Summary
Análisis de contenido intestinal más común de macroinvertebrados son visuales. Que requiere intenso conocimiento sobre la diversidad morfológica de los organismos presa, perder presa con cuerpo suave y, debido a la fuerte trituración de presa, son casi imposibles para algunos organismos, incluyendo los anfípodos. Ofrecemos detallados novela enfoques genéticos para macroinvertebrados presa de identificación en la dieta de los anfípodos.
Abstract
Análisis de redes tróficas es esencial para una mejor comprensión de los ecosistemas. Por ejemplo, las interacciones tróficas pueden sufrir cambios severos causados por la invasión de especies no autóctonas. Sin embargo, es difícil en muchos casos una identificación exacta de las interacciones depredador-presa de campo. Estos análisis a menudo se basan en una evaluación visual del contenido de la tripa o el análisis de ratios de isótopos estables (δ15N y δ13C). Tales métodos requieren amplio conocimiento, respectivamente, diversidad morfológica o la firma isotópica de organismos presa individual, conduce a obstáculos en la identificación exacta de organismos presa. Análisis de contenido de Visual intestino especialmente subestimar organismos presa de cuerpo suave, porque maceración, ingestión y digestión de presas organismos dificultan la identificación de especies específicas. Por lo tanto, estrategias de polimerasa en la reacción en cadena (PCR), por ejemplo el uso de la cartilla del específico de grupo se establece, brindan una herramienta poderosa para la investigación de las interacciones tróficas. Aquí, describimos protocolos detallados para investigar el contenido estomacal de los consumidores de macroinvertebrados del campo mediante sistemas específicos de grupo primer nuclear ácido desoxirribonucleico ribosómico (ADNr). ADN puede ser extraído de especímenes enteros (en el caso de taxa pequeño) o de contenido estomacal de ejemplares recolectados en el campo. Presencia y eficiencia funcional de las plantillas de ADN necesitan ser confirmado directamente desde el individuo probado usando la cartilla universal establece contra la subunidad correspondiente del DNA. También demostramos que presa consumida puede ser determinado más a nivel de especie mediante PCR con cebadores específicos de grupo sin modificar combinan con análisis de polimorfismo (SSCP) hebra posterior conformación utilizando geles de poliacrilamida. Además, nos muestran que el uso de diferentes tintes fluorescentes como etiquetas permite proyección paralela para fragmentos de ADN de grupos de presas diferentes de múltiples muestras contenido intestinal mediante el análisis del fragmento automatizado.
Introduction
Las interacciones depredador-presa, que constituyen la mayoría de las interacciones tróficas y dinámica trófica, son aspectos claves para caracterizar los flujos de materia y energía a través de redes tróficas dentro y entre ecosistemas, que es uno de los principales objetivos de la ecología 1. la determinación de la fuente y el flujo de carbono y nutrientes es promover la comprensión de la conectividad ecológica entre los ecosistemas2. Sin embargo, los ecosistemas, tales como ríos y sus cuencas, no están ligados sólo por flujos de materia orgánica y nutrientes sino también por los movimientos de los organismos3. Así, alteraciones de hábitat interrumpiendo el flujo de recursos que los sistemas pueden fuertemente alterar las redes tróficas de ambos ecosistemas, no sólo directamente sino también indirectamente cambiando la composición respectiva de las comunidades de depredador-presa. Por ejemplo, cambios de redes tróficas han demostrado para ser ligado a los movimientos de depredador solo especies (e.g., trucha arco iris)4. Tales cambios potencialmente amenazan la biodiversidad y el funcionamiento de los ecosistemas acuáticos. Por lo tanto, analizando las interacciones depredador-presa en el campo es esencial para determinar el impacto de los cambios ambientales inducidos por humanos, como prácticas de manejo de agua, en la biodiversidad nativa de los ecosistemas acuáticos.
Puesto que el seguimiento de los vínculos tróficos es difícil en sistemas complejos, varios acercamientos se han establecido que permiten la evaluación de la alimentación de las interacciones en el campo5. Tradicionalmente, las investigaciones de interacciones en el campo de la alimentación se basan en la identificación visual de los restos de la presa en intestinos disecados y requieren un amplio conocimiento acerca de la diversidad morfológica de la presa. Análisis de contenido de Visual intestino han proporcionado penetraciones en el uso de los recursos de varios grupos de consumidores (por ejemplo, variación estacional en la dieta de langosta pescado de6 y7,8 o alimentación preferencias de copépodos). Sin embargo, el proceso físico de digestión dificulta el análisis de contenido de visual intestino y generalmente falta presa-organismos con cuerpo blando9. Para la alimentación de las especies por ingestión de líquido o para algunos consumidores invertebrados que intensivo dilacerar su comida antes de la ingestión, como anfípodos, identificación visual de especies de presas en contenido estomacal es imposible10. Debido a estas limitaciones, el análisis molecular ofrece una alternativa prometedora.
Los análisis moleculares se han convertido en una herramienta común que permiten la detección de la presa rápida y precisa en el contenido estomacal. La gama de tales técnicas es diversa: estrategias basadas en anticuerpos monoclonales o reacciones en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) se utilizan a menudo, debido a su alta especificidad y sensibilidad11. El desarrollo de nuevos anticuerpos monoclonales es intensivo en tiempo y costo, por lo tanto, la aplicación de otras técnicas moleculares es más útil cuando los anticuerpos ya no existen11. Otro método común es la amplificación de regiones del ácido desoxirribonucleico (ADN), como el ácido ribonucleico ribosomal (ARN) genes presentes en la mayoría de las especies, usando la cartilla universal establece12,13. Cuando se utiliza esta técnica, a menudo no es posible identificar toda la gama de organismos presa dentro de fuentes mixtas de ADN14. Un enfoque eficaz para evitar tal inconveniente es usar primer grupo-específicas para el análisis de contenido intestinal genéticos. Diseñado para amplificar sólo regiones de ADN de grupos particulares y excluyen otras especies15,16, cebadores específicos de Grupo permiten la identificación de organismos presa en el nivel taxonómico de los grupos especificados sin análisis secundario de tiempo y costosa. Sin embargo, como todo análisis de contenido de la tripa, tales análisis proporcionan sólo una instantánea del comportamiento alimentario. Por lo tanto, la combinación de análisis de contenido intestinal molecular con análisis de marcadores naturales integración de tiempo (por ejemplo, los isótopos estables) se considera beneficioso1,2.
