Summary
Vanligaste gut innehåll analyser av macroinvertebrates är visuella. Som kräver intensiv kunskaper om morfologiska mångfald av bytesdjur organismer, de missar mjuk arbetsföra bytesdjur och, på grund av stark finfördelning av bytesdjur, är nästan omöjligt för vissa organismer, inklusive vitmärlor. Vi tillhandahåller detaljerade, nya metoder för macroinvertebrate offer identifiering i kosten av vitmärlor.
Abstract
Analysera näringsvävar är väsentliga för en bättre förståelse för ekosystem. Till exempel kan näringsväven interaktioner genomgå svåra förändringar orsakade av invasionen av icke-inhemska arter. Men är en exakt identifiering av fältet predator-bytesdjur interaktioner svårt i många fall. Dessa analyser baseras ofta på en visuell utvärdering av gut innehåll eller analys av stabila isotoper nyckeltal (δ15N och δ13C). Sådana metoder kräver omfattande kunskap om, respektive morphologic mångfald eller isotopisk signatur från enskilda byten organismer, leder till hinder i exakt identifiering av bytesdjur organismer. Visuella gut innehåll analyser underskatta särskilt mjuk arbetsföra prey organismer, eftersom maceration, intag och nedbrytning av bytesdjur organismer försvåra identifiering av specifika arter. Därav, polymeras-kedjereaktion (PCR) baserade strategier, till exempel användningen av gruppspecifika primer sätter, ger ett kraftfullt verktyg för utredning av näringsväven interaktioner. Här beskriver vi detaljerade protokoll för att undersöka tarmen innehållet i macroinvertebrate konsumenter från fältet använda gruppspecifika primer uppsättningar för nukleära ribosomal deoxiribonukleinsyra (rDNA). DNA kan vara utvinns antingen från hela exemplar (vid små taxa) eller ur tarmen innehållet i prover samlas in i fältet. Närvaro och funktionella effektiviteten av DNA mallarna måste bekräftas direkt från testade individen använder universal primer anger inriktning den respektiva subuniten av DNA. Vi visar också att konsumeras bytesdjur kan fastställas ytterligare ned till artnivå via PCR med omodifierade gruppspecifika grundfärger kombineras med efterföljande enda strand konformation polymorfism (SSCP) analyser med hjälp av polyakrylamidgeler. Dessutom visar vi att användningen av olika fluorescerande färgämnen som etiketter ger parallella screening för DNA-fragment av olika bytesdjur grupper från flera gut innehåll prover via automatiserade fragment analys.
Introduction
Predator-bytesdjur interaktioner, som utgör majoriteten av trofiska interaktioner och näringsväv dynamics, är viktiga aspekter att karakterisera flödena av materia och energi i hela näringsvävar inom och mellan ekosystem, som är en av de stora målen för ekologi 1. bestämning av källan och flödet av koldioxid och näringsämnen främja förståelsen av ekologisk konnektivitet mellan ekosystemen2. Dock är ekosystem, såsom floder och deras tillrinningsområden, inte bara kopplade av flöden av organiskt material och näringsämnen men också av förehavanden av organismer3. Således, habitat förändringar att avbryta flödet av resurser som länkar dessa system kan starkt förändra mat duk av båda ekosystem, inte bara direkt utan också indirekt genom att ändra respektive sammansättningen av predator-bytesdjur samhällen. Exempelvis har ändringar av näringsvävar visats vara kopplade till förflyttningar av enda rovdjur arter (t.ex., regnbåge)4. Sådana förändringar hotar potentiellt biologisk mångfald och funktion hos akvatiska ekosystem. Analysera predator-bytesdjur interaktioner i fältet är därför nödvändigt att fastställa påverkan av människans miljöförändringar, såsom vatten förvaltningspraxis, på den inhemska biologiska mångfalden i akvatiska ekosystem.
Eftersom spårning trofiska kopplingar är svårt i komplexa system, har flera metoder fastställts att kunna bedöma om utfodring interaktioner i fält5. Traditionellt, utredningar av utfodring interaktioner i fältet är baserat på visuell identifiering av offer återstår i dissekeras tarmar och kräver en omfattande kunskap om morphologic prey mångfald. Visuella gut innehåll analyser har gett insikter i resursanvändningen av flera grupper av konsumenter (t.ex. säsongrensade i kost av hummer6 och fisk7,8 eller utfodring preferenser av Hoppkräftor). Men fysiska processen för matsmältningen försvårar visuell gut innehåll analyser och oftast missar mjuk arbetsföra prey-organismer9. För arter utfodring av flytande intag eller för vissa ryggradslösa konsumenter som intensivt finfördela maten innan förtäring, som vitmärlor, är visuell identifiering av bytesdjur i gut innehållet omöjligt10. På grund av dessa begränsningar ger molekylär analys ett lovande alternativ.
Molekylära analyser har nu blivit ett vanligt verktyg som möjliggör snabb och exakt byte upptäckt i gut innehållet. Utbudet av sådana tekniker är olika: strategier baserade på monoklonala antikroppar eller polymeras kedjereaktioner (PCR) används ofta, på grund av deras höga specificitet och känslighet11. Utvecklingen av nya monoklonala antikroppar är tid - och kostnadsintensiv, tillämpning av andra molekylära tekniker är därför mer användbar när antikroppar inte redan finns11. En annan vanlig metod är förstärkning av regioner av deoxiribonukleinsyra (DNA) som ribosomal RNA (ribonukleinsyra) gener förekommer i de flesta arter, med universal primer sätter12,13. När du använder denna teknik, är det ofta inte möjligt att identifiera hela skalan av bytesdjur organismer inom blandade källor av DNA14. Ett effektivt sätt att undvika sådana en nackdel är att använda gruppspecifika primer sätter för genetiska gut innehåll analyser. Designad för att förstärka endast DNA regioner i särskilda målgrupper och utesluta alla andra arter15,16, aktivera gruppspecifika primers identifiering av bytesdjur organismer på taxonomisk nivå av de angivna grupperna utan tid - och kostnadsintensiv sekundära analyser. Dock som alla gut innehållsanalys, ger sådana analyser endast en ögonblicksbild av utfodring beteende. Därför anses kombinerar molekylär gut innehåll analyser med analyser av tid-integrera naturliga spårämnen (t.ex. stabila isotoper) fördelaktigt1,2.
