Summary
動物の最も一般的な腸内容の分析は、視覚的な。餌生物の形態の多様性についての強烈な知識を必要とする、彼ら柔らかい bodied 獲物を逃すし、獲物の強力な粉砕により、ヨコエビ類を含むいくつかの生物はほぼ不可能。昆虫の詳細な斬新な遺伝的アプローチ獲物ヨコエビの国会で身分証明書を提供します。
Abstract
食物網の分析は、生態系の理解を深めるために不可欠です。たとえば、食物網の相互作用は、非在来種の侵入によって引き起こされる深刻な変更を受けることができます。ただし、フィールドの捕食者-被食者相互作用の正確な同定は多くの場合困難であります。これらの分析は、腸内容の視覚的評価や安定同位体比 (δ15N そして δ13C) の分析にしばしば基づいています。形態学上の多様性や捕食生物の正確な同定の障害につながる、個々 の餌生物から同位体署名このようなメソッドは、それぞれ、包括的な知識を必要です。浸軟、経口摂取と餌生物の消化によって特定の種の同定困難ため visual 腸内容分析は特に柔らかい bodied 餌生物を過小評価します。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による戦略、たとえばグループ特定のプライマー セットを使用、食物網の相互作用の調査のための強力なツールを提供します。ここでは、核リボソーム デオキシリボ核酸 (rDNA) のグループ特定のプライマー セットを使用してフィールドから消費者を昆虫の消化管内容物を調査するための詳しいプロトコルについて述べる。DNA がすることができます (小分類) の場合全体の標本から抽出またはフィールドの標本の消化管内容物から。存在と DNA のテンプレートの機能の効率テスト個人から直接確認する必要がある普遍的なプライマーを用いた DNA のそれぞれのサブユニットをターゲットに設定します。また、ポリアクリルアミドのゲルを使用して後続の一本鎖コンフォメーション sscp 解析と変更されていないグループ固有のプライマーと PCR によって種レベルまでさらに組み合わせて消費獲物を定めることができることを示します。さらに、ラベルとして異なった蛍光染料の使用できる並列スクリーニング自動化されたフラグメント解析による複数の腸コンテンツ サンプルから別の獲物グループの DNA のフラグメントを示す.
Introduction
栄養相互作用と食物網動態の大半を占める捕食者-被食者の相互作用、物質と食物網内および生態学の主要な目標の 1 つである生態系間を通してエネルギーのフラックスを特徴付ける重要な側面1。 ソースの決意と炭素と栄養素の流れは生態系2間の生態的結合の理解を促進します。ただし、有機物および栄養素のフラックスも生物3の動きには、川などの流域の生態系はだけはリンクされません。したがって、これらのシステムをリンクしているリソースの流れを中断する生息地の変化強く変更できます両方生態系の食物網だけでなく直接、また、間接的捕食者-被食者コミュニティのそれぞれの構成を変更することによって。たとえば、単一の捕食者の種 (例えばニジマス)4の動きにリンクする食物網の変化が示されています。このような変更は潜在的生物多様性と水界生態系の機能を脅かします。したがって、フィールドにおける捕食者-被食者の相互作用の分析水生生態系のネイティブの生物多様性、水管理など、人為的な環境変化の影響を判断することが不可欠です。
栄養連携を追跡は複雑なシステムで難しいので、フィールド5の相互作用の評価を有効にするいくつかのアプローチを確立されています。従来、供給分野における相互作用の調査は切り裂かれた根性のままに獲物の視覚的な識別に基づいています、獲物の形態学的多様性に関する広範な知識を必要とします。視覚的腸内容分析は消費者 (例えばの季節変動ダイエット ロブスター6魚7,8または餌の好みのカイアシ類) のいくつかのグループのリソースの使用に洞察力を提供しています。ただし、消化の物理的なプロセスは visual 腸内容分析を困難、通常柔らかい bodied 獲物生物9をミスします。種の液体摂取によって餌または集中的に摂取、ヨコエビ類のような前に餌を comminute いくつかの無脊椎動物の消費者のため消化管内容物の餌種の視覚的な識別は不可能10です。これらの制限のための分子解析は、有望な代替手段を提供します。
分子解析は、消化管内容物の迅速かつ的確な獲物の検出を許可する一般的なツールとなっています。このような技術の範囲は多様な: モノクローナル抗体またはポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に基づく戦略頻繁にされる、彼らの高い特異性と感度11のため。新しいモノクローナル抗体の開発は時間とコストがかかる、抗体が11を既に存在しない場合したがって、他の分子技術の応用はより便利です。デオキシリボ核酸 (DNA) のように普遍的なプライマーを使用して、ほとんどの種で現在の ribosomal リボ核酸 (RNA) 遺伝子の領域の増幅は12,13を設定する一般的な方法です。この手法を使用して、頻繁にしない DNA14の混在のソース内の餌生物の全範囲を特定することが可能です。このような欠点を避けるために効果的な方法は、グループ特定のプライマーを使用する遺伝的腸内容分析の設定です。特定のターゲット グループの DNA 領域だけを増幅し、すべて他種15,16を除外するように設計、グループ特定のプライマーはせず指定したグループの分類学的レベルの餌生物の同定を有効にします。時間とコストのかかる二次分析。ただし、すべての腸の内容分析のようなそのような分析は摂食行動のスナップショットのみを提供します。したがって、自然なトレーサーの時間統合 (例えば、安定同位体) の解析と分子腸内容分析を組み合わせると、有益な1,2と見なされます。
ここでは、PCR に基づく調査核リボソーム DNA (rDNA) 領域のグループ特定のプライマー セットを使用した同じ試料の安定同位体比分析と組み合わせること捕食者-被食者の相互作用の詳細な方法について述べる。Agarose のゲルの電気泳動で単一獲物グループの DNA の検出について述べる。また、プライマーの特異性より高い分類の解像度が必要なときに該当するようなグループ固有プライマーの PCR 産物のさらに下流解析のための機会を紹介します。単一鎖 DNA (ssDNA) フラグメント フォーム第三構造の一次配列17によって決定される、ためこのようなグループに固有のプライマーによって増幅断片の小さな変化は構造変化に します。このような変更は、ポリアクリルアミドゲル17,18, (種レベル) の摂餌生態のより正確な識別を有効にすると一本鎖コンフォメーション sscp 解析によって検出できます。
Agarose のゲルの電気泳動は DNA のフラグメントを視覚化し、おおよその長さ19、解像度を決定する一般的で安価なツールは DNA の量に依存し、染色染料使用20。通常、可視化はまっすぐ進む純粋な DNA のサンプルを使用する場合、獲物の少ない潜在的消費者の消化管内容物の DNA、agarose のゲルの電気泳動の結果の得点が複雑に。まだ、この検出方法は画面の 1 つのフィールドから消費者の標本数が少ないことは不可能またはいくつか獲物のグループが、得点の合併症なりますサンプル数が高いスクリーニング複数獲物イチイは非常に時間の集中的なとこの実行不可能。高感度の検出法は、さらにフラグメント21の正確な長さの定量を可能にするキャピラリー電気泳動によるフラグメントの自動分析です。ラベルとして異なった蛍光染料を使用して、検出および自動フラグメント解析22,23で対等な長さのさまざまな断片を判断をすることが可能があることいくつかのマイクロ サテライトによる研究を示した 24。したがって、また提案する複数の獲物から DNA の並列検出のための詳しいプロトコル ラベル グループ特定のプライマー セットと自動シーケンサーによる自動フラグメント解析による検出 PCR を使用してグループ。さらに、自動化されたフラグメント解析による獲物の DNA の検出がまた摂取した獲物の相対的な定量化を可能にするアプローチであることを示す事例から結果を報告する.
