Summary
يتم تحليل محتوى الأمعاء الأكثر شيوعاً ماكروينفيرتيبراتيس البصرية. تتطلب معرفة مكثفة عن تنوع الكائنات الحية فريسة المورفولوجية، أنها ملكة جمال الفريسة جسديا لينة، وسبب قوي كومينوشن الجارحة، يكاد يكون من المستحيل لبعض الكائنات الحية، بما في ذلك أمفيبودس. ونحن نقدم النهج الوراثية رواية مفصلة ماكروينفيرتيبراتي فريسة الهوية في النظام الغذائي من أمفيبودس.
Abstract
تحليل الشبكات الغذائية ضروري لفهم أفضل للنظم الإيكولوجية. على سبيل المثال، يمكن الخضوع للتفاعلات الشبكة الغذائية التغيرات الشديدة الناجمة عن غزو الأنواع غير الأصلية. تحديد الحقل الفرائس التفاعلات دقيقة غير صعبة في كثير من الحالات. غالباً ما تستند إلى هذه التحليلات تقييم البصري لمحتوى الأمعاء أو تحليل نسب النظائر المستقرة (δ15N و δ13ج). هذه الأساليب تتطلب معرفة شاملة تقريبا، على التوالي، تنوع السمات أو التوقيع النظائر المشعة من الكائنات الحية فريسة الفردية، مما يؤدي إلى عقبات في تحديد الفريسة الكائنات الحية الدقيقة. يحلل محتوى القناة الهضمية البصرية خاصة نقلل من الكائنات الناعمة الفريسة جسديا، وسبب تعطن والابتلاع والهضم من الكائنات الحية فريسة صعوبة تحديد الأنواع المحددة. ومن ثم بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR) على أساس الاستراتيجيات، على سبيل المثال استخدام التمهيدي المعينة لمجموعة مجموعات، توفر أداة قوية لتحقيق التفاعلات الشبكة الغذائية. هنا، يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة للتحقيق في محتويات القناة الهضمية للمستهلكين ماكروينفيرتيبراتي من الحقل باستخدام مجموعات الخاصة بالفريق التمهيدي للحمض النووي ريبوسومال (المتاشب). يمكن أن يكون الحمض النووي المستخرج أما من عينات كاملة (في حالة الأصناف الصغيرة) أو الخروج من محتويات القناة الهضمية من العينات التي تم جمعها في الميدان. الوجود والكفاءة الوظيفية لقوالب الحمض النووي بحاجة إلى تأكيد مباشرة من الأفراد المختبرة التمهيدي عالمي باستخدام مجموعات تستهدف وحدة فرعية كل منها من الحمض النووي. كما نثبت أنه يمكن تحديد فريسة تستهلك المزيد وصولاً إلى مستوى الأنواع عن طريق PCR مع غير معدلة خاصة بمجموعة الإشعال جنبا إلى جنب مع تكيف اللاحقة جديلة واحدة تعدد الأشكال (SSCP) تحليلات استخدام المواد الهلامية polyacrylamide. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أن استخدام الأصباغ الفلورية مختلفة كتسميات لتمكين الفرز موازية لشظايا من الحمض النووي للمجموعات فريسة مختلفة من عدة عينات محتوى القناة الهضمية عن طريق التحليل الآلي جزء.
Introduction
التفاعلات الفرائس، التي تشكل الغالبية من التفاعلات التغذوية وديناميات الشبكة الغذائية، هي الجوانب الرئيسية لتحديد خصائص تدفق المادة والطاقة في جميع أنحاء الشبكات الغذائية داخل وفيما بين النظم الإيكولوجية، وواحد من الأهداف الرئيسية للإيكولوجيا 1. تحديد المصدر وتدفق الكربون والمغذيات هو الفهم للاتصال البيئي بين النظم الإيكولوجية2. ومع ذلك، لا ترتبط النظم الإيكولوجية، مثل الأنهار ومستجمعات المياه بها، فقط بتدفقات المواد العضوية والعناصر الغذائية ولكن أيضا بتحركات الكائنات الحية3. وهكذا، التعديلات الموئل انقطاع تدفق الموارد التي تربط بين تلك النظم بشدة تغيير الشبكات الغذائية للنظم الإيكولوجية، وكلاهما ليس فقط مباشرة بل أيضا غير مباشر بتغيير تكوين كل منهما جماعات الفرائس. على سبيل المثال، أظهرت التغييرات في الشبكات الغذائية مرتبطة بتحركات المفترس واحد الأنواع (مثل، تراوت قوس قزح)4. هذه التغييرات يمكن أن تهدد التنوع البيولوجي وأداء النظم الإيكولوجية المائية. ولذلك، تحليل التفاعلات الفرائس في الميدان ضروري لتحديد أثر التغيرات البيئية التي يتسبب فيها الإنسان، مثل ممارسات إدارة المياه، على التنوع البيولوجي للنظم الإيكولوجية المائية الأصلية.
