Summary
Am häufigsten Darm Inhaltsanalysen der Makroinvertebraten sind visuell. Intensive Kenntnisse über morphologische Vielfalt der Beute Organismen erfordern, sie vermissen weichen vollmundigen Beute und durch starke Zerkleinerung von Beute, sind fast unmöglich für einige Organismen, einschließlich Amphipoden. Wir bieten detaillierte, neuartigen gentechnische Ansätze für Soisgrabenbaches Identifikation in der Ernährung der Amphipoden Beute.
Abstract
Analyse von Nahrungsketten ist essentiell für ein besseres Verständnis von Ökosystemen. Nahrungsnetz-Interaktionen können zum Beispiel schwere Veränderungen verursacht durch die Invasion der nicht heimischer Arten unterziehen. Eine genaue Identifizierung der Feld-Räuber-Beute-Interaktionen ist jedoch in vielen Fällen schwierig. Diese Analysen basieren häufig auf eine visuelle Beurteilung der Darm Inhalt oder die Analyse der stabile Isotopenverhältnisse (δ15N und δ-13C). Solche Methoden erfordern umfassende Kenntnisse über, bzw. morphologische Vielfalt oder isotopische Unterzeichnung von einzelnen Beute Organismen, zu Hindernissen bei der genauen Identifizierung von Beute Organismen. Visuelle Darm Inhaltsanalysen unterschätzen besonders weichen vollmundigen Beute Organismen, weil Mazeration, Nahrungsaufnahme und Verdauung der Beute Organismen Identifizierung von spezifischen Arten erschweren. Daher Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierte Strategien, zum Beispiel die Verwendung von gruppenspezifischen Primer setzt, bieten ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Nahrungsnetz-Interaktionen. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle zur Untersuchung der Darminhalt der Verbraucher denkt vom Feld mit gruppenspezifischen Primer-Sets für nukleare ribosomale Desoxyribonukleinsäure (rDNA). DNA kann entweder vom ganzen Exemplare (bei kleinen Taxa) extrahiert oder aus Darminhalt im Feld gesammelten Exemplare. Präsenz und Funktionstüchtigkeit der DNA Vorlagen direkt von der getesteten Person bestätigt werden müssen mit universal Primer setzt gezielt die jeweiligen Untereinheit der DNA. Wir zeigen auch, dass verbrauchte Beute bestimmt werden kann, weiter bis auf Artniveau über PCR mit unveränderten gruppenspezifischen Primer, verbunden mit nachfolgenden Einzelstrang Konformation Polymorphismus (SSCP) Analysen mittels Polyacrylamid-Gele. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Verwendung von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen als Etiketten parallel Screening für DNA-Fragmente unterschiedlicher Beute Gruppen aus mehreren Darm Inhalt Proben über automatisierte Fragment Analyse ermöglicht.
Introduction
Räuber-Beute-Interaktionen, die die Mehrheit der trophischen Interaktionen und Nahrungsnetz Dynamik darstellen, sind wichtige Aspekte charakterisieren die Fluten von Materie und Energie im gesamten Nahrungsnetze innerhalb und zwischen den Ökosystemen, die eines der wichtigsten Ziele der Ökologie ist 1. die Bestimmung der Quelle und Fluss von Kohlenstoff und Nährstoffen fördert das Verständnis der ökologischen Vernetzung zwischen Ökosystemen2. Ökosysteme, wie Flüsse und ihre Einzugsgebiete werden jedoch nicht nur durch Fluten von organischen Stoffen und Nährstoffen, sondern auch durch die Bewegungen der Organismen3verknüpft. So können Lebensraum Änderungen unterbrechen die Ressourcen, die diese Systeme verbinden stark Nahrungsketten der beiden Ökosysteme nicht nur direkt, sondern indirekt auch ändern, indem Änderung der jeweiligen Zusammensetzung der Räuber-Beute-Gemeinschaften. Zum Beispiel wurden Änderungen der Nahrungsnetze gezeigt, um die Bewegungen der einzelnen Raubtier Arten (z.B., Regenbogenforelle)4verknüpft werden. Solche Veränderungen drohen möglicherweise biologische Vielfalt und das funktionieren aquatischer Ökosysteme. Daher ist es wichtig, die Auswirkungen von Menschen verursachten Umweltveränderungen, wie Wasser-Management-Praktiken, auf die Einheimischen Biodiversität aquatischer Ökosysteme, Räuber-Beute-Interaktionen im Bereich Analyse.
Da tracking trophische Beziehungen schwierig in komplexen Systemen, entstanden mehrere Ansätze, die es ermöglichen die Beurteilung der Fütterung Interaktionen in Feld5. Traditionell, Untersuchungen der Fütterung Interaktionen im Bereich basieren auf visuelle Identifizierung der Beute bleibt in seziert Mut und erfordern ein umfangreiches Wissen über die Vielfalt der morphologischen Beute. Visuelle Darm Inhaltsanalysen haben Einblicke in die Nutzung der Ressourcen von mehreren Gruppen von Verbrauchern (z. B. jahreszeitliche Variation in der Ernährung der Hummer6 und Fisch7,8 oder Fütterung Präferenzen von Copepoden) zur Verfügung gestellt. Jedoch der physikalischen Prozess der Verdauung erschwert die visuelle Darm Inhaltsanalysen und in der Regel weichen vollmundigen Beute-Organismen9vermisst. Für die Arten Fütterung durch flüssige Einnahme oder für einige wirbellose Verbraucher, die ihre Nahrung vor der Einnahme, wie Amphipoden, intensiv zerkleinern ist visuelle Identifizierung von Beutetieren im Darminhalt unmöglich10. Aufgrund dieser Einschränkungen bietet die molekulare Analyse eine viel versprechende Alternative.
Molekulare Analysen haben jetzt ein gemeinsames Instrument ermöglicht schnelle und präzise Beute Nachweis im Darminhalt geworden. Solche Techniken sind vielfältig: Strategien basierend auf monoklonalen Antikörpern oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden häufig verwendet, wegen ihrer hohen Spezifität und Sensitivität11. Die Entwicklung von neuen monoklonalen Antikörpern ist Zeit- und kostenintensiv, daher die Anwendung der anderen molekularen Techniken ist nützlich, wenn Antikörper11nicht bereits vorhanden sind. Eine andere Möglichkeit ist die Verstärkung der Regionen der Desoxyribonukleinsäure (DNA), wie ribosomale Ribonukleinsäure (RNA) Gene bei den meisten Arten, universelle Grundierung mit12,13. Wenn Sie diese Technik verwenden, ist es oft nicht möglich, das gesamte Spektrum der Beute Organismen in verschiedenen Quellen von DNA-14zu identifizieren. Ein effektiver Ansatz, diesen Nachteil zu vermeiden setzt gruppenspezifischen Primer verwenden für genetische Darm Inhaltsanalysen. Entwickelt, um nur DNA-Abschnitte bestimmter Zielgruppen zu verstärken und schließen alle anderen Arten15,16, ermöglichen gruppenspezifischen Primer Beute Organismen auf der taxonomischen Ebene der angegebenen Gruppen ohne Zeit- und kostenintensive Sekundäranalysen. Wie alle Inhaltsanalyse ausnehmen, bieten solche Analysen jedoch nur eine Momentaufnahme der Fressverhalten. Daher gilt als Kombination von molekularen Darm Inhaltsanalysen mit Analysen von Zeit-Integration von natürliche Tracer (z. B. stabile Isotope) vorteilhaft1,2.
Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode für PCR-basierte Untersuchungen der Räuber-Beute-Interaktionen mit gruppenspezifischen Primer-Sets für nukleare ribosomalen DNA (rDNA) Regionen mit stabilen Isotopen-Analysen der gleichen Probe kombiniert werden. Wir beschreiben den Nachweis der DNA des einzigen Beute Gruppen durch Agarose-Gelelektrophorese. Darüber hinaus präsentieren wir eine Gelegenheit für weitere nachgelagerte Analysen der PCR-Produkte von solchen gruppenspezifischen Primer anwendbar, wenn eine höhere taxonomische Auflösung als die Primer Spezifität erforderlich ist. Da einzelne stranded DNA (SsDNA) Form tertiären Konformationen, die durch ihre primäre Sequenz17bestimmt sind Fragmente, führen kleine Variationen in Fragmenten, die durch solche gruppenspezifischen Primer verstärkt zu Konformationsänderungen. Solche Änderungen können durch Einzelstrang Konformation Polymorphismus (SSCP) Analysen mit Polyacrylamid-Gele17,18, ermöglichen eine genauere Identifizierung der Beute Organismen (bis auf Artniveau) erkannt werden.
