Summary
Análises de conteúdo de intestino mais comuns de macroinvertebrados são visuais. Exigindo intenso conhecimento sobre diversidade morfológica de organismos de presas, eles falta suave rapina encorpada e, devido à forte cominuição de rapina, são quase impossíveis para alguns organismos, incluindo anfípodes. Nós fornecemos abordagens genéticas detalhadas, a novela de macroinvertebrados presas identificação na dieta de anfípodes.
Abstract
Analisar tróficas é essencial para uma melhor compreensão dos ecossistemas. Por exemplo, comida web interações podem sofrer graves alterações causadas pela invasão de espécies não-nativas. No entanto, a identificação exata das interações predador-presa de campo é difícil em muitos casos. Essas análises são frequentemente baseadas em uma avaliação visual do conteúdo do intestino ou a análise de isótopos estáveis (δ15N e δ13C). Esses métodos exigem conhecimento abrangente sobre, respectivamente, diversidade morfológica ou assinatura isotópica de organismos individuais presas, levando a obstáculos na identificação exata dos organismos de rapina. Análises de conteúdo Visual intestino especialmente subestime organismos suave rapina encorpado, porque maceração, ingestão e digestão de presas organismos dificultam a identificação de espécies específicas. Portanto, estratégias de reação em cadeia (PCR) com base de polimerase, por exemplo o uso de primer grupo específico define, fornecer uma ferramenta poderosa para a investigação de interações web de comida. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para investigar o conteúdo do intestino dos consumidores de macroinvertebrados do campo usando conjuntos específicos de grupo primário para ácido desoxirribonucleico de ribosomal nuclear (rDNA). DNA pode ser extraído a partir de espécimes inteiro (no caso de pequenos táxons) ou do conteúdo do intestino de espécimes coletados no campo. Presença e eficiência funcional dos modelos de DNA precisam ser confirmada diretamente do indivíduo testado usar primer universal define visando a respectiva subunidade de DNA. Também demonstramos que presa consumida pode ser determinada mais para baixo ao nível de espécie através de PCR com primers de grupo específicas sem modificações combinadas com análises de polimorfismo (SSCP) conformação subsequente único fio usando géis de poliacrilamida. Além disso, mostramos que o uso de corantes fluorescentes diferentes como rótulos permite rastreio paralelo de fragmentos de DNA de presas diferentes grupos de várias amostras de conteúdo intestino através de análise automatizada de fragmento.
Introduction
Interações predador-presa, que constituem a maioria da comida da web dinâmica e interações tróficas, são aspectos fundamentais para caracterizar os fluxos de matéria e energia ao longo de teias de alimento dentro e entre os ecossistemas, o que é um dos principais objetivos da ecologia 1. a determinação da fonte e fluxo de carbono e nutrientes é promover a compreensão da conectividade ecológica entre ecossistemas2. No entanto, os ecossistemas, tais como rios e suas bacias hidrográficas, não estão ligados somente por fluxos de matéria orgânica e nutrientes, mas também pelos movimentos de organismos3. Assim, alterações de habitat, interrompendo o fluxo de recursos que associam esses sistemas podem fortemente alterar as teias alimentares de ambos os ecossistemas, não só diretamente, mas também indiretamente alterando a respectiva composição das comunidades de predador-presa. Por exemplo, alterações de teias alimentares foram mostradas para ser ligado aos movimentos de predador única espécie (por exemplo, truta arco-íris)4. Tais alterações potencialmente ameaçam a biodiversidade e o funcionamento dos ecossistemas aquáticos. Portanto, analisar interações predador-presa no campo é essencial para determinar o impacto das mudanças ambientais induzidas pelo homem, tais como as práticas de gestão de água, sobre a biodiversidade nativa dos ecossistemas aquáticos.
Desde ligações tróficas de rastreamento é difícil em sistemas complexos, várias abordagens foram estabelecidas que permitem a avaliação da alimentação interações no campo5. Tradicionalmente, as investigações de interações no campo de alimentação baseiam-se na identificação visual dos restos de presas nas entranhas dissecados e exigem um amplo conhecimento sobre diversidade morfológica presa. Análises de conteúdo Visual intestino forneceram introspecções na utilização dos recursos de vários grupos de consumidores (por exemplo, variação sazonal na dieta de lagosta peixe e6 7,8 ou alimentando preferências de copépodes). No entanto, o processo físico de digestão dificulta as análises de conteúdo visual do intestino e perde geralmente suave rapina encorpado-organismos9. Para a alimentação de espécies por ingestão de líquidos ou para alguns consumidores invertebrados que fragmentá intensamente sua comida antes de ingestão, como anfípodas, identificação visual das espécies de presas no conteúdo do intestino é impossível10. Devido a essas limitações, a análise molecular fornece uma alternativa promissora.
Análises moleculares tornaram-se uma ferramenta comum permitindo a deteção de presa rápida e precisa no conteúdo do intestino. A variedade de tais técnicas é diversa: estratégias baseadas em anticorpos monoclonais ou reacções em cadeia do polymerase (PCR) são frequentemente usadas, por causa de sua alta especificidade e sensibilidade11. O desenvolvimento de novos anticorpos monoclonais é demorada e de custo, portanto, a aplicação de outras técnicas moleculares é mais útil quando os anticorpos já não existem11. Outra abordagem comum é a amplificação das regiões do ácido desoxirribonucleico (DNA), como o ácido ribonucleico ribossômico (RNA) genes presentes na maioria das espécies, usando primer universal define12,13. Ao usar essa técnica, muitas vezes não é possível identificar toda a gama de organismos presas dentro de fontes mistas de DNA14. Uma abordagem eficaz para evitar tal uma desvantagem é usar primer grupo específico define para análises de conteúdo genético do intestino. Projetado para amplificar apenas as regiões de ADN de determinados grupos-alvo e excluir todas as outras espécies15,16, primers específicos de grupo possibilitam a identificação de organismos de rapina no nível taxonômico dos grupos especificados sem análises secundárias de tempo - e onerosos. No entanto, como todos estripá-análise de conteúdo, tais análises fornecem apenas um instantâneo do comportamento alimentar. Portanto, combinar as análises de conteúdo intestino molecular com análises de traçadores naturais-integração de tempo (por exemplo, isótopos estáveis) é considerado benéfico1,2.
