Summary
Наиболее распространенными кишки контент анализ мелководьях визуальные. Требующей интенсивных знаний о морфологическое разнообразие хищных организмов, они пропустите мягкой здоровых добычу и, из-за сильного измельчение хищных, почти невозможным для некоторых организмов, в том числе амфиподы. Мы предоставляем подробные, Роман генетических подходов для macroinvertebrate добычу идентификации в рационе амфиподы.
Abstract
Анализ пищевых сетей имеет важное значение для более глубокого понимания экосистем. Например пищевой сети взаимодействия могут пройти серьезные изменения, вызванные вторжения неместных видов. Однако во многих случаях трудно точной идентификации поля хищник жертва взаимодействий. Часто эти анализы основаны на визуальная оценка содержимого кишечника или анализ соотношения стабильных изотопов (δ15N и δ13C). Такие методы требуют всесторонних знаний о, соответственно, морфологическая разнообразия или изотопном подпись от отдельных хищных организмов, ведущих к препятствий в точной идентификации хищных организмов. Визуальные кишки содержание анализа особенно недооценивать мягкой здоровых хищных организмов, потому что мацерации, проглатывание и пищеварение хищных организмов затрудняют выявление конкретных видов. Следовательно, полимеразная цепная реакция (ПЦР) на основе стратегий, например использование группы специфического праймера устанавливает, обеспечивают мощный инструмент для исследования пищевой сети взаимодействия. Здесь мы описываем подробные протоколы для расследования содержимое кишки macroinvertebrate потребителей от поля, используя наборы группа специфического праймера для ядерных рибосомных дезоксирибонуклеиновой кислоты (рДНК). ДНК может быть извлечено из всей образцов (в случае малых таксонов) или из содержимого кишечника образцов, собранных в поле. Присутствие и функциональной эффективности ДНК шаблонов необходимо подтвердить непосредственно из протестированных личности с использованием универсальная грунтовка задает ориентации соответствующих субъединицы ДНК. Мы также продемонстрировать, что потребляемая добычей могут быть определены, далее до уровня видов через PCR с неизмененной группа специфические праймеры в сочетании с последующей одиночной стренги конформации полиморфизм (SSCP) анализа с использованием полиакриламидных гелей. Кроме того мы показываем, что использование различных флуоресцентных красителей как этикетки позволяет параллельный скрининг для фрагментов ДНК различных хищных групп из нескольких образцов контента кишки через анализ автоматизированной фрагмент.
Introduction
Хищник жертва взаимодействий, которые составляют большинство трофических взаимодействий и пищевой сети динамики, являются ключевыми для характеристики потоков материи и энергии в пищевых цепях внутри и между экосистемы, которая является одной из основных целей экологии 1. Определение источника и потоков углерода и питательных веществ углубление понимания экологических связи между экосистем2. Однако экосистем, таких как реки и их водосборных бассейнов, связаны не только потоков органического вещества и питательных веществ, но и движениями организмов3. Таким образом изменения среды обитания, прерывания потока ресурсов, которые связывают этих систем может сильно изменить пищевых цепях как экосистем, не только непосредственно, но также косвенно, изменяя состав соответствующих общин хищник жертва. Например изменения трофических было показано, быть связаны с движениями хищника одного вида (например, радужная форель)4. Такие изменения потенциально угрожает биоразнообразию и функционирование водных экосистем. Таким образом анализируя хищник жертва взаимодействия в области важно определить воздействие антропогенных изменений окружающей среды, например практики водопользования, на родной биоразнообразия водных экосистем.
Поскольку отслеживание трофических связей является сложным в сложных системах, несколько подходов были созданы, которые позволяют оценку кормления взаимодействий в поле5. Традиционно исследования взаимодействия в области кормления основаны на визуальной идентификации останков добычу в расчлененных кишки и требуют обширные знания о разнообразии морфологической добычу. Визуальные кишки содержание анализа оказали идеи использования ресурсов нескольких групп потребителей (например, сезонные изменения в диете омаров6 и рыбы7,8 или кормления предпочтений копепод). Однако физический процесс пищеварения затрудняет анализ содержания визуальные кишки и обычно пропускает мягкой здоровых хищных организмов9. Для видов кормления при попадании жидкости или некоторых беспозвоночных потребителей, которые интенсивно измельчения их пищи до приема пищи, как амфиподы визуальная идентификация хищников в кишечнике содержимое является невозможным10. Из-за этих ограничений молекулярный анализ обеспечивает перспективные альтернативы.
Молекулярный анализ теперь стали общий инструмент, позволяющий добычу быстрого и точного обнаружения в кишечнике содержимое. Спектр таких методов разнообразен: стратегии, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) или моноклональные антитела часто используются, из-за их высокой чувствительности и специфичности11. Развитие новых моноклональных антител требует больших затрат времени и стоимости, поэтому, применение других методов молекулярной более полезным, когда антитела уже не существуют11. Другой распространенный подход является усиление регионов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), как в большинстве видов, используя универсальный грунт генов рибосомной рибонуклеиновой кислоты (РНК) устанавливает12,13. При использовании этого метода, это часто не позволяет выявить целый ряд хищных организмов в рамках смешанных источников ДНК14. Эффективный подход к избежать такой недостаток — использовать группы специфического праймера наборы для анализа генетических кишки содержание. Предназначен для усиления только ДНК регионах конкретных целевых групп и исключения всех других видов15,16, Группа специфические праймеры позволяют идентификацию хищных организмов на таксономический уровень указанных групп без вторичный анализ требует больших затрат времени и стоимости. Однако как все кишки контент-анализ, такой анализ предоставляют только снимок кормления поведение. Таким образом сочетая молекулярной кишки содержание анализа с анализом времени интеграция естественных Трейсеры (например, стабильные изотопы) считается полезным1,2.
Здесь мы описываем подробный метод для проведения расследований на основе ПЦР хищник жертва взаимодействий с использованием наборов группа специфического праймера для ядерных рибосомной ДНК (рДНК) регионов сочетаться с анализом стабильного изотопа же образца. Мы описываем обнаружение ДНК одного хищных групп через электрофорез геля агарозы. Кроме того мы представляем возможность для дальнейшего течению анализ продуктов ПЦР из таких групп специфические праймеры применимых всякий раз, когда требуется высокий таксономический разрешение чем специфика грунтовки. Потому что один мель ДНК (ssDNA) фрагменты формы третичного конформации, которые определяются их первичной последовательности17, небольшие вариации в фрагментах усиливаются такие группы специфические праймеры привести к конформационные изменения. Такие изменения могут быть обнаружены анализами полиморфизм (SSCP) конформации одиночной стренги полиакриламидных гелей17,18, что позволяет более точное определение хищных организмов (вплоть до уровня видов).
