Summary
Plus courantes analyse de contenu des contenus stomacaux des macroinvertébrés sont visuels. Exigeant la connaissance intense sur la diversité morphologique des proies, ils manquer doux corsé proies et, en raison de la forte fragmentation des proies, sont presque impossibles pour certains organismes, y compris les amphipodes. Nous fournissons des approches génétiques détaillées, roman de macroinvertébrés proie d’identification dans le régime alimentaire des amphipodes.
Abstract
Analyse de la chaîne alimentaire est essentiel pour une meilleure compréhension des écosystèmes. Par exemple, trophiques peuvent subir des modifications graves provoquées par l’invasion d’espèces allogènes. Cependant, une identification exacte des interactions prédateur-proie de champ est difficile dans de nombreux cas. Ces analyses sont souvent basées sur une évaluation visuelle du contenu intestinal ou l’analyse des ratios d’isotopes stables (δ15N et δ13C). Ces méthodes nécessitent une connaissance approfondie concernant, respectivement, la diversité morphologique ou signature isotopique des organismes individuels proies, conduisant à des obstacles à l’identification exacte des proies. Analyse de contenu des contenus stomacaux Visual sous-estiment particulièrement doux corsé proies organismes, car macération, ingestion et la digestion des proies compliquent l’identification d’espèces spécifiques. Par conséquent, l’utilisation des amorces spécifiques à un groupe définit des stratégies de réaction en chaîne (PCR) basée de polymérase, par exemple, fournissent un outil puissant pour l’étude des interactions de réseau trophique. Nous décrivons ici les protocoles détaillés afin d’examiner le contenu stomacal de consommateurs de macroinvertébrés du champ à l’aide d’amorces spécifiques à un groupe pour l’acide désoxyribonucléique ribosomal nucléaire (ADNr). L’ADN peut être extraits soit à partir des spécimens entiers (dans le cas des petits taxons) ou de contenus stomacaux de spécimens recueillis sur le terrain. Présence et efficacité fonctionnelle des modèles ADN doivent être confirmés directement à partir de l’individu testé avec l’amorce universelle définit ciblant la sous-unité respectif de l’ADN. Nous démontrons également que des proies consommées peuvent être déterminée en combiné supplémentaire jusqu’au niveau de l’espèce par PCR avec des amorces spécifiques à un groupe non modifiées avec analyses de polymorphisme (SSCP) de conformation monocaténaires ultérieure à l’aide de gels de polyacrylamide. De plus, nous montrons que l’utilisation de différents colorants fluorescents sous forme d’étiquettes permet de projection parallèle pour les fragments d’ADN de proies différentes groupes de plusieurs échantillons de contenu intestin par l’intermédiaire de l’analyse des fragments automatisés.
Introduction
Interactions prédateur-proie, qui constituent la majorité des interactions trophiques et dynamique du réseau trophique, sont des aspects essentiels pour caractériser les flux de matière et d’énergie tout au long de la chaîne alimentaire au sein et entre les écosystèmes, qui est l’un des principaux objectifs de l’écologie 1. la détermination de la source et flux de carbone et des nutriments sont faire avancer la compréhension de la connectivité écologique entre les écosystèmes2. Cependant, les écosystèmes, comme les rivières et leurs bassins versants, ne sont pas seulement liées par les flux de matière organique et des nutriments mais aussi par les mouvements des organismes3. Ainsi, modifications de l’habitat interrompre le flux des ressources qui relient ces systèmes peuvent fortement modifier les réseaux trophiques des deux écosystèmes, non seulement directement mais aussi indirectement en changeant la composition respective des communautés de prédateur-proie. Par exemple, modification des réseaux trophiques ont démontré être lié aux mouvements du prédateur unique espèce (p. ex., la truite arc-en-ciel)4. Ces changements éventuellement mettre en danger la biodiversité et le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Analyse des interactions prédateur-proie dans le domaine est donc essentiel de déterminer l’impact des changements environnementaux induite par l’homme, tels que les pratiques de gestion de l’eau, la biodiversité autochtone des écosystèmes aquatiques.
Suivi des liens trophiques étant difficile dans des systèmes complexes, plusieurs approches ont été établis qui permettent l’évaluation de l’alimentation des interactions dans le champ5. Traditionnellement, enquêtes sur les interactions dans le domaine de l’alimentation reposent sur l’identification visuelle des restes de proies dans les tripes disséqués et nécessitent une connaissance approfondie de la diversité morphologique de proies. Analyses de contenu visuel gut ont fourni des perspicacités dans l’utilisation des ressources de plusieurs groupes de consommateurs (p. ex. variation saisonnière dans le régime alimentaire de homard6 poissons7,8 ou alimentation de préférences et de copépodes). Cependant, le processus physique de digestion complique l’analyse de contenu des contenus stomacaux visuelle et ne manque généralement doux corsé proies-organismes9. Pour les espèces l’alimentation par l’ingestion de liquide ou pour certains consommateurs d’invertébrés qui pulvérisent intensivement leur nourriture avant l’ingestion, comme les amphipodes, identification visuelle des proies dans le contenu intestinal est impossible10. En raison de ces limitations, l’analyse moléculaire offre une alternative prometteuse.
Des analyses moléculaires sont devenus un outil commun permettant la détection de proies rapides et précises dans le contenu intestinal. La gamme de ces techniques est diversifiée : des stratégies fondées sur des anticorps monoclonaux ou des réactions en chaîne par polymérase (PCR) sont souvent utilisés, en raison de leur spécificité et sensibilité élevée11. Le développement de nouveaux anticorps monoclonaux est beaucoup de temps et de coût, par conséquent, l’application des autres techniques moléculaires est plus utile lorsque des anticorps n’existent pas déjà11. Une autre approche commune est l’amplification des régions de l’acide désoxyribonucléique (ADN), comme l’acide ribonucléique ribosomique (ARN) gènes présents dans la plupart des espèces, à l’aide de l’amorce universelle définit12,13. Lorsque vous utilisez cette technique, il n’est souvent pas possible d’identifier l’ensemble des organismes de proies dans les sources mixtes d’ADN14. Une approche efficace pour éviter un tel inconvénient, c’est d’utiliser des amorces spécifiques à un groupe définit pour l’analyse de contenu des contenus stomacaux génétique. Conçu pour amplifier les seules régions de l’ADN de certains groupes cibles et exclure toutes les autres espèces15,16, amorces spécifiques de groupe permettent d’identifier des proies organismes sur le plan taxonomique des groupes spécifiés sans analyses secondaires de gourmandes en temps et en coût. Cependant, comme tout vider l’analyse du contenu, de telles analyses fournissent seulement un instantané du comportement alimentaire. Par conséquent, combinant l’analyse de contenu des contenus stomacaux moléculaires avec les analyses des temps-intégration des traceurs naturels (p. ex., les isotopes stables) est considérée comme bénéfique1,2.