إذ من الصعب تتبع الروابط التغذوية في النظم المعقدة، تم إنشاء عدة نهج التي تمكن من تقييم التغذية التفاعلات في الحقل5. تقليديا، التحقيقات لتغذية التفاعلات في الميدان تستند إلى التعرف البصري من بقايا الفريسة في تشريح الشجاعة وتتطلب معرفة شاملة حول التنوع فريسة مورفولوجك. وقدمت تحليلات محتوى الأمعاء البصرية رؤى في استخدام الموارد من عدة مجموعات من المستهلكين (مثل التباين الموسمي في النظام الغذائي من جراد البحر6 والأسماك7،8 أو تغذية تفضيلات من الكانفاس). بيد أن عملية الهضم المادية يجعل من الصعب تحليل محتوى القناة الهضمية البصرية وعادة ما يخطئ الفريسة جسديا لينة-الكائنات الحية9. لتغذية الأنواع بابتلاع السائل أو لبعض المستهلكين اللافقاريات بشكل مكثف كومينوتي الطعام قبل البلع، مثل أمفيبودس، هو التعرف البصري من الأنواع الفريسة في محتويات القناة الهضمية المستحيل10. بسبب هذه القيود، يوفر التحليل الجزيئي بديلاً واعداً.
التحليلات الجزيئية أصبحت الآن أداة مشتركة للسماح بالكشف عن فريسة السريع والدقيق في محتويات القناة الهضمية. المجموعة من هذه التقنيات المتنوعة: غالباً ما تستخدم استراتيجيات تستند إلى الأجسام المضادة أو بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)، بسبب ما عالية الدقة والحساسية11. تطوير الأجسام المضادة الجديدة هو كثافة الوقت والتكلفة، ولذلك، تطبيق تقنيات جزيئية أخرى مفيد أكثر عندما لا توجد أجسام مضادة بالفعل11. نهج مشترك آخر تضخيم مناطق حمض الخلوي الصبغي (DNA)، مثل الجينات ريبوسومال الحمض النووي الريبي (الرنا) موجودة في معظم الأنواع، استخدام التمهيدي عالمي يحدد12،13. عند استخدام هذا الأسلوب، أنها غالباً ما تكون غير ممكنة لتحديد النطاق الكامل للكائنات الحية فريسة داخل مصادر مختلطة من الحمض الخلوي الصبغي14. نهج فعال لتجنب مثل هذا عيب استخدام التمهيدي المعينة لمجموعة مجموعات لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية. تهدف إلى تضخيم الحمض النووي في مناطق فقط لمجموعات مستهدفة معينة واستبعاد جميع سائر الأنواع15،16، كبسولة تفجير مجموعة محددة يمكن تحديد الكائنات فريسة على المستوى التصنيفي لفئات معينة دون التحليلات الثانوية كثافة الوقت والتكلفة. ومع ذلك، مثل كل القناة الهضمية تحليل المحتوى، توفر هذه التحليلات فقط لقطة من تغذية السلوك. ولذلك، يعتبر الجمع بين تحليل محتوى الأمعاء الجزيئية مع تحليلات لدمج الوقت تتبع الطبيعية (مثل النظائر) مفيد1،2.
وهنا يصف لنا طريقة مفصلة للتحقيقات على أساس PCR التفاعلات الفرائس استخدام مجموعات التمهيدي الخاصة بالمجموعة لمناطق الحمض النووي (المتاشب) ريبوسومال النووية لتكون جنبا إلى جنب مع تحليل النظائر المستقرة للعينة نفسها. يصف لنا الكشف عن الحمض النووي لمجموعات فريسة واحدة عن طريق [اغروس] هلام التفريد. بالإضافة إلى ذلك، نقدم فرصة لمزيد من التحليلات المصب منتجات PCR هذه المجموعة على حدة كبسولة تفجير ينطبق عندما يكون مطلوباً دقة تصنيفية أعلى من خصوصية الإشعال. لأن الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد (ssDNA) شظايا والتشكلات نموذج التعليم العالي التي تتحدد بها تسلسل الأولية17، الاختلافات الصغيرة في شظايا تضخيمه بتلك الخاصة بمجموعة الإشعال تؤدي إلى تغييرات كونفورماشونال. ويمكن الكشف عن هذه التغييرات بجديلة واحدة تحليلات تعدد الأشكال (SSCP) المطابقة مع الجل بولياكريلاميدي17،18، تمكن من تحديد أكثر دقة للكائنات الحية فريسة (وصولاً إلى مستوى الأنواع).