Här beskriver vi en detaljerad metod för PCR-baserade undersökningar av predator-bytesdjur interaktioner med hjälp gruppspecifika primer uppsättningar för nukleära ribosomal DNA (rDNA) regioner ska kombineras med stabil isotopanalyser av samma prov. Vi beskriver påvisande av DNA i enda byte grupper via agaros gelelektrofores. Dessutom presenterar vi en möjlighet för ytterligare nedströms analyser av PCR produkter av sådan gruppspecifika primers tillämpliga när det krävs en högre taxonomisk upplösning än primers' specificitet. Eftersom enda stranded DNA (ssDNA) fragment form tertiär konformationer som bestäms av deras primära sekvens17, leda små variationer i fragment som förstärks av sådan gruppspecifika primers till konfirmerande förändringar. Sådana förändringar kan upptäckas av enda strand konformation polymorfism (SSCP) analyser med polyakrylamidgeler17,18, möjliggör en mer exakt identifiering av bytesdjur organismer (ner till artnivå).
Medan agaros gel-elektrofores är en vanlig och billig verktyg för att visualisera DNA-fragment och avgöra deras ungefärliga längd19, upplösningen beror på mängden DNA och färgning färgen används20. Vanligtvis, visualisering är rakt fram när du arbetar med rena DNA-prover, men potentiellt låga mängder bytesdjur DNA i gut tillfredsställer konsumenternas kan komplicera poängsättning av agaros gelelektrofores resultat. Fortfarande, denna detektionsmetod är genomförbart att skärmen ett lågt antal konsument exemplar från fältet för en eller några offer grupper, men komplikation i scoring gör screening av ett stort antal prover för flera byten taxa tiden extremt intensiva och därmed praktiskt ogenomförbart. En känsligare detektionsmetod är automatiserad analys av fragment via kapillär elektrofores, som dessutom tillåter bestämning av den exakta längden på fragment21. Flera mikrosatellit baserade studier har visat att genom att använda olika fluorescerande färgämnen som etiketter, det är möjligt att upptäcka och fastställa olika fragment av jämförbar längd genom automatiserade fragment analys22,23, 24. Därför, vi presenterar också ett detaljerat protokoll för parallella upptäckt av DNA från flera bytesdjur grupper med PCR med märkta gruppspecifika primer uppsättningar och upptäckt via automatiserade fragment analys med en automatiserad sequencer. Dessutom presenterar vi resultaten från en fallstudie visar att detektion av bytesdjur DNA via automatiserade fragment analys är en metod som möjliggör också en relativ kvantifiering av förtärda bytesdjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samla in Macroinvertebrates från fältet och bereda proverna för genetiska Gut innehåll analyser.
- Samla macroinvertebrates på varje plats, sortera ut individer av konsumenten Art sevärdheter i enstaka rör och frysa dem direkt i flytande kväve eller torris att förhindra gut clearance och nedbrytning av DNA.
Obs: Undvik att förvara prover i alkohol, eftersom vissa macroinvertebrates tenderar att regurgitate innan alkoholen dödar dem. - Bara använda mag-tarmkanalen av medelstora och stora (ca > 3 mm) macroinvertebrate arter för genetiska gut innehåll analyser så den återstående frågan om preparatet kan användas för andra förfaranden (t.ex. stabil isotop analys). Observera att detta inte är tillämplig när du undersöker mycket liten taxa som vatten kvalster. Därför steg 1.2.1 och 1.2.2 förs.cykeletapper.
- Avfrostning något individ och dissekera noggrant dess Gastrointestinalt område under ett stereomikroskop med fina rostfritt stål pincett. Se till att inte punktera mag-tarmkanalen för att undvika förlust av materia.
- Rena tången med sanering lösning att ta bort föroreningar som DNA och RNA efter beredning av varje mag-tarmkanalen. Därför Inkubera tången i 10 min i sanering lösningen. Efteråt, skölj dem med sterilt vatten för att ta bort rester och torka dem med en luddfri pappershandduk.
- Överföring dissekerade magtarmkanalen till en 2,0 mL säker-lås reaktion tube innehållande 440 µL (450 µL möjliga för användning av repetitiva pipett) salt utvinning buffert [SEB, 0.4 M natriumklorid (NaCl), 10 mM Tris (hydroxymetyl)-aminometan hydroklorid (Tris-HCl) pH 8,0 och 2 mM etylendiamintetraättiksyra syra dinatriumsalt torkar (EDTA) pH 8,0]. Store beredd prover vid − 20 ° C omedelbart fram till extraktion av DNA. Se till att DNA extraheras inom ett par dagar.
- Använda en modifierad hög salthalt extraktion protokoll 25 för att extrahera DNA.
- Ta prover ur frysen. Använd tången för att lägga en 5 mm rostfri pärla till varje prov tub och lämna frysta prover på bänken vid rumstemperatur (RT) Tina. Använd en pärla kvarn för att homogenisera prover för 1 min på 15 Hz.
- Snurra ner prover med en kort körning av en centrifug. Använd mikroliter pipetter att lägga till 90 µL (100 µL möjligt för användning av repetitiva pipett) 10% sodium dodecyl sulfate lösning (SDS) och 5 µL av 10 mg/mL proteinas K.
- Vortex prover grundligt och inkubera blandningar för 1 h vid 60 ° C under ständig skakning vid 400 rpm på en thermomixer. Dessutom grundligt vortex prover varje 10 min för att ytterligare främja lysis.
- Snurra ner prover med en kort körning av en centrifug, tillsätt 350 µL 5 M NaCl med mikroliter pipett och vortex grundligt i ca 0,5 - 1 min. Centrifugera proverna för 40 min vid 16 200 x g vid 5 ° C.
Obs: Om flera set i rad måste göras, temperaturinställningen av centrifugen behöver lyftas något (inte högre än 10 ° C) Eftersom SDS tenderar att flockas om temperaturen är för låg. - Användning mikroliter pipetter överföra ca 600 µL supernatanten till en ny 1,5 mL reaktionsröret. Var noga med att inte ta bort något från pelleten.
- Tip rostfritt stål pärlor ur reaktionsrören i ett rostfritt stål tesil, rengör dem med rinnande vatten och odla dem i en petriskål med sanering lösningen för 10 min. Skölj av sanering lösningen med steril vatten och förvara rengjorda pärlor i etanol (> 99%, p.a. grade) eller torrt tills återanvändning.
Obs: Rengöring av pärlor behöver inte göras i det här steget direkt, men snarare kan göras närhelst det finns väntetid i följande steg. - Lägga till 600 µL av iskall isopropanol (p.a. grad) supernatanten med en mikroliter pipett och Invertera noggrant röret ett par gånger. Lagra prover övernattning på -20 ° C.
