आनुवंशिक आंत सामग्री के लिए प्रयोगशाला प्रोटोकॉल समूह विशिष्ट rDNA प्राइमरों का उपयोग जलीय Macroinvertebrates का विश्लेषण
Summary
सबसे आम आंत सामग्री macroinvertebrates के विश्लेषण दृश्य हैं । शिकार जीवों की रूपात्मक विविधता के बारे में गहन ज्ञान की आवश्यकता होती है, वे नरम शरीर शिकार याद आती है और, शिकार की मजबूत comminution के कारण, amphipods सहित कुछ जीवों के लिए लगभग असंभव हैं । हम amphipods के आहार में macroinvertebrate शिकार पहचान के लिए विस्तृत, उपंयास आनुवंशिक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।
Abstract
खाद्य जाले का विश्लेषण पारिस्थितिकी प्रणालियों के एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, खाद्य वेब बातचीत गैर स्वदेशी प्रजातियों के आक्रमण की वजह से गंभीर परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैं । हालांकि, क्षेत्र शिकारी की एक सटीक पहचान-शिकार बातचीत कई मामलों में मुश्किल है । ये विश्लेषण अक्सर आंत सामग्री का एक दृश्य मूल्यांकन या स्थिर आइसोटोप अनुपात के विश्लेषण के आधार पर कर रहे हैं (δ15एन और δ13सी). इस तरह के तरीकों के बारे में व्यापक ज्ञान की आवश्यकता है, क्रमशः, सुघड़ विविधता या व्यक्तिगत शिकार जीवों से isotopic हस्ताक्षर, शिकार जीवों की सटीक पहचान में बाधाओं के लिए अग्रणी. दृश्य आंत सामग्री विश्लेषण विशेष रूप से नरम शरीर शिकार जीवों को मूल्यवान समझना, क्योंकि थकावट, घूस और शिकार जीवों के पाचन मुश्किल विशिष्ट प्रजातियों की पहचान बनाते हैं । इसलिए, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित रणनीतियों, उदाहरण के लिए समूह के उपयोग के विशिष्ट प्राइमर सेट, खाद्य वेब बातचीत की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं । यहां, हम विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए समूह का उपयोग कर क्षेत्र से macroinvertebrate उपभोक्ताओं के आंत सामग्री की जांच करने के लिए परमाणु राइबोसोमल deoxyribonucleic एसिड (rDNA) के लिए विशिष्ट प्राइमर सेट । डीएनए या तो पूरे नमूनों से (छोटे taxa के मामले में) या बाहर क्षेत्र में एकत्र नमूनों की आंत सामग्री से निकाला जा सकता है । उपस्थिति और डीएनए टेंपलेट्स के कार्यात्मक दक्षता की जरूरत है परीक्षण व्यक्ति से सीधे की पुष्टि की यूनिवर्सल प्राइमर डीएनए के संबंधित उप इकाई को लक्षित सेट का उपयोग कर । हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि भस्म शिकार आगे नीचे एकल किनारा अनुरूप बहुरूपता (SSCP) polyacrylamide जैल का उपयोग विश्लेषण के साथ संयुक्त अनसंशोधित समूह विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर के माध्यम से प्रजातियों के स्तर को नीचे निर्धारित किया जा सकता है । इसके अलावा, हम बताते है कि लेबल के रूप में विभिंन फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग विभिंन शिकार समूहों के डीएनए टुकड़े के लिए समानांतर स्क्रीनिंग स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण के माध्यम से एकाधिक आंत सामग्री नमूने से सक्षम बनाता है ।
Introduction
शिकारी-शिकार बातचीत, जो पौष्टिकता बातचीत और खाद्य वेब गतिशीलता के बहुमत का गठन, महत्वपूर्ण पहलुओं के भीतर और पारिस्थितिकी प्रणालियों, जो पारिस्थितिकी के प्रमुख लक्ष्यों में से एक है के बीच खाद्य जाले भर में और ऊर्जा के प्रवाह की विशेषता है 1. स्रोत और कार्बन और पोषक तत्वों के प्रवाह के निर्धारण के पारिस्थितिकी प्रणालियों के बीच पारिस्थितिकी कनेक्टिविटी की समझ2आगे बढ़ रहा है । हालांकि, नदियों और उनके पकड़ने के रूप में पारिस्थितिकी प्रणालियों, जैविक पदार्थ और पोषक तत्वों के प्रवाह से ही नहीं बल्कि जीवों के आंदोलनों