透水的光, 并添加30和 #181; 染色染料 (适用于染色单绞 DNA) 与升吸管。关闭塑料盒的盖子, 摇动它以确保染色染料的均匀分布.
- 从电泳室中取出凝胶盒, 并小心地将缺口玻璃板与凝胶分离。将聚丙烯酰胺凝胶从空白玻璃板上滑入染色液中。将染色浴放置在20和 #160 的震动平台上和着色剂上; #160; 30 和 #160; 持续晃动的最小值.
- 将凝胶小心地从染色液中取出并放置到文档系统的 UV 表中.
注: 由于凝胶的不稳定性, 最好先处理两个人的前一步。一个人应该举行染色浴旁边的 uv 表, 另一个应该达到下的凝胶与双手, 取出, 并滑动到 uv 表. - 关闭文档系统的盖子或门, 并根据制造商和 #39 的指导手册进行拍照.
5。使用自动片段分析在并行检测多个最近摄入的猎物群.
- 使用表2中给出的16组特定底漆对肠道内容 DNA 提取物进行分析, 其中一组底漆由于染色染料的修饰而被贴上标签 (见表2栏, 标题为 "修改"), 并使用并行检测方法自动排序器.
- 使用 DNA 提取物的工作解决方案 (根据步骤1.1 对1.3.11 进行准备), 并对每个入门集进行单独的 PCRs, 如步骤2.1.1 到 2.1.5 (在 表 2 中给出了混合的变体)。使用至少一个控制与纯 dna 从属于各自的目标群 (正面控制) 和一个阴性控制与纯净的脱氧核糖核酸从消费者种类在每个 PCR 奔跑的样品.
- 使用步骤2.1.4 中给定的标准 PCR 协议在 thermocycler 中运行 PCRs, 并根据表 2 中的每个入门集的相应退火温度 (和周期数) 进行调整.
注: 使用相同的反应井 DNA 分配的 pcr 与16种不同的底漆集, 以简化后续聚合 pcr 产品的分批自动化片段分析. - 将 PCR 产品存储在-20 和 #176; C 直到所有属于一个批次的 PCRs 自动片段分析 (请参见 表 2 ) 完成。将 PCR 产品保存在黑暗中, 不要在碎片分析前超过1周保存.
表 2: 2 批15组特定入门对的详细信息由 Koester et al. 建立(2013) 和新设计的 Jae28S 底漆对18S 或 28S rDNA 的区域, 从16目标群水生无脊椎动物。f、正向引物;r, 反向底漆;18S、底漆目标为 18S rDNA 亚基;28S、底漆目标28SrDNA 亚基。和 #34; Hydrobiologia, 是 Dikerogammarus villosus (甲壳, Gammaridae) a 和 #39; 杀手虾和 #39; 在莱茵河系统中？, 768, 2016, 表 S1, 补充材料页 2, Koester 美, 拜耳巴斯蒂安, Gergs 仁和 #233;, #169;国际出版瑞士 2015) 和 #34; 获得斯普林斯的许可 请单击此处查看此表的较大版本.
- 检测所有16入门集的放大片段, 在表2中给出的2批中进行自动片段分析。使用内部尺寸标准 (DNA 大小标准试剂盒-400 (批次 B) 和-600 [批次 A] 来确定片段长度。如以下步骤所述, 准备测序板和自动排序器。请注意, 如果使用其他平台, 则可能需要调整此过程, 而不是在 "材料" 表中提供的.
- 要运行每个批处理示例, 请准备一个包含示例加载解决方案 (SLS) 的混合物和相应的大小标准。21.6、#160、#181、SLS、0.4、#160、#181、#160、大小、#160; 标准和 #160; 试剂盒和 #160;-和 #160; 600、21.7 和 #160; #181; 和 #160; #181; #160; 大小; #160; 标准和 #160; 试剂盒; #160;和 #160; 400 每样批次 B.
- 将 8 PCRs 的 PCR 产品从冷冻库中取出, 然后解冻。确保他们仍然被蒙在鼓里.
- 使用升吸管来加载所需的测序板的井数 (要分析的样品数), 每个22和 #160; 和 #181; 在步骤5.2.1 中描述的混合物利用迷你 (平板) 离心机的短时选择, 对 8 PCRs 的 PCR 产物进行自旋。每个1和 #181 的每一个 PCR 产品每 8 PCRs 入各自的井测序板材与升吸管.