Aquí, describimos un método detallado para las investigaciones basadas en la PCR de las interacciones depredador-presa utilizando conjuntos de primer grupo-específicas para las regiones de ADN (ADNr) ribosomales nucleares para ser combinado con análisis de isótopos estables de la misma muestra. Describimos la detección de ADN de grupos de presas solo mediante electroforesis en gel de agarosa. Además, se presenta una oportunidad para mayores posteriores análisis de productos PCR de tales cartillas de Grupo-específicas aplicables siempre que se requiera una mayor resolución taxonómica que la especificidad de los cebadores. Porque la sola DNA trenzada (ssDNA) fragmentos de conformaciones terciaria de forma que se determinaron por su secuencia primaria17, pequeñas variaciones en los fragmentos amplificados por tales cebadores específicos de grupo conducen a cambios conformacionales. Estos cambios pueden detectarse por análisis de polimorfismo (SSCP) conformación de cadena única con geles de poliacrilamida17,18, lo que permite una identificación más precisa de organismos presa (hasta el nivel de especie).
Mientras que la electroforesis en gel de agarosa es una herramienta común y barata para visualizar fragmentos de ADN y determinar su longitud aproximada19, la resolución depende de la cantidad de ADN y el tinción colorante usado20. Por lo general, la visualización es sencillo cuando se trabaja con muestras de ADN puras, pero potencialmente bajas cantidades de presas DNA en el contenido estomacal de los consumidores puede complicar el marcador de resultados de electroforesis de gel de agarosa. Todavía, este método de detección es factible para detectar un bajo número de muestras al consumidor desde el campo uno o presa de algunos grupos, pero complicación en el marcador hace que la proyección de un gran número de muestras por múltiples presas taxones extremadamente tiempo intensivo y así impracticable. Un método de detección más sensible es el análisis automatizado de fragmentos por electroforesis capilar, que además permite la determinación de la longitud exacta de fragmentos21. Varios microsatélites en estudios han demostrado que mediante el uso de diferentes tintes fluorescentes como las etiquetas, es posible detectar y determinar diferentes fragmentos de longitud comparable por fragmento automatizado análisis22,23, 24. Por lo tanto, también presentamos un protocolo detallado para paralelo detección de ADN de presas múltiples grupos mediante PCR con conjuntos de etiquetado específico de grupo primer y detección mediante análisis del fragmento automatizado con un secuenciador automatizado. Además, presentamos los resultados de un estudio de caso que demuestra que la detección del ADN de la presa mediante el análisis del fragmento automatizado es un enfoque que también permite una cuantificación relativa de la presa ingerida.
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Protocol
1. recoger los macroinvertebrados en el campo y preparar las muestras para los análisis de contenido intestinal genéticos.
- Colecta de macroinvertebrados en cada sitio, ordenar a individuos de especies de consumo de interés en tubos individuales y congelarlas directamente en nitrógeno líquido o hielo seco para evitar la separación de la tripa y la degradación de DNA.
Nota: Evite guardar las muestras en alcohol, porque algunos macroinvertebrados suelen regurgitar antes de que el alcohol mata. - Uso sólo del tracto gastro-intestinal de medianas y grandes (aproximadamente > mm 3) especies de macroinvertebrados para análisis de contenido intestinal genéticos así lo restante de la muestra puede ser utilizada para otros procedimientos (por ejemplo, isótopos estables Análisis). Tenga en cuenta que esto no es aplicable al investigar taxones muy pequeños como ácaros de agua. Por lo tanto, pueden omitirse pasos 1.2.1 y 1.2.2.
- Descongela ligeramente un individuo y diseccionar cuidadosamente su tracto gastro-intestinal bajo un estereomicroscopio con unas pinzas finas de acero inoxidable. Asegúrese de no pinchar el tracto gastro-intestinal para evitar la pérdida de la materia. Pinzas de
- limpiar con solución de descontaminación para eliminar contaminaciones de DNA y RNA después de la preparación de cada tracto gastro-intestinal. Por lo tanto, incubar fórceps durante 10 min en la solución de descontaminación. Luego, enjuagar con agua estéril para retirar residuos y limpiarlo con una toalla de papel sin pelusa.
- Transferencia del tracto gastrointestinal disecado a una reacción de safe-lock 2.0 mL del tubo que contiene 440 μl (450 μl posible uso de pipeta repetitiva) de tampón de extracción de la sal [SEB; 0,4 M cloruro de sodio (NaCl), 10 mM Tris (hidroximetil)-aminometano clorhidrato (Tris-HCl) pH 8.0 y sal de disodio del ácido etilendiaminotetracético 2 mM deshidratan pH 8.0 de (EDTA)]. Tienda preparado muestras en − 20 ° C inmediatamente hasta la extracción de ADN. Asegurar que se extraerá ADN dentro de un par de días.
- Utilizar un protocolo de extracción de sal modificada 25 para extraer ADN.
- Toma de muestras fuera del congelador. Utilizar pinzas para añadir una bola de acero inoxidable de 5 mm a cada tubo de muestras y dejar las muestras congeladas en el Banco a temperatura ambiente (RT) para descongelar. Utilizar un molino de grano para homogeneizar las muestras durante 1 min a 15 Hz.
- Desactivación de muestras con un corto plazo de una centrifugadora. Utilizar pipetas de microlitro para agregar 90 μl (100 μl posible para el uso de la pipeta repetitiva) solución 10% de sodio dodecil sulfato (SDS) y 5 μl de proteinasa K. de 10 mg/mL
- Vortex muestras bien y mezclas por 1 h a 60 ° C con agitación constante a 400 rpm en un Termomezcladores de incubar. Además, bien torbellino muestras cada 10 minutos para promover aún más la lisis.
- Vuelta abajo las muestras con un corto plazo de una centrifugadora, añadir 350 μl de 5 M de NaCl con una pipeta microlitros y agitar bien para aproximadamente 0,5 - 1min centrifugar las muestras durante 40 min a 16.200 x g a 5 ° C.
Nota: Si varios sistemas en una fila tienen que hacer, la temperatura de la centrífuga necesita ser ligeramente levantado (no superior a 10 ° C) porque SDS tiende a flocular si la temperatura es demasiado baja.
Pipetas de microlitro de uso - para transferir aproximadamente 600 μl de sobrenadante a un nuevo tubo de reacción de 1,5 mL. Tenga cuidado de no quitar nada de la pelotilla de. Granos de
- punta de acero inoxidable de los tubos de reacción en un colador de té de acero inoxidable, limpiar con agua corriente y les Incube en un plato Petri con la solución de descontaminación para 10 minutos enjuagar bien la solución de descontaminación con estéril de agua y almacenar granos limpios en etanol (> 99%, grado p.a.) o secos hasta reutilización.
Nota: Limpieza de cuentas no necesita hacer en este paso directamente, pero algo se puede hacer siempre que haya tiempo de espera en los pasos siguientes. - Añadir 600 μl de isopropanol helada (grado p.a.) en el sobrenadante con un microlitro pipeta e invertir cuidadosamente el tubo un par de veces. Almacenar las muestras durante la noche a -20 ° C.