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Protocol
1 ですフィールドから動物を収集し、遺伝子の腸内容分析のサンプルを準備します。
。 各サイトで- 収集動物消費者単一チューブへの興味の種の個体を整理し、直接液体窒素やドライアイス腸クリアランスと DNA の分解を防ぐためにそれらを凍結します
。 注意: いくつかの動物はアルコールは、それらを殺す前に繰り返す傾向があるのでアルコールでサンプルを保存しないでください 。
- のみ使用の中型および大きい胃腸地域 (約 > 3 mm) 昆虫種の遺伝的腸内容分析試料の残りの問題は、他のプロシージャ (例えば、 安定同位体の使用できるように分析)。ミズダニのような非常に小さな分類群を調査するときこれが該当するではないことに注意してください。したがって、1.2.1、1.2.2 の手順を省略できます。
- は、個人を少し解凍そして慎重にステンレス鉗子を用いた顕微鏡下での消化管を解剖します。問題の損失を避けるために胃腸を穴をあけることを確認してください 。
- クリーン鉗子除染液を使用して各消化管の準備の後、DNA および RNA の汚染を削除します。したがって、鉗子除染液で 10 分間を、インキュベートします。その後、残留のトレースを削除し、糸くずのペーパー タオルでふいて滅菌水でそれらをすすいでください 。
- 2.0 mL 安全ロック反応への転送切り裂かれた消化管チューブ含む 440 μ L (反復的なピペットの使用のための 450 μ L 可能) 塩抽出バッファー [SEB; 0.4 M 塩化ナトリウム (NaCl) 10 mM トリス (ヒドロキシメチル)-アミノメタン2 mM エチレンジアミン四酢酸塩と塩酸 (トリス-HCl) pH 8.0、脱水 (EDTA) pH 8.0]。店でサンプルを準備 − DNA の抽出まですぐに 20 ° C。数日間内 DNA が抽出されるということを確認します 。
- 高塩抽出プロトコル 25 を使用して DNA を抽出します。
- 冷凍庫からサンプルを取る。鉗子を使って各サンプル チューブに 1 つ 5 mm ステンレス鋼ビードを追加し、常温に解凍 (RT) ベンチに凍結試料を残します。ビーズミルを使って、15 hz 1 分間試料をホモジナイズしてください 。
- スピンの遠心分離機の短い実行のサンプル。1 マイクロリットル ピペットを使用して 90 μ L (反復的なピペットの使用可能な 100 μ L) 10% ナトリウム dodecyl 硫酸塩溶液 (SDS) および 5 追加 10 mg/mL, プロテイナーゼ K の μ L
- 渦は徹底的にサンプリングし、混合物、thermomixer で 400 rpm で一定の揺れで 60 ° C で 1 時間インキュベートします。さらに、徹底的に渦サンプル溶解を促進する 10 分 。
- スピンの遠心分離の短い実行のサンプル追加 350 μ L ピペット 1 マイクロリットルと徹底的に 40 分間約 0.5 - 1 分遠心分離機のサンプルの渦 5 M の NaCl の 16,200 x g で 5 ° C
注: 行の複数のセットは、行われる必要がある、遠心分離機の温度設定必要 SDS は温度が低すぎる場合を凝集する傾向があるので (ない高い 10 ° C より) 発生するわずか 。
- 使用 1 マイクロリットル ピペット新しい 1.5 mL の反応管に約 600 μ L 上清を移す。ペレットから何も削除しないようにします 。 ステンレス鋼の茶漉しに反応管から
- チップ ステンレス ビーズ水を実行してそれらをきれいにし、10 分は徹底的に滅菌と除染液を洗い流すため除染液をシャーレにそれらをインキュベート水し、エタノールで洗浄されたビーズを保存 (> 99%、年率グレード) や再利用まで乾燥
。 注: ビーズの洗浄、直接この手順で行われる必要はないではなく、次の手順で待機時間があるときに行うことが 。
- 、1 マイクロリットルと上澄みに冷たいイソプロパノール (年率グレード) の追加 600 μ L ピペットし、慎重に数回チューブを反転します。-20 で一晩試料保存 ° C
- 冷凍庫からサンプルと 16,200 × g、室温で 20 分間遠心します。慎重に上澄みを廃棄し、糸くずのティッシュ ペーパーで慎重にチューブを乾燥します。周囲の温度が (以上 25 の ° C) 高い場合遠心上清を廃棄しながら滑りペレットを避けるために 5 ° C でメモします 。
- 洗浄の 70% のエタノールを含む DNA をペレットします。これを行うには、冷たいエタノール (70%、年率グレード) の 200 μ L を追加 16,200 x g と部屋の温度 (または必要な場合、5 の ° C) で 10 分間のサンプル 1 マイクロリットル ピペットと遠心分離機を使用しています。慎重に上澄みを廃棄し、糸くずのティッシュ ペーパーで慎重にチューブを乾燥します。10 μ L ピペットの使用は慎重に残りの上澄みをピペットに約 8 μ L に調整されます。ペレットを邪魔をしないことを確認します 。
- すべてのエタノールを蒸発するまでベンチで常温、もしくは 60 ° C で約 5-20 分のペレットを乾燥します 。
- (蒸気滅菌と DEPC 処理) ヌクレアーゼ フリー 50-100 μ L に溶解ペレット水 (ddH 2 O)、少なくとも 1 (ただしより良い結果を得るに一晩で 4 ° C) h を待つ 。
- 、メーカーによると微量分光光度計、各サンプルに含まれる DNA 量を測定する ' の指示。約 2-10 ng DNA を含む各サンプルの作業希釈を行う/μ L。 冷凍庫に原液を維持します。冷蔵庫の中に実用的なソリューションを維持し、さらにサンプルを確保する処理はまもなく行われます 。
2。最近摂取した獲物の後続の検出用 DNA 抽出物の機能的な効率を確認します
。- の存在とテンプレートの機能の効率をテスト各 DNA 抽出 (手順 1.1 に 1.3.11) ように 普遍的なプライマーを用いたそれぞれの食品のソースに適した設定 (例えば、 無脊椎動物 16 、 26) 獲物 25 , 27 の後続の検出に使用、グループ特定のプライマーとして同じ核サブユニットを対象とします。次の手順は、普遍的なプライマー セット NSF1419/20 や NSR1642/16 16 LSU の D1、D2 fw1 と LSU D1、D2 rev2 LSU D1、D2 rev4 26 の使用を参照してください。PCR の反作用は成功しているし、発生した汚染がないことを証明するために既に正常に増幅されていた DNA を含む肯定的な制御と ddH 2 O を実行各 PCR 内の DNA ではなくを含んでいる 1 つのコントロールのサンプルを使用します。