Nous décrivons ici une méthode détaillée pour les études basées sur la PCR des interactions prédateurs-proies à l’aide d’amorces spécifiques à un groupe de régions de l’ADN (ADNr) ribosomales nucléaires pour être combinés avec les analyses des isotopes stables du même spécimen. Nous décrivons la détection de l’ADN de proies unique par électrophorèse sur gel d’agarose. En outre, nous présentons une opportunité pour approfondir les analyses en aval des produits PCR de ces amorces de groupe spécifiques applicables lorsqu’une résolution taxonomique supérieure à la spécificité des amorces est requise. Étant donné que seul ADN bicaténaire (ssDNA) des fragments des conformations tertiaire forme qui dépendent de leur séquence primaire17, en fragments amplifiés par des amorces spécifiques à un groupe de petites variations mener aux changements conformationnels. Ces changements peuvent être détectées par single strand conformation polymorphisme (SSCP) analyses avec des gels de polyacrylamide17,18, ce qui permet une identification plus précise des organismes de proies (jusqu’au niveau de l’espèce).
Alors que le gel d’agarose est un outil commun et peu coûteux pour visualiser les fragments d’ADN et déterminer leur durée approximative19, la résolution dépend de la quantité d’ADN et la teinture coloration utilisé20. Habituellement, la visualisation est simple lorsque vous travaillez avec des échantillons d’ADN purs, mais éventuellement de faibles quantités de proies ADN dans le contenu stomacal de consommateurs peut compliquer l’évaluation des résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Pourtant, cette méthode de détection est faisable pour dépister un faible nombre de spécimens de consommateurs sur le terrain un ou quelques groupes de proies, mais complication dans la notation rend la projection d’un grand nombre d’échantillons pour plusieurs taxons de proie fois extrêmement intensif et donc impraticable. Une méthode de détection plus sensible est l’analyse automatique de fragments par électrophorèse capillaire, ce qui permet en outre de la détermination de la longueur exacte des fragments21. Plusieurs microsatellites basé ont démontré qu’en utilisant différents colorants fluorescents sous forme d’étiquettes, il est possible de détecter et de déterminer les différents fragments de longueur comparable par fragment automatisés analyse22,23, 24. Par conséquent, nous présentons également un protocole détaillé pour détection parallèle de l’ADN de la proie de plusieurs groupes par PCR avec des amorces spécifiques à un groupe étiquetées et détection par analyse des fragments automatisés avec un séquenceur automatique. En outre, nous présentons les résultats d’une étude de cas qui démontre que la détection de l’ADN de proies par l’intermédiaire de l’analyse des fragments automatisés est une approche qui permet également une quantification relative des proies ingérées.
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Protocol
1. collecter les macroinvertébrés du champ et préparer les échantillons pour les Analyses de contenu génétique Gut.
- Collect macroinvertébrés sur chaque site, trier les individus des espèces de consommateur d’intérêt dans les tubes simples et congeler directement dans l’azote liquide ou de neige carbonique pour empêcher le dégagement de l’intestin et la dégradation de l’ADN.
Remarque : Éviter de stocker les échantillons dans l’alcool, car certains macroinvertébrés ont tendance à régurgiter avant que l’alcool tue. - N’utilisez que le tractus gastro-intestinal des moyennes et grandes (environ > 3 mm) espèces de macro-invertébrés pour l’analyse de contenu des contenus stomacaux génétique donc la matière restante de l’échantillon peut être utilisée pour d’autres interventions (par exemple, isotopes stables analyse). Notez que ce n’est pas applicable lors d’enquêtes sur des taxons très petites comme les acariens. Donc, il sont possible de sauter les étapes 1.2.1 et 1.2.2.
- Légèrement décongeler un individu et disséquer attentivement son tractus gastro-intestinal sous un stéréomicroscope à l’aide de pinces fines en acier inoxydable. Veillez à ne pas percer le tube digestif pour éviter la perte de matière.
- Clean pince à l’aide de solution de décontamination pour éliminer les contaminations de l’ADN et l’ARN après la préparation de chaque tractus gastro-intestinal. Par conséquent, incuber les forceps pendant 10 min dans la solution de décontamination. Ensuite, rincez-les à l’eau stérile pour enlever les traces résiduelles et essuyez-les avec une serviette en papier pelucheux.
- Transfert le tractus gastro-intestinal disséqué à une réaction de coffre-fort-serrure de 2,0 mL tube contenant 440 µL (450 possible µL pour utilisation de la pipette à répétition) de tampon d’extraction du sel [SEB ; 0,4 M de chlorure de sodium (NaCl), 10 mM Tris (hydroxyméthyl)-aminométhane chlorhydrate de (Tris-HCl) pH 8,0 et sel disodique de l’acide de 2 mM éthylènediaminetétraacétique déshydratent (EDTA) pH 8,0]. Magasin de préparé des échantillons à − 20 ° C immédiatement jusqu'à l’extraction de l’ADN. Veiller à ce que l’ADN est extraites dans quelques jours.
- Permet d’extraire l’ADN une extraction de haut-sel mis à jour le protocole 25.
- Prendre des échantillons sortis du congélateur. Forceps permet d’ajouter une bille en acier inoxydable de 5 mm dans chaque tube d’échantillon et laisser les échantillons congelés sur le banc à la température ambiante (RT) à dégeler. Utiliser un moulin à billes pour homogénéiser les échantillons pendant 1 min à 15 Hz.
- Spin down échantillons avec un court trajet d’une centrifugeuse. Utiliser des pipettes à piston pour ajouter 90 µL (100 µL possible pour l’utilisation de la pipette à répétition) 10 % sodium dodécyl sulfate solution (SDS) et 5 µL de protéinase de 10 mg/mL K.
- Vortex échantillons soigneusement et incuber les mélanges pendant 1 h à 60 ° C sous agitation constante à 400 tr/min sur un thermomixer. En outre, soigneusement vortex échantillons toutes les 10 min afin de promouvoir davantage la lyse.
- Spin down échantillons avec un court trajet d’une centrifugeuse, ajouter 350 µL de 5 M de NaCl avec une pipette de microlitre et vortex soigneusement pendant environ 0,5 - 1 min. centrifuger les échantillons pendant 40 min à 16 200 g à 5 ° C.
Remarque : Si plusieurs jeux d’affilée ont à faire, le réglage de la température de la centrifugeuse doit être déclenché un peu (pas supérieure à 10 ° C) parce que le SDS a tendance à floculer si la température est trop basse. - Utilisation microlitre pipettes pour transférer environ 600 µL de surnageant dans un nouveau tube de réaction de 1,5 mL. Veillez à ne pas retirer quoi que ce soit de la pastille.
- Embout inox perles sur les tubes de réaction dans une passoire à thé en acier inoxydable, nettoyez-les à l’eau courante et les incuber dans une boîte de Pétri avec la solution de décontamination pendant 10 min. rincer soigneusement la solution de décontamination avec stérile de l’eau et stocker les perles nettoyées dans de l’éthanol (> 99 %, p.a. grade) ou sec jusqu'à réutilisation.
NOTE : Nettoyage des perles ne doit pas être effectué directement dans cette étape, mais peut plutôt être fait chaque fois qu’il est temps d’attente dans les étapes suivantes. - Ajouter 600 µL d’isopropanol glacee (grade de p.a.) au surnageant avec un microlitre Pipeter et soigneusement inverser le tube une couple de fois. Conserver les échantillons durant la nuit à -20 ° C.
