Summary
En yaygın bağırsak içeriği macroinvertebrates, görsel analizlerdir. Av organizmaların morfolojik çeşitlilik hakkında yoğun bilgi gerektiren, onlar yumuşak gövdeli yırtıcı özledim ve, nedeniyle güçlü ezme yırtıcı solungaçlarınızı de dahil olmak üzere bazı organizmalar için neredeyse imkansız. Biz macroinvertebrate için detaylı, yeni genetik yaklaşımlar diyet tanımlaması solungaçlarınızı av sağlar.
Abstract
Gıda ağları analiz daha iyi ekosistemler anlamak için önemlidir. Örneğin, gıda web etkileşimleri yerli olmayan türler tarafından işgal kaynaklanan şiddetli değişikliklerin uygulayabilir. Ancak, tam tanımlayıcı alan avcı-av etkileşimlerin çoğu zaman zordur. Bu analizler kez bağırsak içeriğinin görsel bir değerlendirme veya kararlı izotop oranları (δ15N ve δ13C) analizine dayalı. Morfolojik çeşitlilik veya bireysel av organizmalar, av organizmalar tam tanımlaması engelleri önde gelen izotopik imzadan, yaklaşık, sırasıyla, kapsamlı bilgi tür yöntemler gerektirir. Maserasyon, sindirim ve sindirim av organizmalar belirli türler tanımlaması zor yapmak çünkü görsel gut içerik analizleri özellikle yumuşak gövdeli yırtıcı organizmalar, hafife. Bu nedenle, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dayalı stratejiler, örneğin gruba özgü astar kullanımını ayarlar, gıda web etkileşimleri soruşturma için güçlü bir araç sağlar. Burada, nükleer ribozomal deoksiribonükleik asit (rDNA) için gruba özgü astar kümeleri kullanarak alanından macroinvertebrate tüketici gut içeriğini incelemek için ayrıntılı iletişim kurallarını açıklar. DNA olabilir tüm örnekler (söz konusu olduğunda küçük takson) ya da hulâsa ya da bağırsak içeriği alanında toplanan örneklerin dışında. Varlığı ve fonksiyonel etkinlik DNA şablonları doğrudan test bireysel onaylanması gereken evrensel astar kullanarak ayarlar DNA'ın ilgili alt birimi hedefleme. Biz de tüketilen av türler düzeyine PCR ile değiştirilmemiş gruba özgü astar ile daha da polyacrylamide Jeller kullanarak sonraki tek iplikçik uyum çok biçimlilik (SSCP) analizleri ile kombine belirlenebilir göstermek. Ayrıca, biz farklı floresan boyalar etiket olarak DNA parçaları farklı av gruplarının otomatik parça analizi yoluyla birden fazla gut içerik örnekleri için paralel tarama sağlar gösterir.
Introduction
Trofik etkileşimleri ve gıda web dynamics çoğunluğu teşkil, avcı-av etkileşimleri Cerayanlar madde ve enerji gıda ağları içinde ve ekoloji ana hedeflerinden biri, ekosistemler arasında boyunca karakterize etmek için önemli yönleri vardır 1. kaynak belirlenmesi ve karbon ve besin akışını ekolojik bağlantı ekosistemler2arasında anlayışı sürdürmek. Ancak, ekosistemler nehirler ve onların popülasyonuna gibi sadece tozlar organik madde ve besin aynı zamanda organizmaların3hareketleri bağlantılı değildir. Böylece, bu sistemleri bağlantı kaynak akışının kesintiye uğratmasını habitat değişiklikler şiddetle her iki ekosistemlerin gıda ağları sadece doğrudan ama aynı zamanda dolaylı olarak avcı-av topluluklar ilgili kompozisyon değiştirerek değiştirebilirsiniz. Örneğin, gıda ağları değişiklikleri tek avcı türler (örneğin, gökkuşağı alabalığı)4hareketleri için bağlanacak şekilde gösterilmiştir. Bu tür değişiklikleri potansiyel biyolojik çeşitlilik ve sucul ekosistemler işleyişini tehdit. Bu nedenle, alan avcı-av etkileşimleri analiz su yönetimi uygulamaları, sucul ekosistemlerin doğal biyolojik çeşitlilik gibi insan kaynaklı çevresel değişikliklerin etkisini belirlemek için önemlidir.
Trofik bağlantıları izleme karmaşık sistemlerinde zor olduğu için birkaç yaklaşım bu etkileşimleri alan5' te beslenme değerlendirmesi etkinleştirmek kurulmuştur. Geleneksel olarak, araştırmalar alanında etkileşimleri beslenme disseke cesaret av kalıntıları görsel tanımlama temel alır ve morfolojik av çeşitlilik hakkında geniş bir bilgi gerektirir. Görsel gut içerik analizleri anlayışlar kaynak kullanımında tüketiciler (Örneğin, mevsimsel değişimi diyet ıstakoz6 ve balık7,8 ya da beslenme tercihleri kopepodların) çeşitli gruplar hazırladık. Ancak, fiziksel sindirim sürecinin görsel gut içerik analizleri zor yapar ve genellikle yumuşak gövdeli yırtıcı-organizmalar9özlüyor. Türler tarafından sıvı sindirim besleme veya yoğun bir şekilde yemek yeme, solungaçlarınızı gibi önce comminute omurgasız bazı tüketiciler için görsel avcı türlerin bağırsak içeriği imkansız10tanımlamasıdır. Bu sınırlamalar nedeniyle, moleküler analiz umut verici bir alternatif sağlar.
Moleküler analiz şimdi hızlı ve hassas bir av algılama bağırsak içeriği sağlayan ortak bir araç haline gelmiştir. Bu tür teknikler farklı aralığıdır: monoklonal antikorlar veya Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) temel stratejileri sıkça kullanılır, onların yüksek özgüllük ve duyarlılık11yüzünden. Yeni monoklonal antikorlar geliştirme zaman ve maliyet yoğun, antikorlar zaten11mevcut bu nedenle, diğer moleküler tekniklerin uygulanması daha yararlıdır. Başka bir ortak yaklaşım deoksiribonükleik asit (DNA), ribozomal ribonükleik asit (RNA) genleri evrensel astar kullanarak çoğu türler içinde mevcut gibi bölgelerinde amplifikasyon12,13çalıştırabilmenizdir. Bu tekniği kullanırken, sık sık av organizmaların DNA14karışık kaynakları içinde bütün dizi tanımlamak mümkün değildir. Böyle bir dezavantajı önlemek için etkili bir yaklaşım gruba özgü astar kullanmak için genetik gut içerik analizleri için ayarlar olduğunu. Belirli hedef gruplar yalnızca DNA bölgelerinde yükseltmek veya tüm diğer türler15,16çıkartmak için tasarlanmış, gruba özgü astar kimlik belirtilen gruplardan taksonomik düzeyde av organizmaların etkinleştirmek zaman ve maliyet yoğun ikincil analizleri. Ancak, tüm içerik analizi gut gibi bu tür analizleri beslenme davranışı yalnızca anlık görüntü sağlar. Bu nedenle, moleküler gut içerik analizleri zaman entegre doğal tarayıcıları (Örneğin, kararlı izotop) analizleri ile birleştirerek yararlı1,2olarak kabul edilir.