Aqui, descrevemos um método detalhado de inquéritos baseados em PCR de interações predador-presa usando conjuntos de cartilha de grupo específicas para as regiões de ADN (rDNA) ribosomal nucleares deve ser combinada com análises de isótopos estáveis do mesmo espécime. Descrevemos a detecção de DNA de rapina única grupos através de eletroforese em gel de agarose. Além disso, apresentamos uma oportunidade para ainda mais a jusante análises de produtos PCR de tais primers específicos de grupo aplicáveis sempre que uma resolução taxonômica maior do que a especificidade dos primers é necessária. Porque o único encalhado DNA (ssDNA) fragmentos de conformações terciário de forma que são determinadas pela sua sequência primária17, pequenas variações em fragmentos amplificados por tais cartilhas específicas do grupo levam a mudanças conformacionais. Tais mudanças podem ser detectadas pelas análises de polimorfismo (SSCP) único filamento conformação com géis de poliacrilamida17,18, permitindo uma identificação mais precisa de organismos de presa (até ao nível de espécie).
Enquanto a eletroforese em gel de agarose é uma ferramenta comum e de baixo custo para visualizar os fragmentos de DNA e determinar seu comprimento aproximado19, a resolução depende da quantidade de DNA e o corante de coloração usado20. Geralmente, a visualização é direta quando se trabalha com amostras de DNA puras, mas potencialmente baixas quantidades de rapina DNA no conteúdo do intestino dos consumidores pode complicar a Pontuação dos resultados de eletroforese de gel de agarose. Ainda, esse método de deteção é viável para a tela de um baixo número de espécimes de consumidor do campo para um ou alguns grupos de presas, mas complicação o artilheiro faz a seleção de um número elevado de amostras para vários táxons de presas extremamente tempo intensivo e, portanto, impraticável. Um método de deteção mais sensível é a análise automatizada de fragmentos através de eletroforese capilar, que além disso permite a determinação do comprimento exato de fragmentos21. Vários microssatélites com base em estudos têm mostrado que usando diferentes corantes fluorescentes como rótulos, é possível detectar e determinar diferentes fragmentos de comprimento comparável por fragmento automatizado análise22,23, 24. Portanto, apresentamos também um protocolo detalhado para a deteção paralela do DNA de várias presas grupos usando PCR com rotulado primeira demão específicas do grupo de moda e deteção através de análise de fragmento automatizado com um sequenciador automático. Além disso, apresentamos os resultados de um estudo de caso, demonstrando que a detecção de DNA de presas através de análise automatizada de fragmento é uma abordagem que também permite uma quantificação relativa de presas ingeridas.
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Protocol
1. coleta de macroinvertebrados do campo e preparar as amostras para análises de conteúdo genético Gut.
- Coleta de macroinvertebrados em cada local, resolver indivíduos da espécie de consumidores de interesse nos tubos simples e diretamente, congelá-los em nitrogênio líquido ou gelo seco para evitar afastamento do intestino e degradação do DNA.
Nota: Evite armazenar as amostras em álcool, porque alguns macroinvertebrados tendem a regurgitar antes o álcool mata-los. - Use somente o trato gastro-intestinal de grande e médio porte (aproximadamente > mm 3) espécies de macroinvertebrados para análises de conteúdo genético do intestino para que a matéria restante da amostra pode ser usada para outros procedimentos (por exemplo, isótopo estável análise). Note que isto não é aplicável quando investigando táxons muito pequenas como água ácaros. Portanto, as etapas 1.2.1 e 1.2.2 podem ser puladas.
- Ligeiramente descongelar um indivíduo e dissecar cuidadosamente seu trato gastro-intestinal sob um estereomicroscópio usando pinça fina de aço inoxidável. Certifique-se de não perfurar o trato gastro-intestinal para evitar a perda de matéria. Pinça de
- limpe usando solução de descontaminação para remover contaminações de DNA e RNA após a preparação de cada trato gastro-intestinal. Portanto, incube o fórceps para 10 min na solução de descontaminação. Depois, enxague com água estéril para remover traços residuais e limpe-os com uma toalha de papel fiapos.
- Transferência do trato gastrointestinal dissecado para uma reação de bloqueio seguro de 2,0 mL do tubo com tampão de extração de sal 440 µ l (é possível 450 µ l para o uso da pipeta repetitivo) [SEB; 0,4 M de cloreto de sódio (NaCl), 10 mM Tris (hidroximetil)-aminometano cloridrato (Tris-HCl) pH 8.0 e sal de dissódico do ácido etilenodiaminotetracético 2mm desidratam pH (EDTA) 8.0]. Loja preparada amostras em − 20 ° C, imediatamente até a extração de DNA. Certifique-se de que dentro de alguns dias será extraído DNA.
- Usar um protocolo de extração de elevado-sal modificado 25 para extrair DNA.
- Tirar amostras do congelador. Usar fórceps para adicionar uma esfera de aço inoxidável de 5mm para cada tubo de amostra e deixar as amostras congeladas no banco à temperatura ambiente (RT) para descongelar. Use um moinho de esfera para homogeneizar as amostras por 1 min em 15 Hz.
- Spin para baixo de amostras com um curto prazo de uma centrífuga. Usar pipetas microlitro para adicionar 90 µ l (100 µ l possível para o uso da pipeta repetitiva) de sódio Dodecil sulfato de sódio solução a 10% (SDS) e 5 µ l de proteinase 10mg/mL K.
- Vortex amostras cuidadosamente e incuba as misturas por 1h a 60 ° C, com agitação constante a 400 rpm em um thermomixer. Além disso, completamente vórtice amostras cada 10min para promover Lise.
- Spin para baixo de amostras com um curto prazo de uma centrífuga, adicionar 350 µ l de 5 M NaCl, com uma pipeta microlitro e vórtice abundantemente durante aproximadamente 0,5 - 1 min. Centrifugar as amostras por 40 min 16.200 x g no 5 ° C.
Nota: Se vários conjuntos em uma linha tem que ser feito, o ajuste da temperatura do centrifugador deve ser ligeiramente elevado (não superior a 10 ° C) porque SDS tende a flocular se a temperatura for muito baixa. - Uso microlitro pipetas para transferir cerca de 600 µ l sobrenadante para um novo tubo de reação de 1,5 mL. Tenha cuidado para não retirar nada a pelota. Grânulos
- inox ponta fora os tubos de reação em um coador de chá de aço inoxidável, limpe-os com água corrente e incube-os em uma placa de Petri com a solução de descontaminação por 10 min. enxaguar cuidadosamente a solução de descontaminação com estéril água e armazenar grânulos limpos em etanol (> 99%, grau p.a.) ou seco até reutilização.
Nota: Limpeza de grânulos não precisa ser feito nesta etapa diretamente, mas um pouco pode ser feito sempre que há tempo de espera nas etapas a seguir. - Adicionar 600 µ l de isopropanol gelado (grau de a.a.) para o sobrenadante com um microlitro pipeta e inverter cuidadosamente o tubo de um par de vezes. Armazenar as amostras durante a noite em -20 ° C.
- Tirar amostras do freezer e centrifugá-los por 20 min no 16.200 × g e temperatura de quarto. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e secar o tubo cuidadosamente com papel de seda de fiapos. Observe que se a temperatura for elevada (mais de 25 ° C), centrifugar a 5 ° C, para evitar as bolinhas escorregando ao descartar o sobrenadante.