- Ta prover ur frysen och centrifugera dem i 20 min vid 16 200 × g och rumstemperatur. Noggrant avlägsna supernatanten och torka röret försiktigt med luddfri mjukpapper. Observera att om den omgivande temperaturen är hög (mer än 25 ° C), Centrifugera vid 5 ° C till undvika pellets glider samtidigt kasta bort supernatanten.
- Tvätta pellets som innehåller DNA med 70% etanol. För att göra detta, tillsätt 200 µL av iskall etanol (70%, p.a. grade) använder en mikroliter pipett och centrifugera prover för 10 min vid 16,200 x g och rumstemperatur (eller 5 ° C, om det behövs). Noggrant avlägsna supernatanten och torka röret försiktigt med luddfri mjukpapper. Använd 10 µL pipett anpassas till cirka 8 µL att Pipettera försiktigt bort återstående supernatanten. Se till att inte störa pelleten.
- Torka pelleten för cirka 5-20 min vid 60 ° C eller vid rumstemperatur på bänken tills alla etanol är avdunstat.
- Lös pelleten i 50-100 µL nuclease-gratis (ånga steriliseras och DEPC behandlas) vatten (ddH 2 O), vänta minst 1 timme (dock bättre resultat uppnås över en natt vid 4 ° C).
- Mäta mängden DNA som finns i varje prov med en mikro-volym spektrofotometer, enligt tillverkaren ' anvisningar. Gör en arbetsutspädningen av varje prov som innehåller cirka 2-10 ng DNA / µL. hålla stamlösning i frysen. Hålla arbetslösning i kylskåpet och se till att ytterligare urval behandlingen görs strax.
2. Verifierar funktionella effektiviteten av DNA-extrakt för efterföljande detektion av nyligen intagna Prey.
- Att säkerställa närvaro och funktionella effektiviteten av mallar, testa varje DNA-extrakt (steg 1.1 till 1.3.11) med hjälp av universal primer anger lämplig för respektive mat (e.g., ryggradslösa djur 16 , 26) som är riktade mot den samma kärn subuniten som den gruppspecifika primer, används för efterföljande identifiering av bytesdjur 25 , 27. Följande steg avser användningen av universal primer uppsättningar NSF1419/20 och NSR1642/16 16 och LSU D1, D2 fw1 och LSU D1, D2 rev2 eller LSU D1, D2 rev4 26. För att bevisa att PCR-reaktionen har varit framgångsrik och att ingen förorening uppstå, använda en positiv kontroll som innehåller DNA som redan hade varit förstärkt framgångsrikt och ett kontrollprov innehållande ddH 2 O i stället för DNA inom varje PCR köra.
- Att förbereda primer fungerande lösningar som innehåller en slutlig koncentration 10 µM grundfärgens, Tillsätt lämplig mängd av den respektive primer lager lösning och ddH 2 O (beroende på koncentrationen av stamlösningen) in i en färska 1,5 mL reaktionsröret hjälp Mikropipetter.
- Lägg till primers, deoxynucleotide mix (dNTP), reaktion buffert, Taq-DNA-polymeras och ddH 2 O i en 1,5 eller 2,0 mL (beroende på antalet prover som skall bearbetas) reaktionsröret, då vortex denna blandning. I tabell 1 ges detaljerade volymer för standard reaktionsblandningen för en 10 µL PCR-reaktion (för detaljer av kemikalier som används, se Tabell för material).
- Användning mikroliter pipetter överföra varje 1 µL DNA extrahera till 9 µL av the standard reaktionsblandningen inom en PCR-röret (eller en brunn av en PCR-platta). Nära reaktionsröret eller reaktionsbrunnarna av plattan (med cap ränder).
- Programmera termocyklern: standardprotokoll för NSF1419/20 och NSR1642/16 16 primer är: 94 ° C i 4 min (denaturering), följt av 30 cykler av 94 ° C för 30 s, 50 ° C (glödgning temperatur) för 30 s, 72 ° C för 90 s och slutliga förlängning vid 72 ° C i 10 min. För LSU primer sätter 26, Använd följande: 94 ° C i 4 min, följt av 45 cykler av 94 ° C för 20 s, 52,5 ° C för 20 s, 72 ° C för 90 s, och en sista förlängning vid 72 ° C i 8 min.
- Plats PCR-rör eller plattor till termocyklern, stänger locket på apparat, och starta programmet respektive.
- Förbered en 1,5% agaros gel med en buffertlösning innehållande Tris base borsyra och EDTA (TBE buffert) och agaros. För beredning av en 1,5% agarosgel, använder en gel gjutning facket med övergripande mått 10 x 7,5 cm × 3 cm, väger 0.45 g agaros i en konisk kolv, använda en mätcylinder för att mäta 30 mL av 1 x TBE buffert (89 mM Tris pH 7,6, 89 mM borsyra och 2 mM EDTA, pH 8,0) och häll det i den koniska kolven. Värm blandningen i mikrovågsugn. Stoppa mikrovågsugn när det finns stora luftbubblor och försiktigt snurra kolven tills lösningen har endast en fas.
- Svalna lösning till cirka 60 ° C, snurra kolven i ett vattenbad. Snabbt Häll lösningen i en gel gjutning facket, avlägsna luftbubblor och infoga kammar. Vänta ca 20 min tills gelen härdas.
- Fyllning elektrofores enhet med 0,5 x TBE och infoga gel gjutning facket som innehåller agarosgel. Kontrollera att den gel Slotsen är fri från luftbubblor.
- Snurra ner de PCR-produkter med hjälp av kort kör alternativet av en mini (plattan) centrifug. Använd en mikroliter pipetten att blanda varje 3 µL av PCR-produkten med 1 µL 6 x laddar färgämne (40% sackaros och 0,25% bromofenolblått) och läsa in den i agarosgel gel springor. Pipettera 1,5 µL av en 100 bp DNA stege i en kortplats på varje rad med mikroliter pipett som storlek standard. Sätt tillbaka locket av elektrofores enheten korrekt och Anslut leder till en strömkälla. Kör gelen vid 100 V/cm för 35 min.
- Att förbereda en färgning bad, häll 1000 mL 1 x TBE in i en fyrkantig plastlåda som ogenomtränglig för ljus. Tillsätt 50 µL av etidiumbromid med mikroliter pipett, stänger locket på plastlåda och skaka den för att säkerställa jämn fördelning av etidiumbromid.
- Gelen från elektrofores enheten och placera den i färgning badet i cirka 10 min. Ta gelen ur färgning badkaret och placera den på en geldokumentationssystem och visualisera det enligt handboken.