بينما [اغروس] هلام التفريد هو أداة شائعة وغير مكلفة لتصور شظايا من الحمض النووي وتحديد الطول التقريبي19، أن القرار يعتمد على الكمية من الحمض النووي وصبغ المصبوغة تستخدم20. عادة، التصور مستقيمة عند العمل مع عينات الحمض النووي نقية، ولكن يحتمل أن انخفاض كميات من فريسة الحمض النووي في محتويات القناة الهضمية من المستهلكين يمكن أن يعقد التسجيل من [اغروس] هلام التفريد النتائج. لا يزال، هذا الأسلوب الكشف عن عمليا الشاشة عدد قليل من العينات المستهلك من الحقل واحد أو فريسة بعض المجموعات، ولكن تعقيد في التهديف يجعل فحص عدد كبير من العينات للغاية مرة متعددة فريسة الأصناف مكثفة، وبالتالي غير عملي. هو أسلوب كشف أكثر حساسية التحليل الآلي للأجزاء عن طريق التفريد الشعرية، مما يسمح تحديد طول الدقيق من شظايا21بالإضافة إلى ذلك. أظهرت العديد من الدراسات الصغرى على أساس أنه من الممكن باستخدام الأصباغ الفلورية مختلفة كتسميات، لكشف وتحديد أجزاء مختلفة من طول قابلة للمقارنة بشظية الآلي تحليل22،23، 24. ولذلك، أيضا نقدم بروتوكول مفصل لكشف موازية للحمض النووي من فريسة متعددة المجموعات باستخدام PCR مع مجموعات المسماة الخاصة بالفريق التمهيدي والكشف عن طريق تحليل جزء الآلي مع المنظم الآلي. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نعرض النتائج دراسة حالة مما يدل على أن الكشف عن فريسة الحمض النووي عن طريق تحليل جزء الآلي هو نهج الذي يتيح أيضا إجراء تقييم كمي نسبي لفريسة بلعها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جمع ماكروينفيرتيبراتيس من الميدان وإعداد العينات لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية.
ماكروينفيرتيبراتيس- جمع في كل موقع، فرز الأفراد من الأنواع المستهلك من الفائدة في أنابيب مفرد، وتجميدها مباشرة في النتروجين السائل أو الثلج الجاف لمنع إزالة القناة الهضمية وتحلل الحمض النووي-
ملاحظة: تجنب تخزين العينات في الكحول، لأن بعض ماكروينفيرتيبراتيس تميل إلى اجتر قبل الكحول يقتل منهم- - فقط استخدام القناة الهضمية المتوسطة والكبيرة (حوالي > 3 مم) الأنواع ماكروينفيرتيبراتي بتحليل محتوى الأمعاء الوراثية حيث يمكن استخدام هذه المسألة المتبقية من العينة لإجراءات أخرى (مثل النظائر المستقرة تحليل). لاحظ أن هذا لا ينطبق عند التحقيق في الأصناف الصغيرة جداً مثل عث المياه. ولذلك، يمكن تخطي الخطوات 1.2.1 و 1.2.2.
- قليلاً تذويب فرد وتشريح بعناية في المسالك المعدية المعوية تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام الملقط غرامة الفولاذ المقاوم للصدأ. تأكد من عدم ثقب القناة الهضمية لتجنب فقدان هذه المسألة- ملقط
- نظيفة باستخدام حل التطهير لإزالة التلوث الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي بعد إعداد كل المسالك المعدية المعوية. ولذلك، احتضان الملقط لمدة 10 دقائق في حل إزالة التلوث. وبعد ذلك شطف لهم مع الماء المعقم إزالة آثار متبقية والقضاء عليها مع منشفة ورقية خالية من الوبر. أنبوب
- نقل تشريح الجهاز الهضمي بفعل قفل صندوق الأمانات مل 2.0 تحتوي على 440 ميليلتر (450 ممكن ميليلتر لاستخدام ماصة المتكررة) استخراج الملح المخزن المؤقت [سيب؛ م 0.4 كلوريد الصوديوم (NaCl)، 10 مم تريس (هيدروكسيميثيل)-أمينوميثاني هيدروكلوريد (تريس-HCl) pH 8.0، وملح حمض ثنائي الإيثيلين 2 مم يذوي (يدتا) pH 8.0]. إعداد عينات في مخزن − 20 درجة مئوية فورا حتى استخراج الحمض النووي. التأكد من أنه سيتم استخراج الحمض النووي في غضون أيام-
- بروتوكول تعديل استخراج الملح عالية 25 استخدام لاستخراج الحمض النووي-
- تأخذ عينات من الثلاجة. استخدام الملقط لإضافة حبة واحدة من الفولاذ المقاوم للصدأ 5 مم لكل أنبوبة العينة، وترك العينات المجمدة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة (RT) لإذابة الجليد. استخدام طاحونة حبة لمجانسة عينات لمدة 1 دقيقة في 15 هرتز-
- تدور أسفل عينات مع المدى قصير لأجهزة الطرد المركزي. استخدام الماصات ميكروليتير لإضافة ميليلتر 90 (ممكن لاستخدام ماصة المتكررة 100 ميليلتر) 10% الصوديوم دوديسيل كبريتات الحل (SDS) و 5 ميليلتر من 10 ملغ/مل بروتيناز ك.