- Lavagem pelotas contendo DNA com etanol a 70%. Para fazer isso, adicione 200 µ l de etanol gelado (70%, grau p.a.) usar uma pipeta microlitro e centrifugar as amostras durante 10 minutos a 16.200 x g e temperatura ambiente (ou 5 ° C, se necessário). Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e secar o tubo cuidadosamente com papel de seda de fiapos. Utilização de uma pipeta de 10 µ l ajustado a aproximadamente 8 µ l para pipetar cuidadosamente fora o sobrenadante restante. Certifique-se de não perturbar a pelota.
- Secar a pelota para cerca de 5 a 20 min a 60 ° C ou à temperatura ambiente no banco até que todos o etanol é evaporado.
- Pelota de dissolver em 50-100 µ l livre de nuclease (vapor esterilizados e tratada DEPC) água (ddH 2 O), espere pelo menos 1 h (embora os melhores resultados serão obtidos durante a noite a 4 ° C).
- Medir a quantidade de DNA contido em cada amostra com um Espectrofotômetro de micro-volume, de acordo com o fabricante ' instruções s. Fazer uma diluição de trabalho de cada amostra contendo aproximadamente 2-10 ng DNA / µ l. manter a solução em estoque no freezer. Manter a solução na geladeira e certifique-se que a amostra mais o processamento é feito logo.
2. Verificar a eficiência funcional do DNA-extratos para a deteção subsequente de rapina recentemente ingerida.
- Para garantir a presença e a eficiência funcional de modelos, testar cada extrato de DNA (passos 1.1 para 1.3.11) usar o primer universal define apropriada para a fonte de alimento respectivos (de invertebrados , por exemplo, 16 , 26) que está direcionando a mesma subunidade nuclear como o primer grupo específico, usado para detecção subsequente de rapina 25 , 27. As etapas a seguir referem-se ao uso de conjuntos de primer universal NSF1419/20 e NSR1642/16 16 e LSU D1, D2 fw1 e LSU D1, D2 rev2 ou LSU D1, D2 rev4 26. Para provar que a reação de PCR tem sido bem sucedida e que não há contaminação ocorreu, use um controle positivo contendo DNA que já tinha sido ampliado com êxito e uma amostra de controlo contendo ddH 2 O em vez de DNA dentro de cada PCR executar.
- Para preparar a primeira demão soluções de trabalho que contêm uma concentração final de 10 µM de primer, pipetar a quantidade adequada da primeira demão respectivas ações solução e ddH 2 O (dependendo da concentração da solução-mãe) em um tubo de reação fresca 1,5 mL utilizando micropipetas.
- Adicionar cartilhas, mistura de deoxynucleotide (dNTPs), amortecedor da reação, Taq DNA polimerase e ddH 2 O em um 1,5 ou 2,0 mL (dependendo do número de amostras a serem processadas) tubo da reação, então vórtice esta mistura. Detalhadas de volumes para a mistura de reação padrão para uma reação de PCR de 10 µ l são dadas na tabela 1 (para obter detalhes dos produtos químicos utilizados, consulte Tabela de materiais).
- Uso microlitro pipetas para transferir cada 1 µ l de DNA extrair em 9 µ l do thmistura de reação padrão e dentro de um tubo PCR (ou um bem de uma placa PCR). Fechar o tubo de reação ou nos poços de reação da placa (com listras cap).
- Programa do thermocycler: é o protocolo padrão para o conjunto de primeira demão NSF1419/20 e NSR1642/16 16: 94 ° C por 4 min (desnaturação), seguido de 30 ciclos de 94 ° C por 30 s, 50 ° C (temperatura do recozimento) por 30 s, 72 ° C para 90 s e uma extensão final a 72 ° C por 10 min. Para a primeira demão LSU define 26, use o seguinte: 94 ° C por 4 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C por 20 s, 52,5 ° C, durante 20 s, 72 ° C por 90 s e uma extensão final a 72 ° C por 8 min.
- Lugar da polimerase ou placas para o thermocycler, feche a tampa do reciclador e iniciar o respectivo programa.
- Prepare um agarose 1,5% do gel usando uma solução tampão contendo Tris base, ácido bórico e EDTA (amortecedor de TBE) e agarose. Para a preparação de um gel de agarose 1,5%, usando uma gel de bandeja de fundição com dimensões totais de 10 × 7,5 cm × 3 cm, pesa 0,45 g agarose num erlenmeyer, usar uma proveta graduada para medir 30 mL de tampão de x TBE 1 (89 mM Tris pH 7,6, o ácido bórico 89 mM e 2 mM EDTA, pH 8.0) e deite-o no Erlenmeyer. Aqueça a mistura usando um microondas. Pare o microondas sempre que haja grandes bolhas e cuidadosamente agite o frasco até que a solução tem apenas uma fase.
- Arrefecer a solução para cerca de 60 ° C, agitar o frasco num banho de água. Rapidamente despeje a solução em uma bandeja de fundição de gel, remover as bolhas de ar e inserir os pentes. Esperar cerca de 20 min até gel é endurecido. Unidade de eletroforese
- preenchimento com 0.5 x TBE e inserir gel de fundição da bandeja que contém o gel de agarose. Certifique-se que o gel de slots são livre de bolhas de ar.
- Spin para baixo os produtos PCR usando a opção de executar curta de uma centrífuga mini (placa). Use uma pipeta microlitro misturar cada 3 µ l de produto PCR com 1 µ l de 6 x carregamento tintura (40% de sacarose e 0,25% bromofenol) e carregá-lo nas ranhuras do gel do gel do agarose. Pipete 1,5 µ l de uma escada de DNA bp 100 para um slot de cada linha com uma pipeta microlitro como tamanho padrão. Substitua a tampa da unidade de electroforese corretamente e ligar os fios para uma fonte de alimentação. Funcione o gel a 100 V/cm por 35 min.
- Para preparar um banho de coloração, despeje 1.000 mL de 1 x TBE numa caixa quadrada plástica impermeável à luz. Adicionar 50 µ l de brometo de etídio com uma pipeta microlitro, feche a tampa da caixa de plástico e agitá-lo para garantir a distribuição igualitária de brometo de etídio.
- Retire o gel da unidade de eletroforese e colocá-lo para o banho de coloração por aproximadamente 10 min. Em seguida, tomar o gel de banho de coloração e coloque-a sobre um sistema de documentação do gel e visualizá-lo de acordo com o manual.