- Analysera bara prover som visade positiva resultat (fragment av tillräcklig storlek visuell i agarosgel) närvaro och funktionella effektivitet av mallar för efterföljande identifiering av nyligen intagna bytesdjur.
| PCR-Mix | koncentration fungerande lösning | Mix för 10 µl PCR-reaktionen | slutlig koncentration i PCR |
| Primer FW | 10 µM | 0,5 μl | 0,5 µM |
| Primer RW | 10 µM | 0,5 & #956 ; l | 0,5 µM |
| reaktion buffert (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16 mM (NH4) 2SÅ4 och 2 mM MgCl2 slutliga koncentrationer) | 1 µM | 1 μl | 1 µM |
| dNTP | 10 mM | < t d > 0,25 μl0,25 mM | |
| Taq polymeras | 5 U | 0.1 µl | 0,05 U |
| ddH 2 0 | 6,65 μl | ||
| < stro ng > Summa belopp reaktionsblandningen | 9 μl | ||
| DNA | 1 μl | ||
Tabell 1: detaljerade protokoll för utarbetandet av standarden reaktionsblandningen för en 10 µL PCR-reaktion.
3. upptäcka nyligen intagna byte/livsmedel med gruppspecifika Primer uppsättningar med hjälp av gelelektrofores.
- Genomföra PCR använder arbetslösning DNA extraheras (beredd enligt steg 1,1 till 1.3.11) och gruppspecifika primer uppsättningen (omärkt, dvs utan modifiering) lämplig för gruppen prey riktade som beskrivs i steg 2.1.1 till 2.1.3 (för variationer i reaktionsblandningen för respektive primer, se tabell 2). Köra PCR använder standardprotokollet i steg 2.1.4 (för glödgning temperaturer för respektive primer, se tabell 2).
- Använda en kontroll med ren DNA från prov tillhör respektive målgruppen (positiv kontroll) och en negativ kontroll med ren DNA från konsumenten arter i varje PCR köra.
- Kontrollera framgången av PCR-reaktionen använda agaros gel-elektrofores som beskrivs i steg 2.1.6 till 2.1.11. PCR-reaktionen var framgångsrik om ett fragment av lämplig längd (se tabell 2) är synlig för positiv kontroll men inte för den negativa kontrollen. Om en eller båda av dessa kriterier är ouppfyllda, upprepa PCR.
- Använda agaros gel elektrofores, enligt beskrivningen i steg 2.1.6 till 2.1.11, för att upptäcka huruvida gruppen prey riktade hade konsumerats av olika konsument exemplaren provas (via dom om fragmentet av lämplig längd är synliga eller inte). Får du inte missa fragment med låg visuell upplösning.
- Store PCR-produkter vid 4 ° C, om ytterligare analyser kommer att ske inom de kommande 24 h eller vid-20 ° C om analyser ska utföras senare.
4. Därefter avgör förbrukade Prey ytterligare nedströms med SSCP analys via Polyakrylamidgelen.
- Förbereda en 9% akrylamid gel för SSCP elektrofores. Förbereda de fungerande lösningarna i laboratorium huva.
- Att förbereda en 200 mL akrylamid fungerande lösning, Fyll en mätcylinder med 20 mL 10 x TBE (109 g för Tris base, 55 g borsyra och 40 mL 0.50 M EDTA, pH 8,0 upplöst i 1000 mL av ddH 2 O) och ytterligare en med 45 mL av 40% (29: 1) akrylamid mix. TBE och akrylamid mix och häll i en mätkolv (en graderad glasflaska med en 200 mL-märket är också lämpliga här) ddH 2 O upp till 200 mL märket. Fortsätta arbeta lösning i kylen (4 ° C) tills den behövs. Använd inte fungerande lösning äldre än en vecka.
- Väg upp 0,1 g av ammonium persulfatoxidation (APS, Använd en balans med minst 0,01 g noggrannhet) i en 1 mL-mätkolv och Lös det genom att lägga till ddH 2 O upp till avläggande av examen till förbereda en 10% APS stamlösning. Överför alikvoter (cirka 350 µL) till färska reaktionsrören.
Obs: En alikvot behövs för varje Polyakrylamidgelen. Lagra den återstående aliquOTS vid-20 ° C och endast Frosta delprover strax innan de behövs. - Montera en gel kassett äventyras av två glasskivor, en tom och en spårat glasplatta (varje 20 x 20 cm), med distanser (1,5 mm tjock) mellan dem köra upp sidorna av glaset. Använd varje tre vik tillbaka klipp (32 mm) på höger och vänster sida för att fixera gel kassett ( figur 1).
- Mix 5 g av agaros och 250 mL 1 x TBE buffert i en konisk kolv att förbereda lösning för en 2% agaros gel. Värme och därefter svalna blandningen enligt beskrivningen i steg 2.1.6 och 2.1.7. Snabbt Häll lösningen i en fyrkantig plastlåda (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) och placera den nedre änden av gel kassetten (steg 4.1.3) i agaros lösningen. Justera fold-back klippen på den nedre änden av gel kassetten till en höjd så att de sitter på kanten av den fyrkantig plastlåda ( figur 1). Vänta cirka 20-30 min tills agaros kontakten helt härdat.
- Fyller 100 mL mäta cylinder med akrylamid arbetslösning (steg 4.1.1) tills 60 mL markeringen och Häll lösningen i en bägare. Använd en mikropipett tillsätt 300 µL av en alikvot av APS stamlösning (steg 4.1.2) och därefter lägga till 37,5 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED). Snabbt, häll över lösningen mellan glasplattorna av gel kassetten. Alternativt, injicera lösningen mellan glasplattorna med en 100 mL engångsspruta med en 1000 µL pipettspetsen justerat till injektion chefen för sprutan.
- Sätt försiktigt en 1,5 mm tjock standard kam i den övre delen mellan glasplattorna. Kammen måste omges av polyakrylamid lösningen. Vänta ca 1 h tills Polyakrylamidgelen är polymeriseras. Undvika ventilation under polymeriseringen så långt som möjligt eftersom det ökar den tid som behövs för gelen att polymerisera.
Obs: Det är möjligt att lagra gjuten geler inom slutna plastpåsar med en våt vävnad i kylskåp upp till 3 dagar.
figur 1: bilden illustrerar den konstruktion att hälla polyakrylamidgeler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Placera gel kassett, som innehåller Polyakrylamidgelen beredd, i en vertikal elektrofores enhet. Fyll enheten elektrofores med (beroende på typ av elektrofores enhet) lämplig mängd 0,5 x TBE och cool enheten ner till 10 ° C med en kyld Cirkulator.
