Summary
Vanligste gut innhold analyser av macroinvertebrates er visuelle. Krever intens kunnskap om morfologiske mangfold av byttedyr organismer, de savner myk bodied byttedyr og på grunn av sterk comminution av byttedyr, er nesten umulig for noen organismer, inkludert amfipoder. Vi gir detaljert, romanen genetiske metoder for macroinvertebrate byttedyr identifikasjon i kostholdet av amfipoder.
Abstract
Analysere næringskjeder er avgjørende for en bedre forståelse av økosystemene. For eksempel kan næringskjeden interaksjoner gjennomgå alvorlige endringer forårsaket av invasjonen av ikke-stedegne arter. Men er en nøyaktig identifikasjon av feltet predator-byttedyr interaksjoner vanskelig i mange tilfeller. Disse analysene er ofte basert på en visuell vurdering av tarmen innhold eller analyse av stabil isotop prosenter (ses15N og ses13C). Slike metoder krever omfattende kunnskap om, henholdsvis morfologiske mangfold eller isotopanrikning signatur fra personlige byttedyr organismer, fører til hindringer i nøyaktig identifikasjon av byttedyr organismer. Visuelle gut innhold analyser undervurdere spesielt myk bodied byttedyr organismer, fordi maserasjon, fordøyelse og fordøyelse av byttedyr gjøre identifikasjon av spesifikk arter vanskelig. Derfor polymerase kjedereaksjon (PCR) basert strategier, for eksempel bruk av gruppespesifikke primer sett, gir et kraftig verktøy for etterforskningen av næringskjeden interaksjoner. Her beskriver vi detaljerte protokoller for å undersøke gut innholdet macroinvertebrate forbrukere fra feltet bruker gruppespesifikke primer sett for kjernefysisk ribosomal deoksyribonukleinsyre (rDNA). DNA kan være Hentet fra hele eksemplarer (i tilfelle av små taxa) eller fra tarmen innholdet av samlet i feltet. Tilstedeværelse og funksjonelle effektivitet DNA malene må bekreftes direkte fra den testede enkelt bruker universell primer sett målretting den respektive delenhet i DNA. Vi viser også at brukte byttedyr kan bestemmes videre til arter nivå via PCR med uforandret gruppespesifikke primere kombinert med påfølgende enkelt tråd konformasjon polymorfisme (SSCP) analyser bruker polyakrylamid gels. Videre viser vi at bruk av ulike fluorescerende fargestoffer som etiketter kan parallelle screening for DNA fragmenter av ulike byttedyr grupper fra flere gut innhold prøver via automatisert fragment analyse.
Introduction
Predator-byttedyr interaksjoner, som utgjør flertallet av trophic interaksjoner og næringskjeden dynamikk, er viktige aspekter å karakterisere flukser av materie og energi gjennom næringskjeder innenfor og mellom økosystemer, som er en av de viktigste målene for økologi 1. fastsettelse av kilden og flyt av karbon og næringsstoffer er fremme forståelsen av økologiske tilkobling mellom økosystemer2. Imidlertid er økosystemer, som elver og deres nedbørfelt, ikke bare koblet av flukser av organisk stoff og næringsstoffer, men også av bevegelser av organismer3. Dermed kan habitat endringer forstyrre flyten av ressurser som kobler disse systemene sterkt endre næringskjeder både økosystemer, ikke bare direkte, men også indirekte ved å endre respektive sammensetningen av predator-byttedyr samfunn. For eksempel vist endringer av næringskjeder seg å være knyttet til bevegelser av enkelt predator arter (f.eks, regnbueørret)4. Slike endringer truer potensielt biologisk mangfold og funksjon av akvatiske økosystemer. Analysere predator-byttedyr interaksjoner i feltet er derfor viktig å fastslå effekten av menneskeskapte miljømessige endringer, for eksempel vann forvaltningspraksis på det opprinnelige biodiversitet av akvatiske økosystemer.
Siden sporing trophic sammenhengene er vanskelig i komplekse systemer, har flere tilnærminger blitt etablert som aktiverer vurdering av fôring interaksjoner i feltet5. Tradisjonelt undersøkelser av fôring interaksjoner i feltet er basert på visuell identifikasjon av byttedyr i dissekert guts og krever en omfattende kunnskap om morfologiske byttedyr mangfold. Visuelle gut innhold analyser har gitt innsikt i ressursbruk av flere grupper av forbrukerne (f.eks sesongvariasjon i kostholdet i hummer6 og fisk7,8 eller fôring valg av Raudåta). Men fysisk prosessen med fordøyelsen gjør visuelle gut innhold analyser vanskelig og vanligvis bommer myk bodied byttedyr-organismer9. Arter fôring av flytende inntak eller noen virvelløse forbrukere som intenst comminute maten før svelging, som amfipoder, er visuell identifikasjon av byttedyr i tarmen innholdet umulig10. På grunn av disse begrensningene er molekylær analyse et lovende alternativ.
Molekylær analyser har nå blitt et vanlig verktøy tillater rask og presis byttedyr oppdagelsen i tarmen innholdet. Slike teknikker er mangfoldige: strategier basert på monoklonale antistoffer eller polymerase kjedereaksjoner (PCR) blir ofte brukt, på grunn av deres høy spesifisitet og følsomhet11. Utviklingen av nye monoklonale antistoffer er tid - og kostnadskrevende, derfor bruk av andre molekylære teknikker er mer nyttig når antistoffer ikke allerede finnes11. En annen felles tilnærming er forsterkning av regionene i deoksyribonukleinsyre (DNA), som ribosomal ribonukleinsyre (RNA) gener i de fleste arter, bruker universell primer angir12,13. Når du bruker denne teknikken, er det ofte ikke mulig å identifisere hele spekteret av byttedyr organismer i blandet kilder DNA14. En effektiv tilnærming til å unngå slik en ulempe er å bruke gruppespesifikke primer sett for genetisk gut innhold analyser. Utviklet for å forsterke bare DNA regioner i bestemte målgrupper og utelukke alle andre arter15,16, aktiverer gruppespesifikke primere identifisering av byttedyr organismer på taksonomisk nivået på de angitte gruppene uten tid - og kostnadskrevende sekundære analyser. Men som alle gut innholdsanalyse, gi slike analyser bare et øyeblikksbilde av fôring atferd. Derfor regnes kombinere molekylær gut innhold analyser med analyser av tid-integrere naturlig tracers (f.eks isotoper) gunstig1,2.