Während Agarose-Gelelektrophorese ist ein gemeinsamer und preiswerte Werkzeug, um DNA-Fragmente zu visualisieren und bestimmen ihre ungefähre Länge19, die Auflösung hängt von der DNA und der Färbung Farbstoff verwendet20. In der Regel die Visualisierung ist geradlinig beim Arbeiten mit reiner DNA-Proben, aber potenziell geringe Mengen an Beute DNA in den Darminhalt der Verbraucher kann das Punktesystem von Agarose-Gel-Elektrophorese-Ergebnisse erschweren. Dennoch diese Nachweismethode ist möglich, eine geringe Anzahl von Verbraucher-Proben aus dem Bereich für einen Bildschirm oder ein paar Beute Gruppen, aber Komplikation in der Wertung macht das Screening eine hohe Anzahl von Proben für mehrere Beute Taxa sehr Zeit intensiv und damit nicht praktikabel. Ein empfindlicher Nachweisverfahren ist die automatisierte Analyse von Fragmenten über Kapillarelektrophorese, wodurch zusätzlich die Bestimmung der genauen Länge des Fragmente21. Mehreren Mikrosatelliten basierten Studien haben gezeigt, dass mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen als Etiketten, es möglich ist zu erkennen und zu bestimmen, verschiedene Fragmente von vergleichbarer Länge durch automatisierte Fragment Analyse22,23, 24. Daher stellen wir auch ein detailliertes Protokoll für parallelen Detektion von DNA aus mehreren Beute Gruppen mittels PCR mit beschrifteten gruppenspezifischen Primer und Erkennung über automatisierte Fragment Analyse mit einem automatisierten Sequenzer. Darüber hinaus präsentieren wir die Ergebnisse aus einer Fallstudie demonstriert, dass die Erkennung von Beute DNA über automatisierte Fragment Analyse Ansatz ermöglicht auch eine relative Quantifizierung von angesaugte Beute.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Makroinvertebraten aus dem Feld zu sammeln und bereiten die Proben für genetische Darm Inhaltsanalysen.
- Sammeln Makroinvertebraten an jedem Standort sortieren Individuen Verbraucher Art von Interesse in einzelne Rohre und direkt Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis, Darm-Clearance und Abbau der DNA zu verhindern.
Hinweis: Vermeiden Sie Proben in Alkohol, zu speichern, weil einige Makroinvertebraten Erbrechen tendenziell vor der Alkohol tötet. - Verwenden Sie nur den Magen-Darmtrakt von mittelgroßen und großen (ca. > 3 mm) denkt Arten für genetische Darm Inhaltsanalysen, sodass die verbleibenden Angelegenheit der Probe für andere Verfahren (z. B. stabiler Isotope verwendet werden kann -Analyse). Beachten Sie, dass dies nicht zutrifft, bei der Untersuchung von sehr kleinen Taxa wie Wasser Milben. Daher können Schritte 1.2.1 und 1.2.2 übersprungen werden.
- Etwas auftauen Individuum und seine Magen-Darm-Trakt unter einem Stereomikroskop mit feinem Edelstahl Pinzette sorgfältig zu sezieren. Achten Sie darauf, nicht den Magen-Darmtrakt zur Vermeidung von Verlust der Materie Punktion.
- Clean-Zange mit Dekontaminationslösung um DNA und RNA Verunreinigungen nach der Zubereitung von jeder Magen-Darm-Trakt zu entfernen. Daher brüten Sie Zange für 10 min in die Dekontaminationslösung. Danach spülen Sie sie mit sterilem Wasser Restspuren entfernen und mit einem fusselfreien Papiertuch abwischen.
- Übertragung der seziert Magen-Darm-Trakt zu einer 2,0 mL-Safe-Lock-Reaktion Rohr mit 440 µL (450 µL möglich für den Einsatz von sich wiederholenden Pipette) Salz Extraktionspuffer [SEB; 0,4 M Natriumchlorid (NaCl), 10 mM Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethane Hydrochlorid (Tris-HCl) pH 8.0 und 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure Binatrium Salz entwässern (EDTA) pH 8.0]. Geschäft bereit Proben bei − 20 ° C sofort bis die Extraktion von DNA. Sicherzustellen, dass innerhalb von wenigen Tagen DNA extrahiert werden.
- Verwenden eine modifizierte hohem Salzgehalt Extraktion Protokoll 25 DNA extrahieren.
- Nehmen Sie Proben aus der Tiefkühltruhe. Verwenden Sie Zange, um jede Probenröhrchen ein 5 mm Edelstahl Korn hinzufügen, und lassen Sie gefrorenen Proben auf der Bank bei Raumtemperatur (RT) Auftauen. Verwenden Sie eine Rührwerksmühle, um Proben für 1 min bei 15 Hz zu homogenisieren.
- Spin-down Proben mit einem kurzen Lauf einer Zentrifuge. Mithilfe von Mikroliter Pipetten hinzu 90 µL (100 µL möglich für den Einsatz von sich wiederholenden Pipette) 10 % Sodium Dodecyl Sulfat-Lösung (SDS) und 5 µL 10 mg/mL Proteinase K.
- Vortex Proben gründlich und inkubieren Sie Mischungen für 1 h bei 60 ° C mit konstanter Schütteln bei 400 u/min auf einen Thermomixer. Darüber hinaus gründlich Wirbel Proben alle 10 Minuten zur weiteren Förderung der Lyse.
- Spin down Proben mit einem kurzen Lauf einer Zentrifuge hinzufügen 350 µL 5 M NaCl ein Mikroliter-Pipette mit Vortex gründlich für ca. 0,5 - 1 min. Zentrifuge Proben für 40 min bei 16.200 x g bei 5 ° c
Hinweis: Wenn mehrere hintereinander zu erfolgen haben, muss die Temperatureinstellung der Zentrifuge (nicht höher als 10 ° C) leicht angehoben werden, weil SDS zum Verklumpen neigt, wenn die Temperatur zu niedrig ist. - Einsatz Mikroliter Pipetten ca. 600 µL Überstand in ein neues 1,5 mL Reaktionsgefäß übertragen. Seien Sie vorsichtig, nicht alles aus dem Pellet entfernen.
- Spitze Edelstahl Perlen aus Reaktionsgefäßen in ein Teesieb aus Edelstahl mit fließendem Wasser reinigen und inkubieren sie in einer Petrischale mit der Dekontaminationslösung für 10 min. gründlich abspülen Dekontaminationslösung mit sterilen Wasser und gereinigte Perlen in Ethanol (> 99 %, p.a. Grade) oder trocken bis Wiederverwendung.
Hinweis: Reinigung von Perlen muss nicht direkt in diesem Schritt getan werden, sondern vielmehr kann getan werden, wenn in den folgenden Schritten gibt es Wartezeiten. - Fügen Sie 600 µL eiskalte Isopropanol (p.a. Klasse), der Überstand mit einem Mikroliter pipette und sorgfältig Invertieren der Röhre ein paar Mal. Speichern von Proben über Nacht bei-20 ° c
- Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und für 20 min bei 16.200 × g und Raumtemperatur zentrifugieren. Sorgfältig den Überstand verwerfen und das Rohr sorgfältig mit fusselfreien Papiertuch trocken. Hinweis das Zentrifugieren Sie wenn die Umgebungstemperatur hoch (mehr als 25 ° C), ist bei 5 ° C, die Pellets Rutschen während den Überstand verwerfen zu vermeiden.