- Échantillons sortis du congélateur et les Centrifuger pendant 20 min à 16 200 × g et à température ambiante. Soigneusement, éliminer le surnageant et sécher le tube soigneusement avec du papier de tissu pelucheux. Notez que si la température ambiante est élevée (plus de 25 ° C), centrifuger à 5 ° C pour éviter les boulettes glissement tout en ignorant le surnageant.
- Lavage pastilles contenant l’ADN avec l’éthanol à 70 %. Pour ce faire, ajouter 200 µL d’éthanol glacé (70 %, grade par an) à l’aide d’une pipette de microlitre et centrifuger les échantillons pendant 10 min à 16 200 x g et la température ambiante (ou 5 ° C, le cas échéant). Soigneusement, éliminer le surnageant et sécher le tube soigneusement avec du papier de tissu pelucheux. Utiliser une pipette µL 10 réglé à environ 8 µL à pipeter soigneusement éteint le surnageant restant. Veillez à ne pas déranger le culot.
- Sécher le culot pour environ 5-20 min à 60 ° C ou à température ambiante sur le banc jusqu'à ce que tout l’éthanol s’évapore.
- Granule de dissoudre dans 50-100 µL exempte de nucléase (stérilisé à la vapeur et traitée par DEPC) eau (ddH 2 O), attendez au moins 1 h (bien que les meilleurs résultats seront obtenus pendant la nuit à 4 ° C).
- Mesurer la quantité d’ADN contenue dans chaque échantillon avec un spectrophotomètre micro-volume, selon le fabricant ' instructions de s. Réaliser une dilution de travail de chaque échantillon contenant environ 2 à 10 ng ADN / µL. conserver la solution mère dans le congélateur. Conserver la solution dans le réfrigérateur et s’assurer que l’échantillon supplémentaire de traitement se fait en peu de temps.
2. Vérifier l’efficacité fonctionnelle des extraits d’ADN pour détection ultérieure des proies récemment ingérés.
- Pour assurer la présence et l’efficacité fonctionnelle des modèles, de tester chaque extrait d’ADN (étapes 1.1 à 1.3.11) avec l’amorce universelle définit approprié pour la source de nourriture respectifs (par exemple, invertébrés 16 , 26) qui ciblent la même sous-unité nucléaire comme l’amorce spécifique au groupe, utilisé pour détection ultérieure des proies 25 , 27. Les étapes suivantes se rapportent à l’utilisation des amorces universelles NSF1419/20 et NSR1642/16 16 et LSU D1, D2 fw1 et LSU D1, D2 rev2 ou LSU D1, D2 rev4 26. Pour prouver que la réaction de PCR a été fructueuse et qu’aucune contamination n’a lieu, utiliser un témoin positif contenant de l’ADN qui avait déjà été amplifié avec succès et un témoin contenant ddH 2 O au lieu de l’ADN au sein de chaque PCR exécuter.
- Pour préparer l’apprêt des solutions de travail qui contiennent une concentration finale 10 de µM de l’amorce, pipette le montant approprié de l’apprêt respectifs stock solution et FD 2 O (en fonction de la concentration de la solution mère) dans une tube de réaction frais de 1,5 mL à l’aide de micropipettes.
- Ajouter des amorces, désoxyribonucléosides mix (dNTPs), tampon de réaction, tube à essais Taq DNA polymérase et FD 2 O dans un mL 1.5 ou 2.0 (selon le nombre d’échantillons à traiter), puis vortex de ce mélange. Volumes détaillés pour le mélange de réaction standard pour une réaction de PCR de 10 µL sont indiquées au tableau 1 (pour les détails des produits chimiques utilisés, voir Table des matières). Pipettes de
- utilisation microlitre de transférer chaque 1 µL d’ADN extrait dans 9 µL de the standard mélange réactionnel dans un tube PCR (ou d’un puits d’une plaque PCR). Fermer le tube de réaction ou les puits de réaction de la plaque (avec des bandes de cap).
- Programme du thermocycleur : est le protocole standard pour les amorces de NSF1419/20 et NSR1642/16 16 : 94 ° C pendant 4 min (dénaturation), suivi de 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 50 ° C (température de recuit) pendant 30 s, 72 ° C pendant 90 s et l’extension finale à 72 ° C pendant 10 min. Pour l’amorce de la LSU lots 26, utilisez la syntaxe suivante : 94 ° C pendant 4 min, suivie de 45 cycles de 94 ° C pendant 20 s, 52,5 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 90 s et une extension finale à 72 ° C pendant 8 min.
- Place PCR tubes ou plaques dans le thermocycleur, fermer le couvercle de la cycler, puis démarrez le programme respectif.
- Préparer un gel d’agarose de 1,5 % de gel à l’aide d’une solution tampon contenant la base de Tris, d’acide borique et EDTA (tampon TBE) et agarose. Pour la préparation d’un gel d’agarose de 1,5 %, en utilisant un plateau de coulage de gel avec encombrement de 10 cm x 7,5 cm x 3 cm, pèse 0,45 g d’agarose dans une fiole conique, utiliser une éprouvette graduée pour mesurer 30 mL de tampon de x TBE 1 (89 mM Tris pH 7,6, acide borique 89 mM et 2 mM EDTA, pH 8,0) et la verser dans la fiole conique. Faire chauffer le mélange à l’aide d’un four à micro-ondes. Arrêter le four à micro-ondes dès que la présence de bulles d’air important et bien agiter le ballon jusqu'à ce que la solution ne comporte qu’une seule phase.
- Refroidir la solution à environ 60 ° C, agiter le ballon dans un bain d’eau. Rapidement versez la solution dans un plateau de coulage de gel, enlever les bulles d’air et insérer les peignes. Attendre environ 20 min jusqu'à ce que le gel est durcie.
- Remplissage unité d’électrophorèse avec 0,5 x TBE et insert gel coulée plateau contenant le gel d’agarose. Assurez-vous que les fentes de gel sont exempts de bulles d’air.
- Spin down les produits PCR à l’aide de l’option exécution courte d’une centrifugeuse de mini (plaque). Utiliser une pipette de microlitre pour mélanger chaque 3 µL du produit PCR avec 1 µL de 6 x chargement colorant (40 % de sucrose et de 0,25 % de bleu de bromophénol) et le charger dans les fentes de gel du gel d’agarose. Pipetter 1,5 µL d’une échelle d’ADN bp 100 dans une fente de chaque ligne avec une pipette de microlitre en taille standard. Replacez le couvercle de l’appareil d’électrophorèse correctement et connecter les fils à une alimentation électrique. Exécutez le gel à 100 V/cm pour 35 min.
- Pour préparer un bain de coloration, verser 1 000 mL de 1 x TBE dans une boite plastique carrée imperméable à la lumière. Ajouter 50 µL de bromure d’éthidium avec une pipette de microlitre, fermer le couvercle de la boîte en plastique et secouez-le pour assurer une répartition égale du bromure d’éthidium.
- Retirer le gel de l’appareil d’électrophorèse et placez-le dans le bain de coloration pendant environ 10 min. Ensuite, prenez le gel sortant du bain de coloration et placez-la sur un système de documentation de gel et le visualiser selon le manuel de.