- にプライマー プライマーの最終濃度 10 μ M が含まれ、それぞれプライマー在庫ソリューション、ddH 2 O (原液の濃度) に応じて適切な量をピペット作業ソリューションを準備する
- 、1.5 mL の新鮮な反応管用マイクロ ピペットを使用しています 。
- は、この混合物、渦、Taq DNA ポリメラーゼと ddH 2 O (処理されるサンプルの数) に応じて 1.5 または 2.0 ml の反応管、反応バッファー deoxynucleotide ミックス (dNTPs) プライマーを追加します。10 μ L の PCR の反作用のための標準的な反応混合物の詳細なボリュームは 表 1 に与えられた (詳細使用する薬品の詳細は、材料の表 を参照). 番目の 9 μ L に抽出 DNA の各 1 μ L を転送する
- 使用 1 マイクロリットル ピペットe PCR チューブ (または PCR プレートの井戸) 内の標準的な反応混合物。反応管または (キャップ ストライプ) を有する板の反応の井戸を閉じます 。
- プログラム、たち: NSF1419/20、NSR1642/16 16 プライマー セットの標準的なプロトコルです: 4 分 (変性)、94 ° C に 30 94 ° C の 30 サイクル続けて s、50 ° の C (熱処理) 30 s、7290 s と 10 分のための 72 ° C で最終的な拡張の ° C。LSU のプライマー セット 26 次の使用: 4 分、94 ° C に続いて 94 ° C の 20 のためのサイクル 45 52.5 ° C、20 s s 72 ° C、90 s、および 72 ° c で 8 分間最後の拡張
- 場所 PCR チューブや、たちにプレート、サーマルサイクラーのふたを閉じ、それぞれのプログラムを起動します 。
- 準備 1.5% の agarose のゲル含有基本トリス緩衝液、ホウ酸と EDTA (TBE バッファー) agarose を使用しています。10 cm × 7.5 cm × 3 cm の全体的な寸法とゲル鋳造トレイを使用して 1.5% の agarose のゲルの準備のため三角フラスコに 0.45 g アガロースの重量を量る、30 mL の 1 x TBE バッファー (89 mM Tris をゲージにメスシリンダーを使用、pH 7.6, 89 mM ホウ酸、2 ミリメートルの EDTA、pH 8.0)、三角フラスコに注ぐ。電子レンジを使用して混合物を加熱します。大きい空気泡があるときに電子レンジを停止し、ソリューションがある 1 つだけの位相まで慎重にフラスコを旋回します 。 ソリューション約 60 ° C に冷却する
- は、水浴でフラスコを旋回します。迅速ゲル鋳造トレイに溶液を注ぐ、空気の泡を削除および櫛を挿入します。ジェルが固まるまでに約 20 分を待つ 。
- 塗り電気泳動ユニット 0.5 x TBE と挿入ゲル鋳造トレイは agarose のゲルを含んでいます。ゲル スロットが気泡の自由を確認します 。
- はミニ (プレート) の遠心分離機の短い実行オプションを使用して PCR の製品にスピンダウンします。ローディングの染料 (40% ショ糖と 0.25% ブロモフェノール ブルー) x 6 の 1 μ L の PCR の製品の各 3 μ L をミックスして agarose のゲルのゲルのスロットにロード 1 マイクロリットル ピペットを使用します。標準サイズとして各行の 1 つのスロットに 1 マイクロリットル ピペットで 100 bp の DNA の梯子の 1.5 μ L をピペットします。電気泳動ユニットの蓋を正しく取り付け、リードを電源装置に接続します。35 分の 100 V/cm でゲルを実行 染色浴を準備する
- 1 の 1,000 mL を注ぐ光不浸透性であり、正方形のプラスチック ボックスに x TBE。1 マイクロリットル ピペットと臭化エチジウムの 50 μ L を追加、プラスチックの箱のふたを閉じ、ethidium 臭化物の等しい配分を確保するためにそれを振る 。
- は、電気泳動装置からゲルを削除し、約 10 分間染色浴に入れます。その後、染色浴からゲルを取るゲルのドキュメンテーション システムの上にそれを置くし、マニュアルに従ってそれを視覚化する 。
- の存在と最近摂取した獲物の後続の検出のためのテンプレートの機能の効率の面で肯定的な結果 (十分なサイズの agarose のゲルの中で視覚のフラグメント) を示した唯一のサンプルを分析します 。
| PCR ミックス | 濃度作業ソリューション | 10 のミックスμ l の PCR 反応 | PCR の最終濃度 |
| プライマー FW | 10 μ M | 0.5 μ l | 0.5 μ M |
| プライマー RW | 10 μ M | 0.5 ・ #956l | 0.5 μ M |
| 反応バッファー (トリス-HCl、pH 8.55、16 mM (NH4) 2SO4 と 2 mM MgCl2 最終濃度 20 mM) | 1 μ M | 1 μ l | 1 μ M |
| dNTP | 10 mM | < td > 0.25 μ0.25 mM | |
| Taq のポリメラーゼ | 5 U | 0.1 μ | 0.05 U |
| ddH 2 0 | 6.65 μ l | ||
| < strong > 量反応混合物を合計 | 9 μ l | ||
| DNA | 1 μ l | ||
テーブル 1: 10 μ L の PCR 反応の標準的な反応混合物の準備のための詳しいプロトコル
。3 です最近摂取した獲物/食品ゲルの電気泳動を使用してグループ特定のプライマー セットを検出。
。- 行う PCR を使用して DNA の実用的なソリューションを抽出 (1.3.11 に 1.1 の手順に従って準備)、グループ特定のプライマー セット (ラベルが付いていない、すなわち、 変更なし) のような対象となる獲物のグループのために適切に記載されています。2.1.1 に 2.1.3 の手順 (それぞれプライマー セットの反応混合物の変化は、表 2 を参照してください)。2.1.4 のステップで与えられる標準的なプロトコルを使用して PCR を実行 (アニーリング温度それぞれプライマー セットのため、表 2 を参照).