Burada, aynı numune kararlı izotop analizi ile birleştirilmek üzere nükleer ribozomal DNA (rDNA) bölgeleri için gruba özgü astar kümeleri kullanarak avcı-av etkileşimlerin PCR tabanlı araştırmalar için detaylı bir yöntem açıklanmaktadır. Biz tek av grupları özel Jel Elektroforez ile DNA tespiti tanımlamak. Ayrıca, daha yüksek taksonomik çözünürlüğe primerler özgüllüğü daha gerekli olduğunda daha da aşağı akım analizleri böyle gruba özgü astar geçerli PCR ürünleri için bir fırsat sunuyoruz. Tek iplikçikli DNA (ssDNA) onların birincil sıra17tarafından belirlenir formu Tersiyer biçimler parçaları çünkü böyle gruba özgü astar tarafından güçlendirilmiş parçaları küçük değişimler konformasyon değişikliklere yol açar. Bu tür değişiklikleri tek iplikçik uyum çok biçimlilik (SSCP) analizleri ile polyacrylamide jeller17,18(tür düzeyine) av organizmaların daha kesin bir kimlik etkinleştirme, tarafından tespit edilebilir.
Özel Jel Elektroforez DNA parçalarının görselleştirmek ve onların yaklaşık uzunluğu19, çözünürlüğünü belirlemek için yaygın ve ucuz bir araç DNA miktarına bağlıdır ve boyama boya20kullanılan iken. Genellikle, görselleştirme yalındır saf DNA örnekleri ile çalışırken olmakla beraber av potansiyel olarak düşük miktarda özel Jel Elektroforez sonuçlarını puanlama DNA tüketici gut içeriğini karmaşık hale getirebilir. Yine de, bu algılama yöntemi alanından tüketici örneklerin düşük bir sayı için bir ekran için uygun veya birkaç grupları av, ama komplikasyon puanlama yapar örnekler çok sayıda tarama için birden çok av takson son derece zaman yoğun ve böylece uygulanamaz. Daha duyarlı bir algılama yöntemi parçaları ayrıca parçaları21tam olarak uzunluğunu tayini sağlar Kapiler Elektroforez ile otomatik analizidir. Birkaç microsatellite dayalı çalışmalar farklı floresan boyalar etiket olarak kullanarak, bu tespit ve karşılaştırılabilir uzunluğu farklı parçaları otomatik parça analizi22,23tarafındanbelirlemek mümkün olduğunu göstermiştir, 24. Bu nedenle, biz de detaylı bir protokol için birden çok av DNA'ın paralel algılama etiketli gruba özgü astar setleri ve algılama otomatik bir sequencer ile otomatik parça analizi yoluyla PCR kullanarak grupları mevcut. Ayrıca, otomatik parça analizi yoluyla av DNA tespiti hafızanın yırtıcı göreli bir miktar da sağlayan bir yaklaşım olduğunu gösteren bir örnek çalışma sonuçları sunmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. alandan Macroinvertebrates toplamak ve örnekleri genetik Gut içerik analizleri için hazırlamak.
- Toplamak macroinvertebrates her sitede tek tüpler içine ilgi tüketici türlerin bireyler çözmek ve doğrudan onları sıvı azot veya bağırsak temizleme ve DNA'ın yıkımı önlemek için kuru buz dondurmak.
Not: bazı macroinvertebrates alkol onları öldürmeden önce kusturmak eğilimindedir çünkü örnekleri alkol, depolamak kaçının. - Sadece mide-bağırsak orta ölçekli ve büyük kullanın (yaklaşık > 3 mm) macroinvertebrate türlerin genetik bağırsak içeriği örnek kalan meselesi diğer işlemleri (Örneğin, kararlı izotop kullanılacak şekilde analizleri için analizi). Bu su akarları gibi çok küçük takson soruşturma zaman uygulanabilir değildir. Bu nedenle, adım 1.2.1 ve 1.2.2-ebilmek var olmak Kaptan.
- Biraz bireyin defrost ve dikkatle incelemek onun mide-bağırsak ince paslanmaz çelik forseps kullanarak bir stereomicroscope altında. Madde kaybını önlemek için mide-bağırsak delmek değil emin olun. DNA ve RNA contaminations her mide-bağırsak hazırlanması sonra kaldırmak için dekontaminasyon çözüm kullanarak
- temiz forseps. Bu nedenle, forseps dekontaminasyon çözüm 10 min için kuluçkaya. Daha sonra kalan izleri ve bir hav bırakmayan kağıt havlu ile silin için steril su ile yıka.
- 2.0 mL güvenli kilit tepki disseke gastrointestinal sistem aktarmak tüp içeren 440 µL (450 µL mümkün tekrarlayan pipet kullanımı için) tuz çıkarımı arabellek [SEB; 0.4 M Sodyum Klorür (NaCl), 10 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethane hidroklorür (Tris-HCl) pH 8.0 ve 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit disodyum tuzu (EDTA) pH 8.0 kurutmak]. Mağaza örnekleri, hazırlanan − hemen DNA ekstraksiyon kadar 20 ° C. DNA birkaç gün içinde elde edilebilir olun.
- DNA ayıklamak için değiştirilmiş yüksek tuz ayıklama protokolü 25 kullanın.
- Dondurucu dışarı almak örnekleri. Forseps bir 5 mm paslanmaz çelik boncuk her örnek tüp eklemek için kullanın ve oda sıcaklığında erimek için (RT) bankta Donmuş numuneler bırakın. Bir boncuk değirmen örnekleri 15 Hz, 1 dk. için homojenize kullanmak.
- Örnekleri ile bir santrifüj kısa bir koşmak aşağı spin. Microliter Pipetler 90 µL (100 µL için tekrarlayan pipet kullanımını mümkün) %10 Sodyum Lauryl Sülfat çözeltisi (SDS) ve 5 eklemek için kullanın µL 10 mg/mL İndinavir K.
- Girdap iyice örnekleri ve karışımlar için 1 h 60 ° C'de sabit bir thermomixer üzerinde 400 rpm sallayarak ile kuluçkaya. Ayrıca, iyice girdap daha fazla lizis desteklemek için her 10 min örnekleri.
- Spin örnekleri ile bir santrifüj kısa bir koşmak aşağı 5'te 16,200 x g 5 M NaCl iyice 40 dk için yaklaşık 0,5 - 1 dakika santrifüj örnekleri için girdap bir microliter pipet ile 350 µL eklemek ° C.
Not: birden çok üst üste yapılması gereken varsa, santrifüj sıcaklık ayarı SDS sıcaklığı çok düşük ise flocculate eğilimindedir çünkü biraz (değil daha yüksek 10 ° C) yükseltilmiş olması gerekir. - Kullanım microliter Pipetler yaklaşık 600 µL süpernatant yeni 1,5 mL tepki tüp içine aktarmak için. Bir şey Pelet kaldırmak değil dikkatli olun.
- Ucu paslanmaz çelik boncuk tepki tüpler içine bir paslanmaz çelik çay süzgeç dışarı akan su ile temiz ve steril dekontaminasyon Çözümle kapalı 10 dk. iyice durulayın için onları bir petri dekontaminasyon solüsyonu içinde kuluçkaya su ve temizlenmiş boncuk etanol depolamak (> % 99, sahne sanatları sınıf) veya yeniden kadar kuru.