- Tomar muestras fuera del congelador y centrifugar 20 min a 16.200 x g y temperatura ambiente. Cuidadosamente, deseche el sobrenadante y secar el tubo cuidadosamente con papel sin pelusa. Tenga en cuenta que si la temperatura ambiente es alta (más de 25 ° C), centrifugar a 5 ° C para evitar que los pellets deslizarse mientras descartando el sobrenadante. Lavado de
- bolitas que contienen ADN con etanol al 70%. Para ello, añada 200 μL de etanol helada (70%, grado p.a.) utilizando una pipeta microlitros y centrifugar las muestras durante 10 minutos a 16.200 x g y temperatura ambiente (o 5 ° C, si es necesario). Cuidadosamente, deseche el sobrenadante y secar el tubo cuidadosamente con papel sin pelusa. Utiliza una pipeta μl 10 ajustado a aproximadamente 8 μl de pipeta cuidadosamente apagado el sobrenadante restante. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
- Secar el pellet para aproximadamente 5-20 min a 60 ° C o a temperatura ambiente en el Banco hasta que el etanol se evapora.
- Pellets de disolver en 50-100 μl libre de nucleasas (vapor esterilizado y tratada DEPC) agua (ddH 2 O), espere al menos 1 h (aunque se obtienen mejores resultados durante la noche a 4 ° C).
- Medir la cantidad de ADN contenida en cada muestra con un espectrofotómetro micro volumen, según el fabricante ' instrucciones. Hacer una dilución de trabajo de cada muestra que contiene aproximadamente 2-10 ng de ADN / μl. mantener la solución en el congelador. Mantener la solución de trabajo en el frigorífico y asegúrese de que muestra mayor procesamiento se realiza poco.
2. Verificar eficiencia funcional de extractos de ADN para la detección posterior de la presa recientemente ingerido.
- Para asegurar la presencia y la eficiencia funcional de las plantillas, prueba cada extracto de ADN (pasos 1.1 a 1.3.11) usando la cartilla universal fija adecuada para la alimentación respectiva (por ejemplo, los invertebrados 16 , 26) que apuntan a la misma subunidad nuclear como el primer grupo-específica, utilizada para la posterior detección de presa 25 , 27. Los pasos siguientes se refieren a la utilización de sistemas de imprimación universal NSF1419/20 y NSR1642/16 16 y LSU D1, D2 fw1 y LSU D1, D2 rev2 o LSU D1, D2 rev4 26. Para demostrar que la reacción de PCR ha sido exitosa y que no llevó a cabo ninguna contaminación, utilizar un control positivo que contiene ADN que ya había sido amplificado con éxito y muestra de un control que contenga ddH 2 O en lugar de ADN dentro de cada PCR ejecutar.
- Para preparar soluciones de trabajo que contienen una concentración final de 10 μm de la cartilla, pipetear la cantidad apropiada de la cartilla respectiva acción solución y ddH 2 O (dependiendo de la concentración de la solución madre) de cartilla en un tubo de reacción de 1,5 mL fresco usando Micropipetas.
- Añadir cebadores, mezcla de Deoxinucleótidos (dNTPs), tampón de reacción, tubo de reacción de Taq ADN polimerasa y ddH 2 O de 1,5 o 2,0 mL (dependiendo del número de muestras a procesar) y vórtice esta mezcla. Detallada los volúmenes de la mezcla de reacción estándar para una reacción de PCR de 10 μl se dan en la tabla 1 (para información de productos químicos utilizados, véase Tabla de materiales). Extracción de
- uso microlitro Pipetas para transferir cada 1 μl de ADN en 9 μl de thmezcla de reacción estándar de e dentro de un tubo PCR (o un pozo de una placa de la polimerización en cadena). Cerrar el tubo de reacción o los pocillos de la placa (con rayas de tapa).
- Programa del termociclador: es el protocolo estándar para el conjunto de la cartilla de NSF1419/20 y NSR1642/16 16: 94 ° C durante 4 min (desnaturalización), seguido de 30 ciclos de 94 ° C por 30 s, 50 ° C (temperatura de recocido) durante 30 s, 72 ° C durante 90 s y una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. Para la imprimación LSU establece 26, utilice lo siguiente: 94 ° C durante 4 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C por 20 s, 52,5 ° C por 20 s, 72 ° C durante 90 s y una extensión final a 72 ° C durante 8 minutos
- Tubos de PCR de lugar o placas en el termociclador, cierre la tapa de la cycler e iniciar el programa.
- Preparar una agarosa 1.5% gel con una solución tampón que contiene Tris base, ácido bórico y EDTA (tampón TBE) y agarosa. Para la preparación de un gel de agarosa al 1,5%, con una bandeja de gel casting con dimensiones de 10 cm × 7,5 cm × 3 cm, pesa 0,45 g agarosa en un matraz cónico, utilice una probeta para medir 30 mL de tampón de x TBE 1 (89 mM Tris pH 7,6, el ácido bórico 89 mM y 2 mM EDTA, pH 8.0) y verter en el frasco cónico. Calentar la mezcla usando un microondas. Parar el microondas cada vez que hay burbujas de aire grandes y agitar cuidadosamente el matraz hasta que la solución tiene sólo una fase.
- Enfriar la solución a aproximadamente 60 ° C, agitar el matraz en un baño de agua. Rápidamente verter la solución en una bandeja de gel casting eliminar burbujas de aire y colocar los peines. Esperar unos 20 min hasta que el gel se endurece. Unidad de electroforesis
- relleno con 0,5 x TBE y Coloque gel casting bandeja que contiene el gel de agarosa. Asegúrese de que las ranuras de gel libres de burbujas de aire.
- Desactivación de los productos PCR mediante la opción run corto de una centrifugadora de mini (placa). Utilice una pipeta microlitros para mezclar cada 3 μl del producto de PCR con 1 μl de 6 x tinte (40% de sacarosa y 0,25% azul de bromofenol) de carga y carga en las ranuras del gel del gel de agarosa. Pipetear 1,5 μl de una escalera de DNA 100 bp en una ranura de cada línea con una pipeta microlitros como tamaño estándar. Vuelva a colocar la tapa de la unidad de electroforesis correctamente y conecte los cables a una fuente de alimentación. Correr el gel a 100 V/cm durante 35 minutos
- Para preparar un baño de tinción, pour 1.000 mL de 1 x TBE en una caja plástica cuadrada impermeable a la luz. Añadir 50 μl de bromuro de etidio con una pipeta de microlitros, cierre la tapa de la caja de plástico y agite para asegurar la distribución equitativa del bromuro de etidio.
- Quitar el gel de la unidad de electroforesis y colóquelo en el baño de tinción durante aproximadamente 10 minutos. Luego, tomar el gel en el baño de tinción y colóquela en un sistema de documentación de gel y visualizar según el manual.