Her beskriver vi en detaljert metode for PCR-baserte undersøkelser av predator-byttedyr interaksjoner ved hjelp av gruppespesifikke primer sett for kjernefysisk ribosomal DNA (rDNA) regioner kombineres med stabil isotop analyser av samme prøven. Vi beskriver oppdagelsen av DNA av enkelt bytte grupper via agarose gel geleelektroforese. I tillegg presenterer vi en mulighet for videre nedstrøms analyser av PCR produkter av slike gruppespesifikke primere gjelder når en høyere taksonomisk oppløsning enn primerne spesifisitet er nødvendig. Fordi enkelt strandet DNA (ssDNA) fragmenter skjemaet tertiær konformasjonen som bestemmes av deres primære sekvens17, føre små variasjoner i fragmenter forsterket av slike gruppespesifikke primere til conformational endringer. Slike endringer kan oppdages ved enkelt tråd konformasjon polymorfisme (SSCP) analyser med polyakrylamid gels17,18, muliggjør en mer nøyaktig identifikasjon av byttedyr organismer (ned til arter nivå).
Mens agarose gel geleelektroforese er en vanlig og rimelig verktøy for å visualisere DNA fragmenter og bestemme deres omtrentlig lengde19, oppløsningen avhenger av mengden av DNA, og flekker fargestoff brukt20. Vanligvis visualisering er rett frem når du arbeider med ren DNA-prøver, men potensielt lave mengder byttedyr DNA i tarmen innholdet forbrukere kan komplisere scoring av agarose gel geleelektroforese resultater. Likevel denne oppdagelsen metoden er mulig å skjermen et lavt antall forbruker prøver fra feltet en eller noen byttedyr grupper, men komplikasjon i scoring gjør screening av et høyt antall prøver i flere byttedyr taxa tid svært intensiv og dermed upraktisk. En mer følsomme gjenkjennings-metoden er automatisk analyse av fragmenter via kapillært geleelektroforese, som i tillegg lar fastsettelse av den nøyaktige lengden fragmenter21. Flere mikrosatellittmarkør basert studier har vist at ved å bruke ulike fluorescerende fargestoffer som etiketter, er det mulig å oppdage og finne ulike fragmenter av sammenlignbare lengde ved automatisert fragment analyse22,23, 24. Derfor presentere vi også en detaljert protokoll for parallell oppdagelsen av DNA fra flere byttedyr grupper bruker PCR med merket gruppespesifikke primer sett og gjenkjenning via automatisert fragment analyse med en automatisert sequencer. I tillegg presenterer vi resultatene fra en studie viser at påvisning av byttedyr DNA via automatisert fragment analyse er en tilnærming som en relativ kvantifisering av inntatt byttedyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samle Macroinvertebrates fra feltet og forberede prøvene genetisk Gut innhold analyser.
- Samle macroinvertebrates på hvert område, sortere ut individer av forbrukernes interesse i enkelt rør, og direkte fryse dem i flytende nitrogen eller tørris å hindre gut klarering og nedbrytning av DNA.
Merk: Unngå å lagre prøver alkohol, fordi noen macroinvertebrates pleier å regurgitate før alkohol dreper dem. - Bare bruke mage-tarmkanalen av mellomstore og store (ca > 3 mm) macroinvertebrate arter for genetisk gut innhold analyser slik gjenværende saken av prøven kan brukes for andre prosedyrer (f.eks stabil isotop analyse). Merk at dette ikke gjelder når undersøke liten taxa som vann midd. Derfor trinn 1.2.1 og 1.2.2 kan hoppet.
- Tine litt privatperson og analysere nøye sin gastro-intestinal område under en stereomicroscope ved hjelp av fine rustfritt stål pinsett. Sørg for ikke å punktere gastro-intestinal område for å unngå tap av materie.
- Rene tang bruker dekontaminering løsning for å fjerne DNA og RNA forurensing etter utarbeidelse av hver mage-tarmkanalen. Derfor ruge tang for 10 min i dekontaminering løsningen. Etterpå, skyll med sterilt vann for å fjerne gjenværende spor og tørk dem med en lofri tørkepapir.
- Overføring dissekert fordøyelsessystemet til en 2.0 mL safe-lock reaksjon rør som inneholder 440 µL (450 µL mulig bruk av repeterende pipette) salt avstamning buffer [SEB; 0,4 M natriumklorid (NaCl), 10 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) pH 8.0 og 2 mM ethylenediaminetetraacetic syre disodium salt tørke (EDTA) pH 8.0]. Store forberedt samples ved − 20 ° C umiddelbart til utvinning av DNA. Sikre at DNA ville være utdraget innen et par dager.
- Bruker en modifisert høy-salt utvinning protokollen 25 å pakke ut DNA.
- Ta prøver ut av fryseren. Bruk tang legge en 5 mm rustfritt stål perle til hver eksempel rør, og la frosne prøvene på benken ved romtemperatur (RT) å tine. Bruk en perle mill til homogenize prøver for 1 min på 15 Hz.
- Nedspinning prøver med et kort løp av en sentrifuge. Bruker mikroliter Pipetter til 90 µL (mulig for bruk av repeterende Pipetter 100 µL) 10% natrium dodecyl sulfat løsning (SDS) og 5 µL av 10 mg/mL proteinasen K.
- Vortex prøver grundig og ruge blandinger 1t på 60 ° C med konstant rister på 400 rpm på en thermomixer. I tillegg grundig vortex prøver hvert 10 min å fremme lysis.
- Spinn ned prøver med et kort løp for en sentrifuge, legge til 350 µL av 5 M NaCl mikroliter pipette og vortex grundig for ca 0,5 - 1 min. sentrifuge prøver for 40 min 16,200 x g på 5 ° C.
Merk: Hvis flere sett på rad har å bli gjort, temperaturinnstillingen på sentrifugen må heves litt (ikke høyere enn 10 ° C) fordi SDS tendens til å flocculate hvis temperaturen er for lav. - Bruk mikroliter Pipetter overføre ca 600 µL supernatant til en ny 1,5 mL reaksjon tube. Vær forsiktig med å fjerne alt fra pellet.
- Tips rustfritt stål perler av reaksjon rør i en rustfritt stål te sil, rengjøre dem med rennende vann og ruge dem i en Petriskål med dekontaminering løsning for 10 min. skyll grundig rensing løsningen med sterilt vann og lagre renset perler i etanol (> 99%, PA klasse) eller tørr før gjenbruk.
Merk: Rengjøring av perler trenger ikke å gjøres i denne steg direkte, men heller kan gjøres når det er ventetid i fremgangsmåten. - Legge til 600 µL av iskalde isopropanol (pa grad) til nedbryting med en mikroliter Pipetter og Inverter nøye røret et par ganger. Lagre prøver overnatting på -20 ° C.