- Analisar amostras única que mostraram resultados positivos (fragmentos de tamanho adequado visual em gel de agarose) em termos de presença e eficiência funcional de modelos para a deteção subsequente de rapina recentemente ingerida.
| PCR-mistura | solução de trabalho de concentração | Mix para 10 reação de PCR µ l | concentração Final no PCR |
| Primer FW | µM 10 | μl 0.5 | 0.5 µM |
| Primer RW | 10 µM | 0.5 & #956 ; l | 0,5 µM |
| amortecedor da reação (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16mm (NH4) 2SO4 e concentrações finais de 2 mM MgCl2) | 1 µM | 1 μl | 1 µM |
| dNTP | 10mm | < t d > 0.25 μl0,25 mM | |
| 5 U | deTaq polimerase | 0,1 μl | 0.05 U |
| ddH 2 0 | 6,65 μl | ||
| < stro ng > Total mistura de reacção quantidade | 9 μl | ||
| DNA | 1 μl | ||
Tabela 1: protocolo para a preparação da mistura de reação padrão para uma reação de PCR de 10 µ l detalhado.
3. detectar presas recentemente ingeridos alimentos/com conjuntos de Primer grupo específico usando electroforese em Gel.
- Realizar PCR usando que a solução de trabalho de DNA extrai (preparado de acordo com passos 1.1 para 1.3.11) e o conjunto de primer grupo específico (sem rótulo, ou seja, sem modificação) apropriado para o grupo de presas alvejado como descreveram em 2.1.1 a 2.1.3 os passos (por variações na mistura de reação para o conjunto da respectiva cartilha, ver tabela 2). Executar o PCR usando o protocolo padrão dado na etapa 2.1.4 (para recozimento de temperaturas para o conjunto da respectiva cartilha, ver tabela 2).
- Usar um controle com DNA puro de um espécime pertencentes ao grupo de destino correspondente (controle positivo) e um controle negativo com DNA puro da espécie do consumidor em cada PCR executar.
- Verificar o sucesso da reação de PCR utilizando eletroforese em gel de agarose descrito nos passos 2.1.6 para 2.1.11. A reação de PCR foi bem sucedida, se um fragmento de tamanho apropriado (ver quadro 2) é visível para o controlo positivo, mas não para o controle negativo. Se um ou ambos destes critérios estão insatisfeitos, repetir a PCR.
- Uso agarose gel eletroforese, conforme descrito nas etapas 2.1.6 para 2.1.11, para detectar se o grupo de presas alvo tinha sido consumido pelo consumidor diferentes espécimes testados (através de julgamento se o fragmento de tamanho apropriado é visível ou não). Certifique-se de não perder fragmentos com baixa resolução visual.
- Produtos de PCR de loja a 4 ° C, se mais análises serão concluídas dentro as próximas 24 horas, ou a-20 ° C, se as análises devem ser executadas mais tarde.
4. Determinar posteriormente consumidas presas ainda mais a jusante usando análise SSCP através do Gel de Polyacrylamide.
- Prepara um gel do acrilamido de 9% para a electroforese do SSCP. Preparar as soluções de trabalho em uma capa de laboratório.
- Para preparar uma solução de trabalho de acrilamida 200ml, encher uma proveta com 20 mL de 10 x TBE (109 g da base Tris, 55 g de ácido bórico e 40 mL de EDTA de 0,50 M, pH 8.0, dissolvido em 1000 mL de DDQ 2 O) e outro com 45 mL de 40% (29:1) mistura de acrilamida. Despeje a mistura TBE e acrilamida num frasco graduado (uma garrafa de vidro graduado com uma marca de 200 mL é também apropriada aqui) e adicione ddH 2 O até a marca de 200 mL. Continue trabalhando solução na geladeira (4 ° C) até que seja necessário. Não use solução de trabalho de mais de uma semana.
- Pesar 0,1 g de persulfato de amónio (APS; uso um equilíbrio com uma precisão pelo menos 0,01 g) para um balão aferido de 1 mL e dissolver ele adicionando ddH 2 O até a graduação marcar para preparar uma solução de reserva 10% APS. Transferir alíquotas (aproximadamente 350 µ l) para tubos de reação fresca.
Nota: Uma alíquota é necessária para cada gel de poliacrilamida. Armazenar o restante aliquOTS-20 ° c e descongele apenas alíquotas logo antes que eles são necessários. - Montar uma fita de gel de comprometida de duas placas de vidro, um branco e um vidro entalhado (cada 20 cm x 20 cm), com espaçadores (1,5 mm de espessura) entre eles subindo dos lados do vidro. Use cada três clipes de dobra-back (32mm) do lado direito e esquerdo para fixar a fita de gel ( Figura 1).
- Mix 5 g de agarose e 250 mL de 1 buffer de x TBE em um Erlenmeyer para preparar a solução para um agarose 2% gel. Aquecer e arrefecer depois mistura conforme descrito nas etapas 2.1.6 e 2.1.7. Rapidamente, despeje a solução em uma caixa de plástico em forma de quadrado (21 x 6,5 cm x 5 cm) e coloque a extremidade inferior da fita gel (etapa 4.1.3) para a solução de agarose. Ajuste os clipes de dobra-back na extremidade inferior da fita gel a uma altura para que sentam-se na borda da caixa plástica quadrada ( Figura 1). Espere aproximadamente 20-30 min até que o plugue de agarose completamente endureceu.
- Preencher um 100ml de medição do cilindro com a solução de trabalho de acrilamida (etapa 4.1.1) até a marca de 60ml e coloque a solução em um béquer. Use uma micropipeta para adicionar 300 µ l de uma alíquota da solução estoque de APS (etapa 4.1.2) e posteriormente adicionar 37,5 µ l de tempted (TEMED). Rapidamente, despeje a solução entre as placas de vidro da fita gel. Alternativamente, injetar a solução entre as placas de vidro com uma seringa descartável de 100ml com uma ponta de pipeta de 1.000 µ l ajustada na cabeça de injeção da seringa.
- Insira cuidadosamente um pente padrão espessura de 1,5 mm na extremidade superior entre as placas de vidro. O pente deve ser cercado pela solução da metalurgia. Espere aproximadamente 1 h até que o gel de poliacrilamida é polimerizado. Evitar a ventilação durante a polimerização, na medida do possível, porque aumenta o tempo necessário para o gel polimerizar.
Nota: É possível armazenar géis fundidos dentro de sacos de plástico selados com um lenço molhado na geladeira até 3 dias.
Figura 1: imagem ilustrando o construção para derramar o gel de poliacrilamida. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Coloque a fita de gel, contendo o gel de poliacrilamida, preparado, em uma unidade de eletroforese vertical. Preenchimento da unidade de eletroforese com a quantidade adequada de 0.5 x TBE e fixe a unidade até 10 ° C, usando um circulador refrigerado (dependendo do tipo de unidade de electroforese).
- Para desnaturação do ADN, Preaqueça um bloco térmico /-reciclador de 96 ° C. Prepare buffer de desnaturação com 95% formamida (grau de 99.5% a.a.) e 5% solução aquosa contendo 0,25% de bromofenol e 40% (p/v) de sacarose.