- دوامة عينات دقيق واحتضان الخلائط ح 1 عند 60 درجة مئوية مع الهز المستمر في 400 دورة في الدقيقة في ثيرموميكسير. بالإضافة إلى ذلك، دقة عينات دوامة كل 10 دقيقة لمواصلة تعزيز تحلل.
- تدور أسفل عينات المدى قصير لأجهزة الطرد المركزي، مع إضافة 350 ميليلتر من كلوريد الصوديوم م 5 مع ماصة ميكروليتير ودوامه جيدا لحوالي 0.5-1 دقيقة الطرد المركزي لعينات 40 دقيقة في 16,200 س ز في 5 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا مجموعات متعددة في صف واحد يجب أن يتم، تحديد درجة الحرارة أجهزة الطرد المركزي يجب أن تكون مرتفعة (لا يزيد عن 10 درجة مئوية) قليلاً لأن الحزب الديمقراطي الصربي يميل إلى فلوككولاتي إذا كانت درجة الحرارة منخفضة جداً- - استخدام ميكروليتير الماصات لنقل حوالي 600 ميليلتر طافية في أنبوب 1.5 مل رد فعل جديد. يجب الحرص على عدم إزالة أي شيء من بيليه. حبات
- الفولاذ المقاوم للصدأ الحافة خارج الأنابيب رد فعل في مصفاة شاي فولاذ المقاوم للصدأ، تنظيفها بالماء الجاري واحتضانها لهم في طبق بتري مع الحل إزالة التلوث عن 10 دقيقة دقة شطف الحل إزالة التلوث معقم المياه وتخزين الخرز تنظيفها في الإيثانول (> 99%، الصف سنوياً) أو الجافة حتى إعادة استخدام.
ملاحظة: تنظيف الخرز لا تحتاج إلى القيام به في هذه الخطوة مباشرة، ولكن بدلاً من ذلك يمكن أن يتم عندما يكون هناك وقت الانتظار في الخطوات التالية- - إضافة 600 ميليلتر من الايزوبروبانول المثلج (الصف سنوياً) للمادة طافية مع ميكروليتير "الماصة؛" وعناية عكس الأنبوب بضع مرات. تخزين العينات بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
- أخذ عينات من الثلاجة والطرد المركزي لهم لمدة 20 دقيقة في 16,200 ز × ودرجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية والجاف للأنبوب بعناية مع خالية من الوبر المناديل الورقية بعناية. لاحظ أنه إذا كانت درجة الحرارة المحيطة مرتفعة (أكثر من 25 درجة مئوية) والطرد المركزي في 5 درجة مئوية لتجنب الانزلاق بينما تجاهل المادة طافية الكريات. أغسل
- الكريات المحتوية على الحمض النووي مع الإيثانول 70%. للقيام بهذا، أضف 200 ميليلتر من الإيثانول المثلج (70%، الصف سنوياً) باستخدام ماصة ميكروليتير وأجهزة الطرد المركزي عينات لمدة 10 دقائق في 16,200 س ز ودرجة حرارة الغرفة (أو 5 درجة مئوية، وإذا لزم الأمر). تجاهل المادة طافية والجاف للأنبوب بعناية مع خالية من الوبر المناديل الورقية بعناية. ضبط استخدام ماصة 10 ميليلتر ميليلتر حوالي 8 "الماصة؛" بعناية قبالة المادة طافية المتبقية. تأكد من عدم الإزعاج بيليه.
- الجاف بيليه لحوالي 5-20 دقيقة عند 60 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء حتى يتبخر جميع الإيثانول.
- بيليه تذوب في 50-100 ميليلتر نوكلاس خالية (بخار تعقيم ويعامل ديبك) الماء (ddH 2 س)، وانتظر على الأقل 1 ح (على الرغم من أنه سيتم الحصول على نتائج أفضل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية).
- قياس كمية الحمض النووي الواردة في كل عينة مع جهاز المطياف الضوئي الصغير الحجم، ووفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. جعل عامل إضعاف كل عينة تحتوي على حوالي 2-10 نانوغرام الحمض النووي/ميليلتر. يبقى الحل المخزون في الثلاجة. يبقى الحل العامل في الثلاجة والتأكد من أن عينة أخرى تتم معالجة قريبا.
2. التحقق من الكفاءة الوظيفية للحمض النووي-مقتطفات للكشف عن اللاحقة فريسة مؤخرا بلعها.