- 実行各 PCR の消費者の種からそれぞれのターゲット グループ (肯定的な制御) と純粋な DNA を持つ 1 つの否定的なコントロールに属する試験片から純粋な DNA の 1 つのコントロールを使用します 。
- 2.1.6 に 2.1.11 の手順に記載されているアガロース電気泳動を用いた PCR 反応の成功を確認します。PCR の反作用は適切な長さの断片 (表 2 参照) が表示される場合は成功した肯定的な制御ではなく、負の制御。これらの条件の一方または両方が満たされて、PCR を繰り返します 。
- 使用アガロースゲル電気泳動、対象となる獲物のグループは (適切な長さの断片が見えるかどうかの判断) を介してテスト消費者が異なる標本によって消費されていたかどうかを検出する 2.1.6 に 2.1.11 の手順で説明するよう。低視覚解像度を持つフラグメントを欠場することを確認してください 。
- ストア PCR の製品または分析が後で実行する場合は-20 ° C で 4 ° c、さらに分析は、次の 24 時間以内に行われます場合 。
4。その後さらに下流ポリアクリルアミドゲルによる SSCP 解析を使用して消費の獲物を決定します
。- SSCP の電気泳動のための 9% アクリルアミドゲルの準備します。研究所フード作業ソリューションを準備します。
- 200 mL アクリルアミド作業ソリューションを準備、10 の 20 mL のメスシリンダーを入力
- x TBE (トリス基地の 109 g、55 g ホウ酸と 0.50 M の EDTA、pH 8.0 ddH 2 O の 1000 mL に溶解した 40 mL) と 45 mL 40% (29:1) のもう 1 つアクリルアミドのミックス。(ご利用いただけます 200 mL マーク卒業ガラス瓶はこちらも適切な) 卒業フラスコに TBE とアクリルアミドのミックスを注ぐし、ddH 2 O 200 mL マークまでを追加します。解決策は必要になるまで、冷蔵庫 (4 ° C) で働き続けます。1 週間以上古い作業ソリューションを使用しないでください 。
- は、ddH 2 O の卒業までを追加することによってそれを 10 %aps ストック溶液を調製するマーク 1 mL メスフラスコとディゾルブに過硫酸アンモニウム (APS; 使用少なくとも 0.01 g の精度でバランス) の 0.1 g の重量を量る。新鮮な反応管に因数 (約 350 μ L) を転送します
。 注: 1 つの因数は各ポリアクリルアミドゲルに必要です。残りの aliqu を保存します。-20 ° C で ots のみ必要な直前因数を解凍と 。
- 組み立ての間にスペーサー (厚さ 1.5 mm) との 2 つのガラス板、1 つの空白と 1 つの切欠きを有するガラス板 (各 20 cm × 20 cm)、妥協したゲル カセットは、ガラスの側面を実行しています。ゲル カセット ( 図 1) をじっと見つめること、左右に各 3 つのフォールド バック クリップ (32 mm) を使用します 。 ゲルの agarose の 250 mL のソリューション 2% の agarose の準備する三角フラスコ 1 x TBE バッファーの
- ミックス 5 g。熱し、その後混合冷却 2.1.6 と 2.1.7 の手順で説明するよう。迅速に正方形のプラスチックの箱の溶液を注ぐ (21 cm × 6.5 cm × 5 cm) とアガロース溶液にゲル カセット (ステップ 4.1.3) の低い方の端を置きます。正方形のプラスチック製ボックス ( 図 1) の縁に座る高さにゲル カセットの下端にフォールド バック クリップを調整します。アガロース プラグが完全に固まるまでに約 20-30 分を待っています 。
- は、60 mL のマークまでアクリルアミド作業ソリューション (ステップ 4.1.1) メスシリンダー 100 mL を記入し、溶液をビーカーに注ぐ。マイクロ ピペットを使用して、APS 原液 (ステップ 4.1.2) の 1 つの因数の 300 μ L を追加し、その後テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 37.5 μ L を追加します。迅速に、ゲルのカセットのガラス板との間の溶液を注ぐ。また、溶液を 100 mL のシリンジに注射器の噴射ヘッド調整 1,000 μ L ピペット チップとガラス板を注入します 。
- は、ガラス板の上部端に 1.5 mm 厚の標準的な櫛を注意深く挿入します。櫛は、ポリアクリルアミド ソリューションで囲む必要があります。ポリアクリルアミドゲルの重合まで約 1 時間を待ちます。ゲル重合に必要な時間が増えるので可能な限り重合中に換気を避ける
。 注: それは 3 日に冷蔵庫の中にウェットティッシュで密閉されたビニール袋内でキャストのゲルを蓄えることです 。
図 1: 画像を示す、ポリアクリルアミドゲルを注ぎを建設。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
- 配置準備、垂直電気泳動装置に電気泳動法を含むゲル カセット。塗りつぶし 0.5 x TBE とクール冷蔵サーキュレータを使用して 10 の ° c 単位の (電気泳動装置の種類) によって異なります適切な量の電気泳動の単位 。
- DNA の変性の予熱ブロック/-自転車乗り 96 ° c. 準備変性バッファーを 95% フォルムアミド (99.5 %p. a. グレード)、0.25% ブロモフェノール ブルーと 40% (w/v) ショ糖を含む 5% 水溶液 。
- は、冷蔵庫や冷凍庫からの PCR の製品を取り出して解凍します。ミニ (プレート) の遠心分離機の短い実行オプションを使用して PCR の製品をスピンダウンします。変性バッファーの 4 μ L で、PCR の製品のそれぞれ 4 μ L を混ぜます。10 分の氷水で冷却ステップの直後に続く 96 ° C で 5 分間混合物を熱
注: サンプルに読み込むポリアクリルアミドゲル (ステップ 4.5) この直後にします 。
- は電気泳動法 (ステップ 4.1.6) から櫛を取り外してマイクロ ピペットを使用して、各サンプルをゲルのスロットに完全に読み込みます。分離するフラグメントのサイズ異なりますが常に必要な 10 ° c. を実行している時間に電気泳動装置を冷却ゲルあたり 8 W で電気泳動を実行します。フラグメント サイズ約 210 の bp、約 3.5 時間の走行時間は適当です 。 染色浴を準備する
- 1 x TBE 正方形のプラスチックに光不透過性ボックスし、染色染料 (単一鎖 DNA を染色に適しています) を 30 μ l 添加の 1,000 mL を注ぐ 1 マイクロリットル ピペットと。プラスチックの箱のふたを閉じ、染色色素の等しい配分を確保するためにそれを振る 。