В то время как электрофорез геля агарозы является общим и недорогой инструмент для визуализации фрагментов ДНК и определить их Приблизительная длина19резолюции зависит количество ДНК и окрашивание красителем используется20. Обычно визуализация это прямо вперед, при работе с чистой образцов ДНК, но потенциально низкое количество хищных ДНК в кишечнике содержимое потребителей может осложнить скоринга результаты электрофореза геля агарозы. Тем не менее, этот метод обнаружения осуществима на экране низкое количество потребителей образцов из поля для одного или несколько охотятся группами, но осложнение в скоринга делает скрининг большое количество образцов для нескольких добычу таксонов чрезвычайно время интенсивных и таким образом неосуществимой. Более чувствительным методом обнаружения является автоматизированный анализ фрагментов через капиллярного электрофореза, который дополнительно позволяет определить точную длину фрагментов21. Несколько микроспутника на основе исследования показали, что с помощью различных флуоресцентных красителей как этикетки, это можно обнаружить и определить различные фрагменты сопоставимых длины путем автоматического фрагмента анализ22,23, 24. Таким образом мы также представить подробный протокол для параллельных обнаружение ДНК из нескольких добычей групп с помощью ПЦР с метками группа специфического праймера наборы и обнаружения через анализ автоматизированной фрагмент с автоматизированной программы sequencer. Кроме того мы представляем результаты тематического исследования, показывающие, что обнаружение ДНК добычу через анализ автоматизированной фрагмент является подход, который позволяет также относительное количественная оценка попадает хищных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. собирать мелководьях от области и подготовить образцы для анализа содержания генетических Gut.
Мелководьях- собрать на каждом сайте, разобраться особей видов потребительского интереса в одной пробирки и заморозить их непосредственно в жидкого азота или сухого льда для предотвращения кишки и деградации ДНК.
Примечание: Избегайте хранения образцов в спирте, потому что некоторые мелководьях склонны извергнуть перед алкоголь убивает их. - Использовать только желудочно кишечного тракта, средних и больших (приблизительно > 3 мм) macroinvertebrate видов для анализа содержания генетических кишечник так оставшийся вопрос образца могут быть использованы для других процедур (например, стабильный изотоп анализ). Обратите внимание, что это не применимо при расследовании очень маленькие таксонов как водных клещей. Таким образом, можно пропустить шаги 1.2.1 и 1.2.2.
- Слегка размораживание индивидуума и тщательно анализировать его желудочно кишечного тракта под стереомикроскопом, используя пинцет тонкой из нержавеющей стали. Убедитесь, что не протыкайте желудочно кишечного тракта, чтобы избежать потери материи.
- Чистые пинцет с помощью решения очистки для удаления загрязнений ДНК и РНК после подготовки каждой желудочно кишечного тракта. Таким образом Инкубируйте щипцы для 10 минут в растворе обеззараживания. Затем промыть стерильной водой для удаления остаточных следов и протереть безворсовой салфеткой.
- Передачи расчлененных желудочно-кишечного тракта к реакции Сейф Блокировка 2,0 мл трубки содержащих 440 мкл (450 мкл возможности для использования повторяющихся пипеткой) добыча соли буфера [SEB; 0,4 М хлорид натрия (NaCl), 10 мм (гидроксиметил) трис-aminomethane гидрохлорид (Tris-HCl) pH 8.0 и 2 мм этилендиаминтетрауксусная динатриевая соль дигидрат (ЭДТА) рН 8,0]. Подготовлены образцы в магазине − 20 ° C сразу до экстракции ДНК. Убедитесь, что в течение нескольких дней будут извлечены ДНК.
- Использовать измененные высоким соли извлечения протокол 25 для извлечения ДНК.
- Взять образцы из морозильника. Использовать щипцы для добавления один шарик нержавеющей стали 5 мм в каждую пробирку образца и оставить на скамейке при комнатной температуре (RT) таять замороженных образцов. Используйте бисерная мельница для гомогенизации образцов за 1 мин 15 Гц.
- Спина вниз образцы с краткосрочной перспективе центрифуги. Использование пипетки микролитр для добавления 90 мкл (100 мкл для использования повторяющихся пипеткой) 10% натрия Додециловый сульфат раствор (СДП) и 5 мкл 10 мг/мл протеиназы K.
- Водоворот образцы тщательно и инкубировать смеси за 1 ч, при 60 ° C с постоянной тряски на 400 об/мин на thermomixer. Кроме того, тщательно вихревой образцов каждые 10 мин для дальнейшего содействия лизис.
- Спин вниз образцы с краткосрочной перспективе центрифуги, мкл 350 5 М NaCl с микролитр пипетки и вихревой тщательно для примерно 0,5 - 1 мин центрифуги образцов для 40 мин на 16200 x g на 5 ° C.
Примечание: Если несколько наборов в строке должны быть сделаны, температуру центрифуги должен быть слегка приподняты (не выше 10 ° C), потому что SDS, как правило, flocculate если температура слишком низка. - Использование микролитр пипетки для передачи примерно 600 мкл супернатант в новой трубки реакции 1,5 мл. Будьте осторожны, чтобы не удалить что-нибудь из гранул.
- Наконечник из нержавеющей стали бусы из трубы реакции в стрейнера чая нержавеющей стали, очистить их проточной водой и инкубировать их в чашке Петри с решением дезактивации для 10 минут тщательно смойте обеззараживания решение с стерильных вода и хранить очищенную бусины в этаноле (> 99%, п.а. класс) или сухой до повторного.
Примечание: Очистка из бисера не нужно быть сделано непосредственно в этот шаг, но скорее может быть сделано, когда есть время ожидания в следующих шагах. - Добавить 600 мкл ледяной изопропиловый спирт (п.а. класс) в надосадке с микролитр Пипетка и осторожно перевернуть трубку пару раз. Хранить образцы ночь в -20 ° с.
- Взять образцы из морозильника и центрифуги их за 20 минут, превышающего 16.200 × g и комнатной температуре. Тщательно удалить супернатант и сухой трубку осторожно с безворсовую салфетку. Обратите внимание, что если окружающий температура высокая (более 25 ° C), центрифуги на 5 ° C, чтобы избежать скольжения во время выброса супернатант гранулы.