- 小心地在测序板内旋下这种混合物, 用一个短的小型平板离心机, 并覆盖每一滴矿物油所用的井。用250-300 和 #181 的缓冲板填充各自的反应井; DNA 分离缓冲器的 L.
- 使用该软件进行毛细管排序器, 根据制造商和 #39 的说明创建示例设置。指定用于控制示例集的方法, 并确定用于处理数据的方法序列 (请参见 表 3 , 以满足在 材料表 中给定的大小标准使用的运行条件。请注意, 在样本设置中的样本分配与测序板中的样本分配 (包括正和负控制, 见步骤 5.1.1) 是非常关键的, 并且该方法足够用于片段分析与各自选择尺寸标准.
- 用去离子水填充润湿托盘, 然后将测序板、缓冲板和润湿托盘插入毛细管序。插入一个含有足够数量的新鲜 DNA 分离凝胶的凝胶盒, 这是样品运行所需的。使用准备好的示例设置运行测序板.
| 变性 | 分开 | 毛细管注入 | |||||
| 温度 | 时间 | 电压 | 时间 | 电压 | 时间 | ||
| 大小标准 600 | 90 和 #176; c | 120s | 4.8 伏 | 60 min | 50 和 #176; c 等待 Temp: 是 | 2.0 kv | 三十年代 |
| 大小标准 400 | 90 和 #176; c | 120s | 6 伏 | 45 min | 50 和 #176; c 等待 Temp: 是 | 2.0 kv | 三十年代 |
表 3: 使用材料表中给定的大小标准对自动排序器进行碎片分析的特定条件.
- 分析结果导出原始数据并将这些数据上载到片段分析程序。选择标准染料颜色顺序各自制造商设置染料颜色渠道.
- 创建一个面板, 根据程序的用户手册, 在批处理中按单个组特定的入门集放大片段长度的预期范围.
- 若要处理数据, 请选择相应的面板、适当的大小标准、标准颜色以及分析和运行过程的类型。选择电泳选项, 从毛细管电泳仪中显示荧光信号强度, 作为每种染料颜色的单线跟踪。将显示标记/入门集, 指示各自的片段范围和与每个被称为峰值的中心关联的检测片段的确切长度将被高亮显示 (在大多数程序中, 通过着色或指定名称).
- 对于每个示例, 计算示例和 #39 的内部大小标准与所选大小标准的匹配程度, 以保证大小调用的成功。大多数片段分析程序都有一个自动计算和可视化匹配的选项。如果大小调用失败, 则对这些示例重复片段分析.
- 目视检查每个样品的电泳, 并确认/取消每个标记/底漆分别设置的每个峰值。根据使用的程序的用户手册, 手动插入符合标记/底漆设置标准或删除错误的峰值。在和 #39 中应用基对大小或 bin 名称; 等位基因标签和 #39;。计算并显示 #39;P 讲表和 #39 中的峰值规格;.
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Representative Results
我们成功地使用了本协议中描述的步骤进行不同研究中的饮食分析。在本节中, 我们将介绍该协议不同部分的适用性的示例。
以 SSCP 分析为例, 演示了作者28建立的组特定引物集的有效性以及对 PCR 产物进行进一步下游分析的潜力, 并进行了饲喂试验。个体的Dikerogammarus villosus作为捕食者和Caenis的猎物被捕获的河流莱茵河和死水附近的卡尔斯鲁厄 (德国)。在实验室中, 捕食者和捕食类群分别在20° c 的过滤河水中被单独保存, 并被饿死36小时。在实验中, 片标本分别放置在烧杯过滤流水 (100 毫升), 喂食两到三Caenis幼虫30分钟, 并随后冷冻在液氮中。对每个villosus的胃肠道进行解剖, 并按照协议1中的描述提取 DNA。DNA 提取物的检测与 Caep28S 底漆集适合探测Caenis , 使用适当的 PCR 协议28 , 如协议3所述。为了验证不同Caenis物种的放大片段之间的差异, 采用了三个Caenis参考物种的肠道含量样本和纯 DNA 样本进行 PCR。琼脂糖凝胶电泳导致单波段双绞股 DNA, 不能区分不同的Caenis物种与这种类型的电泳 (图 2A)。相比之下, 通过 SSCP 凝胶电泳 (如协议4所述), 通过将肠道含量样本与参考样本 (图 2B) 进行比较, 可以将猎物生物体识别为物种级别。