- Waschen Holzpellets enthaltende DNA mit 70 % Ethanol. Um dies zu tun, fügen Sie 200 µL eiskaltes Ethanol (70 %, p.a.-Grade) mit einem Mikroliter-Pipette und Zentrifuge Proben für 10 min bei 16.200 x g und Raumtemperatur (oder 5 ° C, bei Bedarf). Sorgfältig den Überstand verwerfen und das Rohr sorgfältig mit fusselfreien Papiertuch trocken. Verwendung einer 10 µL Pipette auf ca. 8 µL, pipette vorsichtig aus der restlichen überstand angepasst. Achten Sie darauf, nicht zu stören das Pellet.
- Trocknen das Pellet für ca. 5-20 min bei 60 ° C oder bei Raumtemperatur an der Bank, bis das Ethanol verdampft wird.
- Auflösen Pellet in 50-100 µL Nuklease-frei (Dampf sterilisiert und DEPC behandelt) Wasser (DdH 2 O), warten Sie mindestens 1 h (obwohl bessere Resultate werden über Nacht bei 4 ° C erreicht werden).
- Messen die Menge an DNA in jeder Probe mit einem Mikro-Volume Spektralphotometer enthalten nach Angaben des Herstellers ' Anweisungen. Machen eine arbeiten-Verdünnung jeder Probe mit ca. 2 bis 10 ng DNA / µL der Stammlösung in der Tiefkühltruhe halten. Die Arbeitslösung im Kühlschrank aufbewahren und stellen Sie sicher, dass weitere Probe Verarbeitung erfolgt in Kürze.
2. Funktionstüchtigkeit des DNA-Extrakte für die spätere Erkennung von kürzlich aufgenommenen Beute zu überprüfen.
- , Um sicherzustellen, das Vorhandensein und die Funktionstüchtigkeit der Vorlagen, Testen jedes DNA-Extrakt (Schritte 1.1 bis 1.3.11) mit universal Primer setzt für die jeweiligen Nahrungsquelle geeignet (z. B. Wirbellosen 16 , 26), die gezielt die gleichen nuklearen Untereinheit als gruppenspezifischen Primer, verwendet für die spätere Erkennung von Beute 25 , 27. Die folgenden Schritte beziehen sich auf die Verwendung von universal Grundierung Sätze NSF1419/20 und NSR1642/16 16 und LSU D1, D2 fw1 und LSU D1, D2 rev2 oder LSU D1, D2 rev4 26. Um zu beweisen, dass die PCR-Reaktion erfolgreich war und, dass keine Verunreinigungen auftreten, verwenden Sie eine Positivkontrolle mit DNA, die bereits erfolgreich verstärkt worden war und eine Kontrollprobe mit DdH 2 O anstelle von DNA innerhalb jeder PCR ausführen.
- , Grundierung vorzubereiten funktionierende Lösungen, die enthalten eine Endkonzentration 10 µM des Primers, pipette die entsprechende Menge des jeweiligen Primer Lager Lösung und DdH 2 O (abhängig von der Konzentration der Vorratslösung) in einem frisch 1,5 mL Reaktionsgefäß mit Mikropipetten.
- Primer, Deoxynucleotide Mischung (dNTPs), Reaktion Puffer, Taq DNA Polymerase und DdH 2 O in einem 1,5 oder 2,0 mL (abhängig von der Anzahl der zu bearbeitenden Proben) Reaktionsgefäß, dann Wirbel fügen Sie dieser Mischung. Detaillierte Volumes für das standard Reaktionsgemisch für eine 10 µL-PCR-Reaktion sind in Tabelle 1 angegeben (für Details von Chemikalien verwendet, siehe Tabelle of Materials).
- Einsatz Mikroliter Pipetten übertragen jeweils 1 µL DNA extrahieren in 9 µL the standard Reaktionsgemisch innerhalb einer PCR-Röhre (oder einen Brunnen einer PCR-Platte). Schließen Sie das Reaktionsgefäß oder die Reaktion Vertiefungen der Platte (mit Kappe Streifen).
- Programm der Thermocycler: ist das Standardprotokoll für das NSF1419/20 und NSR1642/16 16 Grundierung Set: 94 ° C für 4 min (Denaturierung), gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 50 ° C (Temperatur Glühen) für 30 s, 72 ° C für 90 s und letzte Erweiterung bei 72 ° C für 10 Minuten. Für die LSU Grundierung 26 Sätze, verwenden Sie die folgenden: 94 ° C für 4 min, gefolgt von 45 Zyklen von 94 ° C für 20 s, 52,5 ° C für 20 s, 72 ° C für 90 s und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 8 min.
- Ort PCR Schläuche oder Platten in den Thermocycler, schließen Sie den Deckel von der Cycler, und starten Sie das jeweilige Programm.
- Bereiten Sie eine 1,5 % Agarose-gel mit einer Pufferlösung mit Tris-base, Borsäure und EDTA (TBE Puffer) und Agarose. Wiegen Sie für die Zubereitung von 1,5 % Agarosegel, ein Gel Gießen Tablett mit Abmessungen von 10 cm × 7,5 cm × 3 cm 0,45 g Agarose in einem konischen Kolben, verwenden Sie ein Messzylinder, 30 mL 1 X TBE Puffer (89 mM Tris messen pH 7.6, Borsäure 89 mM und 2 mM EDTA, pH 8,0) und gießen Sie sie in den konischen Kolben. Erhitzen Sie die Mischung mit Hilfe einer Mikrowelle. Die Mikrowelle zu stoppen, wann immer es größere Luftblasen gibt und sorgfältig die Küvette schwenken, bis die Lösung nur eine Phase hat.
- Lösung auf etwa 60 ° C abkühlen wirbeln die Flasche in ein Wasserbad. Schnell Gießen Sie die Lösung in ein Gel Gießen Tablett, entfernen Sie Luftblasen zu, und legen Sie Kämme. Warten Sie ca. 20 min, bis Gel ausgehärtet wird.
- Füllung Elektrophorese Einheit mit 0,5 x TBE und einfügen Gel Casting Tablett, enthält das Agarosegel. Stellen Sie sicher, dass die Gel-Slots frei von Luftblasen sind.
- Spin-down die PCR-Produkte mit dem kurzen Lauf Option einer Zentrifuge Mini (Platte). Verwenden Sie eine Mikroliter-Pipette, um mischen jede 3 µL des PCR-Produkt mit 1 µL 6 x laden Farbstoff (40 % Saccharose und 0,25 % Bromophenol blue) und laden Sie sie in die Gel-Slots die Agarose-Gel. Pipette 1,5 µL einer 100 bp DNA-Leiter in einem Schlitz der jede Zeile mit einem Mikroliter-Pipette als standard Größe. Setzen Sie den Deckel des Referats Elektrophorese korrekt und anschließen Sie führt an ein Netzteil. Führen Sie das Gel mit 100 V/cm für 35 min.
- , Eine Färbung Bad vorzubereiten pour 1.000 mL 1 X TBE in einer quadratischen Kunststoff-Box lichtundurchlässig. Fügen Sie 50 µL Interkalation Bromid mit einem Mikroliter-Pipette, schließen Sie den Deckel von der Kunststoff-Box und schütteln Sie sie dafür Gleichverteilung der Interkalation Bromid.
- Das Gel aus dem Elektrophorese-Gerät entfernen und legen Sie sie in der Färbung Bad für etwa 10 Minuten. Anschließend nehmen Sie das Gel aus dem Flecken Bad und platzieren Sie es auf ein Gel-Dokumentations-System entsprechend der Bedienungsanleitung zu visualisieren.
- Analysieren nur Proben, die positive Ergebnisse (Fragmente von ausreichender Größe visuelle in Agarosegel) in Bezug auf Vorhandensein und Funktionsfähigkeit von Vorlagen für die spätere Erkennung von kürzlich aufgenommenen Beute gezeigt.
| PCR-Mix | Konzentration Arbeitslösung | Mix für 10 µl PCR-Reaktion | Endkonzentration in PCR |
| Primer FW | 10 µM | 0,5 µl | 0,5 µM |
| Primer RW | 10 µM | 0,5 & #956 ; l | 0,5 µM |
| Reaktion Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16 mM (NH4) 2SO4 und 2 mM MgCl2 Endkonzentrationen) | 1 µM | 1 µl | 1 µM |
| dNTP | 10 mM | < t d > 0,25 µl0,25 mM | |
| Taq Polymerase | 5 U | 0,1 μl | 0,05 U |
| DdH 2 0 | 6.65 μl | ||
| < Stro NG > gesamt Betrag Reaktionsgemisch | 9 μl | ||
| DNA | 1 μl | ||
Tabelle 1: ausführliche Protokoll für die Vorbereitung des Reaktionsgemisches standard für 10 µL PCR Reaktion.