- Мыть гранул содержащий ДНК с 70% этиловом спирте. Чтобы сделать это, добавьте 200 мкл ледяной этанола (70%, п.а. класс) с помощью пипетки микролитр и центрифуги образцы для 10 мин на 16 200 x g и комнатной температуры (или 5 ° C, если это необходимо). Тщательно удалить супернатант и сухой трубку осторожно с безворсовую салфетку. Использование пипетки 10 мкл скорректирована с приблизительно 8 мкл для тщательно Пипетка от оставшихся супернатант. Убедитесь в том, чтобы не мешать гранулы.
- Сухие гранулы примерно 5-20 мин при 60 ° C или при комнатной температуре на скамейке, до тех пор, пока все этанола выпаривается.
- Гранул растворяют в 50-100 мкл нуклеиназы бесплатно (паровой стерилизации и лечить DEPC) вода (ddH 2 O), ждать по крайней мере 1 h (хотя лучше результаты будут получены на ночь при 4 ° C).
- Измерить количество ДНК, содержащихся в каждой пробе с микро объем спектрофотометр, по словам производителя ' s инструкции. Сделать рабочий разбавления каждого образца, содержащий около 2-10 нг ДНК / мкл. Держите Стоковый раствор в холодильнике. Сохранить рабочий раствор в холодильнике и убедитесь, что дальнейшие примеры обработка выполняется вскоре.
2. Проверьте работоспособность ДНК-экстрактов для последующего обнаружения недавно попадает хищных.
- Для обеспечения присутствия и функциональной эффективности шаблонов, проверить каждый ДНК экстракт (шаги 1.1 для 1.3.11) используя универсальный грунт устанавливает подходящий для источника соответствующих пищи (например, беспозвоночных 16 , 26) который ориентируетесь же ядерного Субблок как группа специфического праймера, используется для последующего обнаружения добычу 25 , 27. Следующие действия ссылаются на использование универсальная грунтовка наборы NSF1419/20 и NSR1642/16 16 и ЛГУ D1, D2 fw1 и LSU D1, D2 rev2 или LSU D1, D2 rev4 26. Чтобы доказать, что реакция PCR был успешным и что загрязнения не произошло, используйте позитивный элемент управления, содержащий ДНК, которые уже были усилены в успешно и образец один элемент управления, содержащий ddH 2 O вместо ДНК внутри каждой ПЦР запустить.
- Подготовить грунт работающие решения, которые содержат конечная концентрация 10 мкм праймера, Пипетка соответствующее количество соответствующих грунтовка акций решения и ddH 2 O (в зависимости от концентрации Стоковый раствор) в свежий 1,5 мл трубки реакции с использованием micropipettes.
- Добавить грунты, deoxynucleotide смесь (дНТФ), реакция буфера, Taq ДНК полимеразы и ddH 2 O 1,5 или 2.0 мл (в зависимости от количества образцов, чтобы быть обработаны) реакции трубки, то вихря этой смеси. В таблице 1 приведены подробные тома для стандартного реакционной смеси для реакции PCR 10 мкл (более подробную информацию о химических веществ, используемых, см Таблицу материалы).
- Использование микролитр пипетки для передачи каждого 1 мкл ДНК распакуйте в 9 мкл the Стандартный реакционную смесь в ПЦР-пробирку (или хорошо ПЦР плиты). Закрыть трубу реакции или реакции скважин пластины (с полосами Кап).
- Программа Термоциклер: стандартный протокол для NSF1419/20 и NSR1642/16 16 грунтовка набора: 94 ° C 4 мин (денатурация), следуют 30 циклов 94 ° C за 30 s, 50 ° C (температура отжига) для 30 сек, 72 ° C 90 s, и окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин. Для грунтовки LSU задает 26, используйте следующие: 94 ° C для 4 мин, после чего 45 циклов 94 ° C для 20 s, 52.5 ° C 20 s, 72 ° C для 90 s и окончательное расширение при 72 ° C для 8 мин
- Место ПЦР трубы или пластин в Термоциклер, закройте крышку велосипедист и запустить программу соответствующих.
- Подготовка 1,5% агарозном гель с помощью буферного раствора, содержащего Tris база, борная кислота и ЭДТА (КЭ буфера) и агарозы. Для приготовления геля агарозы 1,5%, с помощью литья каппу с габаритными размерами 10 × 7,5 см × 3 см весом 0,45 g агарозы в коническую колбу, используйте Измерительный цилиндр для измерения 30 mL 1 x TBE буфера (89 мм трис pH 7,6, борная кислота 89 мм и 2 мм ЭДТА, pH 8.0) и залить его в коническую колбу. Нагрейте смесь с помощью микроволновой печью. Остановить СВЧ, когда есть большие воздушные пузыри и тщательно вихрем колбу до тех пор, пока решение имеет только одну фазу.
- Для охлаждения решение для приблизительно 60 ° C, вихрем колбу на водяной бане. Быстро Залейте раствор в каппу литья, удалить пузырьки воздуха и вставьте Расчески. Подождите около 20 мин, пока гель ожесточилось.
- Заполнения электрофорез блок с 0,5 х кэ и вставить литья каппу содержащие геля агарозы. Убедитесь, что гель слоты бесплатно воздушных пузырьков.
- Спина вниз продукты PCR, с помощью параметра запуска короткие центрифуги мини (Латы). Использование пипетки микролитр смешать каждый 3 мкл продукта PCR с 1 мкл 6 x загрузки краситель (40% сахарозы и 0,25% бромфеноловый синий) и загрузить его в гель пазы геля агарозы. Пипетка 1.5 µL 100 лестница ДНК bp в один слот каждой строки с пипеткой микролитр как стандартный размер. Замените крышку блока электрофорез правильно и подключены к источнику питания. Побегите гель на 100 V/см для 35 мин
- Подготовить окрашивание баня, залить 1000 мл 1 x TBE в квадратной формы пластиковой коробке пропускающих свет. Добавьте 50 мкл бромид ethidium с пипеткой микролитр, закройте крышку пластиковой коробке и встряхните его для обеспечения равного распределения бромид ethidium.
- Снимите с блока электрофореза геля и поместите его в окрашивание ванну для примерно 10 мин. Затем, принимать гель из окрашивание ванны и поместить его на гель системы документации и визуализировать его в соответствии с руководством.