- Analyser les seuls échantillons qui ont montré des résultats positifs en termes de présence et efficacité fonctionnelle des modèles pour détection ultérieure des proies ingérées récemment (fragments de taille adéquate visuelle en gel d’agarose).
| solution de travail de Concentration | de laPCR-Mix | Mix pour 10 réaction de PCR µl | concentration finale en PCR |
| FW Primer | µM 10 | μl 0,5 | 0,5 µM |
| Primer RW | 10 µM | 0,5 & #956 ; l | 0,5 µM |
| tampon de réaction (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16 mM (NH4) 2SO4 et la concentration finale de 2 mM MgCl2) | 1 µM | 1 μl | 1µm |
| dNTP | 10 mM | < t d > 0,25 μl0,25 mM | |
| Taq polymérase | 5 U | 0,1 μl | 0,05 U |
| FD 2 0 | μl 6.65 | ||
| < stro ng > Total mélange réactionnel montant | μl 9 | ||
| DNA | 1 μl | ||
Tableau 1 : détaillée de protocole pour la préparation du mélange réactionnel standard pour une réaction de PCR de 10µl.
3. détecter les éléments de proies/aliments récemment ingérés avec les amorces spécifiques à un groupe par électrophorèse sur Gel.
- Conduite PCR à l’aide de que la solution de travail de l’ADN extrait (préparées selon les étapes 1.1 à 1.3.11) ainsi que l’ensemble de primer spécifique de groupe (sans étiquette, c'est-à-dire sans modification) approprié pour le groupe de proies ciblé comme décrit dans 2.1.1 à 2.1.3 les étapes (les variations dans le mélange réactionnel pour la respectifs d’amorces, voir tableau 2). Exécuter des PCR en utilisant le protocole standard donné dans étape 2.1.4 (pour le recuit des températures pour les amorces respectifs, voir tableau 2).
- Utiliser un contrôle avec l’ADN pur d’un spécimen à l’appartenance au groupe cible respectifs (contrôle positif) et un contrôle négatif avec l’ADN pur de l’espèce de consommateurs dans chaque PCR exécuter.
- Vérifier le succès de la réaction PCR par électrophorèse sur gel d’agarose, décrit dans les étapes 2.1.6 à 2.1.11. La réaction PCR a été couronnée de succès si un fragment de longueur appropriée (voir tableau 2) est visible pour le contrôle positif, mais pas pour le contrôle négatif. Si un ou les deux de ces critères sont insatisfaites, répéter PCR.
- Utilisation d’agarose gel d’électrophorèse, comme décrit aux étapes 2.1.6 à 2.1.11, afin de détecter si le groupe de proies ciblé avait été consommé par les spécimens de consommateurs différents testés (par jugement que le fragment de longueur appropriée soit visible ou pas). Veillez à ne pas manquer de fragments à basse résolution visuelle.
- Store amplicons à 4 ° C, si de plus amples analyses seront fera dans les prochaines 24 heures, ou à-20 ° C si les analyses doivent être effectuées plus tard.
4. Par la suite déterminer les proies consommées plus loin en aval en utilisant l’analyse SSCP via sur Gel de Polyacrylamide.
- Prépare un gel d’acrylamide de 9 % pour l’électrophorèse SSCP. Préparer les solutions de travail sous une hotte de laboratoire.
- Pour préparer une solution de travail de l’acrylamide de 200 mL, remplir une éprouvette graduée de 20 mL de 10 x TBE (109 g de base Tris, 55 g d’acide borique et 40 mL d’EDTA de 0,50 M, pH 8,0 dissous dans 1000 mL de ddH 2 O) et une autre avec 45 mL de 40 % (29 : 1) mélange de l’acrylamide. Versez le mélange TBE et acrylamide dans une fiole graduée (une bouteille en verre gradué avec une marque de 200 mL est également appropriée ici) et ajouter des ddH 2 O jusqu’au repère de 200 mL. Continuer de travailler la solution au réfrigérateur (4 ° C) jusqu'à ce que nécessaire. N’utilisez pas de solution de travail plue d’une semaine.
- Peser 0,1 g de persulfate d’ammonium (APS ; utiliser une balance avec une précision au moins 0,01 g) dans une fiole jaugée de 1 mL et dissoudre il en ajoutant des ddH 2 O jusqu'à la graduation marque pour préparer une solution APS 10 %. Transférer des aliquotes (environ 350 µL) dans des tubes de réaction douce.
Remarque : Une aliquote est nécessaire pour chaque gel de polyacrylamide. Stocker le reste aliquOTS à-20 ° C et seulement décongeler aliquotes, peu de temps avant qu’ils sont nécessaires. - Assemble une cassette de gel compromise de deux plaques de verre, un blanc et un verre entaillé plaque (chaque 20 x 20 cm), avec des entretoises (1,5 mm d’épaisseur) entre eux en cours d’exécution sur les côtés du verre. Utilisez chaque trois clips de repliement (32 mm) sur le côté droit et gauche pour fixer la cassette de gel ( Figure 1).
- Mix 5 g de gel d’agarose et 250 mL de tampon de x TBE 1 dans une fiole conique de préparer la solution pour un gel d’agarose 2 % gel. Chauffer et refroidir ensuite le mélange tel que décrit dans les étapes 2.1.6 et 2.1.7. Verser rapidement la solution dans une boîte en plastique de forme carrée (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) et placer l’extrémité inférieure de la cassette de gel (étape 4.1.3) dans la solution de gel d’agarose. Ajuster les repliement de clips à l’extrémité inférieure de la cassette de gel jusqu'à une hauteur alors qu’ils sont assis sur le rebord de la boîte en plastique de forme carrée ( Figure 1). Attendre environ 20-30 min jusqu'à ce que la fiche d’agarose a complètement durci.
- Remplir un 100 mL éprouvette cylindrique avec la solution de travail de l’acrylamide (point 4.1.1) jusqu'à la marque de 60 mL et verser la solution dans un bécher. Utiliser une micropipette pour ajouter 300 µL d’une aliquote de la solution stock de APS (point 4.1.2) et par la suite ajouter 37,5 µL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED). Rapidement, verser la solution entre les plaques de verre de la cassette de gel. Vous pouvez également injecter la solution entre les plaques de verre avec une seringue jetable avec une pointe de pipette 1 000 µL ajustée à la tête d’injection de la seringue de 100 mL.
- Insérer soigneusement un peigne standard épaisseur 1,5 mm à l’extrémité supérieure entre les plaques de verre. Le peigne doit être entouré par la solution de polyacrylamide. Attendre environ 1 h jusqu'à ce que le gel de polyacrylamide est polymérisé. Éviter la ventilation lors de la polymérisation dans la mesure du possible car elle augmente le temps nécessaire pour le gel polymériser.
Remarque : Il est possible de stocker des gels coulées dans des sacs en plastique scellés avec un chiffon humide dans le réfrigérateur jusqu'à 3 jours.
figure 1 : photo illustrant la construction à déverser des gels de polyacrylamide. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Placez la cassette de gel, contenant le gel de polyacrylamide préparé, dans une unité d’électrophorèse verticale. Remplir l’appareil d’électrophorèse avec la quantité appropriée (selon le type d’appareil d’électrophorèse) de 0,5 x TBE et laisser refroidir l’appareil jusqu'à 10 ° C à l’aide d’un circulateur réfrigéré.