- は電気泳動室からゲル カセットを取り外して慎重にゲルから切欠き材ガラス板を分離します。空のガラス板からポリアクリルアミド ゲルを染色浴にスライドさせます。一定の揺れで 20 から 30 分の振動プラットフォームと染色ゲルに染色浴を配置します 。
- 染色風呂から慎重にゲルを取るし、ドキュメンテーション システムの UV テーブルの上にそれを配置します
。 注意: ゲルの不安定性により、2 人の前のステップを処理することをお勧めは。一人は UV テーブルの横にある染色浴を保持する必要がある、別の 1 つ必要があります両方の手でゲルの下に到達、それを取るし、UV テーブルの上にスライドします 。
- 蓋またはドキュメント システムのドアを閉じるし、メーカーによると写真を撮る ' s 取扱説明書.
5。複数最近摂取した自動化されたフラグメント解析を使用して並列に獲物グループを検出します
。- 消化管内容 DNA 抽出 16 グループ特定のプライマーを使用して 分析設定染色色素の変更によるラベル セットの 1 つのプライマーで、表 2 に与えられた (表 2 列のタイトル変更を参照)、並列検出メソッドを使用して、自動シーケンサー。
- (1.3.11 に 1.1 の手順に従って準備) DNA の抽出物と行為の実用的なソリューションのような各プライマー用 Pcr に別の使用は、2.1.1 に 2.1.5 (混合物の変化は 表 2 で与えられる) の手順で説明します。実行各 PCR の消費者の種からそれぞれのターゲット グループ (肯定的な制御) と純粋な DNA を持つ 1 つの否定的なコントロールに属する試験片から純粋な DNA を持つ少なくとも 1 つのコントロールを使用します 。 2.1.4 の手順で与えられる標準 PCR のプロトコルを使用してたちで
- 実行 PCRs 調整 表 2 に与えられた集合各プライマーのそれぞれの焼鈍温度 (とサイクル数).
注: 割り当てを使用、同じ DNA 反応井戸の各バッチの PCR の製品の後プールを簡素化する 16 の異なるプライマー セットと PCR フラグメント解析を自動化された 。
自動化されたフラグメント解析が完了した (表 2 参照) は、1 つのバッチに属するすべての PCRs まで-20 ° C で - ストア PCR 製品。暗闇の中で PCR の製品を維持し、それをフラグメント解析前に 1 週間以上保管しないでください 。
テーブル 2: 15 グループ特定のプライマーのペアの 2 つのバッチの詳細斎藤 ら によって確立されました。(2013) と新たに設計された Jae28S プライマーの水生動物の 16 のターゲット グループから 18 や 28 s rDNA 領域の増幅します。f、前方のプライマー。r、逆プライマー;18 歳未満、プライマーをターゲット 18 s rDNA サブユニット;28 秒、プライマーを対象 28 srDNA のサブユニット。"、Hydrobiologia、Dikerogammarus villosus (甲殻綱, Gammaridae)、' キラー エビ ' ライン川における?、768、2016 年表 S1 補足資料ページ 2、斎藤 Meike、バイエル バスティアン、ルネ ・ Gergs、(© スプリンガー国際公開スイス 2015) " スプリンガーの権限を持つ。 この表の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
- 16 プライマー セットの増幅されたフラグメントを検出する自動化されたフラグメント分析表 2 に与えられる 2 つのバッチで。内部サイズ標準を使用 (DNA サイズ スタンダード キット - 400 [バッチ B] と 600 [バッチ A]、それぞれ) フラグメントの長さを決定します。次の手順で説明するよう配列板と自動シーケンサーを準備します。材料表で与えられているよりも別のプラットフォームを使用した場合に調整する必要がありますこの手順メモ。
- 各バッチ サンプルを実行、サンプル読み込みソリューション (SLS) とそれぞれのサイズの標準を含んでいる混合物を準備します。SLS の 21.6 μ L と DNA サイズ スタンダード キット - バッチ A のサンプルと、それぞれ、SLS の 21.7 μ L と 0.3 μ L の DNA サイズ スタンダード キットあたり 600 - 0.4 μ L をピペットします。バッチ B のサンプルあたり 400
- は冷凍庫からそれぞれのバッチに属する 8 PCRs の PCR の製品を取り出して解凍します。彼らがまだ暗闇の中で保たれることを確認します 。
- は、5.2.1 の手順に記載されているそれぞれの混合物の各 22 μ L でシーケンス プレートは必要 (分析するのにサンプルの数) の井戸の数を読み込む 1 マイクロリットル ピペットを使用します。ミニ (プレート) の遠心分離機の短い実行オプションを使用して 8 の PCRs のそれぞれの PCR の製品をスピンダウンします。1 マイクロリットル ピペットとシーケンス プレートのそれぞれの井戸 8 pcr 法のそれぞれの PCR の製品につき各 1 μ L に転送します 。
- は慎重にスピンダウンするとミニ板遠心分離機の短い実行シーケンス プレート内でこの混合物、鉱物油一滴で使われていた井戸のそれぞれをオーバーレイします。250-300 μ L の DNA 分離バッファーとバッファー板のそれぞれの反応の井戸を埋める 。
- 製造業者に従ってサンプル セットアップを作成する毛細血管のシーケンサーのソフトウェアを使用して、' の指示。サンプル セットを制御し、データ (材料表 の標準サイズで使用するために十分な条件を実行するため の表 3 を参照) を処理するために使用するメソッドのシーケンスを決定する方法を割り当てます。サンプル セットアップ内のサンプル割り当て (含むの正と負のコントロールは、ステップ 5.1.1 を参照) シーケンサー プレートのサンプル割り当てと一致しているとフラグメントの適切なメソッドをそれぞれ分析が重要であることに注意してください。標準サイズを選択します 。
- は脱イオン水で濡れトレイを埋める、シーケンス プレート、バッファー ・ プレート、ぬれトレイをキャピラリーのシーケンサーに挿入します。サンプルの実行に必要な新鮮な DNA 分離ゲルの十分な量を含むゲル カートリッジを挿入します。準備されたサンプル セットアップを使用してシーケンス プレートを実行します 。
| 変性 | 別 | キャピラリー | 注入 | ||||
| 温度 | 時間 | 電圧 | 時間 | 電圧 | 時間 | ||