3. erkennen kürzlich aufgenommenen Beute/Lebensmittel mit gruppenspezifischen Primer-Sets mit Gelelektrophorese.
- Durchführung von PCR verwenden, die die Arbeitslösung DNA extrahiert (zubereitet nach Schritte 1.1 bis 1.3.11) und die gruppenspezifischen Primer (unbeschriftete, d. h. ohne Änderung) für die Beute Zielgruppe wie beschrieben in 2.1.1 bis 2.1.3 Schritte (für Variationen im Reaktionsgemisch für den jeweiligen Primer-Satz, siehe Tabelle 2). Führen Sie PCR Standardprotokolls in Schritt 2.1.4 angegeben (annealing Temperaturen für den jeweiligen Primer-Satz, siehe Tabelle 2).
- Verwenden Sie ein Steuerelement mit reiner DNA aus einer Probe, die Zugehörigkeit zu der jeweiligen Zielgruppe (Positivkontrolle) und eine Negativkontrolle mit reiner DNA von der Verbraucher-Arten in jeder PCR ausführen.
- Überprüfen den Erfolg der PCR-Reaktion unter Verwendung der Agarose-Gelelektrophorese in Schritten 2.1.6, 2.1.11 beschrieben. Die PCR-Reaktion war erfolgreich, wenn ein Fragment der entsprechenden Länge (siehe Tabelle 2) sichtbar ist für die positive Kontrolle aber nicht für die negativ-Kontrolle. Wenn eine oder beide der diese Kriterien nicht erfüllten, wiederholen Sie PCR.
- Einsatz Agarose gel Elektrophorese, wie 2.1.6, 2.1.11 beschrieben um festzustellen, ob die Beute Zielgruppe verbraucht hatte, durch die verschiedenen Verbraucher Proben getestet (per Urteil vom ob das Fragment von geeigneter Länge sichtbar ist). Achten Sie darauf, keine Fragmente mit geringen optischen Auflösung verpassen.
- Store PCR-Produkte bei 4 ° C, wenn weitere Analysen innerhalb der nächsten 24 h erfolgen werden, oder bei-20 ° C wenn Analysen später durchgeführt werden sollen.
4. Anschließend bestimmen verbrauchten Beute mit weiter flussabwärts SSCP Analyse über Polyacrylamid-Gel.
- Eine 9 % Acrylamid-Gel für SSCP Elektrophorese vorbereiten. Vorbereiten der Gebrauchslösungen in einem Labor Abzug.
- , Eine 200 mL Acrylamid funktionierende Lösung vorzubereiten, füllen ein Messzylinder mit 20 mL 10 X TBE (109 g Tris-Base, 55 g Borsäure und 40 mL 0,50 M EDTA, pH 8.0 aufgelöst in 1000 mL DdH 2 O) und ein weiteres mit 45 mL von 40 % (29,1) Acrylamid-Mix. FSME und Acrylamid-Mix in einem Messkolben (eine abgestufte Glasflasche mit einer 200 mL-Markierung ist hier auch entsprechende) gießen und DdH 2 O bis 200 mL Markierung hinzufügen. Arbeiten Sie weiter Lösung im Kühlschrank (4 ° C), bis benötigt. Verwenden Sie keine funktionierende Lösung älter als eine Woche.
- Wiegen 0,1 g Ammonium Bleichen (APS, Gebrauch ein Gleichgewicht mit mindestens 0,01 g Genauigkeit) in eine 1 mL volumetrischen Kolben und auflösen, die es durch Zugabe von DdH 2 O bis die Graduierung markieren Sie eine 10 % APS-Stammlösung vorbereiten. Übertragen Aliquote (ca. 350 µL) in frischem Reaktionsgefäßen.
Hinweis: Eine aliquote ist für jedes Polyacrylamid-Gel benötigt. Speichern Sie die verbleibenden aliquOTS bei-20 ° C und nur Aliquote Auftauen, kurz bevor sie benötigt werden. - Montieren eine Gel-Kassette zwei Glasplatten, ein Leerzeichen und einer gekerbten Glasplatte (je 20 cm x 20 cm), mit Abstandhalter (1,5 mm dick) zwischen ihnen gefährdet laufen herauf die Seiten des Glases. Verwenden Sie jede drei Fold-Back-Clips (32 mm) auf der rechten und linken Seite Gel Kassette ( Abbildung 1) zu fixieren.
- Mix 5 g Agarose und 250 mL 1 X TBE-Puffer in einem konischen Kolben vorzubereiten Lösung für ein 2 % Agarose-gel. Erhitzen Sie und kühlen Sie danach Mischung ab, wie in den Schritten 2.1.6 und 2.1.7 beschrieben. Gießen Sie rasch die Lösung in einer quadratischen Kunststoff-Box (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) und legen Sie das untere Ende der Gel-Kassette (Schritt 4.1.3) in die Agarose-Lösung. Einstellen Sie die Fold-Back-Clips am unteren Ende der Gel-Kassette bis zu einer Höhe so, dass sie auf dem Rand des quadratischen Kunststoffbox ( Abbildung 1 sitzen). Ca. 20-30 min warten, bis die Agarose-Stecker vollständig ausgehärtet ist.
- Füllen Sie eine 100 mL Messzylinder mit Acrylamid Arbeitslösung (Schritt 4.1.1) bis zur 60 mL-Markierung und Lösung in ein Becherglas gießen. Verwenden einer Mikropipette 300 µL ein Aliquot der Vorratslösung APS (Schritt 4.1.2) hinzufügen und anschließend 37,5 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) hinzufügen. Schnell, Gießen Sie die Lösung zwischen den Glasplatten der Gel-Kassette. Alternativ die Lösung zwischen den Glasplatten mit einer 100 mL Einwegspritze mit einem 1.000 µL Pipettenspitze angepasst an die Spitze der Injektion der Spritze Spritzen.
- Vorsichtig einsetzen einen 1,5 mm dicken standard-Kamm am oberen Ende zwischen den Glasplatten. Der Kamm muss durch die Polyacrylamid-Lösung eingeschlossen werden. Warten Sie ca. 1 h, bis das Polyacrylamid-Gel polymerisiert wird. Belüftung während der Polymerisation so weit wie möglich vermeiden, denn es erhöht sich den Zeitaufwand für das Gel zu polymerisieren.
Hinweis: Es ist möglich, gegossene Gele in verschlossenen Plastiktüten mit einem feuchten Tuch im Kühlschrank bis zu 3 Tage speichern.
Abbildung 1: Bild zur Veranschaulichung der Bau, Polyacrylamid-Gele gießen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- legen Sie die Gel-Kassette enthält das Polyacrylamid-Gel vorbereitet, zu einer vertikalen Elektrophorese-Einheit. Füllen Sie die Elektrophorese-Einheit mit den entsprechenden Betrag (abhängig von der Art der Elektrophorese Einheit) von 0,5 x TBE und kühlt das Gerät bis zu 10 ° C mit einer gekühlten Zirkulator.
- Für DNA Denaturierung, Heizen Sie ein Thermal-Block /-Cycler bis 96 ° C. Prepare Denaturierung Puffer mit 95 % Formamid (99,5 % p.a. Klasse) und 5 % igen wässrigen Lösung mit 0,25 % Bromophenol blue und 40 % (w/V) Saccharose.
- Die PCR-Produkte aus dem Kühlschrank oder der Tiefkühltruhe nehmen und Auftauen. Spin-down die PCR-Produkte mit dem kurzen Lauf Option einer Zentrifuge Mini (Platte). Mixen Sie jeweils 4 µL des PCR-Produkt mit 4 µL Denaturierung Puffer. Erhitzen Sie Mischungen für 5 min bei 96 ° C unmittelbar gefolgt von einem kühlenden Schritt in Eiswasser für 10 min.