- Analizar sólo las muestras que mostraron resultados positivos (fragmentos de tamaño adecuado visual en gel de agarosa) en términos de presencia y eficiencia funcional de las plantillas para la posterior detección de presas recientemente ingeridos.
| solución de trabajo de la concentración | dePCR-Mix | Mix 10 reacción de PCR μl | concentración Final en la polimerización en |
| Primer FW | 10 μm | 0.5 μl | 0.5 μm |
| Cartilla RW | 10 μm | de 0.5 & #956 ; l | 0.5 μm |
| buffer de reacción (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16 m m (NH4) 2SO4 y concentraciones finales de MgCl2 2 mM) | 1 μm | 1 μl | 1 μm |
| dNTP | 10 mM | < t d > 0,25 μl0.25 mM | |
| 5 U | deTaq polimerasa | 0.1 μl | 0.05 U |
| ddH 2 0 | 6.65 μl | ||
| < stro ng > Total de mezcla de reacción de la cantidad | 9 μl | ||
| ADN | 1 μl | ||
Tabla 1: detalle de protocolo para la preparación de la mezcla de reacción estándar para una reacción de PCR de 10 μl.
3. detectar presas/alimentos recientemente ingeridos con conjuntos de Primer grupo-específica usando la electroforesis del Gel.
- Realizar PCR utilizando que los extractos de la solución de trabajo de la DNA (preparado según pasos 1.1 a 1.3.11) y el conjunto del primer grupo-específica (sin etiqueta, es decir, sin modificación) apropiado para el grupo presa dirigido como se describen en pasos 2.1.1 al 2.1.3 (variaciones en la mezcla de reacción para el conjunto de la cartilla respectiva, ver tabla 2). Ejecutar la polimerización en cadena usando el protocolo estándar de paso 2.1.4 (recocido las temperaturas para el conjunto de la cartilla respectiva, ver tabla 2).
- Utilizar un control con ADN puro de un espécimen perteneciente al grupo de blanco respectivo (control positivo) y un control negativo con el puro ADN de las especies de consumo en cada PCR ejecutar.
- Compruebe el éxito de la reacción de polimerización en cadena usando la electroforesis del gel de agarosa se describe en pasos 2.1.6 a 2.1.11. La reacción de PCR fue exitosa si un fragmento de la longitud correcta (ver tabla 2) es visible para el control positivo, pero no para el control negativo. Si uno o ambos de estos criterios están incumplidas, repetir PCR. Agarosa de uso
- gel de electroforesis, como se describe en pasos 2.1.6 a 2.1.11, para detectar si el grupo presa blanco había sido consumido por el consumidor diferentes muestras analizadas (a través de juicio de que el fragmento de longitud apropiada sea visible o no). Asegúrese de que no se pierdan fragmentos con baja resolución visual.
- Productos de PCR de almacén a 4 ° C, si más análisis se realizará dentro de las 24 horas, o a-20 ° C si los análisis deben realizarse más adelante.
4. Determinar posteriormente la presa consumida más abajo usando análisis de SSCP mediante geles de poliacrilamida.
- Prepara un gel de acrilamida de 9% para electroforesis SSCP. Preparar las soluciones de trabajo en una campana de laboratorio.
- Para preparar una solución de trabajo de acrilamida de 200 mL, llene una probeta 20 ml de 10 x TBE (109 g de Tris base, 55 g de ácido bórico y 40 mL de 0.50 M de EDTA, pH 8.0 disuelto en 1000 mL de ddH 2 O) y otra con 45 mL de 40% (29: 1) mezcla de acrilamida. Vierta la mezcla TBE y acrilamida en un matraz aforado (un frasco de vidrio graduado con una marca de 200 mL es apropiado aquí) y añadir ddH 2 O hasta la marca de 200 mL. Seguir trabajando solución en la nevera (4 ° C) hasta que se necesite. No utilice solución de trabajo de más de una semana.
- Pesar 0,1 g de persulfato de amonio (APS; uso una balanza con una precisión al menos 0,01 g) en un matraz aforado 1 mL y se disuelven por adición de ddH 2 O hasta la graduación marca para preparar una solución stock al 10% APS. Transferir alícuotas (aproximadamente 350 μL) en tubos de reacción nueva.
Nota: Se necesita una alícuota para cada gel de poliacrilamida. Tienda el restante aliquOTS a-20 ° C y descongelar sólo alícuotas poco antes de que se necesitan. - Monta un cassette de gel comprometido de dos placas de vidrio, una en blanco y placa de vidrio con muescas (cada 20 cm x 20 cm), con espaciadores (espesor 1,5 mm) de entre ellos corriendo hasta los lados del vidrio. Utilizar cada tres clips de fold-back (32 mm) en el lado derecho e izquierdo para fijar el cartucho de gel ( figura 1).
- Mezcla 5 g de agarosa y 250 mL de tampón de x TBE 1 en un erlenmeyer, preparar la solución para una agarosa 2% gel. Calentar y luego enfriar la mezcla tal como se describe en los pasos 2.1.6 y 2.1.7. Rápidamente verter la solución en una caja de plástico en forma de cuadrado (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) y colocar el extremo inferior de la cinta de gel (paso 4.1.3) en la solución de agarosa. Ajuste los clips de fold-back en el extremo inferior del gel de cassette para una altura de manera que se sientan en el borde de la caja de plástico en forma de cuadrado ( figura 1). Esperar unos 20-30 min hasta que el enchufe de agarosa ha endurecido completamente.
- Llenar un 100 mL medir cilindros con la solución de trabajo de acrilamida (paso 4.1.1) hasta la marca de 60 mL y vierta la solución en un vaso de precipitados. Utilice una micropipeta para añadir 300 μL de una alícuota de la solución madre de APS (paso 4.1.2) y posteriormente agregar 37.5 μl de tetramethylethylenediamine (TEMED). Rápidamente, verter la solución entre las placas de vidrio de la cinta de gel. Alternativamente, inyectar la solución entre las placas de vidrio con una jeringa desechable de 100 mL con una pipeta de 1000 μl, ajustada a la cabeza de inyección de la jeringa de.
- Introduzca cuidadosamente un peine estándar espesor de 1,5 mm en el extremo superior entre las placas de vidrio. El peine debe estar rodeado por la solución de poliacrilamida. Espere aproximadamente 1 hora hasta que se polimeriza el gel de poliacrilamida. Evitar la ventilación durante la polimerización lo más lejos posible porque aumenta el tiempo necesario para que el gel polimerice.
Nota: Es posible almacenar geles fundidos dentro de bolsas de plástico selladas con un pañuelo húmedo en la nevera hasta 3 días.
figura 1: imagen que ilustra el construcción a geles de poliacrilamida. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Coloque el cartucho de gel, que contiene el gel de poliacrilamida preparado, en una unidad de electroforesis vertical. Llenado el aparato de electroforesis con la cantidad apropiada (dependiendo del tipo de unidad de electroforesis) de 0,5 x TBE y enfriamiento de la unidad hasta 10 ° C mediante un circulador refrigerado.
- Para la desnaturalización del ADN, precaliente un termobloque /-cycler a 96 ° C. preparar buffer de desnaturalización 95% formamida (grado de 99.5% p.a.) y 5% de solución acuosa que contiene azul de bromofenol 0.25% y sacarosa al 40% (w/v).