- Ta prøver ut av fryseren og sentrifuge dem for 20 min på 16,200 × g og romtemperatur. Forsiktig kaste nedbryting og tørr røret med lofri papir. Merk at hvis omkringliggende temperaturen er høy (mer enn 25 ° C), sentrifuge på 5 ° C til unngå pellets gli mens forkaster nedbryting.
- Vask pellets med DNA med 70% etanol. Vil legge 200 µL av iskalde etanol (70%, PA klasse) bruker mikroliter pipette og sentrifuger prøver i 10 min på 16,200 x g og romtemperatur (eller 5 ° C, hvis nødvendig). Forsiktig kaste nedbryting og tørr røret med lofri papir. Bruk en 10 µL pipette justert til ca 8 µL å nøye Pipetter av gjenværende nedbryting. Sørg for ikke å forstyrre pellet.
- Tørr pellet i ca 5-20 minutter ved 60 ° C eller ved romtemperatur på benken til alle etanol er fordampet.
- Oppløsning pellet i 50-100 µL nuclease-fri (operasjonsområdet og DEPC behandlet) vann (ddH 2 O), vente minst 1 h (men bedre resultater oppnås over natten på 4 ° C).
- Måle mengden av DNA som finnes i hvert utvalg med et micro-volum spektrofotometer, ifølge produsenten ' s instruksjoner. Lage en arbeider fortynning av hvert utvalg som inneholder ca 2-10 ng DNA / µL. Hold lager løsningen i fryseren. Holde arbeider løsningen i kjøleskapet og sikre den ytterligere prøven behandlingen skjer snart.
2. Kontroller funksjonelle effektivitet av DNA-ekstrakter for senere gjenkjenning av nylig inntatt byttedyr.
- å sikre tilstedeværelsen og funksjonelle effektivitet maler teste hver DNA ekstrakt (trinn 1.1 å 1.3.11) ved hjelp av universal primer angir egnet for respektive maten kilden (f.eks virvelløse dyr 16 , 26) som er rettet mot den samme kjernefysiske delenhet som gruppespesifikke primer, brukes for senere gjenkjenning av byttedyr 25 , 27. Følgende trinn gjelder bruk av universal primer sett NSF1419/20 og NSR1642/16 16 og LSU D1, D2 fw1 og LSU D1, D2 rev2 eller LSU D1, D2 rev4 26. For å bevise at PCR reaksjonen har vært vellykket og at ingen kontaminering oppstår, bruke en positiv kontrollen som inneholder DNA som hadde allerede blitt forsterket med hell og én kontroll prøve som inneholder ddH 2 O i stedet for DNA i hver PCR kjøre.
- å forberede primer arbeider løsninger som inneholder et endelig konsentrasjon 10 µM av primer, Pipetter riktig mengde respektive primer lager løsning og ddH 2 O (avhengig av konsentrasjonen av lager løsningen) i en frisk 1,5 mL reaksjon tube med Mikropipetter.
- Legge primere, deoxynucleotide mix (dNTPs), reaksjon buffer, Taq DNA utvalg og ddH 2 O i en 1.5 eller 2.0 mL (avhengig av antall eksempler som skal behandles) reaksjon rør, så vortex denne blandingen. Detaljert volumer for standard reaksjonsblandingen for en 10 µL PCR reaksjon er gitt i tabell 1 (for detaljer om kjemikalier som brukes, se Tabell av materialer).
- Bruk mikroliter Pipetter overføre hver 1 µL av DNA ekstra i 9 µL av the standard reaksjonsblandingen i et PCR-rør (eller et godt av en PCR-plate). Lukk reaksjon tube eller reaksjon brønnene på platen (med cap striper).
- Program thermocycler: standard-protokoll for NSF1419/20 og NSR1642/16 16 primer sett er: 94 ° C i 4 min (rødsprit), etterfulgt av 30 sykluser av 94 ° C for 30 s, 50 ° C (annealing temperatur) for 30 s, 72 ° C for 90 s og endelig utvidelse ved 72 ° C i 10 min. For LSU primer sett 26, bruk følgende: 94 ° C i 4 min, etterfulgt av 45 sykluser av 94 ° C for 20 s, 52.5 ° C for 20 s, 72 ° C i 90 s, og en endelig utvidelse ved 72 ° C i 8 min.
- Sted PCR rør eller platene i thermocycler, stenger lokket på cycler, og start programmet respektive.
- Forberede en 1,5% agarose gel med en buffer løsning med Tris base, borsyre og EDTA (TBE buffer) og agarose. For utarbeidelse av en 1,5% agarose gel, bruke en gel avstøpning brett med dimensjoner på 10 cm x 7,5 cm × 3 cm, veie 0,45 g agarose i en konisk kolbe, bruke en måling sylinder til å måle 30 mL 1 x TBE buffer (89 mM Tris pH 7.6, 89 mM borsyre og 2 mM EDTA, pH 8.0) og hell den i konisk kolbe. Varm blandingen med en mikrobølgeovn. Stoppe mikrobølgeovn når det er store luftbobler og nøye virvel kolbe til løsningen har bare én fase.
- Avkjølt løsning på ca 60 ° C, swirl kolbe i et vannbad. Raskt hell løsningen i en gel avstøpning skuff, fjerne luftbobler og sette inn kammer. Vent ca 20 min til gel er herdet.
- Fylle geleelektroforese enhet med 0.5 x TBE og sette gel avstøpning plate inneholder agarose gel. Kontroller at gel sporene er fri for luftbobler.
- Nedspinning PCR produktene bruke alternativet for kort sikt i en mini (plate) sentrifuge. Bruk en mikroliter pipette å blande hver 3 µL av PCR produkt med 1 µL av 6 x lasting fargestoff (40% sukrose og 0,25% bromophenol blå) og laste den inn i gel sporene av agarose gel. Pipetter 1,5 µL av en 100 bp DNA stige i ett spor på hver linje med en mikroliter pipette størrelse standard. Sett lokket på geleelektroforese enheten riktig og koble fører til en strømforsyning. Kjøre gel på 100 V/cm i 35 min.
- å forberede et flekker bad, hell 1000 mL 1 x TBE inn i en firkant-formet plast boksen ugjennomtrengelig for lys. Legge til 50 µL av ethidium bromide med en mikroliter pipette, lukke lokket på boksen plast og rist den for å sikre lik fordeling av ethidium bromide.
- Fjern gel fra geleelektroforese enhet og plasser den i flekker badekaret for ca 10 min. Deretter ta gel ut av flekker badet og legge den til en gel dokumentasjon og visualisere det i henhold til veiledningen.