- لضمان وجود والكفاءة الوظيفية للقوالب، اختبار كل استخراج الحمض النووي (خطوات 1.1 إلى 1.3.11) التمهيدي عالمي باستخدام مجموعات مناسبة لمصدر المواد الغذائية الخاصة بكل منها (مثلاً اللافقاريات 16 ، 26) التي يتم استهداف فرعية النووي نفسه التمهيدي مجموعة محددة، يستخدم للكشف عن اللاحقة فريسة 25 ، 27. الخطوات التالية تشير إلى استخدام مجموعات عالمية التمهيدي NSF1419/20 و NSR1642/16 16 و LSU D1، D2 fw1 و LSU D1، D2 rev2 أو LSU D1، D2 rev4 26. ليثبت أن رد فعل PCR كانت ناجحة وأنه لم يحدث أي تلوث، استخدم عنصر تحكم الإيجابية التي تحتوي على الحمض النووي بالفعل تم تضخيمها بنجاح ونموذج عنصر تحكم واحد يتضمن ddH 2 س بدلاً من الحمض النووي داخل كل بكر تشغيل-
- للتحضير التمهيدي العامل الحلول التي تحتوي تركيز نهائي 10 ميكرومتر من التمهيدي، "الماصة؛" المقدار المناسب من التمهيدي كل الأسهم ddH والحل 2 س (اعتماداً على تركيز حل الأسهم) إلى أنبوب رد فعل جديد 1.5 مل باستخدام ميكروبيبيتيس-
- إضافة كبسولة تفجير، مزيج ديوكسينوكليوتيدي (دنتبس)، رد فعل المخزن المؤقت، "بوليميراز الدنا" بوليميراز و ddH 2 س في مل 1.5 أو 2.0 (اعتماداً على عدد العينات بحيث تتم معالجتها) رد فعل الأنبوبة، ثم دوامة هذا الخليط. مجلدات مفصلة الخليط القياسية رد فعل لفعل بكر 10 ميليلتر وترد في الجدول 1 (للاطلاع على مزيد من التفاصيل من المواد الكيميائية المستخدمة، انظر الجدول للمواد)- استخراج
- ميكروليتير استخدام الماصات لنقل كل ميليلتر 1 من الحمض النووي إلى ميليلتر 9 اله رد فعل قياسي المخلوط داخل أنبوب بكر (أو بئر صفيحة PCR). إغلاق الأنبوب رد فعل أو الآبار رد فعل من اللوحة (مع المشارب كاب). برنامج
- ثيرموسيكلير: بروتوكول قياسي لمجموعة التمهيدي 16 NSF1419/20 و NSR1642/16: 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق (تمسخ)، تليها دورات 30 من 94 درجة مئوية لمدة 30 ق، 50 درجة مئوية (درجة حرارة الصلب) لمدة 30 ق، 72 ° ج 90 ثانية، والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لتعيين التمهيدي LSU 26، استخدم الأمر التالي: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 4، تليها دورات 45 94 درجة مئوية 20 s، 52.5 درجة مئوية 20 s، 72 درجة مئوية ل 90 s، وملحق نهائي في 72 درجة مئوية للحد الأدنى 8
- أنابيب PCR المكان أو لوحات في ثيرموسيكلير، أغلق غطاء cycler، وبدء برنامج كل منهما.
- إعداد 1.5% [اغروس] هلام استخدام الحل المخزن المؤقت الذي يحتوي على قاعدة تريس، الماء المقطر ويدتا (TBE العازلة) و [اغروس]. لإعداد 1.5% [اغروس] هلام، استخدام علبة صب جل مع الأبعاد الكلية من 10 سم × 7.5 سم × 3 سم، تزن ز 0.45 [اغروس] إلى قارورة مخروطية الشكل، استخدم اسطوانة قياس لقياس 30 مل من المخزن المؤقت x TBE 1 (89 مم تريس ، درجة الحموضة 7.6، المقطر 89 مم و 2 مم يدتا، pH 8.0) وصب ذلك في قارورة مخروطية الشكل. بتسخين المخلوط باستخدام ميكروويف. وقف الميكروويف كلما كانت هناك فقاعات الهواء الكبيرة ودوامه في قارورة بعناية حتى الحل إلى مرحلة واحدة فقط-
- إلى تهدئة الحل إلى حوالي 60 درجة مئوية، دوامة قارورة في حمام مائي. سرعة صب الحل في درج صب جل وإزالة فقاعات الهواء، وإدراج كومز. انتظر حوالي 20 دقيقة حتى يتم تصلب جل.