- Tomar los productos PCR fuera de la nevera o el congelador y descongelarlos. Desactivación de los productos PCR mediante la opción run corto de una centrifugadora de mini (placa). Luego, mezcle cada 4 μL del producto PCR 4 μL de tampón de desnaturalización. Calentar la mezcla durante 5 minutos a 96 ° C seguida por un paso de enfriamiento en agua muy fría durante 10 minutos
Nota: Las muestras se deben cargar en el gel de poliacrilamida (paso 4.5) inmediatamente después de esto. - Quitar el peine del gel de poliacrilamida (paso 4.1.6) y utilizar una micropipeta para cargar completamente cada muestra en una ranura de gel. Ejecutar electroforesis en 8 W por gel mientras refrigeración constantemente el aparato de electroforesis a 10 ° C. duración necesaria depende del tamaño del fragmento que se separará. Para tamaños de fragmento de aproximadamente 210 bp, un tiempo en marcha de aproximadamente 3,5 horas se considera apropiado.
- Para preparar un baño de tinción, pour 1.000 mL de 1 x TBE en un cuadrado de plástico impermeable a la luz de la caja y añadir 30 μl de coloración de tinte (apto teñir sola DNA trenzada) con una pipeta de microlitros. Cierre la tapa de la caja de plástico y agite para asegurar la distribución equitativa del tinción colorante.
- Libere el gel de la cámara de electroforesis y separar cuidadosamente la placa ranurada del gel. Deslice el gel de poliacrilamida de la placa de cristal en blanco en el baño de tinción. Colocar el baño de tinción en un gel manchas y plataforma de agitación durante 20 a 30 min con agitación constante.
- Tomar el gel con cuidado en el baño de tinción y colóquela en la mesa de rayos UV de un sistema de documentación.
Nota: Debido a la inestabilidad del gel se recomienda para manejar el paso previo con dos personas. Una persona debe llevar a cabo el baño de tinción junto a la mesa de la UV y otra debe llegar bajo el gel con ambas manos, llevarlo a cabo y deslícelo sobre la tabla de la UV. - Cierre la tapa o puerta del sistema de documentación y tomar una fotografía según el fabricante ' s manual de instrucciones.
5. Detectar múltiples ingestión recientemente grupos de presas en paralelo con fragmento automatizado análisis.
- Analizar el contenido de la tripa ADN extractos utilizando la cartilla específica de grupo 16 establece determinado en la tabla 2, con un primer de un conjunto marcado debido a la modificación con un colorante tinción (ver tabla 2 columna titulada modificación) y utilizar los métodos de detección paralela de un secuenciador automatizado.
- Uso la solución de extractos de ADN (preparados según pasos 1.1 a 1.3.11) y conducta separados PCRs para cada cartilla como se describe en pasos 2.1.1 a 2.1.5 (variaciones en la mezcla se dan en la tabla 2). Utilizar al menos un control con ADN puro de un espécimen perteneciente al grupo de blanco respectivo (control positivo) y un control negativo con el puro ADN de las especies de consumo en cada PCR ejecutar.
- Run PCR en termociclador usando el protocolo estándar de PCR en paso 2.1.4, ajustada a la respectiva temperatura de recocido (y el número de ciclos) para cada primer conjunto dado en la tabla 2.
Nota: Utilizar la misma asignación de ADN de los pocillos de reacción para PCR con cada uno de los 16 conjuntos de diferentes cartilla para simplificar el posterior puesta en común de productos de la PCR para procesar por lotes automatizado análisis de fragmento.
Productos de - tienda PCR a-20 ° C hasta todos los PCRs pertenecientes a un lote para el análisis automatizado del fragmento (ver tabla 2) se acaban. Mantener los productos PCR en la oscuridad y no guardarlas más de 1 semana antes del análisis del fragmento.
tabla 2: información de los 2 lotes de 15 pares de primer grupo-específica establecido por Koester et al. (2013) y el nuevo diseño Jae28S primer par amplificar regiones del rDNA 18S o 28S de 16 grupos de macroinvertebrados acuáticos. f, cartillas de avance; r, cartillas inversas; 18 años, cartilla apunta a la subunidad de ADNr 18S; 28S, primer objetivo los 28S subunidad ADNr. " Clegg, es Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) un ' camarón asesino ' en el sistema del río Rin?, 768, 2016, tabla S1, material complementario página 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer Internacional editorial Suiza 2015) " con autorización de Springer. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
- para detectar los fragmentos amplificados de todos los conjuntos 16 primer realizar análisis automatizado del fragmento en los 2 lotes dados en la tabla 2. Utilizan un estándar de tamaño interno (Kit estándar de tamaño de DNA - 400 [lote B] y - 600 [lote A], respectivamente) para determinar la longitud del fragmento. Preparar la placa de la secuencia y secuenciador automático como se describe en los pasos siguientes. Tenga en cuenta que este procedimiento podría tener que ajustar si se utiliza otra plataforma que en la tabla de materiales.
- Para ejecutar cada lote de muestras, preparar una mezcla que contiene solución de carga de muestra (SLS) y el respectivo tamaño estándar. Pipetee 21,6 μl de SLS y 0,4 μL de ADN tamaño Standard Kit - 600 por muestra del lote A y, respectivamente, 21,7 μl de SLS y 0,3 μl de ADN tamaño Standard Kit- 400 por muestra de lote B.
- Tomar los productos PCR de las 8 PCRs perteneciente al lote respectivo fuera del congelador y descongelarlos. Garantizar que se conservan en la oscuridad.
- Utilizar una pipeta microlitros para cargar el número de pocillos de una placa de la secuencia necesitada (número de muestras a analizar) con cada 22 μL de la mezcla respectiva descrita en el paso 5.2.1. Desactivación de los productos PCR de cada uno de los 8 PCRs utilizando la opción de funcionamiento corto de una centrifugadora de mini (placa). Transferir cada 1 μl producto de PCR de cada uno de los 8 PCRs en los respectivos pocillos de la placa de la secuencia con una pipeta de microlitros.
- Con cuidado girar por esta mezcla dentro de la placa de la secuencia con un corto plazo de una centrífuga de plato mini y superposición de cada uno de los pocillos usados con una gota de aceite mineral. Respectivos pocillos de una placa de búfer se llenan de 250-300 μL de tampón de separación de ADN de.
- Utilizar el software para el secuenciador capilar para crear una configuración de muestra según el fabricante ' instrucciones. Asignar los métodos que muestra sistemas de control y determinar la secuencia de métodos que se utilizarán para procesar los datos (ver tabla 3 para el funcionamiento de las condiciones adecuadas para el uso con el tamaño estándar indicado en la Tabla de materiales). Tenga en cuenta que es fundamental que la asignación de las muestras dentro de la instalación de la muestra coincide con la asignación de la muestra en la placa de la secuencia (incluyendo controles positivos y negativos, vea el paso 5.1.1) y que el método adecuado para el fragmento se analiza con el respectivo tamaño estándar es elegido.