- Анализ только образцы, которые показали положительные результаты (фрагменты адекватного размера визуальные в агарозном геле) с точки зрения присутствия и функциональной эффективности шаблонов для последующего обнаружения недавно попадает хищных.
| ПЦР-микс | концентрация рабочего раствора | смесь для 10 реакции PCR мкл | конечная концентрация в PCR |
| Грунтовка FW | 10 мкм | 0,5 мкл | 0,5 мкм |
| Грунтовка RW | 10 мкм | 0.5 & #956 ; l | 0,5 мкм |
| реакции буфера (20 мм трис-HCl, рН 8.55, 16 мм (NH4) 2SO4 и окончательный концентрацию MgCl2 2 мм) | 1 мкм | 1 мкл | 1 мкм |
| dNTP | 10 мм | < t d > 0,25 мкл0,25 мм | |
| полимеразы Taq | 5 U | 0.1 мкл | 0,05 U |
| ddH 2 0 | 6.65 мкл | ||
| < Стро нг > общий объем реакционной смеси | 9 мкл | ||
| ДНК | 1 мкл | ||
Таблица 1: подробный протокол для подготовки стандартных реакционной смеси реакции PCR 10 мкл.
3. обнаружить недавно попадает добычу/продовольственные товары с группой специфического праймера наборов с помощью электрофореза геля.
- Проведения ПЦР с помощью рабочего раствора ДНК экстракты (подготовлен согласно шаги 1.1 для 1.3.11) и группа специфического праймера набор (без названия, т.е. без изменений) для группы добычу, ориентированные как описано в меры 2.1.1 для 2.1.3 (вариации в реакционной смеси для набора соответствующих грунт, см. таблицу 2). Запуск ПЦР, используя стандартный протокол в шаге 2.1.4 (для отжига температура для набора соответствующих грунт, см. таблицу 2).
- Использовать один элемент управления с чистой ДНК от образца, принадлежащих соответствующей целевой группы (положительный контроль) и один отрицательный контроль с чистой ДНК от потребительских видов в каждом ПЦР запустить.
- Проверить успеха с помощью геля агарозы описано в шагах 2.1.6 в 2.1.11 реакции PCR. Реакция PCR был успешным, если фрагмент соответствующей длины (см. таблицу 2) является видимым для позитивного управления, но не для отрицательного контроля. Если один или оба из этих критериев невыполненными, повторите ПЦР.
- Применения агарозы гель электрофореза, как описано в шагах 2.1.6 в 2.1.11, чтобы обнаружить ли целевые группы добычу была потребляется образцов различных потребителей, тестирование (через решение фрагмент соответствующей длины виден ли или нет). Убедитесь в том, чтобы не пропустить фрагменты с низким разрешением визуальных.
- Продукты PCR хранить при 4 ° C, если дальнейшие анализы будет осуществляться в течение последующих 24 часов, или в-20 ° C, если анализы должны быть выполнены позже.
4. Впоследствии определить потребляемых добычу, далее вниз по течению с помощью SSCP-анализа через гель полиакриламида.
- Подготовиться SSCP электрофореза геля акриламида 9%. Подготовить рабочие решения в лаборатории Худ.
- Подготовить рабочий раствор акриламида 200 мл, заполнить Измерительный цилиндр с 20 мл 10 x TBE (109 g Tris база, 55 г борной кислоты и 40 мл 0,50 М ЭДТА, рН 8,0 растворяют в 1000 мл ddH 2 O) и еще один с 45 мл 40% (29: 1) Акриламид микс. Вылить смесь КЭ и акриламида в градуированный колбу (градуированный стеклянный флакон с отметкой 200 мл подходит также здесь) и добавить ddH 2 O до отметки в 200 мл. Продолжать работе решение в холодильнике (4 ° C), пока он не понадобится. Не используйте рабочий раствор старше, чем одну неделю.
- Вес 0,1 г Персульфат аммония (APS; использование баланс с точностью по крайней мере 0,01 g) в 1 мл объемные колбу и растворяют его, добавив ddH 2 O до окончания Марк подготовить APS раствор 10%. Перевести аликвоты (примерно 350 мкл) в свежих реакции трубы.
Примечание: Один Алиготе необходима для каждого геля полиакриламида. Храните остальные aliquOTS-20 ° c и только разморозить аликвоты, незадолго до того, как они необходимы. - Сборка гель кассету скомпрометирована из двух стеклянных пластин, один пробел и один зубчатый стеклянной пластины (каждый 20 см х 20 см), с прокладками (толщина 1,5 мм) между ними подбегая стороны стекла. Использовать каждый три раза обратно клипы (32 мм) с правой и левой стороны для фиксировать гель кассеты ( рис. 1).
- Смесь 5 g агарозы и 250 мл 1 x TBE буфера в коническую колбу для подготовки решения к 2% агарозном гель. Тепло и потом охладить смесь, как описано в шагах 2.1.6 и 2.1.7. Быстро Залейте раствор в пластиковой коробке, квадратной формы (21 см х 6,5 см х 5 см) и поместите нижний конец гель кассеты (шаг 4.1.3) в раствор агарозы. Отрегулируйте клипы фолд обратно на нижнем конце геля кассеты на высоту таким образом, чтобы они сидят на ободе квадратной формы пластиковые окна ( рис. 1). Подождите примерно 20-30 мин до тех пор, пока вилка агарозы полностью затвердеет.
- Заполнить 100 мл Измерительный цилиндр с рабочий раствор акриламида (шаг 4.1.1) до отметки 60 мл и залейте раствор в стакан. Используйте микропипеткой 300 мкл одной Алиготе APS Стоковый раствор (шаг 4.1.2) и впоследствии 37,5 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED). Быстро Залейте раствор между пластинами стекла кассеты геля. В качестве альтернативы внедрить решение между пластинами стекла с 100 мл одноразовые шприц с кончиком пипетки 1000 мкл скорректирована с головкой инъекционной шприца.
- Осторожно вставить 1,5 мм толщиной стандартного гребня на верхнем конце между пластинами стекла. Гребень должна быть окружена раствор полиакриламида. Подождите примерно 1 h, пока гель полиакриламида полимеризуется. Избегайте вентиляции во время полимеризации, насколько это возможно, потому что это увеличивает время, необходимое для геля для полимеризации.
Примечание: Это возможно для хранения литые гели в запечатанных полиэтиленовых пакетах с мокрой ткани в холодильнике до 3 дней.
Рисунок 1: рисунок иллюстрирует Строительство налить полиакриламидных гелей. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- место кассеты гель, содержащий геля полиакриламида, подготовленный, в блок вертикального электрофореза. Заполнения блока электрофорез с соответствующей суммы (в зависимости от типа блока электрофорез) 0,5 х кэ и прохладный блок до 10 ° C, с помощью холодильных термостат.
- Для денатурации ДНК, разогреть тепловой блок /-cycler к 96 ° C. Prepare денатурации буфер с 95% формамида (класс 99,5% годовых) и 5% водный раствор, содержащий 0,25% бромфеноловый синий и 40% (w/v) сахарозы.