- För DNA denaturering, värm en thermal-block /-apparat till 96 ° C. förbereda denaturering buffert med 95% formamid (99,5% p.a. grad) och 5% vattenlösning som innehåller 0,25% bromofenolblått och 40% (w/v) sackaros.
- Ta de PCR-produkterna ur kylen eller frysen och Tina dem. Snurra ner de PCR-produkter med hjälp av kort kör alternativet av en mini (plattan) centrifug. Blanda sedan, varje 4 µL av en PCR-produkt med 4 µL av denaturering buffert. Värma blandningar under 5 minuter vid 96 ° C omedelbart följt av en kylande steg i iskallt vatten i 10 min.
Obs: Prover bör vara lastas Polyakrylamidgelen (steg 4,5) omedelbart efter detta. - Ta bort kammen från Polyakrylamidgelen (steg 4.1.6) och Använd en mikropipett för att helt ladda varje prov i en gel-kortplatsen. Köra elektrofores på 8 W per gel medan ständigt kylning elektrofores enheten till 10 ° C. kör tid som behövs beror på storleken av fragmentet separeras. För fragment storlekar ca 210 bp, en rinnande tid av ca 3,5 h anses lämpligt.
- Att förbereda en färgning bad, häll 1000 mL 1 x TBE i en fyrkantig plast låda ogenomtränglig för ljus och tillsätt 30 µL färgning färgämne (lämplig att färga enda stranded DNA) med mikroliter pipett. Stäng locket på rutan plast och skaka den för att säkerställa jämn fördelning av färgning färgen.
- Ta bort gel kassetten från elektrofores kammaren och skilja noggrant den skårade glasplattan från gelen. Skjut Polyakrylamidgelen från Tom glasskivan i färgning badet. Placera färgning badet på en skakande plattform och fläcken gel för 20-30 min med konstant skakning.
- Ta gelen försiktigt ur färgning badkaret och placera den på tabellen UV i ett dokumentationssystem.
Obs: På grund av instabiliteten i gelen är det tillrådligt att hantera det föregående steget med två personer. En person bör hålla färgning badet bredvid tabellen UV och en annan ska nå under gelen med båda händerna, ta ut och skjut den på tabellen UV. - Stänga locket eller dörren av dokumentationssystemet och fotografera enligt tillverkaren ' s bruksanvisning.
5. Upptäcka flera nyligen intas Prey grupper parallellt med hjälp av automatiserade Fragment analyser.
- Analysera halten gut DNA extraheras med 16 gruppspecifika primer uppsättningar ges i tabell 2, med en primer av en uppsättning märkas på grund av ändringen med en färgning färgämne (se tabell 2 kolumn med titeln modifiering), och använda de parallella detektionsmetoder av en automatiserad sequencer.
- Använder arbetslösning DNA extrakt (beredd enligt steg 1,1 till 1.3.11) och beteende separata primärvården för varje primer som beskrivs i steg 2.1.1 till 2.1.5 (variationer i blandningen ges i tabell 2). Använd minst en kontroll med ren DNA från prov tillhör respektive målgruppen (positiv kontroll) och en negativ kontroll med ren DNA från konsumenten arter i varje PCR köra.
- Kör primärvården i den termocyklern använder PCR-standardprotokollet i steg 2.1.4, justerat till respektive glödgning temperatur (och antal cykler) för varje primer som anges i tabell 2.
Obs: Använd samma DNA fördelningen av reaktionsbrunnarna för PCR med 16 olika primer set att förenkla efterföljande poolning av PCR-produkter för grupperade automatiserad fragment analyser. - Store PCR produkter vid-20 ° C tills alla primärvården tillhör ett parti för de automatisera fragment analyserna (se tabell 2) är färdiga. Hålla PCR-produkter i mörkret och förvara dem inte längre än 1 vecka före fragment analyser.
tabell 2: Detaljer av 2 partier av 15 gruppspecifika primer par fastställts av Koester o.a. (2013) och nydesignade Jae28S primer par förstärkande regioner av den 18S eller 28S rDNA från 16 målgrupper av vattenlevande macroinvertebrates. f, framåt grundfärger; r, omvänd grundfärger; 18s, primer riktar den 18S rDNA subuniten; 28s, primer riktar 28S rDNA subenhet. " Hydrobiologia, är Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) en ' killer räkor ' i floden Rhen systemet?, 768, 2016, tabell S1, kompletterande material sida 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer Internationell publicering Schweiz 2015) " med tillstånd av Springer. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
- att upptäcka förstärkta fragment av alla 16 primer set genomföra automatiserade fragment analyser i de 2 satser som anges i tabell 2. Använd en inre storlek standard (DNA storlek Standard Kit - 400 [Batch B] och -600 [Batch A], respektive) till avgöra fragment längd. Förbereda sekvensering plattan och automatisk sequencer som beskrivs i följande steg. Observera att detta förfarande kan behöva justeras om du använder en annan plattform än som anges i tabellen material.
- Att köra varje batch-prov, förbereda en blandning som innehåller provet lastning lösning (SLS) och respektive storlek standard. Pipettera 21,6 µL av SLS och 0.4 µL av DNA storlek Standard Kit - 600 per prov av Batch A respektive 21,7 µL av SLS och 0,3 µL av DNA storlek Standard Kit- 400 per prov av Batch B.
- Ta PCR produkter från de 8 primärvården tillhör respektive batch ur frysen och Tina dem. Se till att de hålls fortfarande i mörkret.
- Använda mikroliter pipett till lasta antalet brunnar sekvensering platta behövs (antal prov som ska analyseras) med varje 22 µL av den respektive blandning som beskrivs i steg 5.2.1. Snurra ner PCR produkter från var och en av de 8 primärvården kort kör alternativet av en mini (plattan) centrifug. Överföra varje 1 µL per PCR-produkten av varje av de 8 primärvården i respektive brunnar av sekvensering plattan med mikroliter pipett.
- Försiktigt snurra ner denna blandning inom sekvensering plattan med en kort körning av en mini tallrik centrifug och overlay var och en av de brunnar som används med en droppe av mineralolja. Fyll respektive reaktionsbrunnarna buffert platta med 250-300 µL av DNA separation buffert.
- Använda programvaran för kapillär sekvenseraren för att skapa en prov Setup enligt tillverkaren ' anvisningar. Tilldela metoderna att styra provningssatser och bestämmer vilken sekvens av metoder som används för att bearbeta data (se tabell 3 för att köra villkor som är lämpliga för användning med standarden storlek Material tabell). Observera att det är avgörande att fördelningen av prover inom prov Setup matchar prov tilldelningen i den sekvensering plattan (inklusive positiva och negativa kontroller, se steg 5.1.1) och att metoden som är lämplig för fragment analyserar med respektive storlek standard väljs.