- Llenar una bandeja de humedecimiento con agua desionizada e inserte la placa de la secuencia, placa de búfer y mojar la bandeja en el secuenciador capilar. Inserte un cartucho de gel que contiene una cantidad suficiente de gel fresco de la separación de ADN que se necesita para la muestra ejecutar. Funcionamiento de la placa de la secuencia con la instalación de muestra preparada.
| desnaturalizar | separado | Capilar | inyectar | ||||
| Temperatura | tiempo | tensión de | tiempo | voltaje | tiempo | ||
| tamaño estándar 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 min | 50 º C esperar a que Temp: sí | 2.0 kV | 30 s |
| tamaño estándar 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 min | 50 º C esperar a que Temp: sí | 2.0 kV | 30 s |
tabla 3: condiciones específicas para el análisis del fragmento sobre el secuenciador automatizado utilizando los estándares de tamaño en la tabla de materiales.
- analizar los resultados exportar datos y cargar los datos en el programa de análisis de un fragmento. Elegir tinte estándar órdenes de color de los respectivos fabricantes para establecer canales de color de tinte.
- Crear un Panel que el rango de la longitud del fragmento amplificado por el primer grupo-específica solo establece dentro de un lote según el manual del usuario del programa.
- Para procesar los datos, seleccione el Panel respectivo estándar de tamaño adecuado, color estándar y tipo de análisis y ejecutar un procedimiento. Elija la opción del electroferograma para mostrar intensidades de la señal fluorescente de los instrumentos de electroforesis capilar como un rastreo único para cada color de tinte. Conjuntos de marcadores de la cartilla se muestra indicando el rango respectivo fragmento y se resaltará la longitud exacta del fragmento detectado asociado con el centro de cada pico llamado (en la mayoría de los programas por coloración o nombre asignado) automáticamente.
- Para cada muestra, calcular cuánto la muestra ' s interna tamaño estándar coincide con el estándar de tamaño seleccionado para asegurar el éxito de la convocatoria de tamaño. La mayoría fragmento análisis de programas tienen la opcion de calcular y visualizar al partido automáticamente. Si el llamado tamaño error, repetir fragmento análisis de las muestras.
- Visualmente Revise el electroferograma de cada muestra y confirmar/unconfirm cada pico llamado para cada marcador/primer set por separado. Inserte manualmente picos fuera de lugar que cumplan los criterios de un sistema de marcador/cartilla o eliminar equivocadas según el manual del usuario del programa utilizado. Aplicar el nombre de tamaño o bin de pares en el ' etiqueta del alelo '. Calcular y mostrar las especificaciones de pico en la ' tabla de pico '.
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Representative Results
Hemos utilizado con éxito pasos descritos en este protocolo para el análisis de la dieta en diferentes estudios. En esta sección, presentamos ejemplos que describe la aplicabilidad de las distintas secciones del protocolo.
Por ejemplo, para demostrar la efectividad de los sistemas de primer grupo-específica establecida por los autores28 y el potencial de mayores aguas abajo análisis de productos PCR por análisis SSCP, se realizó un experimento de alimentación. Individuos de Dikerogammarus villosus Caenis spp. larvas como presas y depredadores fueron capturados en el río Rin y aguas estancadas cerca de Karlsruhe (Alemania). En el laboratorio, depredador y presa taxa fueron guardados por separado en agua corriente filtrada a 20 º C y fueron muerto de hambre durante 36 horas. Para el experimento, los especimenes de anfípodo se colocaron en vasos de precipitados con agua corriente filtrada (100 mL) individualmente, alimentados con larvas de Caenis de dos a tres por 30 min y posteriormente congelado en nitrógeno líquido. El tracto gastrointestinal de cada villosus D. fue diseccionado y se extrajo el ADN como se describe en el protocolo 1. Extractos de ADN probaron con la cartilla de Caep28S set adecuada detectar Caenis spp mediante el correspondiente PCR protocolo28 como se describe en el protocolo 3. Para comprobar las diferencias entre fragmentos amplificados de diferentes especies de Caenis , PCR se llevó a cabo con las muestras de contenido intestinal y puras muestras de ADN de tres especies de referencia Caenis . Electroforesis del gel de agarosa a solo bandas de doble trenzada DNA, que no se pueden distinguir entre las diferentes especies de Caenis con este tipo de electroforesis (figura 2A). En cambio, por electroforesis en gel SSCP, tal como se describe en el protocolo 4, fue posible identificar organismos presa a nivel de especie mediante la comparación de las muestras de contenido intestinal con las muestras de referencia (figura 2B). El patrón de SSCP fragmento de los tres taxa de referencia Caenis beskidensis (figura 2B, carril 1), Caenis efectiva (figura 2B, carril 2), y Caenis luctuosa (figura 2B, carril 3) consistió de cuatro bandas con patrones diferenciables. Dos muestras de contenido intestinal (figura 2B, carril 4 y 5) tenían un patrón de fragmento igual a la de C. luctuosa (figura 2B, carril 3). El patrón del fragmento de la tercera muestra de contenido intestinal (figura 2B, carril 6) era idéntico a la de C. efectiva (figura 2B, carril 2). Análisis de la secuencia de los dos la tripa contenidas muestras identificadas como C. luctuosa y C. efectiva (figura 2B, carril 4 y 6) y la especie de referencia respectivos verifica este resultado (véase suplemento electrónico alineación fasta archivo).