- Levar os produtos PCR fora da geladeira ou freezer e descongele-os. Spin para baixo os produtos PCR usando a opção de executar curta de uma centrífuga mini (placa). Em seguida, misture a cada 4 µ l de um produto PCR com 4 µ l de tampão de desnaturação. Aqueça a mistura por 5 min a 96 ° C, imediatamente seguido por uma etapa de resfriamento em água gelada por 10 min.
Nota: As amostras devem ser carregadas para o gel de poliacrilamida (etapa 4.5) imediatamente após este. - Retire o gel de poliacrilamida (etapa 4.1.6) pente e use uma micropipeta para carregar completamente cada amostra em um slot de gel. Execute eletroforese em 8 W por gel enquanto constantemente de refrigeração da unidade de electroforese para 10 ° C. executando o tempo necessário depende do tamanho do fragmento a ser separados. Para tamanhos de fragmento de aproximadamente 210 bp, uma duração de cerca de 3,5 h considera-se adequado.
- Para preparar um banho de coloração, despeje 1.000 mL de 1x TBE em um plástico quadrada caixa impermeável à luz e adicionar 30 µ l de coloração tintura (adequada manchar o único ADN encalhado) com uma pipeta microlitro. Feche a tampa da caixa de plástico e agitá-lo para assegurar a distribuição igual da tintura coloração.
- Remover a fita de gel da câmara de eletroforese e separar cuidadosamente a placa de vidro entalhado do gel. Deslize o gel de poliacrilamida da placa de vidro em branco para o banho de coloração. Coloque o coloração banho em um gel de plataforma e mancha agitação por 20 a 30 min com agitação constante.
- Tomar o gel cuidadosamente fora da banheira de coloração e coloque-a sobre a mesa de UV de um sistema de documentação.
Nota: Devido à instabilidade do gel é aconselhável manipular o passo prévio com duas pessoas. Uma pessoa segurará o coloração banho próximo à tabela de UV e outro deve chegar sob o gel com as duas mãos, levá-lo para fora e deslize-o sobre a mesa UV. - Fechar a tampa ou porta do sistema de documentação e tirar uma fotografia de acordo com o fabricante ' manual de instruções s.
5. Detectar múltiplos ingeriram recentemente grupos de presas em paralelo usando análises automatizadas fragmento.
- Analisar o conteúdo do intestino DNA extrai usando o primer grupo específico 16 define determinado na tabela 2, com um primer de um conjunto rotulado devido a modificação com um corante de coloração (ver tabela 2 coluna intitulada modificação) e usar os métodos de detecção paralelo de um sequenciador automático.
- o uso da solução de trabalho de extratos de DNA (preparados de acordo com passos 1.1 para 1.3.11) e conduta separar PCRs para cada primeira demão definida como descrito nos passos 2.1.1 para 2.1.5 (variações na mistura são apresentadas na tabela 2). Use pelo menos um controle com DNA puro de um espécime pertencentes ao grupo de destino correspondente (controle positivo) e um controle negativo com DNA puro da espécie do consumidor em cada PCR executar.
- PCRs executar no thermocycler usando o protocolo PCR padrão dado na etapa 2.1.4, ajustado para a respectiva temperatura do recozimento (e número de ciclos) para cada primer conjunto determinado na tabela 2.
Nota: Utilize a mesma alocação de DNA dos poços de reação para PCR com cada um dos 16 cartilha diferentes conjuntos para simplificar subsequente partilha dos produtos PCR para loteados automatizada de análises fragmento. - Loja PCR produtos a-20 º C até todos os PCRs pertencentes a um lote para a análise automatizada de fragmento (ver tabela 2) está acabada. Manter os produtos de PCR no escuro e não armazená-los mais de 1 semana antes da análise do fragmento.
tabela 2: detalhes dos 2 lotes de 15 pares específicos de grupo primário estabelecido pelo Koester et al (2013) e o par de primer Jae28S recém-projetado amplificar regiões do rDNA 18S ou 28S de 16 grupos-alvo de macroinvertebrados aquáticos. f, primers para a frente; r, primers reversos; 18s, cartilha destina-se a subunidade de 18S rDNA; 28s, cartilha destina-se a 28S subunidade de rDNA. " Hydrobiologia, é Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) um ' camarão assassino ' no sistema Rio Reno?, 768, 2016, tabela S1, material suplementar página 2, Koester Meike Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer Internacional de publicação Suíça 2015) " com permissão de Springer. clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
- para detectar os fragmentos amplificados de todos os conjuntos de 16 cartilha conduzir análises automatizadas fragmento em 2 lotes descritos na tabela 2. Usar um padrão de tamanho interno (DNA tamanho padrão Kit - 400 [Grupo B] e - 600 [Grupo A], respectivamente) para determinar o comprimento do fragmento. Prepare a placa de sequenciamento e sequenciador automático conforme descrito nas etapas a seguir. Note que este procedimento pode ter que ser ajustada se usando uma outra plataforma do que o indicado na tabela de materiais.
- Para executar cada lote-amostra, prepare uma mistura contendo solução de carregamento da amostra (SLS) e o respectivo tamanho padrão. Pipetar 21,6 µ l de SLS e 0,4 µ l de DNA tamanho padrão Kit - 600 por amostra do lote A e, respectivamente, com 21,7 µ l de SLS e 0,3 µ l de DNA tamanho padrão Kit- 400 por amostra do lote B.
- Levar os produtos PCR de 8 PCRs pertencentes ao respectivo lote do freezer e descongele-os. Certifique-se de que ainda são mantidos no escuro.
- Usar uma pipeta microlitro para carregar o número de poços de uma placa de sequenciamento necessários (número de amostras a serem analisados) com cada 22 µ l da mistura respectiva descrita na etapa 5.2.1. Spin para baixo os produtos PCR de cada um dos 8 PCRs usando a opção de executar curta de uma centrífuga mini (placa). Transferir cada 1 µ l por produto PCR de cada um dos 8 PCRs para os respectivos poços da placa de sequenciamento com uma pipeta microlitro.
- Cuidadosamente spin para baixo esta mistura dentro da placa de sequenciamento com um curto prazo de uma centrífuga mini placa e sobreposição de cada um dos poços utilizados com uma gota de óleo mineral. Preencher poços de reacção respectivos de uma placa de reserva com 250-300 µ l de tampão de separação do DNA.
- Usar o software para o sequenciador capilar para criar uma configuração de amostra de acordo com o fabricante ' instruções s. Atribua os métodos para controlar conjuntos de amostra e determinar a sequência de métodos a serem usados para processar dados (ver tabela 3 para a execução de condições adequadas para uso com o padrão de tamanho dado na Tabela de materiais). Note-se que é crucial que a repartição das amostras dentro da configuração de amostra corresponde a alocação da amostra na placa de sequenciamento (incluindo controles positivos e negativos, consulte a etapa 5.1.1) e que o método adequado para fragmento analisa com os respectivos tamanho padrão é escolhido.