- Fylla en vätning bricka med avjoniserat vatten och infoga den sekvensering plattan, buffert pläterar och vätning fack i kapillär sequencer. Tonerkassetten en gel som innehåller en tillräcklig mängd färsk DNA separationsgelen som behövs för provet körs. Köra sekvensering plattan med beredda prov Setup.
| denaturera | Skilj | Kapillär | injicera | ||||
| Temperatur | tid | spänning | tid | spänning | tid | ||
| storlek standard 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 min | 50 ° C vänta Temp: Ja | 2.0 kV | 30 s |
| storlek standard 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 min | 50 ° C vänta Temp: Ja | 2.0 kV | 30 s |
tabell 3: specifika villkor för fragment analyser vid automatiserad sequencer med hjälp av storlek standarder ges i tabellen material.
- att analysera resultaten exportera rådata och överföra dessa data till ett fragment analys-program. Välja standard färg färg beställningar av respektive tillverkaren ställa dye färgkanaler.
- Skapa en Panel som beskriver det förväntade intervallet av fragment längd förstärks av den enda gruppspecifika primern sätter inom ett parti enligt användarmanualen för programmet.
- Att bearbeta data, markera respektive Panel, lämplig storlek standard, standard färg och typ av analys och köra proceduren. Välj alternativet elektroferogram att Visa fluorescerande signal intensiteter från kapillärelektrofores instrument som en enda rad trace för varje färg färg. Markörer/primer uppsättningar kommer att visas som anger intervallet respektive fragment och den exakta längden på upptäckta fragmentet är associerad med centrum i varje kallas topp kommer att markeras (i de flesta program efter färgning eller tilldelade) automatiskt.
- För varje prov, beräkna hur nära provet ' s inre storlek standard matchar den valda storlek standarden för att lugna framgången av den storlek kallelsen. De flesta fragmentprogram analyser har ett alternativ för att automatiskt beräkna och visualisera denna match. Om den storlek kallelsen misslyckades, upprepa fragment analyser för dessa prover.
- Visuellt kontrollera elektroferogram av varje prov och bekräfta/unconfirm varje topp som kallas för varje markör/primer anges separat. Manuellt infoga felplacerad toppar som passar kriterierna för en markör/primer uppsättning eller ta bort fel ones enligt bruksanvisningen för det program som användes. Tillämpa den baspar storlek eller bin namnet i den ' allel etikett '. Beräkna och Visa topp specifikationerna i den ' Peak tabell '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har framgångsrikt använt stegen som beskrivs i detta protokoll för kost analyser inom olika studier. I det här avsnittet presenterar vi exempel som beskriver tillämpligheten av de olika avsnitten i protokollet.
Som ett exempel, för att demonstrera effektiviteten av gruppspecifika primer uppsättningar fastställts av författarna28 och potentialen för ytterligare nedströms analyser av PCR-produkter av SSCP analyser, utfördes en utfodring experiment. Individer av Dikerogammarus villosus som rovdjur och Caenis spp. larver som bytesdjur fångades i floden Rhen och backwaters nära Karlsruhe (Tyskland). I laboratoriet, rovdjur och bytesdjur taxa hölls separat i filtrerad ström vatten vid 20 ° C och var utsvulten i 36 timmar. För experimentet placerades märlan exemplar i bägare med filtrerad ström vatten (100 mL) individuellt, matas med två till tre Caenis larver i 30 min och därefter fryst i flytande kväve. Mag-tarmkanalen av varje D. villosus var dissekeras och DNA extraherades som beskrivs i protokoll 1. DNA-extrakt testades med Caep28S primer ange lämplig att upptäcka Caenis spp. med lämplig PCR-protokoll28 enligt beskrivningen i protokoll 3. Kontrollera skillnaderna mellan förstärkt fragment av olika Caenis arter genom utfördes PCR med gut innehåll prover och rena DNA-prover av tre Caenis referens arter. Agaros gel-elektrofores ledde till enda band av dubbel stranded DNA, vilka inte kan särskiljas mellan olika Caenis arter med denna typ av elektrofores (figur 2A). Däremot med SSCP gelelektrofores var som beskrivs i protokoll 4, det möjligt att identifiera offer organismer till artnivå genom att jämföra gut innehåll proverna med referensprover (figur 2B). SSCP fragment mönstret av tre referens taxa Caenis beskidensis (figur 2B, lane 1), Caenis horaria (figur 2B, lane 2), och Caenis luctuosa (figur 2B, lane 3) bestod av fyra band med differentierbara mönster. Två gut innehåll prover (figur 2B, lane 4 och 5) hade ett fragment mönster lika med C. luctuosa (figur 2B, lane 3). Fragmentet mönstret av tredje gut innehåll provet (figur 2B, lane 6) var identisk med C. horaria (figur 2B, lane 2). Sekvensanalyser av två gut innehåll prover som identifieras som C. luctuosa och C. horaria (figur 2B, lane 4 och 6) och respektive referens arter verifierade detta resultat (se elektroniska tillägg justering fasta fil).