三参考类群的 SSCP 片段模式Caenis beskidensis (图 2B、lane 1)、 Caenis horaria (图 2B、lane 2)、和Caenis luctuosa (图 2B, 车道 3)由四带可微的模式组成。两个肠道内容样本 (图 2B, 车道4和 5) 的片段模式等于C. luctuosa (图 2B, 3 车道)。第三种肠道内容样本 (图 2B, lane 6) 的片段模式与C. horaria (图 2B, lane 2) 相同。两种肠道含量样品的序列分析被确定为luctuosa和c. horaria (图 2B, 车道4和 6) 和各自的参考种类证实了这个结果 (参见电子补充对准 fasta 文件)。
图 2:原始图像 (A) 琼脂糖凝胶电泳和 (B) SSCP 分析 PCR 片段的肠道内容和参考样品放大的 Caep28S 底漆集。车道1-3 显示的参考样本的物种Caenis beskidensis (1), Caenis horaria (2) 和Caenis luctuosa (3)。在4-6 车道, 介绍了片Dikerogammarus villosus的不同肠道含量样本的片段模式。7车道显示了 100 bp DNA 阶梯的片段模式。请单击此处查看此图的较大版本.
此外, 还进行了一项实验室试验, 其中的水螨属于该物种的Hygrobates fluviatilis , 以摇幼虫为食, 不仅可以确定在水螨中是否能检测到摇个体的 DNA,还要测试检测到的 DNA 数量是否取决于从消耗猎物的时间29。在饥饿螨大约一个星期以后, 每螨被提供了一摇幼虫作为食物。每3-4 个水螨个体被固定在乙醇 (绝对) 的遗传分析使用 Chiro18S 底漆集特定的 dipteran 家族摇28在 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 和 50 h 后, 被喂食29。作为一个消耗量由水螨个体, 各自的猎物个体被分类入以下五哺养的类别: 1 = 完全地被吮, 珠完全地倒空 (和 #62; 90%), 2 = 几乎完全地被吮 (和 #62;75-90%), 3 = 半吮 (和 #62; 50-75%), 4 = 只部份地吮了 (和 #62; 5-50%), 5 = 没有明显的变化在猎物的身体结构 (5%)29。DNA 是从水螨中提取的, 如协议 1 (不含步骤1.2.1 和 1.2.2), 并且在提取物中存在 18S rDNA 和模板的功能效率, 如协议2所述。根据协议4的规定, 使用荧光染料 (见表 2) 和 DNA 尺寸标准试剂盒-400 的 Chiro18S 底漆, 对猎物 dna 进行检测。为了允许在自动排序器的不同运行中分析的样本进行比较, 计算了每个样本的峰值高度与最接近的内部标准的峰值高度之间的比值 (在本例中为即, 360 bp), 并将其用作用于检测到的 DNA 数量的代理。结果表明, 在摇幼虫29上, 几乎所有的Hygrobates fluviatilis的个体都能检测到摇 DNA。从最短的时间间隔 (1 小时后喂养) 到喂养后最长的时间 (50 h), 检测到的猎物 DNA 的相对数量明显减少 (图 3A)29。此外, 还可以确定摄食后的时间与猎物的分类之间的关系 (图 3B)29。在进食后增加的时间内发现的猎物 dna 的减少最有可能完全反映在 dna 的降解和猎物的消化, 因为排的猎物 dna 是非常难以置信的, 由于缺乏肛门在水螨29。这些结果证实了这种方法对摄食猎物的定量的适用性。
图 3:国家 ln 高度-比率 (样本-峰值高度/标准360峰值高度) 和 (A) 在螨喂养后的时间和 (B) 喂养类别 (n = 23) 之间的关系。"实验和应用 Acarology, 第一次检测猎物 DNA 在Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, 蜱螨亚纲): 一个新的方法来确定在水螨的捕食者-猎物关系, 67, 376, p. 马丁, m. Koester, l. Schynawa, r. Gergs, (©国际出版瑞士和 2015) "允许的斯普林斯。请单击此处查看此图的较大版本.