- Analysere bare prøver som viste positive resultater (fragmenter av tilstrekkelig størrelse visuelle i agarose gel) tilstedeværelse og funksjonelle effektivitet maler for senere gjenkjenning av nylig inntatt byttedyr.
| PCR-Mix | konsentrasjon fungerende løsning | Mix for 10 µL PCR reaksjon | siste konsentrasjon i PCR |
| Primer FW | 10 µM | 0,5 μl | 0,5 µM |
| Primer RW | 10 µM | 0,5 & #956 ; l | 0,5 µM |
| reaksjon buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.55, 16 mM (NH4) 2SO4 og 2 mM MgCl2 siste konsentrasjoner) | 1 µM | 1 μl | 1 µM |
| dNTP | 10 mM | < t d > 0,25 μl0,25 mM | |
| Taq polymerase | 5 U | 0,1 μl | 0,05 U |
| ddH 2 0 | 6.65 μl | ||
| < slag ng > totalt beløp reaksjonsblandingen | 9 μl | ||
| DNA | 1 μl | ||
Tabell 1: detaljerte protokoll for utarbeidelse av standard reaksjonsblandingen for en 10 µL PCR reaksjon.
3. oppdage nylig inntatt byttedyr/matvarer gruppespesifikke Primer sett med Gel geleelektroforese.
- Gjennomføre PCR bruker fungerende løsning av DNA ekstrakter (utarbeidet etter trinn 1.1 å 1.3.11) og det gruppespesifikke primer settet (umerket, dvs. uten modifisering) passer for gruppen byttedyr målrettet som beskrevet i Trinn 2.1.1-2.1.3 (for variasjoner i reaksjonsblandingen for respektive primer sett, se tabell 2). Kjøre PCR bruker standard-protokoll i trinn 2.1.4 (for avspenning temperaturer for respektive primer sett, se tabell 2).
- Bruker én kontroll med ren DNA fra et eksemplar som tilhører de respektive målgruppen (positiv kontroll) og én negativ kontroll med ren DNA fra forbrukeren arter i hver PCR kjøre.
- Sjekke suksessen til PCR reaksjon med agarose gel geleelektroforese beskrevet i trinnene 2.1.6 til 2.1.11. PCR reaksjonen var vellykket hvis et fragment av passende lengde (se tabell 2) vises for positiv kontrollen, men ikke for kontrollen negative. Hvis ett eller begge disse kriteriene er oppfylt, gjenta PCR.
- Bruk agarose gel geleelektroforese, som beskrevet i trinnene 2.1.6 til 2.1.11, for å oppdage om gruppen byttedyr målrettet hadde blitt fortært av de forskjellige prøvene testet (via dom om et fragment av passende lengde er synlige eller ikke). Kontroller at ikke gå glipp av fragmenter med lav visuelle oppløsning.
- Store PCR produkter på 4 ° C, hvis videre analyser vil bli gjort innen de neste 24 timer, eller på 20 ° C hvis analyser utføres senere.
4. Deretter bestemme brukte byttedyr ytterligere nedstrøms ved hjelp av SSCP analyse via polyakrylamid Gel.
- Forberede en 9% akrylamid gel SSCP geleelektroforese. Forbered arbeidet løsningene i laboratoriet hette.
- å forberede en 200 mL akrylamid fungerende løsning, fylle en måling sylinder med 20 mL 10 x TBE (109 g Tris base, 55 g av borsyre og 40 mL 0,50 M EDTA, pH 8.0 oppløst i 1000 mL ddH 2 O) og en med 45 mL av 40% (29:1) akrylamid blanding. Hell TBE og akrylamid miks i en uteksaminert kolbe (en uteksaminert glassflaske med et 200 mL merke er også passende her) og legge ddH 2 O opp til 200 mL-merket. Fortsette arbeidet løsning i kjøleskapet (4 ° C) inntil nødvendig. Bruker ikke fungerende løsning eldre enn én uke.
- Veier 0,1 g ammonium persulfate (APS, bruk en balanse med minst 0,01 g nøyaktighet) til en 1 mL volumetriske kolbe og oppløses den ved å legge ddH 2 O til konfirmasjonen merke for å forberede en 10% APS lagerløsning. Overføre dele (ca 350 µL) til frisk reaksjon rør.
Merk: En aliquot kreves for hver polyakrylamid gel. Lagre den gjenstående aliquOTS på 20 ° C og bare tine dele kort tid før de trengs. - Sette en gel kassett kompromittert av to glassplater, en tomt og ett hakk glassplate (hvert 20 cm x 20 cm), med avstandsstykker (1,5 mm tykk) mellom dem kjører opp sidene av glasset. Bruk hver tre brett tilbake klipp (32 mm) på høyre og venstre side til fixate gel kassett ( figur 1).
- Blanding 5 g av agarose og 250 mL 1 x TBE buffer i en konisk kolbe å forberede løsning for en 2% agarose gel. Varme og etterpå avkjølt blanding som beskrevet i trinn 2.1.6 og 2.1.7. Raskt hell løsningen i en firkantet plasteske (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) og plasser den nedre enden av gel kassetten (trinn 4.1.3) i det agarose løsningen. Juster fold tilbake klippene i den lavere enden av gel kassetten til en høyde slik at de sitter på kanten av firkant-formet plast boksen ( figur 1). Vent ca 20-30 min før agarose plug helt hardnet.
- Fylle en 100 mL måle sylinder med akrylamid fungerende løsning (trinn 4.1.1) til 60 mL merket og hell løsning i et beaker. Bruk brønnene til 300 µL av en aliquot av APS lager løsningen (trinn 4.1.2) og senere legger til 37,5 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED). Raskt, hell løsningen mellom glassplater av gel kassetten. Alternativt injisere løsningen mellom glassplater med en 100 mL disponibel sprøyte med 1000 µL pipette tips justert til injeksjon hodet på sprøyten.
- Nøye setter en 1,5 mm tykk standard kam i den øvre enden mellom glassplater. Kammen må være omgitt av polyakrylamid løsningen. Vent ca 1 h til polyakrylamid gel er polymerized. Unngå ventilasjon under polymerisasjon så langt som mulig fordi det øker tiden som krevs for gel til danner.
Merk: Det er mulig å lagre støpt gels i forseglede plastposer med et papir i kjøleskapet opp til 3 dager.
figur 1: bildet illustrerer den bygging å helle polyakrylamid gels. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Plasser gel kassetten, som inneholder polyakrylamid gel forberedt, en vertikal geleelektroforese enhet. Fyll geleelektroforese enheten med det aktuelle beløpet (avhengig av geleelektroforese enhet) på 0,5 x TBE og kule enheten ned 10 ° C med en nedkjølt Sirkulator.