Not: boncuk temizlik Bu adımda doğrudan yapılması gerekli değildir, ancak aşağıdaki adımlarda bekleme süresi ne zaman oldukça yapılabilir. - Buz gibi isopropanol (PA grade) süpernatant ile bir microliter için eklemek 600 µL pipet ve dikkatle tüp birkaç kez tersine çevirin. Saklamak örnekleri gecede, -20 ° c
- Dondurucudan örnekleri almak ve onları 16,200 × g ve oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj kapasitesi. Dikkatle süpernatant atmak ve tüp dikkatle hav bırakmayan kağıt mendil ile kurulayın. Çevredeki sıcaklık (fazla 25 ° C), yüksek ise 5 ° C'de süpernatant atma sırasında kayma granül önlemek için santrifüj kapasitesi unutmayın.
- Yıkama % 70 etanol ile içeren DNA unsurlardandır. Bunu yapmak için buz gibi soğuk etanol (% 70, sahne sanatları sınıf) 200 µL ekleyin bir microliter pipet ve santrifüj kullanarak örnekleri 10 dk 16,200 x g ve oda sıcaklığında (ya da 5 ° C, gerekirse) az için. Dikkatle süpernatant atmak ve tüp dikkatle hav bırakmayan kağıt mendil ile kurulayın. Kullanım 10 µL pipet dikkatle kalan süpernatant pipet için yaklaşık 8 µL göre düzeltilir. Pelet bozmamaya dikkat edin.
- Tüm etanol buharlaşan kadar yaklaşık 60 ° c veya tezgah, oda sıcaklığında 5-20 min için Pelet Makinası.
- Erime Pelet (etki olmaksızın buharla sterilize ve tedavi DEPC) 50-100 µL nükleaz ücretsiz olarak su (GKD 2 O), en az 1 (daha iyi sonuçlar gecede 4 ° C'de elde edilir rağmen) s için bekleyin.
- Üreticiye göre DNA mikro-cilt Spektrofotometre ile her örnekte yer alan miktarını ölçmek ' s yönergeleri. Yaklaşık 2-10 ng DNA içeren her örneğinin çalışma seyreltme yapmak / µL. dondurucuya hisse senedi çözüm tutun. Çalışma çözüm buzdolabında tutmak ve daha fazla örnek sağlamak işleme kısa bir süre yapılır.
2. Son zamanlarda alınan av sonraki tespiti için DNA-özler fonksiyonel etkinlik doğrulayın.
- Varlığı ve şablonları, fonksiyonel etkinlik testi her DNA özü (Adım 1.1-1.3.11) emin olmak için evrensel astar kullanarak ilgili besin kaynağı için uygun ayarlar (Örneğin, omurgasızlar 16 , 26) av 25 , 27 sonraki tespiti için kullanılan gruba özgü primer olarak aynı nükleer alt birimi hedefleme. Aşağıdaki adımları evrensel astar kümeleri NSF1419/20 ve NSR1642/16 16 ve LSU D1, D2 fw1 ve LSU D1, D2 rev2 veya LSU D1, D2 rev4 26 kullanmak için başvurun. PCR reaksiyonu başarılı olmuştur ve hiçbir kirlenme meydana geldi kanıtlamak için bir pozitif kontrol zaten başarılı bir şekilde güçlendirilmiş DNA içeren ve GKD 2 O içinde çalıştırmak her PCR DNA yerine içeren bir denetimi örneğini kullanın.
- İçine astar astar son konsantrasyonu 10 µM içeren, ilgili astar hisse senedi çözüm ve GKD 2 O (bağlı olarak hisse senedi çözüm konsantrasyonu) uygun miktarda pipette çalışma çözümleri hazırlamak için bir MİKROPİPETLER kullanarak taze 1,5 mL tepki tüp.
- Astar, deoxynucleotide mix (dNTPs), reaksiyon arabellek, Taq DNA polimeraz ve GKD 2 O (işlenecek örnekleri sayısı) bağlı olarak 1.5 veya 2.0 ml tepki tüp sonra girdap bu karışıma ekleyin. Detaylı birimler için standart reaksiyon karışımı 10 µL PCR reaksiyon için Tablo 1 ' de verilmiştir (Ayrıntılar kullanılan, kimyasalların için bkz: Tablo reçetesi).
- Kullanım microliter Pipetler DNA'ın her 1 µL aktarmak için th 9 µL ayıklamake standart reaksiyon karışımı bir PCR tüp (ya da bir şey PCR plaka) içinde. Tepki tüp veya plaka (kap çizgili) tepki kuyu kapatın.
- Program thermocycler: NSF1419/20 ve NSR1642/16 16 astar kümesi için standart protokoldür: 94 ° 94 ° C 30 döngüleri için 30 ardından C 4 dk (denatürasyon), s, 50 ° C (tavlama sıcaklığı) 30 s, 72 ° C 90 s ve 10 dk 72 ° C'de son uzantısı için. LSU astar 26 ayarlar için aşağıdakileri kullanın: 94 ° C 4 dk, ardından 45 94 ° C devredir 20 s, 52,5 ° C 20 s, 72 ° C için 90 s ve son uzantısı 8 dk. 72 ° C'de
- Yer PCR tüpleri veya thermocycler, kalıplara cycler kapağını kapatın ve ilgili programını başlatın.
- Hazırla % 1.5 özel bir arabellek çözüm Tris temel içeren, Borik asit ve EDTA (TBE tampon) ve özel kullanarak jel. 10 cm × 7.5 cm × 3 cm, genel boyutları ile bir jel döküm tepsi kullanarak bir % 1.5 özel jel hazırlanması için 0,45 g özel konik bir şişesi tartmak, 30 mL 1 x TBE arabelleği (89 mM Tris ölçmek için bir ölçüm silindir kullanın pH 7,6, 89 mM Borik asit ve 2 mM EDTA, pH 8.0) ve konik şişe dökün. Bir mikrodalga kullanarak karışım ısı. Büyük hava kabarcıkları olduğunda mikrodalga durdurmak ve çözümü tek bir aşama var kadar dikkatle şişeye girdap.
- Çözüm yaklaşık 60 ° c, sakin bir su banyosu şişeye girdap. Hızla çözüm bir jel döküm tepsiye dökün, hava kabarcığı çıkarıp tarak yerleştirin. Jel sertleştirilmiş kadar yaklaşık 20 dk bekleyin.
- Dolgu Elektroforez ünitesi ile 0.5 x TBE ve özel jel içeren INSERT jel döküm tepsi. Jel Yuvaları hava kabarcıkları ücretsiz olduğundan emin olun.
- Mini (plaka) santrifüj kısa çalışma seçeneğini kullanarak PCR ürünleri spin. Microliter pipet her 3 µL PCR ürününün boya (% 40 sukroz ve % 0.25 bromophenol mavi) yükleme x 6 1 µL karıştırın ve özel jel jel yuvalarına yüklemek için kullanın. 1,5 µL 100 bp DNA merdivenin her satırın bir yuvaya microliter pipet ile standart boyutta pipet. Doğru Elektroforez ünitenin kapağını yerine takın ve müşteri adayları bir güç kaynağına bağlayın. Jel 100 V/cm 35 dakika süreyle çalıştırın
- Boyama banyo hazırlamak için 1 1000 mL dökün x TBE içine bir kare şeklinde plastik kutu ışık geçirmez. Etidyum bromür microliter pipet ile 50 µL eklemek, plastik kutu kapağı kapatın ve etidyum bromür eşit dağılımını sağlamak için salla.
- Jel Elektroforez birimden çıkartın ve yaklaşık 10 dakika için boyama Banyosu içine yerleştirin. Sonra jel boyama Banyosu dışarı almak ve bir jel dokümantasyon sistemi yerleştirin ve rehberine göre görselleştirmek.