为了研究侵入性片在野外的重要作用, 在villosus的作用下, 强稳定同位素分析δ13C 和δ15N 的villosus和潜在的食物资源得到了进一步的分子检测最近摄入的猎物在肠道内的内容完全相同的个人。总共收集了来自不同地点的 206 villosus个体, 解剖了每个个体的胃肠道, 并根据协议1提取了 DNA。如协议2所述, 所使用模板的存在和功能效率得到保证。最近的捕食由villosus个人对多个动物的捕食类群进行了测试, 如协议4所述。总的来说, 只有16% 的D. villosus肠道内容对属于16种目标的动物猎物群的 DNA 进行了阳性检测, 因此支持稳定同位素分析结果, 表明低捕食摄食行为侵入性片在字段27。在遗传分析中, 在至少1的肠道含量样本中发现了12种被测猎物群的 dna, 但从未检测到其他4个猎物分类群的 dna (图 4)27。
图 4:直方图, 用于说明villosus的各自数量, 来自所有十站点的个人, 其肠道内容检测为动物的猎物 DNA 阳性.用16组特定的引物进行 PCR。"Hydrobiologia, 是Dikerogammarus villosus (甲壳, Gammaridae) 在莱茵河系统中的 ' 杀手虾 '？, 768, 2016, 310, Koester 美, 拜耳巴斯蒂安, Gergs ren é, (©斯普林国际出版瑞士 2015)" 允许springer.请单击此处查看此图的较大版本.
补充文件Sequence_alignement_feeding_trial. fasta请单击此处下载此文件.
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Discussion
在这里, 我们提出了一个简单和经济高效的方法, pcr 确定的捕食-猎物的相互作用, 从田间样品通过组特定引物的 rDNA 地区, 可以结合其他 non-molecular 分析相同的标本。但是, 该协议中有几个关键步骤。首先, 保证所用底漆的特殊性是必不可少的。其次, 在胃肠道的制备和随后的 DNA 提取过程中, 避免肠道内容物质的污染和丢失是至关重要的。虽然 cross-sample 污染可能导致对猎物 DNA 的假阳性检测, 但肠道内容物质的丢失可能导致很少被消耗的猎物物种。核查属于各自亚单位的 rDNA 的存在和用于分析的模板的功能效率 (《议定书》2节) 对于收集关于所消耗的猎物的代表性信息是必不可少的。这是特别重要的, 如果消费者的猎物群的脱氧核糖核酸不应该哺养可以被检测25,27。此外, 当准备 PCRs (步骤 3.1, 5.1.1 和 5.1.2), 这是至关重要的混合物和协议, 使用完全符合标准, 其中各自的底漆被指定给某一组的分类群。否则, PCR 反应中的 dna 放大可能会完全失效, 或者没有靶向的类群 dna 也可能被放大。因此, 必须在每个 pcr 运行中使用正负控制, 以确保 pcr 反应有效, 不发生污染。此外, 有必要为每个 PCR 运行的样品的数组是准确的文件, 以使正确分配的猎物消费到各自的消费者标本。对于这项任务, 需要特别谨慎, 同时结合 PCR 产品, 以并行检测多个猎物群通过自动片段分析 (步骤 5.2.3)。
对于使用琼脂糖凝胶电泳 (步骤3.2 和 3.3) 检测扩增的碎片, 琼脂糖凝胶应尽可能薄, 在图像的目视检查期间必须小心, 以避免视觉分辨率低的缺失碎片。对于结果和一个适当的结论关于猎物消耗量由消费者, 它是关键的甚而很少被消耗的猎物分类群被认出。浓琼脂糖凝胶降低了潜在的低数量的猎物 DNA 的能见度, 从而减少了错过很少消耗的猎物的可能性, 并引入了分析得出的结论的不确定性。此外, 从健康的角度来看, 使用比溴溴化物更少或无毒的替代品来染色凝胶可能是可取的。通过使用聚丙烯酰胺凝胶进行 SSCP 分析后进一步分析扩增碎片的议定书包括一些应特别注意的步骤。重要的是, 凝胶盒组装是防漏 (步骤 4.1.3) 和聚丙烯酰胺溶液有足够的时间聚合完全 (步骤 4.1.6)。过早打开卡带会导致液体丙烯酰胺溶液泄漏, 尽管准备工作必须从头开始, 但也需要进行大量的清理工作。此外, 将聚丙烯酰胺凝胶转移到染色浴 (步骤 4.7), 并从那里到 UV 表 (步骤 4.8) 需要非常小心, 因为这种凝胶的不稳定性。否则, 凝胶可能撕裂和碎片可能被打乱, 这导致必要重复的程序。