| サイズ標準 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 分 | 50 ° C の温度のため待機: はい | 2.0 kV | 30 s |
| サイズ標準 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 分 | 50 ° C の温度のため待機: はい | 2.0 kV | 30 s |
表 3: 材料表で与えられたサイズの標準を使用して自動化されたシーケンサーにフラグメント解析のための特別条件
。- 結果を分析する raw データをエクスポートし、フラグメント解析プログラムにそれらのデータをアップロードします。選択の標準的な染料染料カラー チャンネルを設定するのにはそれぞれのメーカーの色注文。
- 作成プログラムのマニュアルに従ってバッチ内単一グループ特定のプライマーによって増幅されたフラグメントの長さの予想範囲をアウトライン パネルを設定します 。 、データを処理する
- は、それぞれパネル、適切なサイズの標準、標準色、および解析のタイプを選択し、プロシージャを実行します。各染料の色の単一ライン トレースとしてキャピラリー電気泳動の器具から蛍光信号強度を表示するレーザービームを選択します。それぞれのフラグメント範囲を示すマーカー/プライマー セットが表示され、各と呼ばれるピークのセンターに関連付けられている検出されたフラグメントの正確な長さは、(着色または割り当てられた名前によってほとんどのプログラム) で強調表示されます自動的にします 。
- どのように密接に計算、各サンプルのサンプル ' s の内部サイズを標準サイズの呼び出しの成功を安心して選択したサイズ標準に一致します。ほとんどのフラグメント解析プログラムは、自動的に計算して、この試合を視覚化するオプションを持っています。サイズ呼び出しが失敗した場合はそれらのサンプルのフラグメント解析を繰り返します 。
- は、視覚的に各サンプルのレーザービームを再確認し、各マーカーとプライマーを別々 に設定と呼ばれる各ピークの確認/unconfirm。差し出がましいピーク マーカー/プライマー セットの条件を満たす、使用プログラムのユーザー マニュアルによると間違っているものを削除を手動で挿入します。塩基対のサイズまたは bin 名を適用、' 遺伝子ラベル '。計算や表示のピーク仕様、' ピーク テーブル ' です 。
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Representative Results
正常に、このプロトコルの異なる研究内食事分析で説明されている手順を使用しました。このセクションでは、プロトコルのさまざまなセクションの適用を記述する例を示す.
例として、著者28と SSCP 解析による PCR 産物のさらに下流解析の可能性によって確立されたグループ特定のプライマー セットの有効性を示す、給餌実験が実施されました。Dikerogammarus villosusの捕食者と獲物としてCaenis属幼虫の個体はライン川、背水のカールスルーエ (ドイツ) の近くで捕獲されました。研究室では、捕食者と獲物のイチイは 20 ° C でフィルター処理された河川水で別々 に保管された、36 時間に飢えていた。実験のため端脚類標本は、フィルター選択されたストリーム水 (100 mL)、個別にうんざりして、30 分間 2 〜 3 Caenis幼虫と、液体窒素で凍結後ビーカーに置かれました。各D. villosusの消化管は解剖し、プロトコル 1 で説明したように DNA が抽出されました。DNA の抽出はプロトコル 3 で説明するように適切な PCR プロトコル28を使用してCaenis属の検出に適したセット Caep28S プライマーでテストされました。Caenis種の増幅されたフラグメント間の相違点を確認するには、腸コンテンツ サンプルと 3 Caenis参照種の純粋な DNA のサンプルの PCR を行った。アガロース電気泳動Caenis種電気泳動 (図 2 a) のこのタイプの間で区別できない二重の鎖 DNA の単一のバンドを導いた。対照的に、SSCP ゲル電気泳動、プロトコル 4 で説明したようだった (図 2 b) 試料と腸コンテンツ サンプルを比較することによって種レベルの餌生物を識別すること。SSCP フラグメント パターン 3 参照イチイCaenis beskidensis (図 2 b、1 レーン)、 Caenis horaria (2 b を図レーン 2) の、 、 Caenis luctuosa (図 2 b、3 車線)微分可能のパターンと 4 つのバンドから成っていた。2 つの腸コンテンツ サンプル (図 2 b4 と 5 の車線) は、 c. luctuosa (図 2 b, 3 車線) と等しいフラグメント パターンを持っていた。3 番目の腸コンテンツ サンプル (図 2 b、6 車線) のフラグメント パターンc. horaria (図 2 b, 2 の車線) のそれと同一だった。2 つのシーケンス解析腸c. luctuosaとc. horaria (図 2 b、4 および 6 車線) として識別されるコンテンツのサンプルと、それぞれの関連種は、この結果を検証 (電子補足配置 fasta ファイルを参照してください)。
図 2:(A) agarose のゲル電気泳動の元の画像と (B) SSCP PCR 解析の腸内容の断片し、標準試料 Caep28S プライマー セットで増幅します。レーン 1-3 は、 Caenis beskidensis (1) Caenis horaria (2)、 Caenis luctuosa (3) 種の試料を示します。4-6 車線の端脚類Dikerogammarus villosusの異なる腸コンテンツ サンプルのフラグメント パターンが掲載されています。車線 7 は、100 bp の DNA の梯子のフラグメント パターンを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