- Varlığı ve şablonları sonraki son zamanlarda alınan av algılanması için fonksiyonel etkinlik açısından olumlu sonuçlar (yeterli boyutta özel jel görsel parçaları) gösterdi tek örneklerini.
| PCR-Mix | konsantrasyon çalışma çözüm | Mix 10 için µL PCR reaksiyon | PCR son konsantrasyon |
| Astar FW | 10 µM | 0.5 μl | 0.5 µM |
| Astar RW | 10 µM | 0.5 ve #956 ; l | 0.5 µM |
| reaksiyon arabellek (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16 mM (NH4) 2SO4 ve 2 mM MgCl2 son konsantrasyonları) | 1 µM | 1 μl | 1 µM |
| dNTP | 10 mM | < t d > 0,25 μl0,25 mM | |
| Taq polimeraz | 5 U | 0.1 μl | 0.05 U |
| GKD 2 0 | 6,65 μl | ||
| < stro NG > toplam tutarı tepki karışımı | 9 μl | ||
| DNA | 1 μl | ||
Tablo 1: ayrıntılı bir 10 µL PCR reaksiyon için standart reaksiyon karışımı hazırlanması için protokolü.
3. Jel Elektroforez kullanarak gruba özgü Primer setleri ile son zamanlarda alınan av/gıda maddeleri tespit.
- Yapmak PCR DNA'ın çalışma çözüm ayıklar (1.1-1.3.11 adımları göre hazırlanmış) kullanarak ve gruba özgü astar set (etiketsiz, Yani, değişiklik yapmadan) gibi hedef av grubu için uygun açıklanan 2.1.1-2.1.3 adımlar (reaksiyon karışımı ilgili astar kümesi için farklı için Tablo 2 bakınız). 2.1.4. adımda verilen standart protokolü kullanılarak PCR çalıştırmak (ilgili astar set sıcaklıkları tavlama için bkz tablo 2).
- Bir denetim ile ilgili hedef grubu (pozitif kontrol) ve bir negatif kontrol saf DNA ile çalıştırmak her PCR tüketici türlerden ait bir örnekten saf DNA kullanın.
- Özel Jel Elektroforez açıklanan adımları 2.1.6 2.1.11 kullanarak PCR reaksiyon başarısı kontrol edin. PCR reaksiyon uygun uzunlukta bir parçası (bkz. Tablo 2) görünür durumdaysa başarılı pozitif kontrolü için ama negatif kontrol için değil. Bir ya da iki ölçütü yerine getirilmemiş ise, PCR yineleyin.
- Kullanım özel Jel Elektroforez, hedef av grubu (uygun uzunluk parçası görünür olup olmaması, yargı yolu ile) test farklı tüketici numunelerin tarafından tüketilen olup olmadığını tespit etmek için 2.1.6 2.1.11, adımlarda açıklandığı gibi. Parçaları ile düşük görsel kararlılık kaçırmayın emin olun.
- Mağaza PCR ürünleri 4 ° c, eğer daha fazla analizleri sonraki 24 saat içinde bitmiş, ya da -20 ° C-analizleri daha sonra gerçekleştirilecek varsa,.
4. Daha sonra daha da aşağı Polyacrylamide jel ile SSCP analizi ile tüketilen av belirlemek.
- % 9 Akrilamid jel SSCP Elektroforez için hazır olun. Bir laboratuvar başlıklı çalışma çözümleri hazırlayın.
- 200 mL Akrilamid çalışan bir çözüm hazırlamak, bir ölçüm silindir 10 ile 20 mL doldurmak için x TBE (109 g Tris tabanının, 55 g Borik asit ve 0.50 M EDTA, 1000 mL GKD 2 O çözünmüş pH 8.0 40 mL) ve başka bir 45 mL ile %40 (29:1) Akrilamid karışımı. TBE ve Akrilamid mix (200 mL işareti bulunan mezun cam şişe de burada uygundur) mezun bir şişe dökün ve GKD 2 O kadar 200 mL işareti ekleyin. Çözüm buzdolabında (4 ° C) ihtiyaç kadar çalışmaya devam et. Bir haftadan daha eski çalışma çözüm kullanmayan. 1 mL volumetric flask ve GKD 2 O kadar mezuniyet ekleyerek işaretle bir % 10 APS hisse senedi çözüm hazırlamak için erime
- tartmak 0.1 g amonyum persülfat (İlişkilendir; kullanım ile en az 0,01 g hassasiyetle bir denge). Aliquots (yaklaşık 350 µL) taze tepki tüpler içine transfer.
Not: Bir aliquot her polyacrylamide jel için gereklidir. Mağaza kalan aliquOTS-20 ° C'de ve gerekli kısa bir süre önce sadece aliquots defrost. - Bir jel kaset iki cam tabak, bir boşluk ve bir çentikli cam levha (her 20 cm x 20 cm), aralarındaki mesafe tutucular (1,5 mm kalınlığında) ile tehlikeye montajı cam kenarlarına kadar çalıştırıyor. Her üç kat geri klip (32 mm) sağ ve sol tarafta jel kaset ( şekil 1) bağlamak için kullanın.
- Mix 5 g özel ve çözüm için % 2 özel hazırlamak için konik bir şişesi 1 x TBE arabellekte 250 mL jel. Isı ve daha sonra karışımı 2.1.6 ve 2.1.7 adımlarda açıklandığı gibi serin. Hızla çözüm bir kare şeklinde plastik kutu dökün (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) ve özel çözüm içine jel kaset (Adım 4.1.3) alt sonuna yerleştirin. Onlar kare şeklinde plastik kutu ( şekil 1) kenarında oturup bir yükseklik için jel kaset alt sonuna kat geri klibe ayarlayın. Özel tak tamamen sertleşmiş kadar yaklaşık 20-30 dk bekleyin.
- 100 mL kadar 60 mL işareti silindir Akrilamid çalışma çözüm (Adım 4.1.1) ile ölçme doldurulması ve bir ölçek solüsyonu dökün. Bir micropipette bir aliquot APS hisse senedi çözüm (Adım 4.1.2) 300 µL eklemek ve daha sonra tetramethylethylenediamine (TEMED) 37,5 µL eklemek için kullanın. Hızla, jel kaset cam plakanın arasında solüsyonu dökün. Alternatif olarak, çözüm şırınga enjeksiyon başkanı ayarlanmış bir 1000 µL pipet ucu 100 mL tek kullanımlık şırınga ile cam plakalar arasında enjekte.
- 1.5 mm kalınlığında standart fırça cam plakanın arasında üst sonunda dikkatlice yerleştirin. Tarak polyacrylamide çözüm tarafından alınmalıdır. Polyacrylamide jel polimerli kadar yaklaşık 1 saat bekleyin. Jel polimerize gereken süreyi artırır çünkü havalandırma mümkün olduğunca polimerizasyon sırasında kaçının.
Not: 3 gün buzdolabında ıslak mendil ile mühürlü plastik torbalar içinde döküm jelleri stok ilâ mümkündür.
Resim 1: resim gösteren İnşaat polyacrylamide jeller dökün. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- polyacrylamide hazırlanan, bir Dikey Elektroforez birimde jel içeren jel kaset yerleştirin. Dolgu Elektroforez birim 0.5 x TBE ve serin aşağı 10 ° C soğuk hava sirkülatörün kullanarak birimi uygun miktarda (Elektroforez birimi türüne).