Figura 2: Imagen original de electroforesis en gel de agarosa (A) y el análisis SSCP (B) de PCR los fragmentos del contenido del intestino y amplificaron de muestras de referencia con el conjunto de la cartilla de Caep28S. Carriles 1-3 muestran las muestras de referencia de la especie Caenis beskidensis (1) (2) efectiva de Caenis y Caenis luctuosa (3). Carriles 4-6, se presentan el patrón de fragmento de muestras contenido intestinal diferentes de anfípodo Dikerogammarus villosus . Carril 7 muestra el patrón del fragmento de una escalera de DNA 100 bp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Además, se realizó un experimento de laboratorio en que el agua los ácaros pertenecientes a la especie Hygrobates fluviatilis fueron alimentados en quironómidos larvas no sólo determinan si se puede detectar ADN de individuos de quironómidos consumidas en los ácaros de agua, pero también comprobar si la cantidad de ADN detectado depende del tiempo transcurrido desde el consumo de la presa29. Después de dejar de comer a los ácaros durante aproximadamente una semana, cada ácaro ofrecieron una larva de quironómidos como alimento. Cada 3-4 individuos de ácaro de agua fueron fijados en etanol (absoluto) para el análisis genético utilizando el conjunto de la cartilla de Chiro18S específicas al díptero Chironomidae familia28 en 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 y 50 h después alimentadas29. Como un grado de consumo por los individuos de ácaro de agua, las personas presas respectivas se clasificaron en las siguientes cinco categorías de alimentación: 1 = totalmente aspirado, tegumento completamente vaciada (> 90%), 2 = casi totalmente aspirado hacia fuera (> 75-90%), 3 = semi aspirado hacia fuera (> 50-75%), 4 = sólo parcialmente succionado hacia fuera (> 5-50%), 5 no = cambios visibles en cuerpo estructura (≤5%)29 de la presa. Se extrajo ADN de los ácaros de agua como se describe en el protocolo 1 (sin pasos 1.2.1 y 1.2.2) y la presencia del rDNA 18S en el extracto y la eficiencia funcional de la plantilla fueron verificadas como se describe en el protocolo 2. Detección de ADN se realizó según el protocolo 4 utilizando sólo la Chiro18S con la cartilla adelante la cartilla etiquetada con presa un fluorescente tinte (ver tabla 2) y el Kit estándar del tamaño de ADN - 400. Para permitir comparaciones entre muestras analizaron dentro de diferentes funcionamientos de un secuenciador automatizado, la relación entre la altura del pico de muestra y la altura de la más cercana de estándar interno (es decir, 360 bp en este caso) de cada muestra se calcula y utiliza como un servidor proxy para la cantidad de ADN detectado. Los resultados mostraron que ADN de quironómidos era perceptible en prácticamente todos los individuos de Hygrobates fluviatilis se alimentan de larvas de quironómidos29. Del intervalo más corto (1 h después de la alimentación) para el período más largo después de alimentación (50 h) de la cantidad relativa de ADN detectado presa fue significativamente había reducida (Figura 3A)29. Además, la relación entre el tiempo después de la alimentación y la clasificación de la presa como una proxy de la cantidad ingerida de presa que ADN podría ser confirmada (figura 3B)29. La reducción de presas ADN detectado con el aumento de tiempo después de la alimentación fue muy probablemente totalmente reflejada por la degradación del ADN y la digestión de la presa, porque aprovechan de egestion de ADN es altamente improbable debido a la falta de un ano en el agua los ácaros29. Estos resultados confirman la idoneidad de este enfoque para la cuantificación de la presa ingerida.
Figura 3: Las relaciones entre la nacional ln-relación entre la altura (altura del pico de pico de muestra alturas estándar360 ) y (A) tiempo después de la alimentación de los ácaros y categoría alimentación (B) (n = 23). "Presa de Experimental y aplicada Acarology, primera detección de DNA en Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): un nuevo enfoque para la determinación de las relaciones depredador-presa en ácaros del agua, 67, 376, P. Martin, M. Koester, L. Schynawa, R. Gergs, (© Springer internacional editorial Switzerly 2015) "con autorización de Springer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para investigar la importancia de la depredación por el anfípodo invasor D. villosus en los análisis de isótopos estables de campo, intensivo de δ13C y δ15N de D. villosus y potenciales recursos alimenticios se amplió por molecular detección de la presa recientemente ingerido en el contenido intestinal de los mismos individuos exactos. En total, 206 villosus D. individuos de diferentes sitios fueron recogidos y el tracto gastrointestinal de cada individuo fue diseccionado y ADN fue extraído según el protocolo 1. Se aseguró la presencia y la eficiencia funcional de las plantillas que se utilizan como se describe en el protocolo 2. Reciente depredación por los individuos de D. villosus en varios taxa de presa de macroinvertebrados fue probada como se describe en el protocolo 4. En general, sólo el 16% de los contenidos del intestino villosus D. probado positivo para la DNA pertenecientes a cualquiera de los taxa de presas 16 de macroinvertebrados dirigida y apoyada por lo tanto los resultados de los análisis de isótopos estables que indican un bajo comportamiento de alimentación depredador de los anfípodos invasores en el campo27. Mientras que, dentro de los análisis genéticos, ADN de 12 taxones presa probados fue encontrado en muestras de contenido intestinal por lo menos 1, ADN de los otros 4 taxa de presa nunca fue detectado (figura 4)27.
Figura 4: Histograma que ilustra el respectivo número de individuos de D. villosus de diez todos los sitios cuyo contenido intestinal probaron el positivo para macroinvertebrados presa ADN. PCR se llevó a cabo con 16 conjuntos de primer grupo-específica tal como se indica. "Clegg, es Dikerogammarus villosus (crustáceos Gammaridae) un 'camarón asesino' en el sistema del río Rin?, 768, 2016, 310, Meike Koester, Bastian de Bayer, Gergs René, (© Springer internacional editorial Suiza 2015)" con el permiso de Springer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario. Sequence_alignement_feeding_trial.FASTA por favor haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí, presentamos un método fácil y costo-eficiente para la polimerización en cadena-basado determinación de interacciones depredador-presa de muestras de campo a través de cartillas de Grupo-específicas para las regiones de ADNr, que pueden combinarse con otros análisis no moleculares de las mismas muestras. Sin embargo, hay varios pasos críticos dentro del protocolo. En primer lugar, es esencial asegurar la especificidad de los cebadores utilizados. En segundo lugar, es crucial para evitar la contaminación y pérdida de material de contenido intestinal durante la preparación del tracto gastro-intestinal y la posterior extracción de ADN. Mientras Cruz muestra contaminación puede conducir a detecciones positivas falsas de ADN de presas, pérdida del intestino contenido material podría dar lugar a falta raramente consume presas. Verificación de la presencia de ADNr que pertenece a la subunidad correspondiente y la eficiencia funcional de las plantillas que utiliza para el análisis (sección 2 del Protocolo) es esencial para la recogida de información representativa sobre la presa consumida. Esto es particularmente crucial, si no hay ADN de grupos de presas, que el consumo se supone que se alimentan puede ser detectado25,27. Además, durante la preparación de PCRs (pasos 3.1, 5.1.1 y 5.1.2) es crucial que la mezcla y el protocolo utilizado exactamente caben los criterios en que la respectiva cartilla fue especificada para un cierto grupo de taxones. De lo contrario, amplificación de la DNA en la reacción de PCR puede fallar completamente, o el ADN de especies no objetivo puede ampliarse así. Por lo tanto, es obligatorio el uso positivo y controles negativos en cada PCR asegurar que la reacción de PCR trabajado y contaminación no ocurrió. Además, es necesario que la matriz de las muestras para cada serie PCR se documenta exactamente para permitir la correcta asignación de presa consumida a la muestra de consumidores respectivos. Para esta tarea particular precaución debe tenerse y agrupación de productos PCR para la detección paralela de múltiples grupos de presas mediante análisis automatizados de fragmento (paso 5.2.3).