- تعبئة الوحدة التفريد مع 0.5 x TBE وإدراج جل صب علبة تحتوي على [اغروس] هلام. تأكد من أن فتحات جل أحرار من فقاعات الهواء-
- تدور أسفل منتجات PCR باستخدام خيار تشغيل قصيرة الطرد المركزي ميني (لوحة). استخدام ماصة ميكروليتير لخلط كل ميليلتر 3 منتج PCR مع 1 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ (40% السكروز و 0.25% bromophenol الأزرق) وتحميله في فتحات جل من [اغروس] هلام. "الماصة؛" ميليلتر 1.5 سلم الحمض النووي bp 100 في فتحه واحدة لكل سطر مع ماصة ميكروليتير كحجم قياسي. استبدال الغطاء لوحدة التفريد بشكل صحيح والاتصال يؤدي إلى إمدادات طاقة. تشغيل الهلام في 100 V/سم بالنسبة للحد الأدنى 35
- لإعداد حمام المصبوغة، صب مل 1,000 1 x TBE في علبة بلاستيكية على شكل مربع غير منفذة للضوء. إضافة 50 ميليلتر اثيديوم بروميد مع ماصة ميكروليتير وإغلاق غطاء علبة بلاستيكية واهتز لضمان التوزيع المتساوي من بروميد اثيديوم. إزالة الجل من وحدة التفريد
- ووضعه في الحمام المصبوغة لمدة حوالي 10 دقائق. ثم تأخذ الجل خارج الحمام المصبوغة ووضعه على نظام توثيق جل وتصور أنه وفقا للدليل.
- تحليل العينات الوحيدة التي أظهرت نتائج إيجابية (الأجزاء ذات حجم كاف مرئية في [اغروس] هلام) من حيث الوجود والكفاءة الوظيفية القوالب اللاحقة الكشف عن فريسة مؤخرا بلعها.
| مزيج PCR | تركيز العامل الحل | ميكس ل 10 تفاعل PCR ميليلتر | التركيز النهائي في بكر |
| مهاجم التمهيدي | ميكرومتر 10 | ميكروليتر 0.5 | 0.5 ميكرومتر |
| رو التمهيدي | 10 ميكرون | 0.5 & #956 ؛ ل | 0.5 ميكرومتر |
| رد فعل المخزن المؤقت (20 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.55، 16 مم (NH4) 2SO4، وتركيزات النهائي MgCl2 مم 2) | ميكرومتر 1 | ميكروليتر 1 | ميكرومتر 1 |
| دنتب | 10 ملم | < t د > ميكروليتر 0.250.25 مم | |
| [تق] [بولمرس] | 5 يو | ميكروليتر 0.1 | 0.05 يو |
| ddH 2 0 | ميكروليتر 6.65 | ||
| < بهونغ نغ > مجموع المبلغ رد فعل خليط | ميكروليتر 9 | ||
| الحمض النووي | ميكروليتر 1 | ||
الجدول 1: تفاصيل بروتوكول لإعداد الخليط القياسية رد فعل لفعل بكر 10 ميليلتر.
3-الكشف عن بنود الأغذية فريسة بلعها مؤخرا مع مجموعات التمهيدي مجموعة محددة باستخدام هلام التفريد.
وصف- إجراء PCR استخدام مقتطفات الحل العامل من الحمض النووي (أعدت وفقا للخطوات 1.1 إلى 1.3.11) ومجموعة التمهيدي الخاصة بالمجموعة في (غير مسمى، أي دون تعديل) المناسبة للفريسة والمجموعة المستهدفة مثل خطوات 2.1.1 إلى 2.1.3 (للاختلافات في خليط رد فعل لمجموعة التمهيدي كل منها، انظر الجدول 2). تشغيل PCR باستخدام البروتوكول القياسي في خطوة 2.1.4 (للصلب درجات الحرارة لمجموعة التمهيدي كل منها، انظر الجدول 2).
- استخدام عنصر تحكم واحد مع الحمض النووي نقية من عينة المنتمين إلى المجموعة المستهدفة ذات الصلة (مراقبة إيجابية) ومراقبة سلبية واحدة مع الحمض النووي نقية من أنواع المستهلكين في كل بكر تشغيل-
- تحقق نجاح رد فعل PCR باستخدام [اغروس] هلام التفريد هو موضح في الخطوات 2.1.6 إلى 2.1.11. كان رد الفعل PCR ناجح إذا كان جزء من الطول المناسب (انظر الجدول 2) مرئياً لمراقبة إيجابية ولكن ليس لمراقبة سلبية. وإذا لم يتحقق أحد أو كل من هذه المعايير فكرر PCR.
- استخدام [اغروس] هلام التفريد، كما هو موضح في الخطوات 2.1.6 إلى 2.1.11، للكشف عن ما إذا كانت قد استهلكت فريسة والمجموعة المستهدفة بالعينات المستهلك المختلفة اختبار (عن طريق الحكم ما إذا كان مرئياً الجزء الطول المناسب أم لا). تأكد من لا يغيب عن شظايا مع منخفضة الدقة البصرية-
- منتجات PCR مخزن في 4 درجة مئوية، وإذا كان كذلك التحليلات وسوف يتم خلال 24 ساعة القادمة، أو في-20 درجة مئوية إذا كانت التحليلات التي يتعين القيام بها في وقت لاحق.
4. بعد ذلك تحديد الفريسة المستهلكة كذلك المصب باستخدام تحليل SSCP عبر جل Polyacrylamide.
- تحضير هلام اكريلاميد 9% للتفريد SSCP. إعداد الحلول العامل في غطاء مختبر.