- Pour dénaturation de l’ADN, préchauffer un bloc thermique /-cycler à 96 ° C. préparer un tampon dénaturation avec 95 % formamide (grade de p.a. de 99,5 %) et 5 % solution aqueuse contenant du bleu de bromophénol 0,25 % et 40 % (p/v) de sucrose.
- Utiliser les produits de PCR hors du réfrigérateur ou du congélateur et les décongeler. Tournez en bas des produits PCR à l’aide de l’option exécution courte d’une centrifugeuse de mini (plaque). Ensuite, mélanger chaque 4 µL d’un produit PCR avec 4 µL de tampon de dénaturation. Chauffer le mélange pendant 5 min à 96 ° C, immédiatement suivi par une étape de refroidissement dans l’eau glacée pendant 10 min.
Remarque : Les échantillons doivent être chargés sur le gel de polyacrylamide (étape 4.5) tout de suite après. - Retirer le peigne du gel de polyacrylamide (étape 4.1.6) et utiliser une micropipette pour complètement charger chaque échantillon dans une fente de gel. Exécuter l’électrophorèse à 8 W par gel tandis que refroidissement constamment l’appareil d’électrophorèse à 10 ° C. durée nécessaire dépend de la taille du fragment d’être séparé. Pour les tailles de fragment d’environ 210 bp, une durée d’environ 3,5 h est jugée appropriée.
- Pour préparer un bain de coloration, verser 1 000 mL de 1 x boîte imperméable à la lumière de TBE dans un plastique de forme carrée et ajouter 30 µL de coloration teinture (convient colorer l’ADN bicaténaire unique) avec une pipette de microlitre. Fermer le couvercle de la boîte en plastique et secouez-le pour assurer une répartition égale de la teinture coloration.
- Retirer la cassette de gel de la chambre de l’électrophorèse et séparer soigneusement la plaque de verre entaillé le gel. Faites glisser le gel de polyacrylamide de la plaque de verre vide dans le bain de coloration. Placer la baignoire coloration sur un gel de plate-forme et tache secouer pendant 20 à 30 min avec agitation constante.
- Prendre le gel soigneusement sortant du bain de coloration et placez-la sur la table UV d’un système de documentation.
Remarque : En raison de l’instabilité du gel, il est conseillé de traiter l’étape préalable avec deux personnes. Une personne doit maintenir la coloration baignoire à côté de la table UV et un autre devrait arriver sous le gel avec les deux mains, sortir et faire glisser sur la table UV. - Fermez le couvercle ou la porte du système de documentation et de prendre une photo selon le fabricant ' Manuel d’instructions de s.
5. Détecter les multiples ingéré récemment des groupes de proies en parallèle à l’aide d’Analyses automatisées Fragment.
- Analyser le contenu intestinal ADN extraits à l’aide de l’apprêt spécifique au groupe 16 définit donnée dans le tableau 2, avec une amorce d’un jeu marqué en raison de la modification par une teinture coloration (voir tableau 2 colonne intitulée Modification) et utiliser les méthodes de détection parallèles d’un séquenceur automatique.
- Utilisation d’extraits d’ADN (préparées selon les étapes 1.1 à 1.3.11) et de la conduite, la solution de travail distinctes PCRs pour chaque amorce définie comme décrit dans les étapes 2.1.1 à 2.1.5 (variations dans le mélange sont indiquées dans le tableau 2). Utilisez au moins un contrôle avec l’ADN pur d’un spécimen à l’appartenance au groupe cible respectifs (contrôle positif) et un contrôle négatif avec l’ADN pur de l’espèce de consommateurs dans chaque PCR exécuter.
- Exécuter PCRs dans le thermocycleur en utilisant le protocole standard de PCR donné dans étape 2.1.4, ajustée à la température de recuit respectif (et le nombre de cycles) pour chaque amorce la valeur donnée dans le tableau 2.
Remarque : Utilisez la même allocation d’ADN des puits de réaction PCR avec chacun des 16 différentes amorces pour simplifier ultérieure mise en commun des produits PCR pour lot automatisé fragment analyses. - Store PCR produits à-20 ° C jusqu'à ce que tous les RFT appartenant à un lot pour les analyses de fragments automatisés (voir tableau 2) sont finis. Garder les produits PCR dans l’obscurité et ne pas les entreposer plus de 1 semaine avant les analyses de fragment.
tableau 2 : détails des 2 lots de 15 paires d’amorces spécifiques à un groupe créé par Koester et al. (2013) et la paire d’amorces Jae28S nouvellement conçue amplifier les régions de l’ADNr 18 s ou 28 s de 16 groupes cibles de macroinvertébrés aquatiques. f, amorces vers l’avant ; r, amorces inverses ; 18 s, amorces ciblant la 18 s rADN sous-unité ; 28 s, amorces ciblant le 28 s sous-unité de l’ADNr. " Est de Hydrobiologia, Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) un ' crevettes tueur ' dans le système du Rhin ?, 768, 2016, tableau S1, Supplementary material page 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer Internationale d’édition Suisse 2015) " avec la permission de Springer. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette table.
- pour détecter les fragments amplifiés de toutes les paires d’amorces 16 effectuer des analyses de fragments automatisés dans les 2 lots indiquées dans le tableau 2. Utiliser une norme de taille interne (ADN taille Standard Kit - 400 [lot B] et - 600 [lot A], respectivement) pour déterminer la longueur des fragments. Préparer la plaque de séquençage et séquenceur automatique tel que décrit dans les étapes suivantes. Notez que cette procédure devra peut-être être ajustée si vous utilisez une autre plateforme que celle donnée dans la Table des matières.
- à courir chaque lot-échantillon, préparer un mélange contenant la Solution échantillon de chargement (SLS) et la standard de taille respective. Pipetter 21,6 µL de SLS et 0,4 µL d’ADN Kit de taille Standard - 600 par exemple du lot A et, respectivement, 21,7 µL de SLS et 0,3 µL d’ADN taille Standard Kit- 400 par exemple du lot B.
- Utiliser les produits de PCR du 8 RFT appartenant au lot respectif sortis du congélateur et les décongeler. S’assurer qu’ils sont encore conservés dans l’obscurité.
- Utiliser une pipette de microlitre pour charger le nombre de puits d’une plaque de séquençage nécessaires (nombre d’échantillons à analyser) avec chaque 22 µL du mélange respectif indiqué au point 5.2.1. Tournez en bas de chacun des 8 RFT en utilisant l’option exécution courte d’une centrifugeuse de mini (plaque), les produits de PCR. Transférer chaque 1 µL par produit PCR de chacune des 8 RFT dans les puits respectifs de la plaque de séquençage avec une pipette de microlitre.
- Soigneusement tourner vers le bas de ce mélange dans la plaque de séquençage, avec un court trajet d’une centrifugeuse de mini plaque et superposer chaque puits utilisés avec une goutte d’huile minérale. Remplir les puits de réaction respectifs d’une mémoire tampon avec 250-300 µL de tampon de séparation de l’ADN.