Para la detección de fragmentos amplificados mediante gel de agarosa electroforesis (pasos 3.2 y 3.3) agarosa geles deben ser lo más delgados posible y cuidado debe tenerse durante la inspección visual de la imagen para evitar que faltan fragmentos con baja resolución visual. Para obtener resultados y una conclusión apropiada sobre el consumo de presas por un consumidor, es crucial que incluso raramente consumen presas taxa están siendo reconocidos. Geles de agarosa gruesa disminuyen la visibilidad de potencialmente bajas cantidades de ADN de la presa y así reducen la probabilidad para perder presa raramente consumido e introducir incertidumbres en las conclusiones del análisis. Además, desde una perspectiva de salud, utilizando una alternativa menos - o no-tóxicos que bromuro de etidio para la tinción de los geles puede ser recomendable. El protocolo para posterior análisis aguas abajo más de fragmentos amplificados mediante análisis SSCP utilizando geles de poliacrilamida incluye algunos pasos que deben realizarse con mucha precaución. Es importante que gel cassette montado es prueba de fugas (paso 4.1.3) y la solución de poliacrilamida se da suficiente tiempo para polimerizar totalmente (paso 4.1.6). Abrir demasiado pronto el cassette llevará a fugas de solución de acrilamida líquida y, a pesar de que la preparación tiene que empezar desde el principio, extenso limpieza hay que hacer así. Además, transferir el gel de poliacrilamida en el baño de tinción (paso 4.7) y desde allí sobre la mesa (paso 4.8) de UV deben hacerse muy cuidadosamente debido a la inestabilidad de estos geles. De lo contrario, el gel puede rasgar y fragmentos podrían verse interrumpidos, que conduce a la necesidad de repetir el procedimiento.
Un requisito importante para procesar con éxito datos de análisis automatizado del fragmento es que de la muestra interna tamaño estándar estrechamente coincide con el patrón estándar de tamaño dado por el fabricante (paso 5.3.3) para permitir la determinación de la longitud del fragmento apropiado. Esto es especialmente crucial porque de lo contrario, diferentes fragmentos, con el mismo fluorescente manchas tinte, podrían asignarse a los taxa de presas mal y por lo tanto conducen a un error en el cálculo completo de las interacciones depredador-presa. Además, electropherograms demuestran a menudo el ruido de fondo. Para establecer la confianza en la interpretación, es esencial que los picos del estándar tamaño interno son significativamente mayores que el ruido de fondo de la muestra. En consecuencia, picos para cada marcador/cartilla deben contarse sólo si son significativamente más altos que el ruido de fondo.
Este protocolo puede ser modificado para detectar varios grupos de taxa de presa de intereses dentro de los diferentes consumidores de interés. Es cierto que cebadores específicos de grupo no ya pueden estar disponibles para cada taxón de presas potenciales de interés. Sin embargo, están disponibles no sólo para varios macroinvertebrados de agua dulce taxa28, sino también para una amplia gama de otros taxa cebadores específicos de grupo (por ejemplo, varios taxa de macroinvertebrados marinos16,30 y taxones comunes de vuelo insectos31). De tal modo, la selección del primer grupo-específica establece adecuada amplificar ADN de todas las especies de presa de un taxón determinado, pero sin éxito en la amplificación de ADN de especies no pertenecientes a este taxón, es esencial32. Muchos cebadores específicos de grupo que ahora están disponibles han sido especificados para una determinada gama de taxones (p. ej., 130 taxones de macroinvertebrados de agua dulce común en el sistema de río Rin28). Por lo tanto, para evitar resultados falsos negativos o falsos positivos, la especificidad de estos iniciadores se debe revisar para la gama de taxones comunes en el ecosistema de interés antes de su uso para target taxa y los consumidores no incluidos en el rango de los taxones de que los cebadores se habían establecidos. Además, los análisis moleculares no se puede combinar con otros análisis de la exacta misma individual, la disección del tracto gastrointestinal pueden ser saltados.
Sin embargo, disección del tracto gastrointestinal de los especímenes más grandes también previene la falta de extracción de ADN debido a demasiado material y reduce la presencia de consumidores-ADN en el extracto de la muestra. Sin embargo, estudios han demostrado que utilizando iniciadores específicos de bloqueo, que coloque en el ADN del consumidor y así, bloquear la reacción de PCR puede realzar con eficacia la amplificación de secuencias raras en muestras mixtas33. Por lo tanto, la disección del tracto gastrointestinal puede evitarse, incluso tratándose de especímenes más grandes de consumidores, por el uso de iniciadores específicos de bloqueo. Para la detección paralela de amplicones derivados de varios conjuntos de primer grupo-específica a través de análisis automatizado del fragmento, se debe tener cuidado en la elección de coloración de tinte como etiqueta. Por lo tanto, primer sistemas de amplificación de fragmentos de aproximadamente la misma longitud deben ser marcadas con colorantes fluorescentes claramente distinguibles. Por otra parte, hay una gama de sistemas de electroforesis capilar disponibles de varios fabricantes. Supuestamente, algunos de estos sistemas permiten la determinación de múltiples fragmentos incluso mediante tintes inespecíficos. El protocolo que presentamos podría ser ajustado fácilmente para detectar los fragmentos amplificados con cualquiera de esos sistemas. Aparte de eso, para reducir el tiempo necesario para tanaliza, sería posible optimizar ensayos simple multiplex-PCR para amplificar ADN de grupos de presas de lote de análisis de un fragmento simultáneamente (por ejemplo, la amplificación simultánea de 12 organismos presa de escarabajos34 o hasta seis voladores insectos taxa31).
Una desventaja potencial de análisis de contenido de la tripa en general, y por lo tanto también los análisis descritos en este protocolo, es la baja resolución temporal. Con tales métodos, sólo es posible identificar organismos recientemente ingeridos, que podrían dar lugar a incertidumbres en la importancia de la presa solo organismos2. Sin embargo, hemos demostrado que el análisis genético según este protocolo se puede combinar fácilmente con análisis de isótopos estables (δ15N y δ13C) del exacto mismo consumidor ejemplares25,27. Como un integración de tiempo natural trazador de las interacciones depredador-presa, análisis de isótopos estables se utilizan con frecuencia para caracterizar estructuras de red trófica1, pero potenciales valores isotópicos superposición de especies presa diferentes a menudo impiden una exacta definición de depredador-presa interacciones2. Por lo tanto, usando este protocolo para análisis genéticos en combinación con análisis de isótopos estables para superar las desventajas de cada método puede más nuestra comprensión de redes de alimentación y su relación con los flujos de nutrientes o energía.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Silke Classen del Instituto de investigación para el análisis de ecosistemas y evaluación (gaiac), RWTH Aquisgrán para su asistencia en el establecimiento de los conjuntos de primer grupo específico utilizado en el presente Protocolo. También agradecemos a Peter Martin y Laura Schynawa de la Universidad de Kiel para la colaboración en los experimentos de los ácaros de agua. También agradecemos a los asistentes de laboratorio técnico para mantenimiento de laboratorio funcionando sin problemas y preparar el registro de empresas y números de catálogo. Este trabajo fue financiado por la Fundación de investigación alemana (DFG; proyecto GE 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
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