- Взять ПЦР продукты из холодильника или морозильника и размораживать их. Спин вниз продукты PCR, с помощью параметра запуска короткие центрифуги мини (Латы). Затем смешайте каждый 4 мкл продукта ПЦР с 4 мкл буфера денатурации. Тепло смеси для 5 мин на 96 ° C, сразу же после охлаждения шаг в ледяной воде 10 мин
Примечание: Образцы должны быть загружены на геле полиакриламида (шаг 4.5) сразу же после этого. - Удаления гребень из геля полиакриламида (шаг 4.1.6) и использовать микропипеткой полностью загрузки каждого образца в слот гель. Электрофорез на 8 W на гель во время выполнения постоянно охлаждения электрофорез до 10 ° C. работает время зависит от размера фрагмента должны быть разделены. Для размеров фрагмента приблизительно 210 bp, продолжительность около 3,5 ч считается уместным.
- Подготовить окрашивание баня, залить 1000 мл 1 x TBE в квадратной формы пластиковые коробки пропускающих свет и 30 мкл пятнать краситель (подходит пятно один мель ДНК) с микролитр пипетки. Закройте крышку пластиковой коробке и встряхните его для обеспечения равного распределения окрашивание красителем.
- Удалить гель кассеты из камеры для электрофореза и осторожно отделить зубчатый стеклянную пластину от геля. Слайд гель полиакриламида с пустую стеклянную пластину в окрашивание ванну. Место окрашивание ванна на тряску платформы и пятно гель для 20-30 мин при постоянном встряхивании.
- Принимать гель тщательно из окрашивание ванны и поместить его на таблице УФ системы документации.
Примечание: Из-за нестабильности геля рекомендуется для обработки предварительного шага с двумя людьми. Один человек должен провести окрашивание ванна рядом с таблицей УФ и еще один должен достичь под гелем с обеими руками, взять его и вставьте таблицу УФ. - Закройте крышку или двери системы документации и сфотографировать согласно данным производителя ' инструкция по эксплуатации s.
5. Обнаружение нескольких недавно проглотить добычу групп параллельно с использованием автоматизированных фрагмент анализа.
- Анализ, кишечнике содержание ДНК экстрактов с помощью 16 Группа специфического праймера задает приведенных в таблице 2, грунтом одного набора помечены благодаря модификации с окрашивание красителем (см. таблицу 2 колонку под названием модификации) и использовать методы параллельного обнаружения автоматизированный секвенсора.
- Использования рабочего раствора ДНК экстрактов (подготовлен согласно шаги 1.1 для 1.3.11) и поведения отдельных PCRs для каждого праймера, набор как описано в шагах 2.1.1 до 2.1.5 (вариации в смеси приведены в таблице 2). Используйте по крайней мере один элемент управления с чистой ДНК от образца, принадлежащих соответствующей целевой группы (положительный контроль) и один отрицательный контроль с чистой ДНК от потребительских видов в каждом ПЦР запустить.
- Запуска ГКДЗ в Термоциклер, используя стандартный протокол постановки ПЦР в шаге 2.1.4, скорректированы до соответствующей температуры отжига (и количество циклов) для каждого праймера, набор приведенных в таблице 2.
Примечание: Используйте же выделение ДНК реакции скважин для ПЦР с каждым из 16 различных грунтовка наборов для упрощения последующего объединения продуктов ПЦР для пакетной автоматизированного анализа фрагмента. - Магазин ПЦР продукты при-20 ° C до всех PCRs, принадлежащие к одной партии, для автоматического фрагмента анализов (см. таблицу 2) закончены. Храните продукты PCR в темноте и не хранить их больше, чем за 1 неделю до анализа фрагмента.
Таблица 2: детали 2 партий 15 пар группа специфического праймера установленные костер и др. (2013 год) и недавно разработанных Jae28S грунт пара усилительных регионах 18S или 28S рДНК от 16 целевых групп водных макробеспозвоночных. f, вперед грунты; r, обратный грунты; 18s, грунтовка цели 18S рДНК Субблок; 28s, грунтовка цели 28S Субблок рДНК. " Hydrobiologia, является Dikerogammarus villosus (ракообразные, Gammaridae) ' убийца креветки ' в системе реки Рейн?, 768, 2016, таблица S1, дополнительный материал страница 2, Кестер майке, Бастиан Байер, Рене Gergs, (© Спрингер Международные публикации Швейцария 2015) " с разрешения Springer. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблицы.
- для обнаружения усиливается фрагменты всех 16 грунтовка наборов провести анализ автоматизированной фрагмент в 2 пакетах, приведены в таблице 2. Используйте стандарт внутреннего размера (ДНК размер стандартный набор - 400 [партии B] и - 600 [пакет A], соответственно) чтобы определить длину фрагмента. Подготовьте последовательности пластины и автоматические программы sequencer, как описано в следующих шагах. Обратите внимание, что эта процедура может должны быть скорректированы, если используете другую платформу, чем в таблице материалы.
- Для выполнения каждого пакета образца, подготовить смесь, содержащая образец загрузки решения (SLS) и соответствующие стандартные размер. Пипетка 21.6 мкл SLS и 0.4 мкл ДНК размер стандартного комплекта - 600 за образец пакета A и, соответственно, 21,7 мкл SLS и 0,3 мкл ДНК размер стандартного комплекта- 400 в образец пакетного б.
- Взять продукты PCR 8 ГКДЗ, принадлежащих соответствующей партии из морозильника и размораживать их. Убедитесь, что они по-прежнему находятся в темноте.
- Использовать микролитр пипетки для загрузки количество скважин последовательности плиты необходимо (количество образцов для анализа) с каждой 22 мкл соответствующие смеси, описано в пункте 5.2.1. Спин вниз продукты PCR каждого из 8 PCRs, с помощью параметра запуска короткие центрифуги мини (Латы). Перевести каждый 1 мкл каждого продукта PCR каждого из 8 ГКДЗ в соответствующих скважин последовательности пластины с пипеткой микролитр.
- Тщательно спин вниз эту смесь в пределах последовательности пластины с краткосрочной перспективе мини-плита центрифуги и наложения каждого из скважин, используется с одной капли минерального масла. Заполнить соответствующие реакции скважин буфера плиты с 250-300 мкл буфера разделение ДНК.