- For DNA rødsprit, Forvarm en termisk blokk /-cycler til 96 ° C. forberede rødsprit buffer med 95% formamide (99,5% pa grad) og 5% vannløsning inneholdende 0,25% bromophenol blå og 40% (w/v) sukrose.
- Ta PCR produktene fra kjøleskapet eller fryseren og tines. Nedspinning PCR produktene bruke alternativet for kort sikt i en mini (plate) sentrifuge. Så, blande hver 4 µL PCR produktet med 4 µL rødsprit bufferen. Varme blandinger for 5 min på 96 ° C etterfulgt av et kjøling skritt i vann i 10 min.
Merk: Utvalg bør bli lastet inn polyakrylamid gel (trinn 4.5) umiddelbart etter dette. - Fjerne kam fra polyakrylamid gel (trinn 4.1.6) og bruke brønnene helt laste hvert utvalg i en gel-sporet. Kjør geleelektroforese på 8 W per gel mens kjøling stadig geleelektroforese 10 ° C. kjører tid nødvendig avhengig av størrelsen av fragmentet skilles. For fragment størrelser av ca 210 bp, en kjøretid på ca 3,5 h anses hensiktsmessig.
- å forberede et flekker bad, hell 1000 mL 1 x TBE i en firkant-formet plast boksen ugjennomtrengelig for lys og legge til 30 µL av flekker fargestoff (passer stain enkelt strandet DNA) med en mikroliter pipette. Lukke lokket på boksen plast og rist den for å sikre lik fordeling av flekker fargestoff.
- Fjern gel kassetten fra geleelektroforese kammeret og skille forsiktig hakk glassplaten fra gel. Skyv polyakrylamid gel fra Tom glassplaten i flekker badekaret. Plasser flekker badekaret på en risting plattform og flekk gel for 20-30 min med konstant risting.
- Ta gel forsiktig ut av flekker badet og plassere den på tabellen UV en dokumentasjonssystemer.
Merk: På grunn av ustabilitet i gel anbefales å håndtere det tidligere trinnet med to personer. En person bør holde flekker badekaret UV bordet og en annen skal nå under gel med begge hender, ta ut og sett den på tabellen UV. - Lukker lokket døren av dokumentasjon og ta et bilde ifølge produsenten ' s bruksanvisningen.
5. Oppdage flere nylig inntatt byttedyr grupper parallelt med automatisert Fragment analyser.
- Analyser gut innholdet DNA trekker ut bruker 16 gruppespesifikke primer angir gitt i tabell 2, med en primer av et sett merket på grunn av endring med en flekker fargestoff (se tabell 2 kolonne med tittelen modifisering), og bruke de parallelle gjenkjenningsmetoder av en automatisert sequencer.
- Bruk arbeidsoppløsning av DNA ekstrakter (utarbeidet etter trinn 1.1 å 1.3.11) og gjennomføre separat PCRene for hver primer som beskrevet i trinn 2.1.1 til 2.1.5 (variasjoner i blandingen er gitt i tabell 2). Bruke minst én kontroll med ren DNA fra et eksemplar som tilhører de respektive målgruppen (positiv kontroll) og én negativ kontroll med ren DNA fra forbrukeren arter i hver PCR kjøre.
- Kjøre PCRene i thermocycler ved hjelp av standard PCR-protokollen i trinn 2.1.4, justert til respektive annealing temperatur (og antall sykluser) for hver primer sett gitt i tabell 2.
Merk: Bruk samme DNA tildeling av reaksjon for PCR med hver av de 16 forskjellige primer settene å forenkle påfølgende pooling PCR produkter for benytte automatisert fragment analyser. - Store PCR produkter på 20 ° C til alle PCRene tilhører en batch for automatisert fragment analysene (se tabell 2) er fullført. Holde PCR produkter i mørket og ikke lagre dem lengre enn 1 uke før fragment analyser.
tabell 2: detaljer av de 2 grupper av 15 gruppespesifikke primer etablert av Koester et al. (2013) og nyutviklet Jae28S primer paret forsterke regioner 18S eller 28S rDNA fra 16 målgrupper av akvatiske macroinvertebrates. f, frem primere; r, omvendt primere; 18s, primer mål 18S rDNA delenhet; 28S, primer mål 28S rDNA delenhet. " Hydrobiologia, er Dikerogammarus villosus (krepsdyr, Gammaridae) en ' killer reker ' i Rhinen systemet?, 768, 2016, tabell S1, tilleggsmateriale side 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer Internasjonale publisering Sveits 2015) " med tillatelse fra Springer. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
- å oppdage forsterket fragmenter av alle 16 primer sett utføre automatiserte fragment analyser i 2 kladdene i tabell 2. Bruke en intern størrelse standard (DNA størrelse Standard Kit - 400 [satsvis B] og -600 [satsvis A], henholdsvis) til å fastslå fragment lengde. Forberede sekvensering plate og automatisk sequencer som beskrevet i fremgangsmåten nedenfor. Vær oppmerksom på at denne prosedyren må kanskje justeres hvis bruker en annen plattform enn at gitt i tabellen materialer.
- å kjøre hver satsvise utvalg, Forbered en blanding som inneholder eksempel laste løsning (SLS) og respektive størrelsen standard. Pipetter 21,6 µL av SLS og 0,4 µL av DNA størrelse Standard Kit - 600 per eksempel Batch a og henholdsvis 21,7 µL av SLS og 0,3 µL av DNA størrelse Standard Kit- 400 per eksempel Batch B.
- Ta PCR produkter av 8 PCRene tilhører de respektive batchen ut av fryseren og tines. Sikre at de blir fortsatt holdt i mørket.
- Bruker en mikroliter pipette laste antall ble en sekvensering plate nødvendig (antall eksempler som skal analyseres) med hver 22 µL av respektive blandingen beskrevet i trinn 5.2.1 Oppgi. Nedspinning PCR produktene for hver 8 PCRene bruke alternativet for kort sikt i en mini (plate) sentrifuge. Overføre hver 1 µL per PCR produkt av 8 PCRene i de respektive brønnene med sekvensering platen med en mikroliter pipette.
- Nøye spinne ned denne blandingen i sekvensering platen med et kort løp for en mini plate sentrifuge og overlegg hver av brukes med en dråpe mineralolje. Fylle respektive reaksjon wells fra en buffer plate med 250-300 µL DNA separasjon bufferen.
- Bruke programvaren for kapillær sequenceren til å opprette et eksempeloppsett ifølge produsenten ' s instruksjoner. Tilordne metodene for å kontrollere Prøvesett og bestemme rekkefølgen metodene brukes til å behandle data (se tabell 3 for å kjøre forhold tilstrekkelig for bruk med størrelse standard gitt i Materialer tabell). Merk at det er avgjørende at tildeling av prøver i den eksempeloppsett samsvarer med eksempel tildeling i sekvensering platen (inkludert positive og negative kontroller, se trinn 5.1.1) og at metoden tilstrekkelig for fragment analyserer med de respektive størrelse standard velges.