Figur 2: Ursprungliga bilden av (A) agaros gel-elektrofores och (B) SSCP analys av PCR-fragment av gut innehåll och referensprov förstärks med Caep28S primer. Lanes 1-3 visar referensprover av arten Caenis beskidensis (1), Caenis horaria (2) och Caenis luctuosa (3). Lanes 4-6, mönstret fragment av olika gut innehåll prover av märlan Dikerogammarus villosus presenteras. Lane 7 visar fragment mönster i en 100 bp DNA stege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dessutom genomfördes ett laboratorium experiment i vilka vatten som kvalster tillhör arten Hygrobates fluviatilis matades på fjädermyggor larver inte bara avgöra om DNA av fjädermyggor individer konsumeras kan upptäckas i vatten kvalster, men också för att testa om DNA upptäcks beror på förfluten tid sedan konsumtion av bytesdjur29. Efter svälter kvalster för ungefär en vecka, erbjöds varje kvalster en fjädermyggor larva som mat. Varje 3-4 vatten mite individer har korrigerats i etanol (absolut) för genetisk analys med Chiro18S primer uppsättningen specifika till sorgmyggor familjen fjädermyggor28 vid 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 och 50 h efter matas29. Som en grad av konsumtion av vatten mite personer, respektive byte individerna klassificerades i följande fem kategorier som utfodring: 1 = helt sög ut, integument helt tömt (> 90%), 2 = nästan helt sög ut (> 75-90%), 3 = semi sög ut (> 50-75%), 4 = bara delvis sugs ut (> 5-50%), 5 = ingen synlig förändring i bytets kropp struktur (≤5%)29. DNA var ur vatten kvalster som beskrivs i protokoll 1 (utan steg 1.2.1 och 1.2.2) och förekomsten av 18S rDNA extraktet och funktionella effektiviteten av mallen kontrollerades enligt protokoll 2. Identifiering av bytesdjur DNA utfördes enligt protokoll 4 använder endast Chiro18S primer med framåt primern märkt med en fluorescerande färgämne (se tabell 2) och DNA storlek Standard Kit - 400. Att möjliggöra jämförelser mellan prover analyseras inom olika körningar av en automatiserad sequencer, förhållandet mellan prov topphöjden och topphöjd den närmaste intern standard (dvs360 bp i detta fall) av varje prov beräknas och användes som en proxy för mängden DNA upptäcks. Resultaten visade att fjädermyggor DNA var detekterbart i praktiskt taget alla individer av Hygrobates fluviatilis matas på fjädermyggor larver29. Från det kortaste intervallet (1 h efter utfodring) för den längsta perioden efter utfodring (50 h) den relativa mängden upptäckta prey DNA var betydligt minskat (figur 3A)29. Dessutom bekräftade förhållandet mellan tid efter utfodring och prey klassificeringen som en proxy för den intagna mängden byte DNA kan vara (figur 3B)29. Minskning av offer DNA upptäcks med ökande tid efter utfodring var troligen helt reflekteras av nedbrytningen av DNA och nedbrytning av bytet, eftersom egestion av offer DNA är högst osannolika på grund av en anus i vatten kvalster29. Dessa resultat bekräftar lämpligheten av denna metod för kvantifiering av förtärda bytesdjur.
Figur 3: Relationer mellan nationella ln-höjdförhållande (prov-peak höjder/standard360 topphöjden) och (A) tid efter utfodring av kvalster och (B) utfodring kategori (n = 23). ”Experimentell och tillämpad Acarology, första upptäckten av offer DNA i Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): en ny strategi för fastställande av predator-bytesdjur relationer i vatten kvalster, 67, 376, P. Martin, M. Koester, L. Schynawa, R. Gergs, (© Springer International publicerar Switzerloch 2015) ”med tillstånd av Springer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att undersöka betydelsen av predation av den invasiva märlan D. villosus i de fältet, intensiva stabil isotopanalyser δ13C och δ15N D. villosus och potentiella matresurser var främjas av molekylär Påvisande av nyligen intagna byten inom gut innehållet i exakt samma personer. Totalt 206 D. villosus individer från olika platser samlades och mag-tarmkanalen av varje individ var dissekeras och DNA extraherades enligt protokoll nr 1. Närvaro och funktionella effektiviteten av de mallar som används var säker enligt protokoll 2. Senaste predation av D. villosus individerna på flera macroinvertebrate byte taxa testades enligt protokoll 4. Övergripande, bara 16% av D. villosus gut innehållet testats positivt för DNA tillhör någon av de 16 riktade macroinvertebrate byte taxa, och stödde därför resultaten av de analyser som stabil isotop som anges en låg Tibias utfodring beteende av den invasiva märlan i fält27. Medan, inom de genetiska analyserna, hittades DNA av 12 testade prey taxa i minst 1 gut innehåll prov, var DNA av de 4 andra bytesdjur taxa aldrig upptäckta (figur 4)27.
Figur 4: Histogram illustrerar respektive antalet D. villosus individer från alla tio webbplatser vars gut innehåll testade positivt för macroinvertebrate offer DNA. PCR utfördes med 16 gruppspecifika primer uppsättningar som anges. ”Hydrobiologia, är Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) en 'killer räka' i floden Rhen systemet?, 768, 2016 310, Koester Meike, Bastian Bayer, Gergs René, (© Springer International Publishing Schweiz 2015)” med tillstånd av Springer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil. Sequence_alignement_feeding_trial.fasta vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en enkel och kostnadseffektiv metod för PCR-baserade bestämning av predator-bytesdjur interaktioner från fältprov via gruppspecifika primers för rDNA regioner, som kan kombineras med andra icke-molekylära analyser av samma exemplar. Dock finns det flera kritiska steg i protokollet. För det första är det viktigt att säkerställa specificiteten av primers används. För det andra är det viktigt att undvika kontaminering och förlust av gut innehåll material under utarbetandet av mag-tarmkanalen och efterföljande utvinning av DNA. Cross-prov kontaminering kan leda till falskt positiva upptäcka byten DNA, konsumeras förlust av gut innehåll material kan leda till saknas sällan bytesdjur. Kontroll av närvaron av rDNA tillhör den respektiva subuniten och mallar som används för analys (avsnitt 2 i protokollet) funktionell effektivitet är viktigt för att samla in representativ information om bytet konsumeras. Detta är särskilt avgörande, om ingen DNA av bytesdjur för konsumenten är tänkt för att livnära sig på kan vara upptäckta25,27. När du förbereder primärvården (steg 3.1, 5.1.1 och 5.1.2) är det dessutom avgörande att blandningen och protokoll som används för exakt passar de kriterier som respektive primern har angetts för en viss grupp av taxa. Annars antingen amplifiering av DNA i PCR-reaktionen kan misslyckas helt, eller DNA av taxa som inte riktade kan förstärkas samt. Därför är det obligatoriskt att använda positiva och negativa kontroller inom varje PCR kör garanterar att PCR-reaktionen arbetade och ingen förorening inträffade. Dessutom är det nödvändigt att matrisen av proverna för varje PCR-körning är dokumenterad exakt för att aktivera rätt tilldelningen av bytesdjur som konsumeras med respektive konsument förlagan. För denna uppgift behöver särskild försiktighet vidtas samtidigt samla PCR-produkter för parallella upptäckt av flera byten grupper via automatiserade fragment analyser (steg 5.2.3).