- DNA denatürasyon için bir termal-blok /-cycler 96 Onceden ° C. Prepare denatürasyon arabellek % 95 formamide (% 99.5 sahne sanatları sınıf) ve % 0.25 bromophenol mavi ve % 40 (w/v) Sükroz içeren %5 sulu çözüm.
- Buzdolabı ya da derin dondurucu PCR ürünleri alın ve onları defrost. Bir mini (plaka) santrifüj kısa çalışma seçeneğini kullanarak PCR ürünleri spin. Sonra her 4 µL PCR ürününün denatürasyon arabellek 4 µL ile karıştırın. Isı karışımları 10 dakika süreyle buzlu su soğutma bir adımda hemen ardından 96 ° C'de 5 min için
Not: Örnekleri polyacrylamide jel (Adım 4.5) hemen bundan sonra yüklü olmalıdır. - Tarak polyacrylamide jel (Adım 4.1.6) çıkarın ve bir micropipette tamamen her örnek bir jel yuvasına yüklemek için kullanın. Elektroforez jel başına 8 W çalışmasını sürekli gerekli 10 ° c süre Elektroforez birimine soğutma ayrılması parçasının boyutuna bağlıdır. Parça boyutları yaklaşık 210 için bp, yaklaşık 3,5 saat çalışan bir zamanı olarak kabul edilir uygun.
- Boyama banyo hazırlamak için 1000 mL 1 x TBE kare şeklinde plastik içine ışık geçirmez kutu ve boya (tek iplikçikli DNA leke için uygun) Boyama 30 µL ekleyin dökün microliter pipet ile. Plastik kutu kapağı kapatın ve boyama boya eşit dağılımını sağlamak için salla.
- Jel kaset Elektroforez odasından kaldırın ve çentikli cam levha jel dikkatle ayırın. Polyacrylamide jel boş cam tabaktan boyama banyo içine kaydırın. Sürekli titriyor ile 20-30 dk için titreyen bir platform ve leke jel üzerine boyama Banyosu yerleştirin.
- Jel boyama banyosu dışında dikkatlice alıp bir belgelendirme sisteminin UV masaya yerleştirin.
Not: jel istikrarsızlık nedeniyle önceki adım iki kişiyle işlemek için tavsiye edilir. Bir kişi UV tablosunun yanındaki boyama Banyosu tutun ve bir tane jel iki eliyle altında ulaşmak, dışarı almak ve UV masaya slayt. - Kapağı veya dokümantasyon sisteminin kapıyı kapatın ve üreticiye göre fotoğraf çekmek ' s kullanım kılavuzu.
5. Birden çok son zamanlarda yutulur av grupları otomatik parça analizleri kullanarak paralel olarak algılamak.
- Analiz DNA bağırsak içeriğini ayıklar 16 gruba özgü astar kullanarak ayarlar tablo 2., bir boyama boya ile değişiklik nedeniyle etiketli bir kümesinin bir astar ile verilen (bkz. Tablo 2 sütun değiştirme başlıklı) ve paralel algılama yöntemleri kullanın otomatik bir sequencer,.
- (1.1-1.3.11 adımları göre hazırlanmış) DNA özleri ve kuralları çalışma çözüm her astar gibi ayarlamak için PCR ayırmak kullanma adımları 2.1.1 için (karışım değişimler Tablo 2 verilen) 2.1.5 açıklandığı. En az bir denetim ile ilgili hedef grubu (pozitif kontrol) ve bir negatif kontrol saf DNA ile çalıştırmak her PCR tüketici türlerden ait bir örnekten saf DNA kullanın. Tablo 2 ' de verilen ayarla her astar için
- çalıştırmak PCR adım 2.1.4, verilen standart PCR protokolü kullanılarak thermocycler içinde düzeltilmiş ilgili tavlama sıcaklığı (ve döngü sayısı).
Not: PCR ile her sonraki PCR ürünlerinin havuzu toplanmış için basitleştirmek için 16 farklı astar ayarlar otomatik parça analizleri için tepki wells aynı DNA tahsisi kullanın. - Mağaza PCR ürünleri-20 ° c kadar tüm PCR otomatik parça analizleri (bkz. Tablo 2) bitti mi için bir toplu işlemine ait. PCR ürünleri karanlıkta bırakın ve onları parça analizleri önce 1 haftadan uzun tutmayın.
Tablo 2:, 15 gruba özgü astar çiftinin 2 toplu işlemleri ayrıntılarını Koester ve ark. tarafından kurulan (2013) ve yeni tasarlanmış Jae28S astar çift su macroinvertebrates 16 hedef grupları üzerinden 18S veya 28S rDNA bölgelerinde yükseltecek. f, ileri astar; r, ters astar; 18s, astar 18S rDNA alt birim hedefleri; 28s, astar 28S hedefler. rDNA alt birim. " Hydrobiologia, Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) olan bir ' katil karides ' Ren Nehri sistemi?, 768, 2016, tablo S1, takıma giren malzeme sayfa 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© sıçramak Uluslararası İsviçre 2015 yayımlama) " Springer izniyle. Bu tablo daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- tüm 16 astar kümeleri güçlendirilmiş parçaları tespit etmek için
- Tablo 2'de verilen 2 gruplar halinde otomatik parça analizleri yapmak. Bir iç boyutu standart kullanın (DNA boyutu standart Kit - 400 [toplu B] ve - 600 [toplu iş A], sırasıyla) parçası uzunluğu belirlemek için. Sıralama plaka ve Otomatik Sekanslama aşağıdaki adımlarda açıklandığı şekilde hazırlayın. Bu yordamı Eğer bu malzemeler tabloda verilen daha başka bir platform kullanarak ayarlanması gerekebilir Not.
- Toplu örnekleri çalıştırmak için örnek yükleme çözümü (SLS) ve standart ilgili boyutu içeren bir karışım hazırlamak. SLS 21,6 µL ve DNA boyutu standart Kit - örnek toplu iş a ve, sırasıyla, SLS 21,7 µL ve DNA boyutu standart Kit 0.3 µL başına 600 - 0.4 µL pipet örnek toplu iş b başına 400
- Dondurucu dışında ilgili toplu ait 8 PCR PCR ürünleri alın ve onları defrost. Onlar hala karanlıkta tutulur emin olmak.
- Her 22 µL 5.2.1. adımda açıklanan ilgili karışımı ile gerekli bir sıralama plaka (çözümlenmesi için örnekleri sayısı) kuyu sayısı yüklemek için bir microliter pipet kullanın. PCR ürünlerinin her bir mini (plaka) santrifüj kısa çalışma seçeneğini kullanarak 8 PCR spin. Sıralama plaka microliter pipet ile ilgili kuyu içine her 1 µL PCR ürün her 8 PCR birinin başına transfer.
- Dikkatle bu karışımı bir mini plaka santrifüj kısa bir çalışma ile sıralama plaka içinde aşağı spin ve her bir damla mineral yağ ile kullanılan Wells yerleşimi. DNA ayrılık arabellek 250-300 µL ile ilgili tepki Kuyu yapımı bir arabellek tabak doldurun.
- Bir örnek kurulum üretici göre oluşturmak için kılcal sequencer yazılımı kullanın ' s yönergeleri. Örnek ayarlar kontrol ve (Tablo 3 bkz: Malzemeler tablo verilen boyutu standart ile kullanım için yeterli koşulları çalıştırmak için) verileri işlemek için kullanılan yöntemleri sırasını belirlemek için yöntemleri atamak. Örnekleri örnek Setup içerisinden tahsisi (dahil olmak üzere pozitif ve negatif, bkz adım 5.1.1) sıralama plaka örnek tahsisini eşleşip eşleşmediğini ve parça için yeterli yöntemi ile ilgili inceliyor çok önemli olduğunu unutmayın boyutu standart seçilir.