- Fylle wetting skuff med deionisert vann og sett på sekvensering plate, buffer plate og wetting skuffen inn kapillær sequenceren. Sett inn en gel patronen inneholder en tilstrekkelig mengde frisk DNA separasjon gel som er nødvendig for prøven kjøre. Kjøre sekvensering platen bruk forberedt eksempel.
| denature | separat | Kapillær | Sett inn | ||||
| Temperatur | tid | spenning | tid | spenning | tid | ||
| størrelse standard 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 min | 50 ° C vent Temp: Ja | 2.0 kV | 30 s |
| størrelse standard 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 min | 50 ° C vent Temp: Ja | 2.0 kV | 30 s |
tabell 3: spesifikke vilkår for fragment analyser på automatiserte sequenceren bruke størrelse-standarder som er gitt i tabellen materialer.
- å analysere resultatene eksporterer rå data og sende dem til et fragment analyseprogram. Velge standard farge farge ordre fra den respektive produsenten sette fargestoff fargekanaler.
- Opprette et Panel beskriver forventet rekke fragment lengde forsterket av enkelt gruppespesifikke primer angir i en bunke i henhold til brukerhåndboken for programmet.
- å behandle data, Velg respektive Panel, riktig størrelse standarden, standardfarge, og typen analyse og kjøre prosedyre. Velg electropherogram å vise fluorescerende signal intensiteter kapillært geleelektroforese instrumenter som enkelt linje spor for hver farge farge. Markører/primer sett vises som angir området respektive fragment og den nøyaktige lengden av oppdaget fragment knyttet til midten av hver kalt topp utheves (i de fleste programmer etter farge eller navn) automatisk.
- For hver prøve, beregne hvor nært prøven ' s interne størrelsen standard samsvarer med den valgte størrelse standarden å omvurdere suksessen av de størrelse. De fleste fragment analyser programmer har et alternativ til å automatisk beregne og visualisere denne kampen. Hvis størrelse kallet mislykkes, gjenta fragment analyser for disse prøvene.
- Visuelt kontroller electropherogram av hvert utvalg og bekrefte/unconfirm hver topp kalt for hver markør/primer sette separat. Sette inn uncalled topper som passer kriteriene for en markør/primer sett eller slette feil som i henhold til brukerhåndboken programmet brukte manuelt. Bruke base par størrelse eller bin navnet i den ' allelet etikett '. Beregne og vise topp spesifikasjonene i den ' Peak tabell '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukt trinnene som beskrives i denne protokollen for diett analyser i forskjellige studier. I denne delen presenterer vi eksempler som beskriver anvendelse av de forskjellige delene av protokollen.
Som et eksempel for å demonstrere effektiviteten av gruppespesifikke primer sett av forfattere28 og potensialet for videre nedstrøms analyser av PCR produkter av SSCP analyser, ble en fôring eksperimentet gjennomført. Personer med Dikerogammarus villosus som rovdyr og Caenis spp. larver idet prey ble tatt i Rhinen og backwaters nær Karlsruhe (Tyskland). I laboratoriet, predator og byttedyr taxa ble holdt seg i filtrert strømmen vann ved 20 ° C og var utsultet i 36 timer. For eksperimentet ble taksonomisk eksemplarer plassert i kanner med filtrerte strømmen vann (100 mL), matet med to til tre Caenis larver i 30 min, og deretter frosset i flytende nitrogen. Fordøyelsessystemet til hver D. villosus ble dissekert og DNA ble trukket ut som beskrevet i protokollen 1. DNA ekstrakter ble testet med Caep28S primer angir passende å oppdage Caenis spp. bruker de riktige PCR protokoll28 som beskrevet i Protocol 3. For å bekrefte forskjellene mellom forsterket fragmenter av ulike Caenis arter, ble PCR gjennomført med gut innhold prøver og ren DNA-prøver av tre Caenis referanse arter. Agarose gel geleelektroforese førte til enkelt band av double-strandet DNA, som ikke kan skilles mellom de ulike Caenis artene med denne typen geleelektroforese (figur 2A). Derimot av SSCP gel geleelektroforese var som beskrevet i protokoll 4, det mulig å identifisere byttedyr organismer arter nivå ved å sammenligne gut innhold prøvene med referanse prøvene (figur 2B). SSCP fragment mønster av de tre referanse taxa Caenis beskidensis (figur 2B, lane 1), Caenis horaria (figur 2B, lane 2), og Caenis luctuosa (figur 2B, lane 3) besto av fire band med deriverbare mønstre. To gut innhold prøver (figur 2B, lane 4 og 5) hadde et fragment mønster for C. luctuosa (figur 2B, lane 3). Fragment mønster av tredje gut innhold prøven (figur 2B, lane 6) var identisk med C. horaria (figur 2B, lane 2). Sekvensen analyser av to gut innhold prøvene identifisert som C. luctuosa og C. horaria (figur 2B, lane 4 og 6) og de respektive referanse artene bekreftet dette resultatet (se elektronisk supplement justering fasta fil).