- لإعداد حل عامل اكريلاميد 200 مل، وملء اسطوانة قياس مع 20 مل 10 x TBE (109 ز قاعدة تريس، 55 غ من الماء المقطر ومل 40 م 0.50 يدتا، pH 8.0 المذابة في 1000 مل ddH 2 س) وآخر واحد مع 45 مل من 40% (فيها) مزيج الاكريلاميد. صب المزيج TBE والاكريلاميد تخرج قارورة (زجاجة زجاج تخرج مع علامة 200 مل أيضا مناسبة هنا) وإضافة ddH 2 س حتى علامة 200 مل. إبقاء العمل الحل في الثلاجة (4 درجات مئوية) حتى المطلوبة. لا تستخدم العامل الحل الأقدم من أسبوع واحد-
- تزن 0.1 غرام من فوق كبريتات الأمونيوم (وكالة الأنباء الجزائرية؛ استخدام توازن بدقة ز 0.01 على الأقل) إلى دورق حجمي 1 مل وحل أنه بإضافة ddH 2 س حتى التخرج مناسبة لإعداد حل أسهم APS 10%. نقل مختبرين (حوالي 350 ميليلتر) في أنابيب رد فعل جديد.
ملاحظة: مطلوب قاسمة واحد لكل جيل بولياكريلاميدي. تخزين اليكو المتبقيةمحطة تكرير النفط في-20 درجة مئوية وتذويب مختبرين إلا قبل وقت قصير من أنها ضرورية.
تشغيل - تجميع كاسيت جل الشبهة من ألواح الزجاج اثنين وواحد فارغ ولوحة زجاج مسنن واحد (كل 20 سم × 20 سم)، مع الفواصل (1.5 مم) بينهما حتى الجانبين من الزجاج. استخدم كل مقاطع ثلاثة إضعاف إلى الوراء (32 مم) على الجانب الأيمن والأيسر يحملق هلام كاسيت ( الشكل 1).
- ز 5 مزيج من [اغروس] و 250 مل من المخزن المؤقت x TBE 1 في قارورة مخروطية الشكل لإعداد حل 2% [اغروس] هلام. الحرارة وبعد ذلك يبرد الخليط كما هو موضح في الخطوات 2.1.6 و 2.1.7. سرعة صب الحل في علبة بلاستيكية على شكل مربع (21 سم × 6.5 سم × 5 سم) ثم ضع الطرف الأدنى من كاسيت هلام (الخطوة 4.1.3) إلى الحل [اغروس]. ضبط مقاطع إضعاف إلى الوراء في نهاية الكاسيت جل إلى ارتفاع أقل بحيث كانوا يجلسون على حافة المربع البلاستيك مربع الشكل ( الشكل 1). انتظر حوالي 20-30 دقيقة حتى تماما وقد تصلب التوصيل [اغروس]- تعبئة من 100 مل قياس الاسطوانة مع الحل العامل اكريلاميد (الخطوة 4.1.1) حتى علامة 60 مل
- وصب الحل في كوب. استخدام ميكروبيبيتي إضافة 300 ميليلتر من قاسمة واحد الحل APS الأسهم (الخطوة 4.1.2) وبعد ذلك إضافة ميليلتر 37.5 من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد). سرعة، من أجل الحل بين ألواح الزجاج للكاسيت هلام. وبدلاً من ذلك، ضخ الحل بين ألواح الزجاج بحقنه المتاح 100 مل مع تلميح ماصة ميليلتر 1,000 المعدلة لرئيس حقن حقنه.
- بعناية إدراج مشط قياسية سميكة 1.5 مم في نهاية العليا بين ألواح الزجاج. يجب أن تكون محاطة المشط بحل بولياكريلاميدي. انتظر حوالي 1 ح حتى يتم بلمرة هلام بولياكريلاميدي. تجنب التهوية خلال البلمرة قدر الإمكان لأنه يزيد من الوقت اللازم للهلام بلمرة.
ملاحظة: من الممكن لتخزين المواد الهلامية مسبوك داخل أكياس بلاستيكية محكمة الإغلاق مع أنسجة رطب في الثلاجة ما يصل إلى 3 أيام-
رقم 1: صورة توضح البناء صب المواد الهلامية بولياكريلاميدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- وضع كاسيت هلام، التي تحتوي على هلام polyacrylamide على استعداد، في وحدة التفريد رأسي. تعبئة الوحدة التفريد مع المبلغ المناسب (اعتماداً على نوع وحدة التفريد) 0.5 x TBE وباردة الوحدة وصولاً إلى 10 درجات مئوية باستخدام مدوار مبردة.