- Encha uma bandeja de umectação com água desionizada e insira a placa de sequenciamento, placa de reserva e umectante bandeja no sequenciador capilar. Inserir um cartucho de gel que contém uma quantidade suficiente de gel fresco da separação do DNA que é necessário para executar o exemplo. Verifique a placa de sequenciamento usando a configuração de amostra preparada.
| desnaturar | separe | Capilar | injetar | ||||
| Temperatura | tempo | tensão | tempo | tensão | tempo | ||
| tamanho padrão 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 min | 50 ° C espera para Temp: Sim | 2.0 kV | 30 s |
| tamanho padrão 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 min | 50 ° C espera para Temp: Sim | 2.0 kV | 30 s |
tabela 3: condições específicas para as análises do fragmento sobre o sequencer automatizado usando os padrões de tamanho dados na tabela de materiais.
- para analisar os resultados exportar dados brutos e carregar os dados para um programa de análise de fragmento. Escolher a tintura padrão ordens de cor do respectivo fabricante para definir os canais de cores de tintura.
- Criar um painel no intervalo esperado do comprimento do fragmento amplificado por um único primer grupo específico de estrutura de tópicos define dentro de um lote de acordo com o manual do usuário do programa.
- Para processar os dados, selecione o respectivo painel adequado tamanho padrão, cor padrão e tipo de análise e executar o procedimento. Escolha a opção electroferograma para exibir as intensidades de sinal fluorescente de instrumentos de eletroforese capilar como um traço da linha única para cada cor de tinta. Conjuntos de marcadores/primer serão exibidos indicando o intervalo respectivo fragmento e o comprimento exato do fragmento detectado associado com o centro de cada pico chamado será destacado (na maioria dos programas por coloração ou nome atribuído) automaticamente.
- Para cada amostra, calcular como estreitamente a amostra ' s interno tamanho padrão coincide com o padrão de tamanho selecionado para tranquilizar o sucesso da chamada tamanho. A maioria dos programas de análises de fragmento tem uma opção para automaticamente calcular e visualizar esta partida. Se o chamado tamanho falhou, repita o fragmento análises para as amostras.
- Visualmente verificar novamente a electroferograma de cada amostra e confirmar/unconfirm cada pico chamado para cada marcador/primer definido separadamente. Inserir manualmente picos desnecessário que preenche os critérios de um conjunto de marcador/primer ou excluir erradas de acordo com o manual do usuário do programa utilizado. Aplicar o nome de tamanho ou bin de pares de base no ' alelo rótulo '. Calcular e exibir as especificações de pico no ' tabela de pico '.
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Representative Results
Usamos com sucesso as etapas descritas neste protocolo para análises de dieta dentro de diferentes estudos. Nesta seção, apresentamos exemplos descrevendo a aplicabilidade das diferentes secções do protocolo.
Por exemplo, para demonstrar a eficácia dos conjuntos específicos de grupo primário estabelecido pelos autores28 e o potencial de mais a jusante as análises de produtos PCR por análises SSCP, foi conduzido um experimento de alimentação. Foram capturados exemplares de Dikerogammarus villosus como predadores e larvas de spp. cais como presas no Rio Reno e remansos perto de Karlsruhe (Alemanha). No laboratório, predador e presa táxons foram mantidos separadamente em água corrente filtrada a 20 ° C em estavam faminto por 36 horas. Para o experimento, espécimes de crustáceos foram colocadas em copos com água corrente filtrada (100 mL) individualmente, alimentado com larvas de cais de dois a três por 30 min e posteriormente congelados em nitrogênio líquido. O trato gastrointestinal de cada d. villosus foi dissecado e DNA foi extraído como descrito no protocolo 1. Extratos de DNA foram testados com o primer Caep28S conjunto apropriado para detectar spp. cais usando o apropriado de protocolo PCR28 conforme descrito no protocolo 3. Para verificar as diferenças entre fragmentos amplificados das diferentes espécies de cais , PCR foi realizado com as amostras de conteúdo de intestino e puras amostras de DNA de três espécies de referência do cais . Eletroforese em gel agarose levado a única bandas de ADN encalhado dobro, que não podem ser distinguidos entre as diferentes espécies de cais com este tipo de electroforese (Figura 2A). Em contraste, por eletroforese em gel SSCP, conforme descrito no protocolo n º 4, foi possível identificar organismos presa ao nível da espécie, comparando as amostras de conteúdo do intestino com as amostras de referência (Figura 2B). O padrão de fragmento SSCP dos três taxa referência beskidensis cais (Figura 2B, faixa 1), cais horaria (Figura 2B, pista 2), e cais são (Figura 2B, faixa 3) consistia de quatro bandas com padrões diferenciáveis. Duas amostras de conteúdo intestino (Figura 2B, pista 4 e 5) tinham um padrão de fragmento igual do c. são (Figura 2B, lane 3). O padrão de fragmento da terceira amostra conteúdo intestino (Figura 2B, faixa 6) era idêntico de c. horaria (Figura 2B, lane 2). Análises de sequência dos dois estripá-amostras de conteúdo identificadas como são c. e c. horaria (Figura 2B, lane 4 e 6) e a espécie de referência respectivos verificado este resultado (consulte suplemento eletrônica alinhamento fasta arquivo).