- Bir ıslatma tepsi deiyonize su ile doldurun ve sıralama plaka, tampon plaka ve ıslatma tepsi kapiller sequencer yerleştirin. Örnek çalıştırmak için gerekli olan taze DNA ayrılık jel yeterli miktarda içeren bir jel kartuşu takın. Hazırlanan örnek Kurulumu kullanarak sıralama plakayı araştırmanı.
| denatüre | ayrı | Kılcal damar | enjekte | ||||
| Sıcaklık | zaman | gerilim | zaman | gerilim | zaman | ||
| boyutu standart 600 | 90 ° C | 120 s | 4,8 kV | 60 dk | 50 ° C Temp için bekleyin: Evet | 2.0 kV | 30 s |
| boyutu standart 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 dk | 50 ° C Temp için bekleyin: Evet | 2.0 kV | 30 s |
Tablo 3: belirli koşullar için parça analizleri malzemeleri tabloda verilen boyut standartları kullanarak Otomatik Sekanslama üzerine.
- sonuçları analiz etmek için
- ham verileri verme ve bu verileri bir parçası analysis program yüklemek. Standart boya boya renk kanalları ayarlamak için renk siparişleri ilgili üreticinin seçin.
- Tek Kişilik gruba özgü astar tarafından güçlendirilmiş parçası uzunluğu beklenen dizi özetleyen bir Panel ayarlar içinde bir toplu iş programının kullanıcı kılavuzuna göre oluştur. Verileri işlemek için
- ilgili Panel, uygun boyutu standart, Standart renk ve analiz türü seçin ve yordamı çalıştırın. Floresan sinyal yoğunluklarda Kapiler Elektroforez cihazları üzerinden bir tek satır izleme için her boya renk olarak görüntülemek için electropherogram seçeneği seçin. İşaretleri/astar kümeleri ilgili parça aralığı belirten görüntülenir ve algılanan parçasının her denilen zirve merkeziyle ilişkili tam uzunluğu (çoğu program tarafından renklendirme veya atanan ad) vurgulanır otomatik olarak.
- Ne kadar yakından her örnek için hesaplamak örnek ' s iç boyutunun çift boyutu arama başarısını güvence vermek için seçili boyutu standart aynı. Çoğu parçası analizleri program otomatik olarak hesaplamak ve bu maç görselleştirmek için bir seçenek var. Boyutu arama başarısız olursa, bu örnekleri için parça analizleri yineleyin.
- Görsel olarak her örnek electropherogram yeniden denetleyin ve Onayla/unconfirm ayrı olarak ayarlayın her işaretleyici/astar için denilen her tepe. El ile bir işaretleyici/astar kümesinin ölçütlere uyan veya kullandığınız programın kullanıcı kılavuzuna göre yanlış olanları silmek biraz beklenmedik doruklarına yerleştirin. Baz çifti boyutu veya depo adı Uygula ' alleli etiket '. Hesaplamak ve en yüksek teknik özellikleri görüntülemek ' tepe tablo '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı için diyet analizleri farklı çalışmalar içinde açıklanan adımları başarıyla kullanılır. Bu bölümde, biz protokol farklı bölümlerini uygulanabilirliği açıklayan örnekler mevcut.
Örneğin, yazarlar28 ve daha da aşağı akım analizleri PCR ürünleri SSCP analizleri tarafından potansiyel tarafından kurulan gruba özgü astar kümeleri etkinliğini göstermek için bir besleme deney. Dikerogammarus villosus birey olarak saldırganlar ve Caenis'in spp. larva av olarak Ren Nehri ve önemsizden Karlsruhe (Almanya) yakınındaki ele geçirildi. Laboratuvarda, avcı ve yırtıcı takson süzülmüş akışı suda 20 ° C'de ayrı ayrı tutuldu ve 36 saat boyunca aç. Deneme için amphipod numuneler kadehler tek tek, iki veya üç Caenis'in larva 30 dk için beslenen ve daha sonra sıvı azot içinde donmuş süzülmüş akışı su (100 mL) ile yerleştirildi. Her D. villosus gastrointestinal sistem disseke ve DNA Protokolü 1'de açıklandığı gibi ayıklandı. DNA özler Caenis'in spp. uygun PCR protokolü28 Protokolü 3'te açıklandığı gibi kullanarak algılamaya uygun ayarla Caep28S astar ile test edildi. Farklı Caenis'in türlerin güçlendirilmiş parçaları arasındaki farklar doğrulamak için PCR gut içerik örnekleri ve üç Caenis'in başvuru türünün saf DNA örnekleri ile yapılmıştır. Özel Jel Elektroforez Elektroforez (şekil 2A) bu tip farklı Caenis'in türler arasında ayırt edemez çift telli DNA'ın tek grup yol açtı. Buna ek olarak, SSCP Jel Elektroforez tarafından Protokolü 4'te açıklandığı gibi av organizmaların türler düzeye gut içerik örnekleri başvuru örnekleri (şekil 2B) ile karşılaştırarak tanımlamak mümkün oldu. SSCP parçası desen üç başvuru özellikleri Caenis'in beskidensis (şekil 2B, lane 1), Caenis'in horaria (şekil 2B, lane 2), ve Caenis'in luctuosa (şekil 2B, lane 3) dört şeritli türevlenebilir desenleri ile oluşuyordu. İki bağırsak içerik örnekleri (şekil 2B, lane 4 ve 5) C. luctuosa (şekil 2B, lane 3) eşit bir parçası desen vardı. Üçüncü gut içerik örnek (şekil 2B, lane 6) parça desen C. horaria (şekil 2B, lane 2) için özdeş. Sıra analizleri iki delik deşik içerik örnekleri C. luctuosa ve C. horaria (şekil 2B, lane 4 ve 6) olarak tanımlanan ve bu sonucu ilgili başvuru türler doğrulanmadı (elektronik ek hizalama fasta dosyasına bakın).