- Utiliser le logiciel pour le séquenceur capillaire pour créer un exemple d’installation selon le fabricant ' instructions de s. Attribuer les méthodes pour contrôler les ensembles d’échantillons et de déterminer la séquence des méthodes à utiliser pour traiter les données (voir le tableau 3 pour l’exécution des conditions adéquates pour une utilisation avec la norme de taille donnée dans la Table des matières). Notez qu’il est crucial que la répartition des échantillons dans le Setup de l’échantillon correspond à la répartition de l’échantillon dans la plaque de séquençage (y compris les contrôles positifs et négatifs, voir étape 5.1.1) et que la méthode adéquate pour fragment analyse avec différents taille standard Aquamatic.
- Remplir un plateau de mouillage à l’eau désionisée et insérez la plaque de séquençage, plaque tampon plateau de mouillage dans le séquenceur capillaire. Insérer une cartouche de gel contenant une quantité suffisante de frais gel de séparation d’ADN qui est nécessaire pour les échantillons. Exécutez la plaque de séquençage à l’aide de la configuration d’échantillon préparé.
| dénaturer | séparée | Capillaire | injecter | ||||
| Température | temps | tension | temps | tension | temps | ||
| taille standard 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 min | 50 ° C, attendez de Temp : Oui | 2,0 kV | 30 s |
| Taille 400 standard | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 min | 50 ° C, attendez de Temp : Oui | 2,0 kV | 30 s |
tableau 3 : conditions spécifiques pour l’analyse de fragment sur le séquenceur automatisé en utilisant les normes de taille données dans la Table des matières.
- pour analyser les résultats à l’exportation des données brutes et télécharger ces données sur un programme d’analyse de fragment. Choisissez le colorant standard des commandes de couleur du fabricant respectif pour régler les canaux de couleur de colorant.
- Créer un panneau décrivant la gamme attendue de longueur des fragments amplifié par l’amorce spécifique à un groupe unique définit dans un lot selon le manuel d’utilisation du programme.
- Pour traiter les données, sélectionnez le panneau respectif, taille standard, couleur standard et type d’analyse, puis exécuter une procédure. Choisissez l’option électrophorégramme pour afficher les intensités du signal fluorescent d’instruments d’électrophorèse capillaire comme un traçage de ligne unique pour chaque couleur de colorant. Marqueurs/amorces seront affichera indiquant la plage fragment respectifs et la longueur exacte du fragment détecté associé au centre de chaque pic appelé est surlignée (dans la plupart des programmes de la coloration ou le nom attribué) automatiquement.
- Pour chaque échantillon, calculer comment étroitement l’échantillon ' s interne taille standard correspond à la norme de taille choisie pour assurer le succès de l’appel de taille. La plupart des programmes analyses fragment ont une option pour automatiquement calculer et visualiser ce match. Si l’échec de l’appel de taille, répéter les analyses de fragments pour les échantillons.
- Visuellement revérifier l’électrophorégramme de chaque échantillon et confirmer/unconfirm chaque pic appelé pour chaque marqueur/amorce réglée séparément. Insérer manuellement des pics injustifiées qui répondent aux critères d’un marqueur/amorces ou suppriment les mauvaises selon le manuel d’utilisation du programme utilisé. Appliquer le nom de taille ou bin de paires de bases dans le ' allèle Label '. Calculer et afficher les spécifications de pic dans le ' Table Peak '.
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Representative Results
Nous avons utilisé avec succès les étapes décrites dans le présent protocole pour l’analyse de la diète dans les différentes études. Dans cette section, nous présentons des exemples décrivant l’applicabilité des différentes sections du protocole.
À titre d’exemple, pour démontrer l’efficacité des amorces spécifiques à un groupe créé par les auteurs28 et la possibilité d’approfondir les analyses en aval des produits PCR par des analyses SSCP, ont conduit une expérience alimentaire. Individus de Dikerogammarus villosus comme prédateurs et des Caenis spp. larves comme proies ont été capturés dans le Rhin et la région lacustre près de Karlsruhe (Allemagne). En laboratoire, prédateurs et des proies taxons ont été tenus à l’écart dans l’eau filtrée à 20 ° C et ont été affamés pendant 36 heures. Pour l’expérience, les spécimens amphipode ont été placés dans des béchers avec de l’eau des cours d’eau filtrée (100 mL) alimentés individuellement, avec deux ou trois Caenis larves pendant 30 min et ensuite congelés dans l’azote liquide. Le tube digestif de chacun d. villosus a été disséqué et ADN a été extrait, comme décrit dans le protocole 1. Extraits d’ADN ont été testés avec l’amorce de Caep28S la valeur appropriée détecter des Caenis spp., à l’aide de la PCR appropriée protocole28 tel que décrit dans le Protocole N° 3. Pour connaître les différences entre les fragments amplifiés de différentes espèces de Caenis , PCR a été réalisée avec les échantillons de contenu gut et pures échantillons d’ADN de trois espèces de référence Caenis . Électrophorèse sur gel d’agarose a conduit à des bandes individuelles d’ADN bicaténaire, qu’on ne peut pas distinguer entre les différentes espèces de Caenis avec ce type d’électrophorèse (Figure 2 a). En revanche, par électrophorèse sur gel SSCP, tel que décrit dans le Protocole N° 4, il était possible d’identifier les proies organismes au niveau de l’espèce en comparant les échantillons contenu du tube digestif avec les échantillons de référence (Figure 2 b). Le modèle de SSCP fragment des trois taxons référence Caenis beskidensis (Figure 2 b, voie 1), Caenis horaria (Figure 2 b, allée 2), et Caenis luctuosa (Figure 2 b, piste 3) se composait de quatre bandes avec motifs dérivables. Deux échantillons de contenu intestinale (Figure 2 b, voies 4 et 5) ont un pattern de fragment égal à celle de c. luctuosa (Figure 2 b, piste 3). Le patron de fragment du troisième échantillon contenu de l’intestin (Figure 2 b, voie 6) était identique à celui de c. horaria (Figure 2 b, allée 2). Analyse de la séquence des deux sens contenus échantillons identifiés comme luctuosa c. et c. horaria (Figure 2 b, lane 4 et 6) et l’espèce de référence respectifs vérifié ce résultat (voir supplément électronique alignement fasta dossier).