- Использовать программное обеспечение для капиллярной sequencer для создания установки образца, по словам производителя ' s инструкции. Назначьте методы для управления комплектов образцов и определить последовательность методов, которые будут использоваться для обработки данных (см. таблицу 3 для выполнения условий для использования с размер стандарт, приведены в Таблице материалов). Обратите внимание, что это важно, что распределение образцов в пределах установки образца соответствует распределения выборки в последовательности пластины (включая позитивные и негативные элементы, см. шаг 5.1.1) и что метод достаточное для фрагмента анализирует с соответствующими Стандартный размер выбирается.
- Заполнить лоток смачивание с дейонизированной водой и вставьте капиллярную sequencer последовательности пластины, буфер пластины и смачивания лоток. Вставьте картридж гель, содержащий достаточное количество свежей гель разделение ДНК, которая необходима для запуска образца. Запуск последовательности пластину, используя подготовленный установки образца.
| денатурировать | отдельные | Капиллярный | придать | ||||
| Температуры | напряжения | время | время | напряжения | время | ||
| Размер стандартного 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 кв | 60 мин | 50 ° C ждать Temp: Да | 2.0 кв | 30 s |
| Размер стандартного 400 | 90 ° C | 120 s | 6 кв | 45 мин | 50 ° C ждать Temp: Да | 2.0 кв | 30 s |
Таблица 3: особые условия для анализа фрагмента по автоматизированной секвенсор, с помощью стандартов размера, дано в таблице материалы.
- для анализа результатов экспорта необработанных данных и загрузить эти данные в программу анализа фрагмента. Выберите Стандартная краска цвета заказы соответствующих производителя краска цвета каналы.
- Создать группу изложением ожидаемый диапазон длин фрагмента, усиливается одной группы специфического праймера устанавливает в пакете согласно руководству пользователя программы.
- Для обработки данных, выберите соответствующие группы, соответствующий размер стандарт, Стандартный цвет и тип анализа и запустите процедуру. Выберите параметр electropherogram для отображения интенсивностью флуоресцентного сигнала от капиллярного электрофореза инструментов как одну строку трассировки для каждого цвета краски. Наборы маркеров/грунтовка будет отображаться указанием диапазона соответствующих фрагмент и точная длина обнаруженных фрагмент, связанный с центром каждого называется пик будет выделена (в большинстве программ по окраске или имя, назначенное) автоматически.
- Для каждого образца, рассчитать как близко образца ' s внутренний размер стандарт соответствует стандарту выбранный размер успокоить успех размер призвание. Большинство программ анализа фрагмента имеют возможность автоматически вычислить и визуализировать этот матч. Если размер призвание не удалось, повторите анализ фрагмента для этих образцов.
- Визуально проверьте electropherogram каждого образца и подтвердить/unconfirm каждый пик под названием для каждого маркера/грунтовки, установить отдельно. Вручную вставьте невызываемый пики, которые соответствуют критериям набора маркеров/грунтовка или удалять неправильно согласно руководству пользователя программы используется. Применить имя размер или bin базы пара в ' аллеля лейбл '. Вычисление и отображение пик спецификации в ' таблицы пик '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы успешно использовать шаги, описанные в этом протоколе для диеты анализов в рамках различных исследований. В этом разделе мы представляем примеры, описывающие применимость различных разделов протокола.
Как пример чтобы продемонстрировать эффективность группы специфического праймера наборов, созданных авторами28 и потенциал дальнейшего течению анализ продуктов ПЦР по SSCP-анализа, кормления эксперимент был проведен. Люди Dikerogammarus villosus как хищников и Caenis spp. личинки как добычу были захвачены в реку Рейн и заводи возле Карлсруэ (Германия). В лаборатории хищником и жертвой таксонов хранились отдельно в отфильтрованных поток воды при 20 ° C и были голодали на 36 часов. Для эксперимента бокоплав образцы были помещены в стаканы с водой (100 мл) поток отфильтрованных индивидуально, кормили с двух-трех Caenis личинок для 30 минут и впоследствии заморожены в жидком азоте. Расчлененный желудочно-кишечного тракта каждого D. villosus и ДНК было извлечено, как описано в протоколе 1. Экстракты ДНК были протестированы с Caep28S грунтом, установить подходящей для обнаружения Caenis spp., используя соответствующий протокол PCR28 , как описано в протоколе 3. Чтобы проверить различия между усилителем фрагменты различных видов Caenis , ПЦР было проведено с кишки контента образцы и чистые образцы ДНК трех видов ссылку Caenis . Электрофорез геля агарозы привело к одной полосы двойной мель ДНК, который нельзя различить между разными видами Caenis с этим типом электрофореза (рис. 2A). В противоположность этому электрофорезом геля SSCP, как описано в протокол 4, можно было идентифицировать организмы хищных видов уровень путем сравнения содержимого образцы кишки с образцов (рис. 2B). SSCP фрагмент шаблон трех справочных таксонов Caenis beskidensis (Рисунок 2B, переулок 1), Caenis horaria (Рисунок 2B, переулок 2), и Caenis luctuosa (Рисунок 2B, Лейн 3) состоял из четырех полос с дифференцируемыми узорами. Два кишки контента образцы (Рисунок 2Б, переулок, 4 и 5) имели шаблон фрагмента, равный с C. luctuosa (Рисунок 2Б, Лейн 3). Шаблон фрагмента третьего кишки содержимое образца (рис. 2B, переулок 6) был аналогичен C. horaria (Рисунок 2Б, переулок д. 2). Анализ последовательности двух кишки содержание образцов определены как C. luctuosa и C. horaria (Рисунок 2Б, переулок, 4 и 6) и проверить этот результат, видов соответствующих ссылок (см. дополнение электронная выравнивание fasta файл).