Resim 2: (A)özel Jel Elektroforez orijinal görüntü ve (B) SSCP analizini PCR gut içerik parçaları ve başvuru örnekleri Caep28S astar set ile güçlendirilmiş. Dar sokak 1-3 türler Caenis'in beskidensis (1), Caenis'in horaria (2) ve Caenis'in luctuosa (3) başvuru örnekleri göster. Şerit 4-6, parça desen amphipod Dikerogammarus villosus farklı gut içerik örnekleri sunulmaktadır. Lane 7 100 bp DNA merdivenle parçası desenini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ayrıca, bir laboratuar DNA chironomid bireylerin tüketilen su akarları tespit eğer larvaları sadece tür Hygrobates fluviatilis ait akarları chironomid beslenen edildi hangi su belirlemek içinde yapılan, Ama ayrıca DNA miktarını tespit test için av29tüketim beri geçen zaman bağlıdır. Yaklaşık bir hafta için akarları açlıktan sonra her kene bir chironomid larva gıda olarak teklif edildi. Her 3-4 su akar bireyler etanol (mutlak) kullanarak dipteran aile Chironomidae28 için belirli Chiro18S astar küme 1'de genetik analiz için 2, 3, 7, 9, 24, 32 ve 50 h29beslenen sonra tespit edildi. Tüketimi su akar bireyler tarafından derecesini anılan sıraya göre av bireyler aşağıdaki beş besleme kategorilere sınıflandırıldı: 1 tamamen emdi, deri tamamen boşaltılmış = (> % 90), 2 neredeyse tamamen dışarı emdi = (> % 75-90), 3 her şeyi berbat ettin yarı = (> % 50-75), 4 = sadece kısmen her şeyi berbat ettin (> 5-%50), 5 = avın vücut yapısı (≤5%)29görünür bir değişiklik yok. DNA su akarları (Adım 1.2.1 ve 1.2.2) protokolü 1'de açıklandığı gibi ayıklandı ve 18S rDNA özü varlığı ve fonksiyonel etkinlik şablonunun doğrulandı Protokolü 2'de açıklandığı gibi. Algılama DNA gerçekleştirilen Protokolü sadece Chiro18S kullanarak ileri astar ile ayarla astar etiketli ile 4 göre yırtıcı bir floresan boya (bkz. Tablo 2) ve DNA boyutu standart Kit - 400. Örnekleri arasında karşılaştırmalar analiz otomatik bir sequencer, örnek pik yüksekliği ve pik yüksekliği arasındaki oran farklı ishal içinde izin vermek için dahili standart en yakın (Yani, 360 bu durumda bp) her örneğinin hesaplanır ve olarak kullanılan bir proxy tespit DNA miktarı için. Sonuçları chironomid DNA chironomid larva29tarihinde beslenen Hygrobates fluviatilis hemen hemen tüm bireylerin tespit olduğunu gösterdi. En uzun süre için en kısa aralığı (1 h besleme sonra) gelen (50 h) besleme tespit edilen av DNA göreli miktarını önemli ölçüde sonra (şekil 3A)29azaltılmış. Ayrıca, besleme sonra zaman ve av sınıflandırma ilişkisi DNA olabilir av alınan miktarı için bir proxy gibi (şekil 3B)29doğruladı. Azalması giderek artan bir süre sonra besleme olasılıkla tespit DNA tamamen DNA bozulması ve sindirim yırtıcı tarafından yansıyan av, egestion, av çünkü DNA bir anüs su akarları29eksikliği nedeniyle son derece mantıksız. Bu sonuçlar bu yaklaşım hafızanın av miktar için uygunluğu doğrulayın.
Şekil 3: Ulusal ln yükseklik-oranı (örnek-tepe yükseklikleri/standart360 en yüksek yükseklik) ve(a)arasındaki ilişkileri zaman sonra besleme akarları ve (B) besleme Kategori (n = 23). "Deneysel ve uygulanan Acarology, ilk olarak algılanmasını av DNA'fluviatilis Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari'siniz): su akarları, avcı-av ilişkileri belirlemek için yeni bir yaklaşım 67, 376, s. Martin, M. Koester, L. Schynawa, R. Gergs, (© Springer Uluslararası Olimpiyat yayımlamave 2015) "Springer izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Alan, yoğun kararlı izotop analizlerde invaziv amphipod D. villosus tarafından avlanma δ13C önemi ve δ15araştırmak için N D. villosus ve potansiyel gıda kaynakları elektronika tarafından Moleküler bağırsak içeriği tam olarak aynı bireylerin içinde son zamanlarda alınan av olarak algılanması. Toplamda, 206 D. villosus bireyler farklı sitelerden toplanmıştır ve gastrointestinal sistem her bireyin disseke ve DNA Protokolü 1 göre ayıklandı. Varlığı ve kullanılan şablonları fonksiyonel etkinlik güvence verdi Protokolü 2'de açıklandığı gibi. D. villosus bireyler üzerinde birden çok macroinvertebrate av takson tarafından son predasyona Protokolü 4'te açıklandığı gibi test edildi. Genel olarak, D. villosus bağırsak içeriği sadece % 16 16 hedeflenen macroinvertebrate av takson birine ait DNA için pozitif test ve bu nedenle düşük bir predacious beslenme davranış belirtilen kararlı izotop analizi sonuçlarını desteklenen alan27' deki invaziv amphipod. Genetik analizlerle içinde DNA'sı 12 test av özellikleri en az 1 gut içerik örnekte bulundu, diğer 4 av özellikleri DNA asla algılanan (şekil 4)27oldu.
Şekil 4: İlgili sayisi D. villosus bağırsak içeriği macroinvertebrate için pozitif test tüm on sitelerden gösteren çubuk grafik av DNA'sı. PCR 16 gruba özgü astar kümeleriyle belirtildiği şekilde gerçekleştirilmiştir. "Hydrobiologia, Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) Ren Nehri 'katil karides' sistemidir?, 768, 2016, 310, Koester Meike, Bayer Bastian Gergs René, (© Springer Uluslararası Yayıncılık İsviçre 2015)" izni ile Springer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek dosya. Sequence_alignement_feeding_trial.FASTA Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, avcı-av etkileşimler aynı numune moleküler olmayan diğer analizler ile kombine edilebilir rDNA bölgeler için gruba özgü astar ile alan örneklerinden PCR tabanlı tespiti için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem mevcut. Ancak, protokol içinde çeşitli kritik adımlar vardır. İlk olarak, kullanılan astar özgüllük temin esastır. İkinci olarak, mide-bağırsak hazırlanması ve DNA'ın sonraki çıkarma sırasında kontaminasyon ve gut içerik malzeme kaybı önlemek çok önemlidir. Çapraz-örnek kirlenme av DNA yanlış pozitif tespiti için a_rısına, gut malzeme nadiren eksik açabilecek içerik kaybı avcı türlerin tüketilen. İlgili alt birim ve fonksiyonel etkinlik analizleri (Bölüm 2 iletişim kuralı) için kullanılan şablonları ait rDNA varlığı doğrulanması hakkında tüketilen av temsilcisi bilgileri toplamak için esastır. Özellikle tüketici beslenecek sözde av gruplarının DNA tespit edilen25,27olabilir eğer çok önemli bu. Ayrıca, PCR (Adım 3.1, 5.1.1 ve 5.1.2) hazırlarken bu karışımı ve tam olarak kullanılan iletişim kuralı ilgili astar özellikleri belirli bir gruba belirtildi ölçütlere uyan çok önemlidir. Aksi takdirde, DNA amplifikasyon içinde PCR reaksiyon tamamen başarısız olabilir veya DNA hedeflenmemiş özellikleri de güçlendirilmiş. Bu nedenle, olumlu kullanmak için zorunludur ve PCR reaksiyon temin için çalıştı ve hiçbir kirlenme oluştu içinde her PCR negatif denetimleri çalıştırmak. Ayrıca, her PCR çalıştırmak örnekleri dizisi tam olarak etkinleştirmek için ilgili tüketici numune tüketilen av doğru ataması için belgelenen gereklidir. Bu görev için belirli uyarı PCR ürünleri otomatik parça analizleri (Adım 5.2.3) üzerinden birden çok av grubu paralel algılanması için havuzu oluşturma sırasında alınması gerekir.