さらに、実験室はユスリカの種Hygrobates 発生学に属するダニが供給された水だけでなく幼虫決定、ミズダニのユスリカ個人消費の DNA を検出できるかどうかに行ったしかし、DNA 検出量は獲物29の消費からの経過時間に依存する場合をテストするためにも。ダニは約 1 週間、飢えている後、各ダニは食品として 1 つのユスリカ幼虫を提供されました。各 3-4 水ダニ個人は、2、3、7、9、24、32、50 h に29供給された後、(絶対) 1 双翅目家族ユスリカ28に固有の Chiro18S のプライマー セットを使用して遺伝学的解析のため、エタノールで修正されました。次の 5 つの餌のカテゴリに分類されたそれぞれの獲物個人水ダニ個人消費の程度として: 1 = 完全に吸い込ま、外皮が完全に空に (> 90%)、2 をほぼ完全に吸い込ま = (>75-90%)、3 = 半吸い出さ (> 50-75%)、4 = だけが部分的に吸い出さ (> 5-50%), 5 = 獲物の体構造 (≤5%)29で目に見える変化はありません。1.2.1、1.2.2 の手順) を除いたプロトコル 1 で説明したように水ダニから抽出された DNA、抽出液中の 18 s rDNA の存在とテンプレートの機能の効率は、プロトコル 2 で説明したように確認されました。DNA はプロトコル 4 Chiro18S のみを使用して前方のプライマーとプライマーが付いた沿って行われた獲物の検出蛍光染料 (表 2参照) と DNA サイズ スタンダード キット - 400。自動シーケンサー、サンプルのピーク高さとのピーク高さの比の異なる実行中のサンプル間の比較分析を許可するように、内部標準に最も近い (すなわち、360 この場合 bp) 各サンプルの計算され、として使用検出された DNA の量のためのプロキシ。結果、 Hygrobates 産地ユスリカ幼虫29供給の事実上すべての個人でユスリカの DNA ができた。最長期間を最短の間隔 (授乳後 1 h) から有意 (50 h) 検出された獲物 DNA の相対量を給餌後は、(図 3 a)29を減少します。さらに、DNA がある可能性があります餌の摂取量のプロキシとして餌後と獲物分類との関係は、(図 3 b)29を確認しました。削減は獲物らしい餌後時間の増加とともに検出された DNA DNA の分解と獲物の消化によって完全に反映、神の DNA を捕食するので、水のダニ29で肛門の不足のため非常にもっともらしい。これらの結果は、摂取した餌の定量化のためのこのアプローチの適合性を確認します。
図 3:ダニと (B) 供給カテゴリの授乳後時間の国家 ln 高さ比 (サンプル ピーク高さ/標準360ピーク高さ) と (A) の関係 (n = 23)。「実験および適用だに、の最初の検出捕食Hygrobates 産地(Hydrachnidia、ダニ) の DNA: 水ダニ捕食者-被食者の関係を決定するための新しいアプローチ 67, 376、r. Gergs、l. Schynawa、m. 斎藤 P. マーティン (©スプリンガー国際 Switzerl を公開・ 2015)"スプリンガーの権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
分子によって促進されたD. villosusと潜在的な食料資源の N δ13C のフィールド、集中的な安定同位体比分析に端脚類侵襲D. villosus捕食の重要性と δ15を検討するには正確な同一個体の消化管内容物中で最近摂取した獲物を検出します。合計では、206 のD. villosus個人別のサイトから収集された個々 の消化管は解剖し、プロトコル 1 によると DNA が抽出されました。存在と使用するテンプレートの機能の効率は、プロトコル 2 で説明したように保証されました。複数の昆虫餌分類群にD. villosus個人によって最近の捕食は、プロトコル 4 で説明したようにテストされました。全体的に、 D. villosus消化管内容物のわずか 16 %16 対象昆虫餌分類群に属する dna 陽性、したがって低捕食性の摂食行動を示す安定同位体分析の結果をサポートフィールド27端脚類侵襲。一方、遺伝的解析内 12 テスト餌分類群の DNA は少なくとも 1 腸コンテンツ サンプルで発見された、餌 4 分類群の DNA は検出された (図 4)27をなかった。
図 4:昆虫の腸内容が陽性のすべての 10 サイトからD. villosus個人のそれぞれの数を示すヒストグラム獲物 DNA 。PCR を行った 16 グループ特定のプライマー セットで示される。「Hydrobiologia、'キラー エビ' Dikerogammarus villosus (甲殻綱, Gammaridae) は、ライン川システムで? 768、2016 年 310、斎藤 Meike、バイエル バスティアン、ルネ ・ Gergs、(© スプリンガー国際公開スイス 2015)」許可を得てスプリンガー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足ファイル。Sequence_alignement_feeding_trial.fastaこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、簡単かつコスト効率の高い PCR に基づく同じ標本の他の非分子分析と組み合わせることができます rDNA 領域のグループ固有プライマーを介してフィールド サンプルから捕食者-被食者相互作用の決定法を提案する.ただし、プロトコルの中でいくつかの重要な手順があります。まず、使用されるプライマーの特異性を保証することは不可欠です。第二に、それは胃腸管の準備、その後の DNA の抽出の間に汚染や腸のコンテンツの材料の損失を避けるために重要です。クロス サンプルの汚染は、獲物の DNA の誤検出につながることができます、腸の材料はほとんど行方不明につながる可能性がありますコンテンツの損失は餌種を消費しました。それぞれのサブユニットと解析 (プロトコルのセクション 2) 用のテンプレートの機能の効率に属する rDNA の存在の検証は、摂餌量に関する代表的な情報の収集に不可欠です。これは、特に消費者を餌になって捕食グループの DNA が検出された25,27できますない場合、非常に重要です。さらに、Pcr (ステップ 3.1、5.1.1 5.1.2) を準備するときは、混合物と正確に使用されるプロトコルがそれぞれプライマーはイチイの特定のグループに指定されている基準に適合が重要です。それ以外の場合、PCR の反作用の内で DNA の増幅が完全に失敗するまたはない対象分類群の DNA をも増幅する可能性があります。したがって、正を使用する義務が、各 PCR 内のマイナス コントロール実行 PCR 反応を保証するために働いた、汚染が発生していません。さらに、PCR の実行ごとにサンプルの配列はそれぞれ消費者試験片に消費される獲物の正しい割り当てを有効にすると正確に書かれている必要があります。このタスクでは、特定の警告は自動化されたフラグメント解析 (ステップ 5.2.3) 経由で複数の獲物グループの並列検出のための PCR の製品をプールしながら撮影する必要があります。