För detektion av förstärkta fragment använda agaros gelelektrofores (steg 3.2 och 3.3) agaros gel bör vara så tunt som möjligt och försiktighet måste vidtas under visuell inspektion av bilden att undvika saknas fragment med låg visuell upplösning. För resultat och en lämplig slutsats om prey förbrukning av en konsument är det viktigt att även sällan förbrukade prey taxa är att erkännas. Tjocka agaros gel minskar synbarheten av potentiellt låga mängder bytesdjur DNA och därmed minska sannolikheten för att missar sällan förbrukade bytesdjur och införa osäkerheter i slutsatserna från analysen. Dessutom ur ett hälsoperspektiv, med ett mindre eller icke-giftiga alternativ än etidiumbromid för färgning gelerna kan vara lämpligt. Protokollet för efterföljande ytterligare nedströms analys av förstärkta fragment via SSCP analyser med hjälp av polyakrylamidgeler innehåller några steg som ska utföras med stor försiktighet. Det är viktigt att gel kassett monteras är läckagefria (steg 4.1.3) och polyakrylamid lösningen ges tillräckligt med tid att polymerisera helt (steg 4.1.6). Öppna kassetten för tidigt kommer leda till läckande flytande akrylamid lösning och, trots att preparatet har startas från början, omfattande saneringen måste göras också. Dessutom överföra Polyakrylamidgelen in i färgning badet (steg 4.7) och därifrån till de UV tabell (steg 4,8) måste göras mycket noggrant på grund av instabiliteten i sådana geler. Annars gelen kan slita och fragment kunde störas, vilket leder till nödvändigheten av att upprepa proceduren.
En viktig förutsättning för framgångsrikt bearbetning av data som mottagits från automatiserade fragment analyser är att provets interna storlek standard nära matchar mönstret storlek standard ges av tillverkaren (steg 5.3.3) att möjliggöra bestämning av den lämpliga fragment längd. Detta är särskilt viktigt eftersom annars olika fragment, märkt med den samma fluorescerande färgning dye, kan tilldelas till de fel prey taxa och därför leda till en komplett felbedömning av predator-bytesdjur interaktioner. Elektroferogrammen visar dessutom ofta bakgrund buller. För att upprätta förtroende i tolkningen, är det viktigt att topparna av inre storlek standard är betydligt högre än bakgrundsljud av provet. Toppar för varje markör/primer bör följaktligen endast räknas om de är betydligt högre än bakgrundsbruset.
Detta protokoll kan ändras för att upptäcka flera grupper av bytesdjur taxa av intresse inom olika konsumenter av intresse. Visserligen kanske gruppspecifika primers redan inte tillgängliga för alla potentiella bytesdjur taxon av intresse. Gruppspecifika primers finns dock tillgängliga inte bara för flera sötvatten macroinvertebrate taxa28, men också för ett brett spektrum av andra taxa (t.ex. flera Marina macroinvertebrate taxa16,30 och gemensam taxa av flygande insekter31). Därmed, val av gruppspecifika primer anger lämplig att förstärka DNA av alla byten arter av ett visst taxon, men misslyckas i förstärkning av DNA från arter som inte tillhör denna taxon, är väsentliga32. Många gruppspecifika grundfärger som finns nu har angetts för ett visst område av taxa (t.ex., 130 taxa av sötvatten macroinvertebrates gemensamma i floden Rhen system28). Därför, för att undvika falskt negativa eller falskt positiva resultat, specificiteten av sådana primers bör vara rechecked för spänna av taxa vanligt i ekosystemet i intresse före sin ansökan om mål taxa och konsumenter som inte ingår i intervallet av taxa för som primers hade fastställts. Dessutom om de molekylära analyserna inte ska kombineras med andra analyser av exakt samma enskilda, dissektion av mag-tarmkanalen kan hoppas över.
Ändå, dissekera mag-tarmkanalen av större exemplaren också förhindrar fel på DNA-extraktion på grund av för mycket material och minskar förekomsten av konsument-DNA i provextraktet. Studier har dock visat att använda specifika blockerande grundfärg, som binda till DNA av konsumenten och därmed blockera det, för PCR-reaktionen kan effektivt öka förstärkningen av sällsynta sekvenser i blandade prover33. Därför kan dissekering av mag-tarmkanalen undvikas, även när man arbetar med större konsument exemplar, genom användning av särskilda blockerande grundfärg. För parallella påvisande av amplikoner som härrör från flera gruppspecifika primer uppsättningar via automatiserade fragment analyser, bör vara försiktig i valet av färgning färgämne som etikett. Därmed, bör primer uppsättningar förstärkande fragment av ungefär samma längd märkas med klart urskiljbara fluorescerande färgämnen. Dessutom finns en rad kapillärelektrofores system från flera tillverkare. Några av dessa system kan förmodligen bestämning av flera fragment även via ospecifikt färgämnen. Det protokoll som presenteras här kan enkelt justeras för att upptäcka förstärkta fragment med något av dessa system. Bortsett från det, att minska den tid som behövs för than analyserar, skulle det vara möjligt att optimera enda multiplex PCR-analyser för att förstärka DNA av bytesdjur grupper av ett fragment analys batch samtidigt (exempelvis samtidiga amplifiering av 12 byte organismer av skalbaggar34 eller upp till sex flygande insekt taxa31).
En potentiell nackdel med gut innehåll analyser i allmänhet, och därför också de analyser som beskrivs i detta protokoll, är den låga temporal upplösningen. Med sådana metoder är det endast möjligt att identifiera nyligen intagna organismer, som kan leda till osäkerhet i betydelsen av enstaka byte organismer2. Vi visade dock att genetisk analys enligt detta protokoll kan enkelt kombineras med analyser av stabila isotoper (δ15N och δ13C) exakt samma konsument exemplar25,27. Som tid-integrera naturliga spårämne av predator-bytesdjur interaktioner, stabil isotopanalyser används ofta för att karakterisera näringsväven strukturer1, men potentiella överlappande isotopiska värden från olika bytesdjur hindra ofta en exakt definition av predator-bytesdjur interaktion2. Därför använder det här protokollet för genetiska analyser i kombination med stabil isotopanalyser för att övervinna nackdelarna med varje metod kan ytterligare vår förståelse av näringsvävar och deras förhållande till näringsämne eller energi flöden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Silke Classen från forskningsinstitutet för ekosystemanalys och bedömning (gaiac), RWTH Aachen för hennes hjälp i etableringen av de gruppspecifika primer uppsättningar används i detta protokoll. Vi tackar också Peter Martin och Laura Schynawa från universitetet i Kiel för samarbetet i vatten kvalster experiment. Vi tackar också tekniska lab assistenterna för att hålla labbet friktionsfritt och förbereda registret över företag och katalognummer. Detta arbete stöds av den tyska forskningsfondens (DFG; projekt GE 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
- Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
- Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
- Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
- Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
- Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
- Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
- Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
- Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
- Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
- Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
- Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
- Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
- Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
- Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
- Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
- Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
- Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
- Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
- Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
- Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
- Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6 (2007).
- Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
- Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
- Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
- Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831 (2007).
- Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).
- Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
- Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12 (2008).
- Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).