से भी जुड़े हैं3. इस प्रकार, आवास परिवर्तन संसाधनों के प्रवाह में दखल है कि उन प्रणालियों कड़ी दृढ़ता से दोनों पारिस्थितिकी प्रणालियों के खाद्य जाले बदल सकते हैं, न केवल सीधे, लेकिन भी अप्रत्यक्ष रूप से शिकारी शिकार समुदायों के संबंधित संरचना बदलकर । उदाहरण के लिए, खाद्य जाले के परिवर्तन के लिए एक शिकारी प्रजातियों के आंदोलनों (जैसे, इंद्रधनुष ट्राउट)4से जोड़ा जा दिखाया गया है । इस तरह के परिवर्तन संभावित जैव विविधता और जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों के कामकाज की धमकी । इसलिए, क्षेत्र में शिकारी शिकार बातचीत का विश्लेषण, जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों के देशी जैव विविधता पर, जल प्रबंधन प्रथाओं के रूप में मानव प्रेरित पर्यावरण परिवर्तन, के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है ।
चूंकि ट्रैकिंग पौष्टिकता लिंकेज जटिल प्रणालियों में मुश्किल है, कई दृष्टिकोण स्थापित किया गया है कि क्षेत्र में बातचीत खिलाने के आकलन को सक्षम5। परंपरागत रूप से, क्षेत्र में बातचीत खिलाने की जांच शिकार के दृश्य पहचान के आधार पर कर रहे है विच्छेदित हिंमत में रहता है और सुघड़ शिकार विविधता के बारे में एक व्यापक ज्ञान की आवश्यकता है । दृश्य आंत सामग्री विश्लेषण उपभोक्ताओं के कई समूहों के संसाधन उपयोग में अंतर्दृष्टि प्रदान की है (जैसे, लॉबस्टर6 और मछली7के आहार में मौसमी भिंनता,8 या copepods के खिला वरीयताओं) । हालांकि, पाचन की शारीरिक प्रक्रिया दृश्य आंत सामग्री का विश्लेषण करता है मुश्किल है और आम तौर पर नरम शरीर शिकार-जीवों9याद करते हैं । तरल घूस से खिला प्रजातियों के लिए या कुछ invertebrate उपभोक्ताओं के लिए है कि गहन घूस से पहले अपने भोजन, amphipods की तरह, आंत सामग्री में शिकार प्रजातियों में से दृश्य पहचान असंभव है10। इन सीमाओं के कारण, आणविक विश्लेषण एक आशाजनक विकल्प प्रदान करता है ।
आणविक विश्लेषण अब एक आम आंत सामग्री में तेजी से और सटीक शिकार का पता लगाने की अनुमति उपकरण बन गए हैं । इस तरह की तकनीक की रेंज विविध है: मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) पर आधारित रणनीतियों अक्सर उनकी उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के कारण,11का उपयोग किया जाता है । नए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के विकास के समय और लागत गहन है, इसलिए, अन्य आणविक तकनीकों के आवेदन अधिक उपयोगी है जब एंटीबॉडी पहले से ही11मौजूद नहीं है । एक अंय आम दृष्टिकोण deoxyribonucleic एसिड (डीएनए), राइबोसोमल ribonucleic एसिड (आरएनए) ज्यादातर प्रजातियों में मौजूद जीन की तरह के क्षेत्रों के प्रवर्धन, यूनिवर्सल प्राइमर सेट12,13का उपयोग कर रहा है । इस तकनीक का उपयोग करते समय, यह अक्सर डीएनए के मिश्रित स्रोतों के भीतर शिकार जीवों की पूरी श्रृंखला की पहचान करने के लिए संभव नहीं है14. इस तरह की एक खामी से बचने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण आनुवंशिक आंत सामग्री विश्लेषण के लिए समूह विशेष प्राइमर सेट का उपयोग करने के लिए है । विशेष लक्ष्य समूहों के केवल डीएनए क्षेत्रों बढ़ाना और अंय सभी प्रजातियों के बाहर15,16, समूह विशिष्ट प्राइमरों के बिना निर्दिष्ट समूहों के वर्गीकरण स्तर पर शिकार जीवों की पहचान को सक्रिय करने के लिए डिज़ाइन समय और लागत गहन माध्यमिक विश्लेषण । हालांकि, सभी आंत सामग्री विश्लेषण की तरह, इस तरह के विश्लेषण केवल खिला व्यवहार का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं । इसलिए, समय के विश्लेषण के साथ आणविक आंत सामग्री विश्लेषण के संयोजन प्राकृतिक अनुरेखकों को एकीकृत (जैसे, स्थिर आइसोटोप) लाभकारी माना जाता है1,2.