Agarose のゲル電気泳動法 (手順 3.2 と 3.3) agarose を使用して増幅断片の検出のためのゲルはできるだけ薄くする必要があります、低視認解像度を持つフラグメントの欠落を回避するイメージの検査中にように注意しています。結果、消費者が捕食量について適切な結論もほとんど消費餌分類群が認識されていることが重要です。厚い agarose のゲルは、潜在的に低量の獲物 DNA の可視性を減少させるし、ほとんど消費獲物を逃すし、分析から導いた結論の不確実性を導入する確率を減らします。さらに、健康の観点から、ゲルの汚損のため臭化エチジウムより少ないまたは非毒性の代替を使用してお勧めできます。その後さらに下流解析は、ポリアクリルアミドゲルを用いた SSCP 解析を介して増幅断片のためのプロトコルには、特定の注意して実行する必要がありますいくつかの手順が含まれています。組み立てゲル カセットは防漏 (ステップ 4.1.3) ポリアクリルアミド ソリューションが完全に重合を十分な時間を与えられることが重要です (ステップ 4.1.6)。カセットをあまりにも早く開く液体アクリルアミド ソリューションをリークしが同様に行われるクリーンアップ広範な初めから開始する、準備をしているという事実にもかかわらず、 します。(ステップ 4.7) 染色浴とこのようなゲルの不安定性のために非常に慎重に行う必要がある UV テーブル (手順 4.8) にそこからさらに、ポリアクリルアミドのゲルの転送。そうでなければ、ゲルを引き裂くかもしれないし、フラグメントが中断することも、手順を繰り返す必要性に 。
自動化されたフラグメント解析から受信したデータを正常に処理するための主要な要件の 1 つはサンプルのサイズが内部標準は、密接の測定を有効にする (ステップ 5.3.3) 製造業者によって与えられたサイズ標準パターンを一致すること、適切なフラグメントの長さ。そうでなければ、同じ蛍光染料を染色でラベル付け、さまざまな断片間違った餌分類群に割り当てられている可能性があります、したがって捕食者-被食者の相互作用の完全な誤審につながるために、これは特に重要です。さらに, エレクトロフェロはしばしばバック グラウンド ノイズを示します。解釈で信頼を確立するには、それは内部サイズ標準のピークがサンプルのバック グラウンド ノイズより有意に高いことが不可欠です。したがって、各マーカー/プライマーのピークは、彼らがバック グラウンド ノイズよりも有意に高い場合にのみカウント必要があります。
このプロトコルは興味の様々 な消費者の関心の餌分類群のいくつかのグループを検出して変更できます。確かに、プライマー グループ特定できない場合がありますすでに関心のすべての潜在的な獲物の分類のため。それにもかかわらず、グループ特定のプライマーがいくつか淡水昆虫分類群28、他の分類群の広い範囲のためにも利用できる (例えば、いくつか海洋昆虫分類群16,30と飛行昆虫31の一般的な分類)。それにより、グループ特定のプライマーの選択を与えられた分類群のすべての餌生物の DNA を増幅する適切な設定しますがこの分類群に属していない種から DNA の増幅に成功したの必須32ではありません。利用可能になりました多くのグループ固有のプライマーは、イチイ (例えばライン川システム28で一般的な淡水動物の 130 のイチイ) の特定の範囲の指定されています。したがって、偽陰性や偽陽性の結果を避けるために、このようなプライマーの特異性をターゲット及び消費者の分類の範囲に含まれないため、アプリケーションの前に利益の生態系における一般的な分類群の範囲を再確認する必要があります。プライマーが確立されていた。さらに、それらの分子の解析を併用しない場合消化管の正確な同じ個人、郭清の他の解析をスキップ可能性があります。
しかし、あまりにも多くの材料のための DNA の抽出の失敗を防ぐことができます大きい標本の消化管の解剖も、サンプル抽出物の消費者 DNA の存在感を減少します。しかし、研究は、特定のブロックのプライマーを使用すると、消費者の DNA を付けるし、それにより PCR 反応をブロックして、効果的に強化できます混合サンプル33のまれなシーケンスの増幅を示しています。したがって、消化管の解剖を回避できます、大きい消費者標本を扱う場合でも特定のブロックのプライマーの使用によって。自動化されたフラグメント解析を介して複数のグループ特定のプライマー セットから派生した産物の並列検出のためのラベルとして色素を染色の選択に注意をすべき。これにより、およそ同じ長さの断片を増幅するプライマー セットを明確に区別できる蛍光染料でラベルされるべき。さらに、複数の製造業者から利用できるキャピラリー電気泳動システムの範囲があります。これらのシステムのいくつかはおそらく非特異的染料経由でも複数のフラグメントを決定をできます。ここで提示されたプロトコルは、これらのシステムのいずれかで増幅されたフラグメントを検出する簡単に調節できます。それから離れて、t に必要な時間を短縮するには彼を分析、それは同時に 1 つのフラグメント解析バッチの獲物グループの DNA を増幅する単一マルチプレックス PCR の試金を最適化することが可能 (例えば、同時増幅 12 の摂餌生態カブトムシ34または六つの飛行までの昆虫イチイ31)。
潜在的な不利な点は一般に、内容分析を腸、従ってまたこのプロトコルで記述されている分析は時間分解能が低い。このようなメソッドは、単一の餌生物2の重要性の不確実性につながる可能性があります最近摂取した生物を識別することだけです。しかし、我々 はこのプロトコルによると遺伝学的解析は正確な同じ消費者標本25,27の安定同位体 (δ13C と δ15N) の解析と簡単に組み合わせることができます実証。捕食者-被食者の相互作用の時間統合自然トレーサー、食物網構造1を特徴付ける、安定同位体比分析を頻繁に潜在的な重複する同位体値が異なる餌種からしばしば正確な支障なく捕食者-被食者相互作用2の定義。したがって、安定同位体比分析との組み合わせでの遺伝学的解析のこのプロトコルを使用して、さらに食物網と栄養素やエネルギーのフラックスの関係の私達の理解の各方法缶の欠点を克服するために。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
研究所からシルクはクラッセンは、生態系の解析と評価 (ガイアウッド)、このプロトコルで使用されるグループ特定のプライマー セットの確立で彼女の援助のため RWTH Aachen を感謝いたします。我々 はまたミズダニの実験でピーター ・ マーティンと協力のキール大学からローラ Schynawa をありがとうございます。スムーズに実行し、企業とのカタログ番号の登録の準備のラボの維持の技術研究室助手を感謝いたします。この作品は、ドイツ研究振興協会 (DFG; プロジェクト GE 2219/3-1) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
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