Figure 2 : Image originale de gel d’agarose (A) et l’analyse SSCP (B) de l’ACP des fragments d’intestin contenu et échantillons de référence amplifié avec le Caep28S d’amorces. Voies 1-3 montrent les échantillons de référence de l’espèce Caenis beskidensis (1), Caenis horaria (2) et Caenis luctuosa (3). Dans les couloirs 4-6, le modèle de fragment d’échantillons de contenu différents intestinale de l’amphipode Dikerogammarus villosus se présentent. Voie 7 illustre le modèle de fragment d’une échelle d’ADN bp 100. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
En outre, une expérience en laboratoire a été menée en eau acariens appartenant à l’espèce Hygrobates fluviatilis étaient nourris sur chironomides larves non seulement déterminer si l’ADN d’individus de chironomidés consommée peut être détectée dans les acariens, mais aussi de tester si la quantité d’ADN détecté dépend de la durée écoulée depuis la consommation de la proie29. Après les acariens de la faim pendant environ une semaine, chaque mite lui offrit une larve de chironomidés comme nourriture. Chaque individus de mite de l’eau 3-4 ont été fixées dans l’éthanol (absolu) pour l’analyse génétique à l’aide de la Chiro18S d’amorces spécifiques au famille diptères Chironomidae28 au 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 et 50 h après être nourris29. Comme une mesure de la consommation par les personnes de mite de l’eau, les individus proies respectifs ont été classés en cinq catégories alimentaires suivantes : 1 = complètement aspiré, tégument complètement vidé (> 90 %), 2 = presque complètement aspiré dehors (> 75-90 %), 3 = semi sucée dehors (> 50-75 %), 4 = seulement partiellement sucée dehors (> 5-50 %), 5 ne = aucun changement visible corps structure (≤5 %)29 de la proie. ADN a été extrait les acariens comme décrit dans le Protocole N° 1 (sans étapes 1.2.1 et 1.2.2) et la présence de 18 s rADN dans l’extrait et l’efficacité fonctionnelle du modèle ont été vérifiées, tel que décrit dans le Protocole N° 2. Détection des proies ADN a été effectué selon protocole N° 4 en utilisant seulement le Chiro18S apprêt sertie de l’apprêt avant marquée avec une fluorescence teindre (voir tableau 2) et l’ADN taille Standard Kit - 400. Pour permettre des comparaisons entre les échantillons analysés dans des séries différentes d’un séquenceur automatique, le rapport entre la hauteur de pic d’échantillon et la hauteur du pic de la plus proche de l’étalon interne (c.-à-d.360 bp dans ce cas) de chaque échantillon ont été calculés et utilisés comme un proxy pour le montant de l’ADN détecté. Les résultats ont montré que chironomides ADN a été détecté dans pratiquement tous les individus de Hygrobates fluviatilis , se nourrissent de larves de chironomidés29. De l’intervalle le plus court (1 h après le repas) à la plus longue période après que alimentation (50 h) la quantité relative de l’ADN de proie détectée était significativement réduite (Figure 3 a)29. En outre, la relation entre l’heure après la tétée et la classification des proies comme approximation de la quantité ingérée de proies QU'ADN pourrait être confirmé (Figure 3 b)29. La réduction de la proie ADN détecté avec le temps après que l’alimentation a été très probablement complètement reflété par la dégradation de l’ADN et la digestion de la proie, car égestion de proie ADN est très improbable en raison de l’absence d’un anus en eau acariens29. Ces résultats confirment la pertinence de cette approche pour la quantification des proies ingérées.
Figure 3 : Relations entre la nationale ln ratio-hauteur (hauteur du pic360 échantillon-crête hauteurs/standard) et (A) le temps après la tétée d’acariens et de la catégorie alimentation (B) (n = 23). « Experimental and Applied Acarology, première détection des proies ADN dans Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari) : une nouvelle approche permettant de déterminer les relations prédateur-proie dans les acariens, 67, 376, P. Martin, L. Schynawa, M. Koester, Fred R., (© Cavalier International Suisse d’éditionet 2015) « avec la permission de Springer. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Afin d’étudier l’importance de la prédation par l’amphipode invasive d. villosus dans les analyses de terrain, intensive des isotopes stables de δ13C et δ15N de d. villosus et ressources alimentaires potentielles ont été favorisé par moléculaire détection des proies récemment ingérés dans le contenu stomacal de ceux-là mêmes exacte. Au total, 206 d. villosus individus provenant de différents sites ont été recueillis et le tube digestif de chacun a été disséqué et ADN a été extrait selon le protocole 1. La présence et l’efficacité fonctionnelle des modèles utilisés a été assuré comme décrit dans le Protocole N° 2. Prédation récente par les individus d. villosus sur plusieurs taxons de proie de macroinvertébrés a été testée comme décrit dans le Protocole N° 4. Dans l’ensemble, seulement 16 % du contenu stomacal de d. villosus testés positif pour ADN appartenant à l’une des 16 taxons proies ciblées macroinvertébrés et appuie par conséquent les résultats des analyses isotopiques stables qui indiquent un comportement alimentaire prédatrices faible de l’amphipode envahissante dans la zone27. Même si, dans les analyses génétiques, ADN de 12 taxons de proie testé figurait dans l’échantillon contenu d’au moins 1 intestin, ADN des 4 autres taxons proies n’a jamais été détectée (Figure 4)27.
Figure 4 : Histogramme illustrant le nombre respectif de d. villosus individus de tous les sites de dix dont stomacaux testé positif pour les macroinvertébrés proie ADN. PCR a été réalisée avec 16 amorces spécifiques à un groupe comme indiqué. « Hydrobiologia, est Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) un « tueur de crevettes » dans le système du Rhin ?, 768, 2016, 310, Meike Koester, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer International Publishing Suisse 2015) « avec la permission de Springer. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire fichier. Sequence_alignement_feeding_trial.fasta s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Nous présentons ici une méthode simple et rentable pour PCR-based détermination des interactions prédateur-proie des échantillons sur le terrain via des amorces spécifiques à un groupe pour les régions d’ADNr, qui peuvent être combinées avec d’autres analyses non moléculaire des échantillons mêmes. Cependant, il y a plusieurs étapes cruciales au sein du protocole. Tout d’abord, il est essentiel d’assurer la spécificité des amorces utilisées. Deuxièmement, il est essentiel d’éviter la contamination et la perte du contenu du tube digestif au cours de la préparation du tractus gastro-intestinal et l’extraction ultérieure de l’ADN. Alors que la contamination croisée-échantillon peut conduire à fausses détections positives de l’ADN de proies, perte du tube digestif contenu matériel pourrait conduire à manque rarement consommé espèces-proies. Vérification de la présence de l’ADNr appartenant à la sous-unité respectif et l’efficacité fonctionnelle des modèles utilisés pour les analyses (article 2 du protocole) est essentielle pour recueillir des informations représentatives sur les proies consommées. C’est en particulier indispensable, si aucun ADN de proies, que le consommateur est censé se nourrissent ne peut être détecté25,27. En outre, lors de la préparation des RFT (étapes 3.1, 5.1.1 et 5.1.2), il est crucial que le mélange et le protocole utilisé exactement répondent aux critères dont l’amorce respectif a été spécifié pour un certain groupe de taxons. Dans le cas contraire, l’amplification de l’ADN dans la réaction de PCR peut échouer complètement ou l’ADN des taxons non ciblés pourrait être amplifiée ainsi. Par conséquent, il est obligatoire d’utiliser positive et contrôles négatifs au sein de chaque PCR courir pour s’assurer que la réaction de PCR a travaillé et aucune contamination s’est produite. En outre, il est nécessaire que le tableau des échantillons pour chaque série PCR est documenté exactement afin de permettre l’affectation correcte des proies consommées à l’échantillon de consommateurs respectifs. Pour cette tâche, une prudence particulière devra être prise tout en mettant en commun les produits de la PCR pour la détection parallèle de plusieurs groupes de proies par analyses automatisées fragment (étape 5.2.3).