Figur 2: Opprinnelige bildet av (A) agarose gel geleelektroforese og (B) SSCP analyse av PCR fragmenter av tarmen innhold og referanse prøver forsterket med Caep28S primer sett. Baner 1-3 viser referanse prøvene av arten Caenis horaria og Caenis beskidensis (1) (2) og Caenis luctuosa (3). I baner 4-6, presenteres fragment mønster av ulike gut innhold prøver av taksonomisk Dikerogammarus villosus . Lane 7 viser fragment mønster av en 100 bp DNA stige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Videre ble en laboratory eksperimentet gjennomført i vann midd tilhører arten Hygrobates ørret ble matet på chironomid larver ikke bare bestemme hvis DNA av chironomid individer fortært kan påvises i vann-midd men også for å teste om mengden av DNA funnet avhenger tiden siden forbruk av byttedyr29. Etter sultne midd i omtrent en uke, ble hver midd tilbudt en chironomid Larven som mat. Hver 3-4 vann midd personer ble løst i etanol (absolutt) for genetisk analyse med Chiro18S primer sett spesifikke til den dipteran familie fjærmygg28 på 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 og 50 h etter matet29. Som en grad av forbruk av vann midd enkeltpersoner, respektive byttedyr personer ble klassifisert i følgende fem fôring Kategorier: 1 = helt sugd ut, integument helt tømt (> 90%), 2 = nesten helt sugd ut (> 75-90%), 3 = semi sugd ut (> 50-75%), 4 = bare delvis sugd ut (> 5-50%), 5 = ingen synlig endring i byttedyr kroppen struktur (≤5%)29. DNA ble Hentet fra vann midd som beskrevet i protokollen 1 (uten trinn 1.2.1 og 1.2.2) og tilstedeværelsen av 18S rDNA i utdrag og funksjonelle effektiviteten av malen ble bekreftet som beskrevet i protokollen 2. Påvisning av byttedyr DNA ble utført i henhold til protokollen 4 bruker bare Chiro18S primer med fremover primer merket med et fluorescerende farge (se tabell 2) og DNA størrelse Standard Kit - 400. Slik at sammenligninger mellom prøvene analysert i forskjellige utførelser av en automatisert sequencer, forholdet mellom eksempel peak høyde og topp høyden på den nærmeste interne standard (dvs360 bp i dette tilfellet) av hver prøve ble beregnet og brukt som en proxy for DNA funnet. Resultatene viste at chironomid DNA var i nesten alle individer av Hygrobates ørret matet på chironomid larver29. Fra det korteste intervallet (1 h etter fôring) den lengste perioden etter fôring (50 h) relative oppdaget byttedyr DNA var betydelig redusert (figur 3A)29. Videre bekreftet forholdet mellom tid etter fôring og byttedyr klassifisering som en proxy for inntatt mengden byttedyr DNA kan være (figur 3B)29. Reduksjon av byttedyr DNA funnet med økende etter fôring var sannsynligvis helt reflektert av nedbrytning av DNA og fordøyelse av byttedyr, fordi egestion av byttedyr DNA er svært usannsynlig skyldes mangel på en anus i vann midd29. Disse resultatene bekrefter egnetheten av denne tilnærmingen for kvantifisering av inntatt byttedyr.
Figur 3: Relasjoner mellom nasjonale ln høydeforhold (sample-peak høyder/standard360 topp høyde) og (A) tid etter fôring midd og (B) fôring kategori (n = 23). "Experimental og brukt Acarology, første oppdagelsen av byttedyr DNA i Hygrobates ørret (Hydrachnidia, Midder): en ny tilnærming for å bestemme predator-byttedyr forhold i vann mites, 67, 376, P. Martin, M. Koester, L. Schynawa, R. Gergs, (© Springer International publisering Switzerlog 2015) "med tillatelse av Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Undersøke betydningen av predasjon ved invasiv taksonomisk D. villosus i feltet, intensiv stabil isotop analysene ses13C og ses15av D. villosus og potensielle matressurser var fremmet av molekylære gjenkjenning av nylig inntatt byttedyr i tarmen innholdet de eksakte samme personene. Totalt 206 D. villosus personer fra ulike steder ble samlet og Fordøyelsessystemet til hver enkelt ble dissekert og DNA ble pakket ut i henhold til protokollen 1. Tilstedeværelse og funksjonelle effektivitet maler brukes ble sikret som beskrevet i protokollen 2. Siste predasjon ved D. villosus personer på flere macroinvertebrate byttedyr taxa ble testet som beskrevet i protokoll 4. Total, bare 16% D. villosus gut innholdet testet positivt for DNA tilhører noen av de 16 målrettet macroinvertebrate byttedyr taxa og støttes derfor resultatene av stabil isotop analysene som indikerte en lav predacious fôring atferd av invasiv taksonomisk i feltet27. Mens det i de genetiske analysene, DNA av 12 testet byttedyr taxa ble funnet i minst 1 gut innhold utvalg, var DNA av 4 andre byttedyr taxa aldri oppdaget (Figur 4)27.
Figur 4: Histogrammet illustrerer respektive antall D. villosus personer fra alle ti nettsteder gut innholdet testet positivt for macroinvertebrate byttedyr DNA. PCR ble utført med 16 gruppespesifikke primer sett som angitt. "Hydrobiologia, er Dikerogammarus villosus (krepsdyr, Gammaridae) en killer reker Rhinen?, 768, 2016, 310, Koester Meike, Bastian Bayer, Gergs René, (© Springer International publisering Sveits 2015)" med tillatelse av Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra fil. Sequence_alignement_feeding_trial.FASTA Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en enkel og kostnadseffektiv metode for PCR-baserte fastsettelse av predator-byttedyr interaksjoner fra feltet prøver via gruppespesifikke primere for rDNA regioner, som kan kombineres med andre ikke-molekylær analyser av de samme. Det er imidlertid flere avgjørende skritt i protokollen. Først er det viktig å sikre spesifisiteten av primere brukt. Dernest er det avgjørende å unngå forurensning og tap av tarmen innholdet materiale under utarbeidelsen av mage-tarmkanalen og påfølgende utvinning av DNA. Mens utvalg med cross forurensning kan føre til false positiv oppdagelsen av byttedyr DNA, brukt tap av tarmen innhold materiale kan føre til manglende sjelden byttedyr. Verifisering av tilstedeværelsen av rDNA tilhører de respektive delenhet og funksjonelle effektiviteten av maler som brukes til analyser (inndeling 2 protokollen) er viktig for informasjonsinnsamling representant om byttet forbrukes. Dette er spesielt viktig, hvis ingen DNA av byttedyr forbrukeren er ment for å spise kan være oppdaget25,27. Videre, når forbereder PCRene (trinn 3.1, 5.1.1 og 5.1.2) er det avgjørende at blandingen og protokollen nøyaktig passer kriteriene som den respektive primeren var angitt til en bestemt gruppe av taxa. Ellers enten forsterkning av DNA i PCR reaksjonen kanskje ikke helt eller DNA av taxa ikke mål kan bli forsterket også. Derfor er det obligatorisk å bruke positive og negative kontroller innenfor hver PCR kjøre å sikre at PCR reaksjonen arbeidet og ingen forurensning oppstod. I tillegg er det nødvendig at matrisen av prøvene for hver PCR-kjøring er dokumentert nøyaktig for at riktig tildeling av byttedyr konsumert respektive kjedene prøven. For denne oppgaven må spesielt forsiktig tas når pooling PCR produkter for parallell påvisning av flere byttedyr grupper via automatisert fragment analyser (trinn 5.2.3).