Güçlendirilmiş parçaları özel Jel Elektroforez (Adım 3.2 ve 3.3) özel kullanarak tespiti için jeller gibi ince olmalı ve görüntünün görsel denetim sırasında düşük görsel çözünürlüğü ile parçaları eksik önlemek için alınması gereken bakımı vardır. Sonuç ve tüketiciler tarafından av tüketimi hakkında uygun bir sonuç için bile nadiren tüketilen av takson tanınan önemlidir. Kalın özel jelleri av DNA'ın potansiyel olarak düşük miktarda görünürlüğünü azaltmak ve böylece nadiren tüketilen av özledim ve belirsizlikler analizinden çizilmiş sonuçlar içinde tanıtmak için olasılığını azaltır. Ayrıca, bir sağlık açısından, daha az - ya da alternatif bir non-toksik etidyum bromür daha jelleri boyama için kullanmak tavsiye olabilir. Sonraki aşağı akım analizinde polyacrylamide Jeller kullanarak SSCP analizleri yolu ile güçlendirilmiş parçaları için protokolü belirli dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken bazı adımlar içerir. Bu jel kasete monte sızıntı geçirmez (Adım 4.1.3) ve polyacrylamide çözüm yeterli zaman tamamen polimerize verilir önemlidir (Adım 4.1.6). Kaset çok erken açılması için sıvı Akrilamid çözüm sızıntı ve hazırlık de yapılması gereken temizlik kapsamlı başından itibaren başlatılacak olan rağmen yol açacaktır. Ayrıca, polyacrylamide jel boyama Banyosu (Adım 4,7) ve UV tablo (Adım 4.8) çok dikkatli bir şekilde böyle jelleri istikrarsızlık nedeniyle yapılması gereken üzerine oradan aktarıyorum. Aksi takdirde, jel gözyaşı ve parçaları da zorunluluk için yordamı yineleyin neden bozulmuş.
Otomatik parça analizleri alınan verileri başarılı bir şekilde işlenmesi için bir önemli ihtiyacı olduğunu örnek'ın iç boyutu standart yakından belirlenmesi etkinleştirmek için (Adım 5.3.3) üretici tarafından verilen boyutu standart desen eşleşmesini uygun parça uzunluğu. Çünkü aksi takdirde, farklı parçaları, boya, boyama aynı floresan ile etiketli yanlış av takson atanabilir ve bu nedenle avcı-av etkileşimleri tam bir hata için neden bu özellikle önemlidir. Ayrıca, electropherograms sık sık arka plan gürültü göster. Yorumunu güven kurmak için iç boyutu standart doruklarına örnek arka plan gürültü önemli ölçüde daha yüksek esastır. Sonuç olarak, eğer onlar arka plan gürültü anlamlı olarak daha yüksek tepeler her işaretleyici/astar için yalnızca sayılması.
Bu iletişim kuralı avını özellikleri çeşitli tüketici ilgi içinde ilgi çeşitli gruplar algılamak için değiştirilebilir. Kuşkusuz, gruba özgü astar zaten her potansiyel av takson ilgi için mevcut olmayabilir. Yine de, gruba özgü astar sadece birkaç tatlı su macroinvertebrate takson28, ama aynı zamanda çeşitli diğer özellikleri için kullanılabilir (Örneğin, birkaç deniz macroinvertebrate takson16,30 ve ortak özellikleri) uçan böcekler31. Böylece, gruba özgü astar yelpazesi DNA'ın belirli bir takson tüm avcı türlerin yükseltmek uygun ayarlar, ancak temel32DNA amplifikasyon bu takson ait olmayan türlerden içinde başarısız olur. Are şimdi elde edilebilir birçok gruba özgü astar özellikleri (örneğin, tatlı su macroinvertebrates Ren Nehri sistemi28ortak 130 takson) belirli bir Aralık için belirtildi. Bu nedenle, yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlar önlemek için böyle astar özgüllük takson ortak hedef özellikleri ve özellikleri için aralıktaki dahil tüketiciler için onların uygulamadan önce ilgi ekosistem aralığı için yeniden denetlenebilir astar kurulan. Ayrıca, bu moleküler analizleri ile Birleşik değil istiyorsak gastrointestinal sistem tam olarak aynı bireysel, diseksiyon diğer analizlerini atlanabilir.
Yine de, daha büyük örneklerin gastrointestinal sistem Anatomi da DNA ekstraksiyon başarısızlık nedeniyle çok fazla malzeme engeller ve tüketici-DNA örneği özü varlığını azaltır. Ancak, çalışmalar belirli engelleme primerler kullanılarak, hangi tüketici DNA için eklemek ve böylece, PCR reaksiyon için blok etkin bir şekilde karışık örnekleri33nadir serilerinde amplifikasyon artırabilir göstermiştir. Bu nedenle, gastrointestinal sistem diseksiyon, zaman bile daha büyük tüketici numuneler ile ilgili belirli engelleme primerler kullanılarak önlenebilir. Otomatik parça analizleri yolu ile birden çok gruba özgü astar kümesi türetilmiş amplicons paralel tespiti için etiket olarak boya boyama seçiminde özen gösterilmelidir. Böylece, yaklaşık aynı uzunlukta parçaları yükseltecek astar setleri ile açıkça ayırt floresan boyalar etiketli. Ayrıca, çeşitli üreticilerin Kapiler Elektroforez Sistemleri bir dizi mevcuttur. Bu sistemlerin bazı sözde birden çok parçaya bile belirsiz boyalar ile tayini sağlar. Burada sunulan iletişim kuralı, herhangi bir bu sistemleri ile güçlendirilmiş parçaları tespit etmek için kolayca ayarlanabilmektedir. Bunun dışında t için gereken süreyi azaltmak içino inceliyor, tek multiplex-PCR deneyleri DNA parçası analiz toplu av grupları aynı anda yükseltmek için en iyi duruma getirmek mümkün olacaktır (örneğin, aynı anda amplifikasyon 12 av organizmaların böcekleri34 veya yukarı altı uçan böcek takson31).
Bir potansiyel dezavantajı delik deşik içerik analizleri genel olarak ve bu nedenle de bu protokol için açıklanan analizleri düşük zamansal çözünürlük. Tür yöntemler ile sadece tek av organizmalar2önemli belirsizlikler neden olabilir son zamanlarda alınan organizmalar tanımlamak mümkündür. Ancak, bu protokole göre genetik analiz kolayca tam aynı tüketici numunelerin25,27kararlı izotop (δ15N ve δ13C) analizleri ile kombine edilebilir gösterdi. Zaman entegre doğal izleyici avcı-av etkileşimlerin kararlı izotop analizleri gıda web yapıları1karakterize için sık sık kullanılır, ancak farklı avcı türlerin potansiyel örtüşen izotopik değerleri genellikle kesin bir engel avcı-av etkileşimleri2tanımı. Bu nedenle, her yöntem yapabilirsiniz dezavantajları daha fazla gıda ağları ve besin veya enerji tozlar ile ilişkilerini anlayışımızı üstesinden gelmek için kararlı izotop analizi ile birlikte genetik analizler için bu iletişim kuralını kullanan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Silke Classen Araştırma Enstitüsü'nden ekosistem analizi ve değerlendirmesi (gaiac), bu protokol için kullanılan gruba özgü astar kümeleri kurulmasında yardımını RWTH Aachen için teşekkür ederim. Biz de teşekkür Peter Martin ve Laura Schynawa Kiel Üniversitesi işbirliği için gelen su akarları deneyler. Biz de sorunsuz çalışmasını ve şirketler ve Katalog numaraları kayıt hazırlık lab teknik laboratuar görevlileri tutmak için teşekkür ederiz. Bu eser (DFG; proje GE 2219/3-1) Alman Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
- Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
- Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
- Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
- Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
- Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
- Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
- Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
- Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
- Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
- Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
- Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
- Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
- Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
- Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
- Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
- Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
- Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
- Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
- Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
- Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
- Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6 (2007).
- Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
- Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
- Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
- Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831 (2007).
- Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).
- Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
- Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12 (2008).
- Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).