Hinweis: Proben sollten auf das Polyacrylamid-Gel (Schritt 4.5) sofort im Anschluss geladen werden. - Kamm aus dem Polyacrylamid-Gel (Schritt 4.1.6) zu entfernen und mit einer Mikropipette vollständig jede Probe in ein Gel-Steckplatz geladen. 8 W pro Gel Elektrophorese Laufzeit während ständig die Kühleinheit der Elektrophorese, 10 ° C. laufen benötigte Zeit hängt von der Größe des Fragments getrennt werden. Für Fragment Größen von ca. 210 bp, die Laufzeit beträgt ca. 3,5 h angemessen.
- , Eine Färbung Bad vorzubereiten Gießen 1.000 mL 1 X TBE in einem quadratischen Kunststoff box lichtundurchlässig und hinzufügen 30 µL Farbstoff (geeignet, einzelne stranded DNA zu beflecken) Färbung mit einem Mikroliter-Pipette. Schließen Sie den Deckel von der Kunststoff-Box und schütteln Sie sie dafür Gleichverteilung der Färbung Färbung.
- Entfernen die Gel-Kassette aus der Elektrophorese-Kammer und trennen Sie die eingekerbte Glasplatte vorsichtig aus dem Gel. Schieben Sie das Polyacrylamid-Gel von der leere Glasplatte in der Färbung Bad. Legen Sie die Färbung Bad auf ein Schütteln Plattform und Fleck Gel für 20 bis 30 min. mit konstanter schütteln.
- Nimm das Gel vorsichtig aus dem Flecken Bad und lege ihn auf den UV-Tisch eines Dokumentationssystems.
Hinweis: Aufgrund der Instabilität des Gels ist es ratsam, den vorherige Schritt mit zwei Personen zu behandeln. Eine Person sollte die Färbung Bad neben dem UV-Tisch halten und ein anderes unter das Gel mit beiden Händen greifen, nehmen Sie es heraus und schieben Sie es auf den UV-Tisch sollte. - Schließen den Deckel oder Tür das Dokumentationssystem und fotografieren Sie laut Hersteller ' Bedienungsanleitung s.
5. Mehrere kürzlich eingenommen Beute Gruppen parallel mit automatisierten Fragment Analysen zu erkennen.
- Analysieren, die der Darm Inhalt DNA extrahiert mit den 16 gruppenspezifischen Primer setzt gemäß Tabelle 2, mit einer Zündkapsel eines Satzes durch Modifikation mit einer Färbung Färbung gekennzeichnet (siehe Tabelle 2 Spalte mit der Überschrift Änderung), und verwenden Sie die Methoden der parallelen Detektion von einem automatisierten Sequenzer.
- Beschriebenen nutzen die Arbeitslösung des DNA-Extrakte (zubereitet nach Schritte 1.1 bis 1.3.11) und Verhalten zu trennen PCRs für jede Grundierung wie in Schritten 2.1.1 bis 2.1.5 (Variationen in der Mischung sind in Tabelle 2 angegeben). Verwenden Sie mindestens ein Steuerelement mit reiner DNA aus einer Probe, die Zugehörigkeit zu der jeweiligen Zielgruppe (Positivkontrolle) und eine Negativkontrolle mit reiner DNA von der Verbraucher-Arten in jeder PCR ausführen.
- Laufen PCRs in den Thermocycler Standardprotokolls der PCR gegeben im Schritt 2.1.4, angepasst an die jeweiligen Anlasstemperatur (und die Anzahl der Zyklen) für jedes set in Tabelle 2 angegebenen Grundierung.
Hinweis: Verwenden Sie die gleichen DNA-Verteilung der Reaktion Brunnen für die PCR mit jedem der 16 verschiedenen Grundierung Sets zu vereinfachen, spätere Zusammenlegung von PCR-Produkte für zusammengefasst Fragment Analysen automatisierte. - Store PCR Produkte bei-20 ° C bis alle PCRs Zugehörigkeit zu einer Charge für die automatisierte Fragment-Analysen (siehe Tabelle 2) fertig sind. PCR-Produkte im Dunkeln halten und lagern Sie sie nicht länger als 1 Woche vor dem Fragment Analysen.
Tabelle 2: Details der 2 Chargen von 15 gruppenspezifischen Primer-Paaren gegründet von Koester Et al. (2013) und der neu gestalteten Jae28S Primerpaar Regionen der 18 oder 28 s rDNA aus 16 Zielgruppen aquatische Makroinvertebraten verstärken. f, forward Primer; R, reverse Primer; 18, zielt Grundierung 18 s rDNA Untereinheit; 28 s, Zündkapsel zielt auf die 28 s rDNA Untereinheit. " Hydrobiologia, Dikerogammarus Villosus (Crustacea, Gammaridae) ist ein ' killer Shrimp ' im Rhein-System?, 768, 2016, Tabelle S1, ergänzendes Material Seite 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer International Publishing Schweiz 2015) " mit freundlicher Genehmigung des Springer-Verlags. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Tabelle.
- zu erkennen, die amplifizierten Fragmente aller 16 Grundierung Sets führen Sie Analysen durch automatisierte Fragment in den 2 Chargen in Tabelle 2 angegeben. Verwenden einen interne Größe Standard (DNA-Größe Standard Kit - 400 [Charge B] und -600 [Charge A], beziehungsweise) Fragmentlänge bestimmen. Bereiten Sie die Sequenzierung Platte und automatischen Sequenzer, wie in den folgenden Schritten beschrieben. Beachten Sie, dass dieses Verfahren eingestellt werden, wenn eine andere Plattform als die angegebenen Materialien verwenden könnte.
- Laufen jede Charge-Probe, bereiten Sie eine Mischung mit Probe laden Lösung (SLS) und der jeweiligen Größe standard. Pipette 21,6 µL SLS und 0.4 µL DNA Größe Standard-Kit - 600 pro Probe eines Batch und bzw. 21,7 µL SLS und 0,3 µL DNA Größe Standard-Kit- 400 pro Probe Charge b
- Die PCR-Produkte von den 8 PCRs Zugehörigkeit zu der jeweiligen Charge aus dem Gefrierschrank nehmen und Auftauen. Stellen Sie sicher, dass sie immer noch im Dunkeln gehalten werden.
- Verwenden eine Mikroliter-Pipette, die Anzahl der Vertiefungen der Sequenzierung Platte benötigt (Anzahl der zu analysierenden Proben) laden mit jeweils 22 µL der jeweiligen Mischung im Schritt 5.2.1 beschrieben. Spin-down die PCR-Produkte von jedem der 8 PCRs mit dem kurzen Lauf Option einer Zentrifuge Mini (Platte). Jeweils 1 µL pro PCR Produkt von jeweils 8 PCRs in die jeweiligen Vertiefungen der Sequenzierung Platte mit einem Mikroliter-Pipette übertragen.
- Sorgfältig spin-down diese Mischung in die Sequenzierung Platte mit einem kurzen Lauf einer Mini-Platte-Zentrifuge und jeder der Brunnen mit einem Tropfen Mineralöl verwendet zu überlagern. Jeweiligen Reaktion Brunnen einer Puffer-Platte mit 250-300 µL DNA Trennung Puffer füllen.
- Die Software für die Kapillare Sequenzer verwenden, um erstellen Sie eine Beispiel-Setup nach Angaben des Herstellers ' Anweisungen. Weisen Sie die Methoden zum Sample-Sets zu steuern und bestimmen die Reihenfolge der Methoden verwendet, um Daten zu verarbeiten (siehe Tabelle 3 für die Ausführung von Bedingungen für die Nutzung mit der Größe Standard in der Materialtabelle angegeben). Beachten Sie, dass es entscheidend ist, dass die Verteilung der Proben innerhalb der Beispiel-Setup die Probe-Zuordnung in der Sequenzierung Platte entspricht (einschließlich positive und negative Kontrollen, siehe Schritt 5.1.1) und die Methode ausreichend für Fragment mit den jeweiligen analysiert Größe Standard gewählt wird.