成功处理从自动片段分析中获得的数据的一个主要要求是, 样本的内部尺寸标准与制造商 (步骤 5.3.3) 提供的大小标准模式紧密匹配, 从而能够确定适当的片段长度。这是特别重要的, 因为否则, 不同的片段, 标签与相同的荧光染色染料, 可能被分配到错误的猎物分类, 因此导致一个完整的误判的捕食者-猎物的相互作用。此外, electropherograms 经常显示背景噪音。为了建立对解释的信心, 重要的是, 内部尺寸标准的峰值明显高于样品的背景噪声。因此, 每个标记/底漆的峰值只有当它们明显高于背景噪声时才应计算。
这一协议可以修改, 以检测多个群体的利益, 在不同的消费者感兴趣的猎物群。诚然, 对于每一个潜在的猎物群来说, 特定的引物可能已经没有了。然而, 组特定的引物不仅适用于几个淡水动物类群28, 而且也适用于其他种类繁多的分类群 (例如,几个海洋动物分类群16,30和飞行昆虫的常见分类群31)。因此, 选择适合于放大特定分类的所有捕食物种的 dna 的基团特异性引物集, 但不成功地从不属于这个分类的物种的 dna 放大, 是必不可少的32。现在已有许多特定的群特异性引物被指定用于给定范围的分类群 (例如, 在河莱茵系统28中共有的淡水无脊椎动物的130类群)。因此, 为了避免假阴性或假阳性结果, 此类引物的特异性应检查在其应用于目标分类群之前, 在其所关注的生态系中常见的分类群的范围内, 而不包括在分类群的范围内的消费者该底漆已建立。此外, 如果这些分子分析不能与其他完全相同个体的分析相结合, 胃肠道解剖可能会被忽略。
然而, 解剖更大的标本的胃肠道也防止 dna 提取失败, 因为太多的材料, 并减少在样本提取物的消费者 dna 的存在。然而, 研究表明, 使用特定的阻断引物, 它附着在消费者的 DNA, 从而阻止它, 为 PCR 反应可以有效地提高在混合样品的稀有序列的放大33。因此, 即使在处理较大的消费者标本时, 也可以通过使用特定的阻断底漆来避免胃肠道剥离。对于通过自动片段分析从多组特定的底漆中获得的增的并行检测, 应注意染色染料作为标签的选择。因此, 底漆的放大片段, 大致相同的长度应该被贴上明确的可区分荧光染料。此外, 有一系列的毛细管电泳系统可从几个制造商。这些系统中的一些甚至可以通过不染料来测定多个碎片。这里提出的协议可以很容易地被调整, 以检测放大的片段与任何这些系统。除此之外, 减少 t 所需的时间他分析, 这将是可能的优化单复用 PCR 方法, 以扩大一个片段分析批次的猎物群的 DNA 同时 (例如, 同时放大12捕食生物的甲虫34或多达六飞行昆虫分类群31)。
肠道内容分析的一个潜在的缺点一般, 因此也描述的分析在这个协议, 是低时间分辨率。有了这些方法, 只可能发现最近摄入的有机体, 这可能导致不确定的重要性单一的猎物生物体2。然而, 我们证明, 根据这个协议的遗传分析可以很容易地结合分析稳定的同位素 (δ15N 和δ13C) 的确切相同的消费者标本25,27。作为捕食者-猎物相互作用的时间自然示踪剂, 稳定同位素分析经常被用来描述食物 web 结构1, 但不同捕食物种的潜在重叠同位素值往往会阻碍精确捕食者与猎物的相互作用的定义2。因此, 利用这一协议进行遗传分析, 结合稳定同位素分析, 克服每种方法的弊端, 可以进一步了解食物网及其与养分或能量通量的关系。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Silke 克拉森的生态系统分析和评估研究所 (创), RWTH 亚琛为她的帮助建立了该协议中使用的特定于组的入门集。我们还要感谢基尔大学的彼得马丁和劳拉 Schynawa 的合作, 在水螨的实验。我们还感谢技术实验室助理保持实验室运行顺畅, 并准备注册的公司和目录编号。这项工作得到了德国研究基金会 (DFG; 项目 GE 2219/3-1) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
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