Рисунок 2: Исходное изображение электрофореза геля агарозы (A) и (B) SSCP анализ ПЦР фрагментов содержимого кишечника и эталонных образцов усиливается с набором Caep28S грунт. Полос 1-3 показывают образцов пород Caenis beskidensis (1), Caenis horaria (2) и Caenis luctuosa (3). В строках 4-6 представлены шаблоне фрагмента содержимого образцов различных кишки бокоплав Dikerogammarus villosus . Переулок 7 показан фрагмент шаблон 100 bp ДНК лестницы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Кроме того лабораторный эксперимент был проведен в котором вода, клещей, принадлежащих к видам Hygrobates fluviatilis кормили на chironomid личинки не только определить, если ДНК лиц chironomid потребляется могут быть обнаружены в водных клещей, но также проверить, если количество ДНК обнаружено, зависит время, прошедшее после потребления хищных29. После голодать клещей для приблизительно одну неделю, каждый клещ была предложена одна личинка chironomid как еда. Каждый человек клеща воды 3-4 были зафиксированы в этаноле (абсолютное) для генетического анализа, с помощью Chiro18S грунт для dipteran семьи Chironomidae28 на 1, 2, 3, 7, 9, 24, 32 и 50 h после кормят29. Как степень потребления воды клеща лицами, добычей соответствующих лиц были разделены на следующие пять категорий кормления: 1 = полностью сосал, покровов полностью опорожнить (> 90%), 2 = почти полностью сосал из (> 75-90%), 3 = полу всасывается из (> 50-75%), 4 = только частично всасывается из (> 5-50%), 5 = никаких видимых изменений в добычу тело структуры (≤5%)29. ДНК было извлечено от водных клещей, как описано в протоколе 1 (без шаги 1.2.1 и 1.2.2) и присутствие 18S рДНК в экстракте и функциональной эффективности шаблона были проверены, как описано в Протоколе 2. Обнаружение ДНК была выполнена согласно протокола 4, используя только Chiro18S грунт с вперед грунтовка помечены с добычей флуоресцентные краски (см. таблицу 2) и ДНК размер стандартный набор - 400. Чтобы разрешить сравнений между выборками проанализированы в рамках различных запусков автоматических секвенсор, соотношение между образца пик и пик высотой ближайшего внутренний стандарт (т.е., 360 bp в данном случае) каждого образца были рассчитаны и используется в качестве прокси на сумму ДНК обнаружено. Результаты показали, что chironomid ДНК было обнаружено в практически всех лиц Hygrobates fluviatilis питались личинки chironomid29. С короткий интервал (1 час после кормления) для длинный период после кормления (50 h) относительное количество обнаруженных добычу ДНК была значительно снижена (Рисунок 3А)29. Кроме того связь между временем после кормления и добычей классификации как прокси для попадает количество хищных ДНК может быть подтверждено (рис. 3B)29. Сокращение добычу ДНК обнаружено с увеличением времени после кормления, скорее всего, полностью отражение деградации ДНК и пищеварения Хищникик, потому что щажению на добычу ДНК весьма неправдоподобным, из-за отсутствия ануса в водных клещей29. Эти результаты подтверждают пригодность этого подхода для количественной оценки попадает добычу.
Рисунок 3: Отношения между национальными ln-соотношение высоты (пример пик высот/стандарт360 пик высота) и (A) время после кормления клещей и кормления категории (B) (n = 23). «Экспериментальная и применяется акарологии, первое обнаружение жертвой ДНК в Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, клещи): новый подход для определения отношения хищник жертва в водных клещей, 67, 376 P. Мартин, м. костером, L. Schynawa, р. Gergs, (© Спрингер Международный Издательский Switzerlи 2015 годы)» с разрешения Springer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Расследовать важность хищничество, инвазивные бокоплав D. villosus в поле, интенсивный Устойчивый изотоп анализ δ13C и δ15N D. villosus и потенциальных продовольственных ресурсов были способствовать молекулярной Обнаружение хищных недавно попадает в кишечник содержимое точно те же люди. В общей сложности 206 D. villosus людей с разных сайтов были собраны и желудочно-кишечного тракта каждого человека был расчлененный и ДНК было извлечено в соответствии с протоколом 1. Присутствие и функциональной эффективности шаблонов, используемых заверили, как описано в Протоколе 2. Последние хищничество лицами D. villosus на нескольких macroinvertebrate добычу таксонов был испытан, как описано в Протоколе 4. В целом только 16% содержимое кишки D. villosus положительный результат для ДНК, принадлежащие к любой из 16 целевой macroinvertebrate добычу таксонов и поэтому поддерживает результаты анализов стабильных изотопов, которые указали низкий хищнической кормления поведение из инвазивных бокоплав в поле27. Если, в генетический анализ ДНК 12 проверенных добычу таксонов был найден в по крайней мере 1 кишки содержимое образца, ДНК 4 других хищных таксонов никогда не был обнаруженных (рис. 4)27.
Рисунок 4: Гистограммы, иллюстрирующие соответствующее количество лиц д villosus от всех десяти сайтов, содержимое которых кишка положительный результат на macroinvertebrate добычу ДНК. ПЦР была проведена с 16 Группа специфического праймера наборы, как указано. «Hydrobiologia, является Dikerogammarus villosus (ракообразными, Gammaridae) «убийца креветки» в системе реки Рейн?, 768, 2016, 310, Кестер майке, Бастиан Байер, Рене Gergs (© Springer международной публикации Швейцария 2015)» с разрешения Спрингер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительного файла. Sequence_alignement_feeding_trial.fasta пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем легко и экономически эффективным методом для определения на основе ПЦР хищник жертва взаимодействий от образцов поле через группу специфические праймеры для рДНК регионов, которые могут быть объединены с другими не молекулярный анализ образцов же. Однако есть несколько важных шагов в рамках протокола. Во-первых обеспечивая специфики праймеры используются имеет важное значение. Во-вторых важно избежать загрязнения и потери кишки содержание материала в процессе подготовки желудочно кишечного тракта и последующего извлечения ДНК. В то время как кросс образец загрязнение может привести к ложных положительных обнаружение ДНК добычу, потеря кишки, материал может привести к пропуску редко контента потребляется хищников. Проверка наличия рДНК, принадлежащих к соответствующим субъединицы и функциональной эффективности шаблонов, используемых для анализа (статья 2 протокола) имеет важное значение для сбора репрезентативной информации о потребляемых добычу. Это особенно важно, если нет ДНК хищных групп, которую потребитель должен кормить на могут быть обнаружены25,27. Кроме того при подготовке ДЗП (шаги 3.1, 5.1.1 и 5.1.2) важно, что смесь и протокол используется точно соответствуют критериям, в которых соответствующие грунт был указан для определенной группы таксонов. В противном случае амплификация ДНК в реакции PCR может не полностью, либо ДНК таксонов не нацелены может быть усилена также. Таким образом это обязательно использовать позитивные и негативные элементы управления в пределах каждой ПЦР запустить заверить, что реакции PCR работал и загрязнения не произошло. Кроме того необходимо, что массив образцы для каждого запуска ПЦР документально точно, чтобы включить правильный назначения хищных потребляется для образца соответствующих потребителей. Для выполнения этой задачи особую осторожность необходимо принимать при объединении продуктов ПЦР для параллельных обнаружения нескольких групп добычу через анализ автоматического фрагмента (шаг 5.2.3).