- Füllen Sie ein Tablett Benetzung mit entionisiertem Wasser und legen Sie die Sequenzierung Platte, Platte Puffer und Benetzung Tablett in der Kapillare Sequencer. Setzen Sie eine Gel-Patrone mit einer ausreichenden Menge an frischen DNA Trennung Gel, welches für die Probe laufen benötigt wird. Führen Sie die Sequenzierung Platte mit dem vorbereiteten Probe Setup.
| denaturieren | Seperate | Kapillare | injizieren | ||||
| Temperatur | Zeit | Spannung | Zeit | Spannung | Zeit | ||
| Größe standard 600 | 90 ° C | 120 s | 4,8 kV | 60 min | 50 ° C warten auf Temp: Ja | 2,0 kV | 30 s |
| Größe standard 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 min | 50 ° C warten auf Temp: Ja | 2,0 kV | 30 s |
Tabelle 3: spezifische Bedingungen für Fragment Analysen auf den automatisierten Sequenzer mit Hilfe der Größe Standards gegeben in der Materialtabelle.
- die Ergebnisse analysieren raw-Daten zu exportieren und diese Daten auf ein Fragment-Analyse-Programm hochladen. Wählen Sie standard Farbstoff Farbe Aufträge des jeweiligen Herstellers festzulegende Farbstoff Farbkanäle.
- Erstellen eine Gliederung des erwarteten Bereichs Fragmentlänge verstärkt durch die einzelnen gruppenspezifischen Primer Panel innerhalb einer Charge gemäß der Bedienungsanleitung des Programms setzt.
- Zur Verarbeitung der Daten wählen Sie das entsprechende Feld, angemessene Größe Standard, Standardfarbe und Art der Analyse und Prozedur ausführen. Wählen Sie die Electropherogram-Option Fluoreszenzsignal Intensitäten von Kapillarelektrophorese Instrumente als eine einzige Zeile Spur für jede Farbe angezeigt. Markierungen/Primer-Sets der jeweiligen Fragment Anzeigebereich angezeigt werden und die genaue Länge des gefundenen Fragments verbunden mit dem Zentrum der jeweils genannte Gipfel wird (in den meisten Programmen durch Färbung oder zugewiesene Name) markiert automatisch.
- Für jede Probe berechnen, wie eng die Probe ' s interne Größe standard entspricht den gewählten Größe Standard um den Erfolg der Größe Berufung zu beruhigen. Die meisten Fragment-Analysen-Programme haben eine Option, um automatisch berechnen und visualisieren dieses Match. Wenn der Größe-Aufruf fehlgeschlagen ist, wiederholen Sie Fragment Analysen für diese Proben.
- Visuell überprüfen Sie die Electropherogram jeder Probe und bestätigen/unconfirm jeder Gipfel namens für jede Markierung/Grundierung separat festgelegt. Fügen Sie manuell unangebracht Gipfeln, die passen der Kriterien eines Satzes Marker/Primer oder falschen entsprechend der Gebrauchsanweisung des verwendeten Programms löschen. Die Basenpaare Größe oder Lagerplatz Namen in das ' Allel Label '. Berechnung und Anzeige der Peak-Spezifikationen in der ' Peak Tisch '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir haben erfolgreich in diesem Protokoll für Diät-Analysen im Rahmen verschiedener Studien beschriebenen Schritte. In diesem Abschnitt zeigen wir Beispiele beschreiben die Anwendbarkeit der einzelnen Abschnitte des Protokolls.
Als Beispiel um die Wirksamkeit von gruppenspezifischen Primer-Sets von der Autoren-28 und das Potenzial der nachgeschalteten Analysen der PCR-Produkte von SSCP Analysen, gegründet wurde ein Fütterungsversuch durchgeführt. Personen der Dikerogammarus Villosus als Raubtiere und Caenis spp. Larven als Beute wurden in den Rhein und die Backwaters in der Nähe von Karlsruhe (Deutschland) gefangen genommen. Im Labor Räuber und Beute Taxa wurden separat in gefilterten Bachwasser bei 20 ° C gehalten und waren ausgehungert nach 36 Stunden. Für das Experiment wurden Höhlenflohkrebs Exemplare in Bechergläsern mit gefilterten Bachwasser (100 mL) einzeln, mit zwei bis drei Caenis Larven für 30 min zugeführt und anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren gelegt. Magen-Darmtrakt von jedem D. Villosus wurde seziert und DNA extrahiert wurde, wie im Protokoll Nr. 1 beschrieben. DNA-Extrakte wurden mit der Caep28S Primer set passend Caenis spp. mit der entsprechenden PCR-Protokoll28 in Protokoll Nr. 3 beschriebenen erkennen getestet. Um Unterschiede zwischen amplifizierten Fragmente verschiedener Caenis Arten zu überprüfen, wurde mit dem Darm zufriedene Beispiele und reine DNA-Proben von drei Caenis Referenz Arten PCR durchgeführt. Agarose-Gelelektrophorese führte zu einzelnen Bands der doppelten stranded DNA, die zwischen den verschiedenen Arten der Caenis mit dieser Art von Elektrophorese (Abbildung 2A) unterschieden werden können. Im Gegensatz dazu konnte durch SSCP Gelelektrophorese, wie in Protokoll Nr. 4 beschrieben Beute Organismen auf Artniveau zu identifizieren, durch den Vergleich der Darm zufriedene Beispiele mit den Referenzproben (Abb. 2 b). Die SSCP Fragment Muster von drei Referenz-Taxa Caenis Beskidensis (Abbildung 2 b, Spur 1), Caenis Horaria (Abbildung 2 b, Spur 2), und Caenis Luctuosa (Abbildung 2 b, Bahn 3) bestand aus vier Bands mit differenzierbare Mustern. Zwei Darm Inhalt Proben (Abb. 2 b, Spur 4 und 5) hatten eine Fragment Muster entspricht derjenigen C. Luctuosa (Abb. 2 b, Spur 3). Das Fragment das dritte Darm Inhalt Beispiel (Abb. 2 b, Bahn 6) war identisch mit der von C. Horaria (Abb. 2 b, Spur 2). Sequenzanalysen der beiden gut zufriedene Beispiele als C. Luctuosa und C. Horaria (Abb. 2 b, Spur 4 und 6) und der jeweiligen Referenz-Arten bestätigt dieses Ergebnis (siehe elektronische Ergänzung Ausrichtung Fasta-Datei).