For påvisning av forsterket med agarose gel geleelektroforese (trinn 3.2 og 3.3) agarose gelé bør være så tynne som mulig og omsorg må tas under visuell inspeksjon av bildet å huske fragmenter med lav visuelle oppløsning. Resultater og en passende konklusjon om byttedyr forbruk av en forbruker er det avgjørende at selv sjelden brukte byttedyr taxa blir anerkjent. Tykk agarose gels redusere synligheten av potensielt lave mengder byttedyr DNA, og dermed redusere sannsynligheten savner sjelden brukte byttedyr og introdusere usikkerhet konklusjonene trukket fra analysen. Videre fra et helseperspektiv bruker en mindre - eller ikke-giftig alternativ enn ethidium bromide til farging geléer kan være tilrådelig. Protokollen for påfølgende videre nedstrøms analyse av forsterket via SSCP analyser bruker polyakrylamid gels inkluderer noen trinn som skal utføres med spesiell forsiktighet. Det er viktig at gel kassett samlet er tette (trinn 4.1.3) og polyakrylamid løsningen er gitt nok tid til danner helt (trinn 4.1.6). Åpne kassetten for tidlig vil føre til lekker flytende akrylamid løsning og, til tross for at forberedelsene har startes fra begynnelsen, omfattende opprydding må gjøres også. Videre, overføre polyakrylamid gel i flekker badekaret (trinn 4.7) og derfra til de UV (trinn 4.8) må gjøres veldig nøye på grunn av ustabilitet i slike gels. Ellers gel kan rive og fragmenter kan bli forstyrret, som fører til nødvendigheten av å gjenta.
En viktig forutsetning for vellykket behandling data mottatt fra automatisert fragment analyser er at prøvens interne størrelse standard samsvarer størrelse standardmønster gitt av produsenten (trinn 5.3.3) for fastsettelse av den aktuelle fragment lengde. Dette er spesielt viktig fordi ellers ulike fragmenter, merket med det samme fluorescerende flekker fargestoff, kan tilordnes feil byttedyr taxa og derfor føre til en fullstendig feilvurdering predator-byttedyr samhandlinger. Videre viser electropherograms ofte bakgrunnsstøy. For å etablere tillit i tolkningen, er det viktig at toppene av interne størrelse standarden er betydelig høyere enn bakgrunnsstøy fra utvalget. Topper for hver markør/innføring bør derfor bare bli regnet hvis de er betydelig høyere enn bakgrunnsstøy.
Denne protokollen kan endres for å oppdage flere grupper av byttedyr arter av interesse i ulike forbrukere av interesse. Riktignok kanskje gruppespesifikke primere allerede ikke tilgjengelig for alle potensielle byttedyr gruppe (biologi) av interesse. Likevel gruppespesifikke primere er ikke bare tilgjengelig for flere ferskvann macroinvertebrate taxa28, men også for en rekke andre taxa (f.eks flere marine macroinvertebrate taxa16,30 og vanlige arter av flygende insekter31). Dermed valget av gruppespesifikke primer angir passende å forsterke DNA av alle byttedyr i en gitt gruppe (biologi), men ikke forsterkning av DNA fra arter som ikke tilhører denne gruppe (biologi), er essensielle32. Mange gruppespesifikke primere som finnes nå er angitt for et gitt taxa (f.eks, 130 arter av ferskvann macroinvertebrates vanlig i Rhinen systemet28). Derfor, for å unngå falsk negativt eller falske positive resultater, spesifisitet av slike primere bør kontrolleres for omfanget av taxa vanlig i økosystemet rundt før programmet for målet taxa og forbrukere ikke inkludert i størrelsesorden taxa for som hadde blitt etablert primerne. Videre, hvis de molekylær analysene ikke kombineres med andre analyser av den nøyaktig samme person, Disseksjon av fordøyelsessystemet kan bli utelatt.
Likevel dissekere fordøyelsessystemet av større prøver også forhindrer feil DNA utvinning på grunn av for mye materiale og reduserer tilstedeværelsen av forbruker-DNA i prøven utdrag. Men har studier vist at bruker bestemte blokkerer primere, som knytter til DNA av forbrukeren og dermed blokkere det, for PCR reaksjonen kan effektivt forbedre forsterkning av sjeldne sekvenser blandet prøver33. Derfor kan Disseksjon av mage-tarmkanalen unngås, selv når du arbeider med større forbruker prøver, ved bruk av bestemte blokkerer primere. Parallell deteksjon av amplicons fra flere gruppespesifikke primer sett via automatisert fragment analyser, bør forsiktighet utvises i valg av flekker fargestoff som etikett. Dermed skal primer sett forsterke fragmenter av omtrent samme lengde være merket med klart kan skilles fluorescerende fargestoffer. Videre, det er en rekke kapillært geleelektroforese systemer tilgjengelig fra flere produsenter. Noen av disse systemene tillater angivelig fastsettelse av flere fragmenter med via uspesifikke fargestoffer. Protokollen presenteres her kan enkelt justeres for å oppdage forsterket fragmenter med noen av disse systemene. Bortsett fra det, for å redusere tiden nødvendig for tHan analyserer, ville det være mulig å optimalisere enkelt multipleks PCR analyser for å forsterke DNA av byttedyr én fragment analyse satsvise samtidig (for eksempel samtidige forsterkning av 12 byttedyr biller34 eller opptil seks flygende insekter taxa31).
En potensiell ulempe med gut innhold analyser generelt, og derfor også analysene beskrevet i denne protokollen, er den lave timelige oppløsningen. Med slike metoder er det bare mulig å identifisere nylig inntatt organismer, som kan føre til usikkerhet i betydningen av enkelt bytte organismer2. Vi viste imidlertid at genetisk analyse i henhold til denne protokollen kan lett kombineres med analyser av isotoper (ses15N og ses13C) av de nøyaktige samme forbruker prøver25,27. Som en tid integrert naturlig tracer predator-byttedyr samhandlinger, stabil isotop analyser brukes ofte til å beskrive næringskjeden strukturer1, men potensielle overlappende isotopanrikning verdier fra ulike byttedyr hindrer ofte en eksakt definisjon av predator-byttedyr interaksjoner2. Derfor bruker denne protokollen for genetiske analyser i kombinasjon med stabil isotop analyser for å overvinne ulempene ved hver metode kan ytterligere vår forståelse av næringskjeder og deres forhold til næringsstoffer eller energi flukser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Silke Classen fra Research Institute for økosystemet analyse og vurdering (gaiac), RWTH Aachen for henne hjelp i etableringen av gruppespesifikke primer brukes i denne protokollen. Vi takker også Peter Martin og Laura Schynawa fra Universitetet i Kiel for samarbeid i vann midd eksperimenter. Vi takker også teknisk lab assistentene for å holde laboratoriet knirkefritt og forberede register og katalognummer. Dette arbeidet ble støttet av tysk Research Foundation (DFG, prosjektet GE 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
- Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
- Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
- Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
- Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
- Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
- Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
- Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
- Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
- Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
- Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
- Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
- Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
- Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
- Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
- Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
- Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
- Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
- Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
- Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
- Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
- Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6 (2007).
- Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
- Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
- Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
- Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831 (2007).
- Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).
- Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
- Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12 (2008).
- Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).