यहां, हम पीसीआर के लिए एक विस्तृत विधि-शिकारी शिकार बातचीत के लिए समूह-विशिष्ट प्राइमरी सेट का उपयोग कर का वर्णन परमाणु राइबोसोमल डीएनए (rDNA) क्षेत्रों के लिए एक ही नमूना के स्थिर आइसोटोप विश्लेषण के साथ संयुक्त किया जाना है । हम agarose जेल ट्रो के माध्यम से एकल शिकार समूहों के डीएनए का पता लगाने का वर्णन । इसके अतिरिक्त, हम इस तरह के समूह विशिष्ट प्राइमरों की पीसीआर उत्पादों की आगे की बहाव के विश्लेषण के लिए एक अवसर प्रस्तुत जब भी प्राइमरों की विशिष्टता से एक उच्च वर्गीकरण संकल्प की आवश्यकता है । क्योंकि एकल असहाय डीएनए (ssDNA) टुकड़े तृतीयक अनुरूप है कि उनकी प्राथमिक अनुक्रम द्वारा निर्धारित कर रहे है17, इस तरह के समूह द्वारा परिलक्षित टुकड़ों में छोटे बदलाव-विशिष्ट प्राइमरों के गठन के परिवर्तन के लिए सीसा । इस तरह के परिवर्तन एकल किनारा क्षेऽ बहुरूपता (SSCP) polyacrylamide जैल17,18के साथ विश्लेषण द्वारा पता लगाया जा सकता है, शिकार जीवों की एक और अधिक सटीक पहचान को सक्षम करने (प्रजातियों के स्तर पर नीचे).
जबकि agarose जेल ट्रो डीएनए टुकड़े कल्पना और उनके अनुमानित लंबाई19निर्धारित करने के लिए एक आम और सस्ती उपकरण है, संकल्प डीएनए की मात्रा पर निर्भर करता है और दाग डाई20का इस्तेमाल किया । आमतौर पर, दृश्य सीधे आगे जब शुद्ध डीएनए के नमूनों के साथ काम कर रहा है, लेकिन संभावित रूप से उपभोक्ताओं की आंत सामग्री में शिकार डीएनए की कम मात्रा agarose जेल ट्रो परिणामों के स्कोरिंग जटिल कर सकते हैं । फिर भी, इस पद्धति का पता लगाने के लिए एक या कुछ शिकार समूहों के लिए क्षेत्र से उपभोक्ता नमूनों की एक कम संख्या स्क्रीन संभव है, लेकिन स्कोरिंग में जटिलता कई शिकार taxa के लिए नमूनों की एक उच्च संख्या की स्क्रीनिंग अत्यंत समय गहन और इस प्रकार बनाता है अव्यावहारिक. एक और अधिक संवेदनशील का पता लगाने विधि केशिका ट्रो, जो इसके अलावा टुकड़े की सही लंबाई के निर्धारण की अनुमति देता है के माध्यम से टुकड़ों के स्वचालित विश्लेषण है21। कई सट्रेक् आधारित अध्ययनों से पता चला है कि लेबल के रूप में अलग फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करके, यह पता लगाने और स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण द्वारा तुलनीय लंबाई के विभिंन टुकड़ों का निर्धारण22,23से संभव है, 24. इसलिए, हम भी एक स्वचालित sequencer के साथ स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण के माध्यम से लेबल समूह विशिष्ट प्राइमर सेट और पता लगाने के साथ पीसीआर का उपयोग कई शिकार समूहों से डीएनए के समानांतर पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद । इसके अतिरिक्त, हम एक मामले का अध्ययन का प्रदर्शन है कि स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण के माध्यम से शिकार डीएनए का पता लगाने के परिणाम मौजूद एक दृष्टिकोण है जो भी घूस शिकार के एक रिश्तेदार ठहराव सक्षम बनाता है ।
Protocol
1. कलेक्ट & #160; फील्ड से Macroinvertebrates और जेनेटिक आंत कंटेंट जोडकर के लिए नमूने तैयार करें । प्रत्येक साइट पर macroinvertebrates इकट्ठा, बाहर एकल ट्यूबों में ब्याज की उपभोक्ता प्रजातियों के व्यक्तियों तरह, और सीधे उंह…
Representative Results
Discussion
यहां, हम पीसीआर के लिए एक आसान और लागत कुशल विधि-शिकारी के निर्धारण आधारित समूह के माध्यम से क्षेत्र के नमूनों से शिकार बातचीत rDNA क्षेत्रों के लिए विशिष्ट प्राइमरों, जो एक ही नमूनों के अंय गैर आणविक विश्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पारिस्थितिकी तंत्र विश्लेषण और मूल्यांकन (gaiac) के लिए अनुसंधान संस्थान से सिल्क Classen धंयवाद, समूह की स्थापना में उसकी सहायता के लिए RWTH आकिन विशिष्ट प्राइमर इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सेट । हम भी पीटर मार्टिन और लौरा Schynawa काइल विश्वविद्यालय से पानी के कण ‘ प्रयोगों में सहयोग के लिए धंयवाद । हम भी प्रयोगशाला सुचारू रूप से चल रहा है और कंपनियों और सूचीपत्र संख्या के रजिस्टर की तैयारी रखने के लिए तकनीकी प्रयोगशाला सहायकों का धंयवाद । यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG; प्रोजेक्ट जीई 2219/3-1) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes – Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel – LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
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