Abbildung 2: Originalbild der Agarose-Gelelektrophorese (A) und (B) SSCP Analyse der PCR-Fragmente von Darm Inhalt und Referenzproben verstärkt mit den Caep28S Grundierung. Bahnen 1 bis 3 zeigen die Referenzproben der Gattung Caenis Beskidensis (1), Caenis Horaria (2) und Caenis Luctuosa (3). In Gassen 4-6 das Fragment Muster der verschiedenen Darm zufriedene Beispiele der Höhlenflohkrebs Dikerogammarus Villosus vorgestellt. Lane 7 zeigt das Fragment Muster einer 100 bp DNA-Leiter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Darüber hinaus wurde eine Labor-Experiment durchgeführt, in denen Wasser Milben gehören zur Gattung Hygrobates Fluviatilis auf Chironomid gefüttert wurden Larven, nicht nur festzustellen, ob DNA Chironomid Individuen, die konsumiert in den Wasser-Milben nachgewiesen werden kann, aber auch um zu testen ob die Menge an DNA erkannt hängt die verstrichene Zeit seit Verbrauch der Beute29. Nach verhungern die Milben für etwa eine Woche, bot jede Milbe eine Chironomid Larven als Nahrung. Jeweils 3-4 Wasser Milbe Einzelpersonen wurden in Ethanol (absolut) für genetische Analysen anhand der Chiro18S Primer spezifisch für die Dipteren Familie Chironomidae28 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 und 50 h nach gefüttert29fixiert. Als Grad der Verbrauch von Wasser Milbe Einzelpersonen, die jeweiligen Beute Individuen wurden in die folgenden fünf Fütterungen Kategorien eingeteilt: 1 = völlig gesaugt, Integument vollständig entleert (> 90 %), 2 = fast vollständig heraus gesaugt (> 75-90 %), 3 = halb abgesaugt (> 50-75 %), 4 = nur teilweise abgesaugt (> 5-50 %), 5 = keine sichtbare Veränderung in der Beute Körper Struktur (≤5 %)29. DNA wurde extrahiert aus der Wasser-Milben gemäß Protokoll Nr. 1 (ohne Schritte 1.2.1 und 1.2.2) und das Vorhandensein von 18 s rDNA im Extrakt und die Funktionstüchtigkeit der Vorlage wurden überprüft, wie im Protokoll Nr. 2 beschrieben. Nachweis von DNA gemäß Protokoll Nr. 4 nur die Chiro18S mit Grundierung Primer nach vorne gesetzt beschriftet erfolgte mit Beute einen fluoreszierenden Farbstoff (siehe Tabelle 2) und die DNA-Größe Standard Kit - 400. Ermöglicht Vergleiche zwischen den Proben analysiert, in verschiedenen Ausführungen von einem automatisierten Sequenzer, das Verhältnis zwischen Probe Scheitelhöhe und der Scheitelhöhe von der nächstgelegenen interner Standard (d.h.360 bp in diesem Fall) jeder Probe berechnet und als verwendet wurden ein Proxy für die Menge der DNA festgestellt. Ergebnisse zeigten, dass Chironomid DNA nachweisbar in praktisch allen Individuen der Hygrobates Fluviatilis Chironomid Larven29gefüttert wurde. Aus das kürzesten Intervall (1 h nach der Fütterung), die längste Periode nach der Fütterung (50 h) der relativen Menge der erkannten Beute DNA deutlich war reduziert (Abb. 3A)29. Darüber hinaus bestätigt das Verhältnis zwischen Zeit nach der Fütterung und der Beute Einstufung als Proxy für den aufgenommenen Betrag der Beute, die DNA werden konnte (Abb. 3 b)29. Die Reduzierung der Beute DNA erkannt mit zunehmender Zeit nach Fütterung am ehesten war vollständig reflektiert durch die Schädigung der DNA und Verdauung der Beute, weil Freimachung der Beute DNA ist aufgrund des Fehlens eines Anus in Wasser Milben29höchst unglaubwürdig. Diese Ergebnisse bestätigen die Eignung dieses Ansatzes für die Quantifizierung von angesaugte Beute.
Abbildung 3: Beziehungen zwischen den nationalen ln Höhenverhältnis (Probe-Spitze Höhen/Standard360 Peakhöhe) und (A) Zeit nach Verfütterung von Milben und Fütterung Kategorie (B) (n = 23). "Experimentelle und angewandte Acarology, erster Nachweis von DNA in Hygrobates Fluviatilis (Hydrachnidia, Acari) Beute: ein neuer Ansatz zur Bestimmung der Räuber-Beute-Beziehungen im Wasser Milben, 67, 376, s. Martin, M. Koester, L. Schynawa, R. Gergs (© Springer International veröffentlichen Großbritund 2015) "mit freundlicher Genehmigung des Springer-Verlags. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Untersuchen die Bedeutung der Plünderung durch die invasive Höhlenflohkrebs D. Villosus in den Feld, intensive stabilen Isotopen-Analysen von δ-13C und δ15N D. Villosus und potenzielle Nahrungsressourcen durch molekulare gefördert wurden Erkennung von kürzlich aufgenommenen Beute innerhalb der Darminhalt der exakten gleichen Individuen. Insgesamt 206 D. Villosus Individuen aus verschiedenen Standorten wurden gesammelt und der Magen-Darm-Trakt jedes einzelnen wurde seziert und DNA extrahiert wurde, gemäß Protokoll Nr. 1. Das Vorhandensein und die Funktionstüchtigkeit der verwendeten Vorlagen wurde versichert, wie im Protokoll Nr. 2 beschrieben. Den letzten Nachstellung durch die D. Villosus Individuen auf mehrere denkt Beute Taxa wurde getestet, wie im Protokoll Nr. 4 beschrieben. Insgesamt nur 16 % der Darminhalt D. Villosus für DNA, die Zugehörigkeit zu einer der 16 gezielte denkt Beute Taxa positiv getestet, und aus diesem Grund unterstützt die Ergebnisse der stabilen Isotopen-Analysen, die eine niedrige räuberisch Fressverhalten angegeben von der invasiven Höhlenflohkrebs in der Feld-27. Während DNA von 12 getesteten Beute Taxa innerhalb der Genanalysen in mindestens 1 Darm Inhalt Probe gefunden wurde, wurde DNA von den 4 anderen Beute Taxa nie erkannt (Abbildung 4)27.
Abbildung 4: Histogramm zur Veranschaulichung der jeweiligen Anzahl D. Villosus Personen aus allen zehn Seiten deren Darminhalt denkt positiv getestet Beute DNA. PCR erfolgte mit 16 gruppenspezifischen Primer Sätze wie angegeben. "Hydrobiologia, ist Dikerogammarus Villosus (Crustacea, Gammaridae) eine"killer-Shrimp"in der Rhein-System?, 768, 2016, 310, Koester Meike, Bastian Bayer, Gergs René (© Springer International Publishing Schweiz 2015)" mit freundlicher Genehmigung von Springer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Datei. Sequence_alignement_feeding_trial.FASTA Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode für PCR-basierte Bestimmung der Räuber-Beute-Interaktionen von Feldproben über gruppenspezifischen Primer für rDNA Regionen, die mit anderen nicht-molekulare Analysen der gleichen Proben kombiniert werden können. Allerdings gibt es einige wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls. Erstens ist es wichtig, versichert die Spezifität der Primer verwendet. Zweitens ist es wichtig zur Vermeidung von Verschmutzung und Verlust der Darm Inhalt Material bei der Vorbereitung des Magen-Darm-Trakt und die anschließende Extraktion von DNA. Während Kreuz-Sample-Kontamination zu falsch positiven Nachweis von Beute DNA führen kann, verbraucht Verlust des Darms Content-Material führen könnten, zu selten fehlen Beutetiere. Überprüfung der Anwesenheit von rDNA Zugehörigkeit zu der jeweiligen Untereinheit und die Funktionstüchtigkeit der Vorlagen für die Analysen (Abschnitt 2 des Protokolls) ist essentiell für repräsentative Informationen über die Beute verzehrt. Dies ist insbesondere wichtig, wenn keine DNA Beute Gruppen soll der Verbraucher ernähren sich von erkannten25,27sein kann. Darüber hinaus bei der Vorbereitung der PCRs (Schritt 3.1, 5.1.1 und 5.1.2) ist es entscheidend, dass die Mischung und das Protokoll verwendet genau die Kriterien passen, mit denen der jeweiligen Primer auf eine bestimmte Gruppe von Taxa angegeben. Ansonsten, Verstärkung von DNA innerhalb der PCR-Reaktion möglicherweise nicht vollständig oder die DNA von Taxa, die nicht gezielt als auch verstärkt werden könnte. Daher ist es obligatorisch, positiv zu verwenden und Negativkontrollen innerhalb jeder PCR ausführen, um sicherzustellen, dass die PCR-Reaktion gearbeitet und keine Verunreinigung aufgetreten ist. Darüber hinaus ist es notwendig, dass das Array der Proben für jeden PCR-Lauf dokumentiert ist, genau um die richtige Zuordnung der Beute verbraucht, um die jeweiligen Verbraucher Probe zu ermöglichen. Für diese Aufgabe muss besonderer Vorsicht bei der Bündelung von PCR-Produkte für parallelen Detektion mehrerer Beute Gruppen über automatisierte Fragment Analysen (Schritt 5.2.3).