Figura 2: Imagem original da electroforese do gel de agarose (A) e (B) SSCP análise de PCR fragmentos do conteúdo do intestino e amostras de referência e ampliou com o conjunto da primeira demão de Caep28S. Faixas 1-3 mostram as amostras de referência da espécie beskidensis cais (1), cais horaria (2) e cais são (3). Nas faixas de rodagem 4-6, o padrão de fragmento de amostras de conteúdo diferente do intestino do Dikerogammarus villosus crustáceos são apresentados. Estrada 7 mostra o padrão de fragmento de uma escada de DNA bp 100. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além disso, um experimento de laboratório foi conduzido em que foram alimentados com ácaros pertencentes à espécie Hygrobates fluviatilis na chironomid a água as larvas não só determinar se DNA de chironomid indivíduos consumidos pode ser detectado em ácaros da água, Mas também para testar se a quantidade de DNA detectado depende do tempo transcorrido desde o consumo de presas29. Depois de passar fome os ácaros por aproximadamente uma semana, cada ácaro ofereceram-me uma larva de chironomid como alimento. Cada 3-4 indivíduos de ácaro de água foram fixados em etanol (absoluta) para análise genética, usando o conjunto de primeira demão de Chiro18S específicos para as frequentes família Chironomidae28 em 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 e 50 h após sendo alimentado29. Como um grau de consumo por parte dos indivíduos de ácaro de água, os rapina respectivos indivíduos foram classificados nas seguintes cinco categorias alimentação: 1 = completamente sugado para fora, tegumento completamente esvaziado (> 90%), 2 = quase completamente sugado para fora (> 75-90%), 3 = semi sugado para fora (> 50-75%), 4 = apenas parcialmente sugado para fora (> % de 5-50), 5 = nenhuma mudança visível em corpo estrutura (≤ 5%)29 a rapina. DNA foi extraído os ácaros de água conforme descrito no protocolo 1 (sem etapas 1.2.1 e 1.2.2) e a presença de 18S rDNA no extracto e a eficiência funcional do modelo foram verificadas conforme descrito no protocolo 2. Deteção de rapina DNA foi realizada de acordo com o protocolo 4 usando apenas o Chiro18S cartilha em conjunto com o primer para a frente de rotulado com uma fluorescente tintura (ver quadro 2) e o Kit DNA para o tamanho padrão - 400. Para permitir comparações entre as amostras analisaram dentro de diferentes sequências de um sequenciador automático, a relação entre a altura do pico de amostra e a altura do pico do mais próximo do padrão interno (ou seja, 360 bp neste caso) de cada amostra foi calculado e usado como um proxy para a quantidade de DNA detectado. Resultados mostraram que o DNA chironomid foi detectável em praticamente todos os indivíduos de Hygrobates fluviatilis alimentados com larvas de chironomid29. Do intervalo mais curto (1 h após a alimentação) para o período mais longo após alimentação (50 h) a quantidade relativa de rapina detectado DNA foi significativamente reduzida (Figura 3A)29. Além disso, a relação entre o tempo após a alimentação e a classificação de rapina como um proxy para a quantidade ingerida de rapina que DNA poderia ser confirmado (Figura 3B)29. A redução de rapina DNA detectado com o aumento de tempo após a alimentação era mais provável completamente refletida pela degradação do DNA e a digestão das presas, porque egestion de rapina DNA é altamente implausível devido à falta de um ânus em água ácaros29. Estes resultados confirmam a adequação desta abordagem para a quantificação de presas ingeridas.
Figura 3: Relações entre o nacional ln-relação de altura (altura do pico de amostra-pico alturas/padrão360 ) e (A) hora após a alimentação dos ácaros e alimentação categoria (B) (n = 23). "Experimental e aplicada Acarology, primeira detecção de presas DNA em Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): uma nova abordagem para determinar as relações predador-presa em ácaros de água, 67, 376, P. Martin, L. Schynawa, M. Koester, Rick R., (© Springer internacional publicando CIDe 2015) "com permissão de Springer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para investigar a importância da predação pelos crustáceos invasiva d. villosus nas análises de campo, intensivo isótopo estável de δ13C e δ15N do d. villosus e potenciais recursos alimentares foram promovida por molecular deteção de rapina recentemente ingerida dentro o conteúdo do intestino dos indivíduos mesmos exatos. No total, foram coletados 206 d. villosus indivíduos de diferentes sites e o trato gastrointestinal de cada indivíduo foi dissecado e DNA foi extraído de acordo com o protocolo 1. A presença e a eficiência funcional dos modelos utilizados foram assegurados conforme descrito no protocolo 2. Recente predação por parte dos indivíduos de d. villosus em vários táxons de presas de macroinvertebrados foi testada conforme descrito no protocolo n º 4. Em geral, apenas 16% do conteúdo do intestino d. villosus teste positivo de DNA pertencentes a qualquer um dos 16 taxa alvo macroinvertebrados presa e portanto, suporte para os resultados das análises isótopo estável que indicou um baixo comportamento predatório do amphipod invasiva no campo27. Enquanto, dentro as análises genéticas, DNA de 12 táxons de rapina testado foi encontrado na amostra de conteúdo de pelo menos 1 intestino, DNA dos 4 outros táxons presa nunca foi detectado (Figura 4)27.
Figura 4: Histograma ilustrando o respectivo número de d. villosus indivíduos de todos os dez sites cujo conteúdo intestino testou positivo para macroinvertebrados presas DNA. PCR foi realizado com 16 conjuntos específicos de grupo primário como indicado. "Hydrobiologia, é Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) um camarão' assassino' no sistema Rio Reno?, 768, 2016, 310, Koester Meike, Bastian Bayer, Gergs René, (© Springer International publicação Suíça 2015)" com permissão de Springer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar. Sequence_alignement_feeding_trial.FASTA clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Aqui, apresentamos um método fácil e custo-eficiente para determinação de PCR-baseados de interações predador-presa de amostras de campo através de cartilhas específicas do grupo para as regiões de rDNA, que podem ser combinadas com outras análises non-molecular dos mesmos espécimes. No entanto, existem várias etapas críticas dentro do protocolo. Em primeiro lugar, assegurando a especificidade dos primers usados é essencial. Em segundo lugar, é fundamental evitar contaminação e perda de material de conteúdo intestino durante a preparação do tracto gastro-intestinal e a posterior extração do DNA. Enquanto Cruz-amostra contaminação pode levar a falsos positivos na detecção de DNA de presa, perda de intestino conteúdo material pode levar à falta raramente consumida espécies de suas presas. Verificação da presença de rDNA pertencentes a subunidade respectiva e a eficiência funcional de modelos usados para as análises (secção 2 do protocolo) é essencial para a coleta de informações representativas sobre a presa consumida. Isto é particularmente crucial, se nenhum DNA dos grupos de presas, de que o consumidor deve se para alimentar pode ser detectado25,,27. Além disso, ao preparar o PCRs (medidas 3.1, 5.1.1 e 5.1.2) é fundamental que a mistura e o protocolo usado exatamente preenche os critérios em que o respectivo primer foi especificado para um determinado grupo de táxons. Caso contrário, amplificação do DNA dentro da reação de PCR pode falhar completamente, ou o DNA dos táxons não-alvejado pode ser amplificado também. Portanto, é obrigatório o uso positivo e negativos controles dentro de cada PCR executar garantir que a reação de PCR trabalhou e sem contaminação ocorreu. Além disso, é necessário que a matriz das amostras para cada execução PCR está documentada exatamente para permitir a correta atribuição de presas consumidas ao modelo dos respectivos consumidores. Para esta tarefa, atenção especial precisa ser levado ao pool de produtos PCR para detecção paralela de múltiplos grupos de presas através de análises automatizadas de fragmento (etapa 5.2.3).