Для обнаружения усиливается фрагментов с помощью агарозы gel электрофорез (шаги 3.2 и 3.3) агарозы гели должны быть тонкие, как можно и ухода должно быть принято в ходе визуального осмотра изображения во избежание недостающие фрагменты с низким разрешением визуальных. Для результаты и соответствующий вывод о хищных потребление потребителем важно признать даже редко потребляемых добычу таксонов. Гели агарозы толстые уменьшить видимость потенциально низкого количества ДНК добычу и тем самым уменьшить вероятность пропустить редко потребляемых добычу и внедрить неопределенности в выводы из анализа. Кроме того с точки зрения здравоохранения, используя меньше или нетоксичные альтернативы чем бромид ethidium для окрашивания гелей может быть целесообразным. Протокол для последующего течению анализа усиливается фрагментов через SSCP-анализа с использованием полиакриламидных гелей включает в себя некоторые шаги, которые должны быть выполнены с определенной осторожностью. Важно, что гель Кассета собрана герметичным (шаг 4.1.3) и раствор полиакриламида предоставляется достаточно времени для полимеризации полностью (шаг 4.1.6). Открытие кассеты слишком рано приведет протечки жидкого акриламида раствор и, несмотря на тот факт, что подготовка началась с самого начала, обширные очистке предстоит также. Кроме того передача гель полиакриламида в окрашивание ванну (шаг 4.7), а оттуда на УФ-таблицы (шаг 4.8) необходимо сделать очень тщательно из-за нестабильности таких гелей. В противном случае гель может сорвать и фрагментов может быть нарушена, что приводит к необходимости повторить процедуру.
Одним из основных требований для успешно обработки данных, полученных от автоматизированных фрагмент анализа является, что стандарт внутреннего размер образца соответствует размер стандартный шаблон, указанных заводом-изготовителем (шаг 5.3.3) чтобы включить определение Длина соответствующий фрагмент. Это особенно важно, потому что в противном случае, различные фрагменты, помечены же люминесцентные окрашивания краской, могут быть назначены неправильные добычу таксонов и поэтому привести к полной супружеству хищник жертва взаимодействий. Кроме того electropherograms часто показывают фоновый шум. Для установления доверия в интерпретации, важно, что вершины размер внутреннего стандарта значительно выше, чем фоновый шум образца. Следовательно вершины для каждого маркера/грунтовки следует считать только если они значительно выше, чем фоновый шум.
Этот протокол может быть изменен для обнаружения нескольких групп добычу таксонов интерес в рамках различных потребителей интереса. По общему признанию группа специфические праймеры не уже могут быть доступны для каждого потенциального добычу таксон интерес. Тем не менее, Группа специфические праймеры доступны не только для нескольких пресноводных macroinvertebrate таксонов28, но и для широкого круга других таксонов (например, несколько морских macroinvertebrate таксонов16,-30 и Общие таксонов летающих насекомых31). Таким образом выбор группы специфического праймера устанавливает подходящие для того усилить ДНК всех хищных видов данного Таксон, но неудачным в амплификации ДНК от вида, не принадлежащих к этот Таксон, важное значение32. Многие группы специфические праймеры, которые теперь доступны были указаны для данного диапазона таксонов (например, 130 таксонов пресноводных мелководьях распространены в системе реки Рейн28). Таким образом чтобы избежать ложных или ложно отрицательные результаты, специфика такие грунты следует перепроверил для ряда таксонов в экосистеме интерес до их применения для целевых таксонов и не входит в диапазон таксонов для потребителей который был создан грунтовки. Кроме того если эти молекулярные анализы не сочетаться с другими анализ точное же отдельных, рассечение желудочно-кишечного тракта могут быть пропущены.
Тем не менее рассекает желудочно-кишечного тракта больших образцов также предотвращает сбой экстракции ДНК из-за слишком много материала и уменьшает наличие потребителей ДНК в экстракте образца. Однако исследования показали, что использование конкретных блокирующие грунты, которые придают ДНК потребителей и тем самым блокировать его, для реакции PCR может эффективно повысить усиление редких последовательностей в смешанных образцов33. Таким образом рассечение желудочно-кишечного тракта можно избежать, даже при работе с более крупных потребителей образцов, с использованием конкретных блокирующие грунты. Для параллельных обнаружения ампликонами, полученных из нескольких наборов группа специфического праймера через автоматизированный фрагмент анализа следует осторожность в выборе пятнать краситель как метка. Таким образом грунтовка наборы, усиливая фрагменты примерно такой же длины должны быть маркированы ясно distinguishable флуоресцентными красителями. Кроме того существует целый ряд систем капиллярного электрофореза от нескольких производителей. Некоторые из этих систем якобы позволяют определение нескольких фрагментов даже через неспецифических красители. Протокола, представленные здесь легко могут быть скорректированы для обнаружения усиливается фрагменты с любым из этих систем. Кроме того, чтобы сократить время, необходимое для tОн анализирует, можно было бы оптимизировать один мультиплекс ПЦР анализы для того чтобы усилить ДНК хищных групп один фрагмент анализа партии одновременно (например, одновременное усиление 12 организмов хищные жуки34 или до шести летающих насекомых 31таксонов).
Потенциальным недостатком кишки содержание анализы в целом, и поэтому также анализы, указанных в настоящем Протоколе, является низкая временное разрешение. С такими методами это возможно только для идентификации недавно попадает организмов, которые могут привести к неопределенности в важности одного хищных организмов2. Однако мы продемонстрировали, что генетический анализ согласно протоколу может легко сочетаться с анализ стабильных изотопов (δ15N и δ13C) точное же потребителей образцов25,27. Как время интеграция естественных трассировщик хищник жертва взаимодействий стабильный изотоп анализы часто используются для характеризуют трофической структуры1, но потенциальные перекрывающиеся изотопный значения из различных хищников часто затрудняют точное определение хищник жертва взаимодействия2. Таким образом использование этого протокола для генетического анализа в сочетании с анализом стабильного изотопа преодолеть недостатки каждого метода может далее наше понимание пищевых сетях и их отношения к питательных и энергетических потоков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Silke Классен из научно-исследовательского института для анализа экосистем и оценки (gaiac), RWTH Aachen за ее помощь в создании группы специфического праймера наборы, используемые в настоящем Протоколе. Мы также благодарим Питера Мартина и Лаура Schynawa из университета Kiel для сотрудничества в экспериментах водных клещей. Мы также благодарим технической лаборанты для поддержания лаборатории работает плавно и подготовка реестра компаний и каталожные номера. Эта работа была поддержана немецкого фонда научных исследований (DFG; проект GE 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
- Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
- Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
- Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
- Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
- Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
- Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
- Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
- Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
- Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
- Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
- Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
- Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
- Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
- Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
- Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
- Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
- Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
- Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
- Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
- Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
- Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6 (2007).
- Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
- Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
- Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
- Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831 (2007).
- Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).
- Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
- Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12 (2008).
- Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).