Für den Nachweis der amplifizierten Fragmente mit Agarose-Gel-Elektrophorese (Schritt 3.2 und 3.3) Agarose Gele sollten so dünn wie möglich sein und Pflege hat bei der visuellen Inspektion des Bildes getroffen werden, um fehlende Fragmente mit geringen optischen Auflösung zu vermeiden. Für Ergebnisse und eine entsprechende Aussage über Beute Verbrauch von einem Verbraucher ist es wichtig, dass auch selten verzehrt Beute Taxa erkannt werden. Dicken Agarose-Gele vermindern die Sichtbarkeit der potenziell geringe Mengen an Beute DNA und verringern so die Wahrscheinlichkeit zu verpassen nur selten verzehrt Beute und Unsicherheiten in den Schlussfolgerungen aus der Analyse stellen. Darüber hinaus kann aus gesundheitlicher Sicht, eine weniger oder ungiftige Alternative als Interkalation Bromid zum Färben die Gele mit ratsam sein. Das Protokoll für die spätere nachgelagerte Analyse des amplifizierten Fragmente über SSCP Analysen mittels Polyacrylamid-Gel enthält einige Schritte, die mit besonderer Vorsicht erfolgen sollte. Es ist wichtig, dass Gel Kassette montiert auslaufsicher (Schritt 4.1.3 ist) und die Polyacrylamid-Lösung genügend Zeit erhält vollständig polymerisieren (Schritt 4.1.6). Öffnen der Kassette zu früh führt zu undichten Flüssigkeit Acrylamid-Lösung und trotz der Tatsache, dass die Vorbereitung von Anfang an, umfangreiche Aufräumarbeiten sowie getan werden muss, gestartet werden. Darüber hinaus überträgt das Polyacrylamid-Gel in der Färbung Bad (Schritt 4,7) und von dort in die UV Tabelle (Schritt 4.8) muss sehr sorgfältig durchgeführt werden, aufgrund der Instabilität der solche Gele. Andernfalls das Gel könnte reißen und Fragmente könnte gestört werden, das führt zu der Notwendigkeit, den Vorgang wiederholen.
Eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreich Datenverarbeitung erhielt von automatisierten Fragment Analysen ist, dass die Probe innere Größe Standard entspricht der Größe standard-Muster gegeben durch den Hersteller (Schritt 5.3.3) zur Bestimmung von der entsprechenden Fragmentlänge. Dies ist besonders wichtig, da sonst verschiedene Fragmente, gekennzeichnet mit der gleichen fluoreszierenden Farbstoff, beflecken die falsche Beute Taxa zugeordnet werden könnte und daher zu einer kompletten Fehleinschätzung der Räuber-Beute-Interaktionen führen. Darüber hinaus zeigen Electropherograms oft Hintergrundgeräusche. Um Vertrauen in die Interpretation zu etablieren, ist es wichtig, dass die Gipfel der inneren Größe Standard deutlich höher als das Hintergrundrauschen der Probe sind. Spitzen für jeden Marker/Primer sollten folglich nur gezählt werden, wenn sie deutlich höher als die Hintergrundgeräusche sind.
Dieses Protokoll kann geändert werden, um mehrere Gruppen von Beute Taxa Sehenswürdigkeiten verschiedene Verbraucher von Interesse zu erkennen. Zugegeben, gruppenspezifischen Primer nicht bereits für jeden potentiellen Beute Taxon von Interesse möglicherweise verfügbar. Gruppenspezifischen Primer sind jedoch nicht nur für mehrere Süßwasser denkt Taxa28, sondern auch für eine breite Palette von anderen Taxa (z. B. mehrere marine denkt Taxa16,30 und gemeinsamen Taxa von fliegenden Insekten-31). Dabei die Auswahl der gruppenspezifischen Primer setzt geeignete DNA von den Beutetieren eines gegebenen Taxons zu verstärken, aber erfolglos bei der Verstärkung von DNA aus Arten dieses Taxons nicht aus, ist wesentlich32. Für einen bestimmten Bereich der Taxa (z.B. 130 Taxa von Süßwasser Makroinvertebraten häufig in der Rhein-System28) wurden viele gruppenspezifischen Primer, die jetzt verfügbar sind angegeben. Daher sollte zur Vermeidung von falsch-negativen oder falsch-Positive Ergebnisse der Spezifität von solchen Primer für den Bereich der Taxa in das Ökosystem des Interesses vor deren Anwendung für Ziel Taxa und Verbraucher, die nicht im Bereich von Taxa für enthalten häufig geprüft werden die Primer aufgerichtet worden war. Darüber hinaus sollen diese molekulare Analysen nicht kombinierbar mit möglicherweise anderen Analysen der exakt gleichen individuellen, Dissektion des Magen-Darm-Trakt übersprungen werden.
Dennoch seziert den Gastrointestinaltrakt größere Exemplare auch verhindert Versagen der DNA-Extraktion wegen zu viel Material, und das Vorhandensein von Verbraucher-DNA in der Probe-Extrakt reduziert. Jedoch haben Studien gezeigt, dass mit bestimmten blockierenden Zündkapseln, die legen auf die DNA des Verbrauchers und damit blockieren, für die PCR-Reaktion effektiv die Verstärkung der seltene Sequenzen Mischproben33erhöhen können. Daher kann Zergliederung des Magen-Darm-Trakt vermieden werden auch beim Umgang mit größeren Verbraucher Proben, durch den Einsatz von spezifischen blockierende Primer. Für parallelen Detektion der Amplifikate mehrere gruppenspezifischen Primer Sätze über automatisierte Fragment Analysen abgeleitet sollte bei der Wahl der Färbung Farbstoff als Label zu achten. Dabei sollten Grundierung Sätze verstärken Fragmente von etwa die gleiche Länge mit klar unterscheidbare Fluoreszenzfarbstoffen beschriftet werden. Darüber hinaus gibt es eine Reihe von Kapillarelektrophorese Systeme von mehreren Herstellern. Einige dieser Systeme können angeblich der Bestimmung der mehrere Fragmente auch über unspezifische Färbungen. Die hier vorgestellten Protokoll könnte leicht amplifizierten Fragmente mit keinem dieser Systeme erkennen angepasst werden. Abgesehen davon, dass zur Verringerung des Zeitaufwands für tEr analysiert, wäre es möglich, einzelne Multiplex-PCR-Assays zur DNA der Beute Gruppen ein Fragment Analyse Charge gleichzeitig verstärken zu optimieren (z. B. gleichzeitige Verstärkung 12 Beute Organismen Käfer34 oder bis zu sechs fliegende Insekt Taxa-31).
Ein potenzieller Nachteil der Darm Inhaltsanalysen im allgemeinen und damit auch die in diesem Protokoll beschriebenen Analysen ist die geringe zeitliche Auflösung. Mit solchen Methoden ist es nur möglich, kürzlich aufgenommene Organismen zu identifizieren, die zu Unsicherheiten in der Bedeutung der einzelnen Beute Organismen2führen könnte. Allerdings haben wir gezeigt, dass genetische Analyse nach diesem Protokoll mit Analysen von stabilen Isotopen (δ15N und δ-13C) von der exakt gleichen Verbraucher Exemplare25,27leicht kombiniert werden kann. Als Zeit-Integration von natürliche Tracer von Räuber-Beute-Interaktionen stabilen Isotopen-Analysen werden häufig verwendet, um Nahrungsnetz Strukturen1charakterisieren, aber potenzielle überlappende Isotopen-Werte aus verschiedenen Beutetiere oft erschweren eine genaue Definition der Räuber-Beute-Interaktionen2. Daher ist die Verwendung dieses Protokolls für genetische Analysen in Kombination mit stabilen Isotopen-Analysen die Nachteile jeder Methode kann weiter unser Verständnis von Nahrungsketten und ihre Beziehung zu Nährstoff oder Energie Flüsse zu überwinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Silke Classen vom Forschungsinstitut für Ökosystem Analyse und Bewertung (Gaiac), RWTH Aachen für ihre Hilfe bei der Schaffung der in diesem Protokoll verwendeten gruppenspezifischen Primer-Sets. Wir danken auch Peter Martin und Laura Schynawa von der Universität Kiel für die Zusammenarbeit in der Wasser-Milben-Experimente. Wir danken auch der technische Laboranten zur Aufbewahrung Labor reibungslos läuft und das Register der Unternehmen und Katalognummern vorbereiten. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Projekt GE 2219/3-1) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
- Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
- Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
- Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
- Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
- Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
- Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
- Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
- Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
- Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
- Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
- Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
- Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
- Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
- Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
- Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
- Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
- Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
- Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
- Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
- Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
- Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6 (2007).
- Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
- Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
- Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
- Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831 (2007).
- Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).
- Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
- Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12 (2008).
- Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).