Para a detecção de fragmentos amplificados utilizando agarose gel de agarose de eletroforese (etapas 3.2 e 3.3) géis deverão ser tão finas quanto possível e tem que ser tomado durante a inspeção visual da imagem para evitar perder fragmentos com baixa resolução visual. Para resultados e uma conclusão adequada sobre consumo de presas por um consumidor, é fundamental que a presa ainda raramente consumida táxons estão sendo reconhecidas. Géis de agarose grossa diminuem a visibilidade dos potencialmente pequenas quantidades de DNA de presas e, assim, reduzem a probabilidade para falta de rapina raramente consumida e introduzir incertezas nas conclusões extraídas da análise. Além disso, numa perspectiva de saúde, utilizar uma alternativa menos - ou não-tóxico do que o brometo de ethidium para manchar o gel pode ser aconselhável. O protocolo para posterior analise posterior a jusante de fragmentos amplificados através de análises SSCP usando géis de poliacrilamida inclui algumas etapas que devem ser realizadas com especial cuidado. É importante que o gel de gaveta montada é à prova de vazamento (etapa 4.1.3) e a solução de poliacrilamida é dado tempo suficiente para polimerizar completamente (etapa 4.1.6). Abrindo a gaveta muito cedo conduzirá ao escape do acrilamido líquido solução e, apesar do fato de que a preparação tem de ser iniciado desde o início, extenso limpeza precisa ser feito também. Além disso, transferindo o gel de poliacrilamida, para o banho de coloração (etapa 4.7) e de lá para a mesa (etapa 4.8) UV precisa ser feito com muito cuidado devido à instabilidade de tais géis. Caso contrário, o gel pode rasgar e fragmentos podem ser interrompidos, o que leva à necessidade de repetir o procedimento.
Um dos principal requisitos para processamento com êxito dados recebidos de análises automatizadas de fragmento é que a amostra interno tamanho padrão parecido com o padrão de tamanho dado pelo fabricante (etapa 5.3.3) para permitir a determinação da comprimento do fragmento apropriado. Isto é especialmente importante porque, caso contrário, os diferentes fragmentos, rotulados com a mesma fluorescente coloração tintura, podem ser atribuídos aos taxa de rapina errado e, portanto, levam a um erro de julgamento completo de interações predador-presa. Além disso, electropherograms muitas vezes mostram o ruído de fundo. Para estabelecer a confiança na interpretação, é essencial que os picos do padrão interno tamanho são significativamente maiores do que o ruído de fundo da amostra. Por conseguinte, picos para cada marcador/primer somente devem ser contados, se eles são significativamente mais elevados do que o ruído de fundo.
Este protocolo pode ser modificado para detectar vários grupos de rapina táxons de interesse dentro de vários consumidores de interesse. Reconhecidamente, primers específicos do grupo podem não já estar disponíveis para cada táxon de rapina potencial de interesse. Não obstante, primers específicos de grupo estão disponíveis não só para diversos macroinvertebrados de água doce táxons28, mas também para uma ampla gama de outros táxons (por exemplo, macroinvertebrados marinhos vários táxons de16,30 e táxons comuns de voando insetos31). Desse modo, a seleção de grupo específicas primer jogos apropriada amplificar o ADN de todas as espécies de presas de um determinado táxon, mas vencida na amplificação de DNA de espécies que não pertencem a este táxon, é essencial32. Muitos primers específicos de grupo que estão agora disponíveis foram especificados para um determinado intervalo de táxons (por exemplo, 130 táxons de macroinvertebrados de água doce comuns no Rio Reno sistema28). Portanto, para evitar resultados falso-negativos ou falso-positivos, a especificidade de tais primers deve ser reverificada para a gama de táxons comuns no ecossistema de interesse antes da sua aplicação para os táxons de destino e os consumidores não incluídos no intervalo de táxons para que as primeiras demão tinham sido estabelecidas. Além disso, se as análises moleculares não devem ser combinadas com outras análises da dissecação individual, mesma exata do tracto gastrointestinal podem ser ignorados.
Não obstante, dissecar o trato gastrointestinal de espécimes maiores também impede falha de extração de DNA por causa de muito material e reduz a presença do consumidor-DNA no extracto de amostra. No entanto, estudos têm mostrado que utilizando primers específicos de bloqueio, que prenda o DNA do consumidor e assim bloquear, para que a reação de PCR pode efetivamente melhorar a amplificação de sequências raras em amostras misturadas33. Portanto, dissecação do tracto gastrointestinal pode ser evitada, mesmo quando lidando com grandes espécimes do consumidor, pelo uso de primers específicos de bloqueio. Para detecção paralela de amplicons derivado de vários conjuntos específicos de grupo primário através de análises automatizadas de fragmento, tenha cuidado na escolha da coloração tintura como rótulo. Desse modo, primeira demão moda amplificar fragmentos de aproximadamente o mesmo comprimento deve ser rotuladas com corantes fluorescentes claramente distinguíveis. Além disso, há uma gama de sistemas de eletroforese capilar disponíveis de vários fabricantes. Alguns desses sistemas supostamente permitam a determinação de vários fragmentos até mesmo através de corantes inespecíficos. O protocolo apresentado aqui poderia facilmente ser ajustado para detectar fragmentos amplificados com qualquer um desses sistemas. Além disso, para reduzir o tempo necessário para tEle analisa, seria possível otimizar ensaios único multiplex-PCR para amplificar DNA dos grupos de presas de lote de análise de um fragmento simultaneamente (por exemplo, simultânea amplificação de 12 organismos presas de besouros34 ou até voar seis inseto táxons31).
Uma desvantagem potencial de estripá-análises de conteúdo em geral, e, portanto, também as análises descritas no presente protocolo, é a baixa resolução temporal. Com tais métodos, só é possível identificar organismos recentemente ingeridos, que podem levar a incertezas na importância de rapina única organismos2. No entanto, temos demonstrado que a análise genética de acordo com este protocolo facilmente pode ser combinado com análises de isótopos estáveis (δ15N e δ13C) da exata mesma consumidor espécimes25,27. Como um traçador natural-integração de tempo de interações predador-presa, análises de isótopos estáveis são frequentemente usadas para caracterizar alimentos web estruturas1, mas potenciais sobrepostos valores isotópicos de espécies de presas diferentes muitas vezes impedem uma exata definição de de interações predador-presa2. Portanto, usando esse protocolo para análises genéticas em combinação com as análises de isótopos estáveis para superar as desvantagens de cada método pode ainda mais nossa compreensão das teias alimentares e sua relação com fluxos de nutrientes ou de energia.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Silke Classen do Instituto de pesquisa para análise do ecossistema e avaliação (gaiac), RWTH Aachen pela sua assistência no estabelecimento dos conjuntos específicos de grupo primário usado neste protocolo. Agradecemos também Peter Martin e Laura Schynawa da Universidade de Kiel para a cooperação em experimentos dos ácaros da água. Agradecemos também os assistentes de laboratório técnico para manutenção de laboratório funcionando sem problemas e preparar o registo das empresas e números de catálogo. Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa alemã (DFG; projeto GE 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
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