Pour la détection des fragments amplifiés à l’aide d’agarose gel électrophorèse (points 3.2 et 3.3) d’agarose gels doivent être aussi minces que possible et le soin doit être pris au cours de l’inspection visuelle de l’image pour éviter le manque de fragments à basse résolution visuelle. Pour les résultats et une conclusion appropriée sur la consommation de proies par un consommateur, il est crucial que les taxons de proie encore rarement consommés ont été récompensés. Des gels d’agarose épais diminuent la visibilité des potentiellement faibles quantités d’ADN de proies et de réduisant ainsi la probabilité pour manquez rarement consommée de proies et d’introduire des incertitudes dans les conclusions tirées de l’analyse. En outre, dans une perspective de santé, à l’aide d’une solution de rechange moins - ou non-toxique que le bromure d’éthidium pour la coloration des gels serait peut-être souhaitable. Le protocole pour ultérieures en aval analyse des fragments amplifiés par des analyses SSCP en utilisant des gels de polyacrylamide inclut des mesures qui devraient être effectuées avec une prudence particulière. Il est important que la cassette de gel Assemblée est bien étanche (étape 4.1.3) et la solution de polyacrylamide est donnée assez de temps à se polymériser complètement (étape 4.1.6). Ouvrir la cassette trop tôt conduira à une fuite de solution liquide d’acrylamide et, malgré le fait que la préparation doit être commencé dès le début, une vaste nettoyage doit être fait aussi bien. En outre, de transférer le gel de polyacrylamide dans le bain de coloration (étape 4.7) et de là sur la table (étape 4.8) de UV devront être effectuées avec beaucoup d’attention en raison de l’instabilité de ces gels. Sinon, le gel pourrait déchirer et fragments pourraient être perturbées, ce qui conduit à la nécessité de répéter la procédure.
Un impératif majeur pour le traitement avec succès des données provenance d’analyses automatisées fragment est que norme interne de taille de l’échantillon correspond le modèle standard de taille donné par le fabricant (étape 5.3.3) pour permettre la détermination de la longueur des fragments appropriés. Ceci est particulièrement important parce que sinon, les différents fragments, étiquetés avec le même fluorescent, coloration teinture, pouvant être attribuées aux taxons des proies mal et donc conduisent à une erreur de jugement complet des interactions prédateurs-proies. En outre, électrophérogrammes présentent souvent des bruits de fond. Pour établir la confiance dans l’interprétation, il est essentiel que les pics de la norme de taille interne sont significativement plus élevées que le bruit de fond de l’échantillon. En conséquence, les pics pour chaque marqueur/amorce seulement devraient être comptées si elles sont significativement plus élevées que le bruit de fond.
Ce protocole peut être modifié pour détecter plusieurs groupes de proies taxons d’intérêt au sein des différents consommateurs d’intérêt. Certes, des amorces spécifiques à un groupe déjà peut-être pas disponibles pour chaque taxon de proies potentielles d’intérêt. Néanmoins, les amorces spécifiques à un groupe sont disponibles non seulement pour plusieurs d’eau douce de macroinvertébrés taxons28, mais aussi pour un large éventail d’autres taxons (par exemple, plusieurs marins macroinvertébrés taxons16,30 et taxons communs du vol des insectes,31). Ainsi, le choix des amorces spécifiques à un groupe définit approprié pour amplifier l’ADN de toutes les espèces de proies d’un taxon donné, mais pas réussi à l’amplification de l’ADN des espèces n’appartenant ne pas à ce taxon, est essentiel32. Des amorces spécifiques à un groupe nombreux qui sont maintenant disponibles ont été spécifiés pour un ensemble donné de taxons (p. ex., 130 taxons de macroinvertébrés eau douce courantes dans le système de Rhin28). Par conséquent, pour éviter des résultats faussement négatifs ou de faux-positifs, la spécificité de ces amorces devrait de nouveau vérifiée pour l’ensemble de taxons communs dans l’écosystème d’intérêt avant leur application pour les taxons cibles et les consommateurs non inclus dans la gamme des taxons pour les amorces constitué. En outre, si ces analyses moléculaires ne sont ne pas cumulables avec d’autres analyses de la dissection individuelle, même exacte du tractus gastro-intestinal peuvent être ignorés.
Néanmoins, dissection de l’appareil gastro-intestinal de plus gros spécimens également empêche l’échec de l’extraction d’ADN à cause de trop de matière et réduit la présence d’ADN-consommateur dans l’extrait d’échantillon. Toutefois, des études ont montré qu’en utilisant des amorces spécifiques de blocage, qui attachent à l’ADN du consommateur et ainsi de le bloquer, pour la réaction PCR peut effectivement améliorer l’amplification des séquences rares échantillons mixtes33. Par conséquent, la dissection du tube digestif peut être évitée, même lorsqu’ils traitent avec les plus grands spécimens de consommateur, en utilisant des amorces spécifiques de blocage. Pour la détection parallèle des amplicons provenant de plusieurs amorces spécifiques à un groupe via des analyses automatisées fragment, il faut dans le choix de coloration teinture comme étiquette. Ainsi, amorces, amplification des fragments d’environ la même longueur devraient être étiquetés avec les colorants fluorescents distingués nettement. En outre, il y a une gamme de systèmes d’électrophorèse capillaire disponibles auprès de plusieurs fabricants. Certains de ces systèmes soi-disant permettent la détermination de plusieurs fragments même par l’intermédiaire de colorants non spécifiques. Le protocole présenté ici peut facilement être ajusté afin de détecter des fragments amplifiés avec n’importe lequel de ces systèmes. En outre, afin de réduire le temps nécessaire pour tIl analyse, il serait possible d’optimiser les essais seul multiplex-PCR pour amplifier l’ADN de proies de lot analyse un fragment simultanément (par exemple, de l’amplification simultanée de 12 organismes de proies de coléoptères34 ou jusqu'à six flying insect taxons31).
Un inconvénient potentiel de gut analyses du contenu en général, et donc aussi les analyses décrites dans le présent protocole, est la faible résolution temporelle. Avec ces méthodes, il n’est plus possible d’identifier les organismes récemment ingérés, qui pourraient conduire à des incertitudes liées à l’importance de la proie seul organismes2. Cependant, nous avons démontré que l’analyse génétique selon ce protocole peut facilement être combiné avec les analyses des isotopes stables (δ15N et δ13C) de l’exact même consommateur spécimens25,27. Un traceur naturel intégrant à la fois des interactions prédateurs-proies, analyses des isotopes stables sont fréquemment utilisés pour caractériser le réseau trophique des structures1, mais possibles valeurs isotopiques qui se chevauchent de proies différentes espèces souvent gêné une exacte définition de prédateur-proie des interactions2. Par conséquent, utilisant ce protocole pour des analyses génétiques en combinaison avec les analyses des isotopes stables pour surmonter les inconvénients de chaque méthode peut plus loin notre compréhension des réseaux trophiques et leur relation avec les flux de nutriments ou d’énergie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Silke Classen de l’Institut de recherche pour l’analyse de l’écosystème et évaluation (gaiac), RWTH Aachen pour son aide dans la mise en place des amorces spécifiques utilisés dans le présent protocole. Nous remercions également Peter Martin et Laura Schynawa de l’Université de Kiel pour la coopération dans les expériences des acariens de l’eau. Nous remercions également les assistants de laboratoire technique pour garder le laboratoire fonctionne bien et préparer le registre des sociétés et des numéros de catalogue. Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche allemande (DFG ; projet GE 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
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