- تمسخ الحمض النووي، يسخن الكتلة الحرارية/-cycler إلى 96 ° تحضير جيم تمسخ المخزن المؤقت مع 95% ميثلامين (99.5 في المائة سنوياً الصف) و 5% محلول مائي يحتوي على 0.25% بروموفينول الأزرق والسكروز 40% (w/v)-
- منتجات PCR خارج البراد أو الثلاجة وإذابة الثلج منها. تدور أسفل منتجات PCR باستخدام خيار تشغيل قصيرة الطرد المركزي ميني (لوحة). ثم يخلط كل ميليلتر 4 منتج PCR 4 ميليلتر من تمسخ المخزن المؤقت. حرارة خليط لمدة 5 دقائق في 96 درجة مئوية متبوعاً مباشرة بخطوة تبريد في الماء المثلج للحد الأدنى 10
ملاحظة: يجب تحميل عينات على جل polyacrylamide (الخطوة 4، 5) فورا بعد هذا- - إزالة مشط من جل polyacrylamide (الخطوة 4.1.6) واستخدام ميكروبيبيتي لتحميل كل عينة تماما في فتحه جل. تشغيل التفريد في 8 ث كل جل بينما التبريد باستمرار وحدة التفريد إلى 10 ° "جيم تشغيل" الوقت اللازم يعتمد على حجم الأجزاء في فصله. لأحجام جزء من ما يقرب من 210 شركة بريتيش بتروليوم، وقت تشغيل حوالي 3.5 ساعة تعتبر ملائمة.
- لإعداد حمام المصبوغة، صب مل 1,000 س 1 TBE إلى بلاستيك على شكل مربع مربع غير منفذة للضوء وإضافة 30 ميليلتر لتلطيخ صبغ (مناسبة وصمة عار واحد الذين تقطعت بهم السبل من الحمض النووي) مع ماصة ميكروليتير. أغلق غطاء علبة بلاستيكية واهتز لضمان التوزيع المتساوي لصبغ المصبوغة.
- إزالة كاسيت جل من الدائرة الكهربي وفصل لوحة زجاج مسنن بعناية عن الهلام. الشريحة جل polyacrylamide من لوحة زجاج فارغة في الحمام المصبوغة. ضع حمام المصبوغة على جل يهز منصة ووصمة عار لمدة 20 إلى 30 دقيقة مع الرج المستمر-
- أخذ الجل بعناية خارج الحمام المصبوغة ووضعه على طاولة الأشعة فوق البنفسجية نظام الوثائق.
ملاحظة: بسبب عدم استقرار الجل من المستصوب للتعامل مع الخطوة السابقة مع اثنين من الناس. شخص واحد ينبغي أن تعقد حمام المصبوغة بجوار الجدول الأشعة فوق البنفسجية وواحد آخر ينبغي التوصل إلى إطار هلام بكلتا يديه، واعتبر خارجاً، والانزلاق إلى الطاولة الأشعة فوق البنفسجية- - بإغلاق الغطاء أو الباب نظام الوثائق والتقاط صورة وفقا للشركة المصنعة ' دليل التعليمات s-
5. كشف متعددة تناولها مؤخرا مجموعات فريسة في نفس الوقت باستخدام تحليلات يفتت الآلي.
- تحليل محتوى الأمعاء الحمض النووي تستخرج التمهيدي 16 مجموعة محددة باستخدام مجموعات معينة في الجدول 2، مع أول كتاب واحد من مجموعة وصفت بسبب التعديل مع صبغة المصبوغة (انظر الجدول 2 العمود عنوان التعديل)، واستخدام أساليب الكشف عن متوازي من المنظم الآلي.
- استخدام حل العامل مقتطفات الحمض النووي (أعدت وفقا للخطوات 1.1 إلى 1.3.11)، وإجراء فصل تقارير إتمام المشروعات للتمهيدي كل مجموعة مثل هو موضح في الخطوات 2.1.1 ل 2.1.5 (الاختلافات في الخليط ترد في الجدول 2). استخدم عنصر تحكم واحد على الأقل مع الحمض النووي نقية من عينة المنتمين إلى المجموعة المستهدفة ذات الصلة (مراقبة إيجابية) ومراقبة سلبية واحدة مع الحمض النووي نقية من أنواع المستهلكين في كل بكر تشغيل-
- "تشغيل تقارير إتمام المشروعات" في ثيرموسيكلير استخدام بروتوكول PCR القياسية في خطوة 2.1.4، ضبط درجة الحرارة انلينغ كل منهما (وعدد الدورات) للتمهيدي كل مجموعة معينة في الجدول 2-
ملاحظة: استخدام نفس الحمض النووي تخصيص الآبار رد فعل للألى PCR مع كل مجموعة من مجموعات مختلفة من التمهيدي 16 تبسيط اللاحقة تجميع منتجات PCR لمجموعات التحاليل يفتت. - "بكر تخزين" المنتجات في-20 درجة مئوية حتى جميع تقارير إتمام المشروعات المنتمين إلى دفعة واحدة للانتهاء من التحليلات يفتت الآلي (انظر الجدول 2). تبقى منتجات PCR في الظلام وعدم تخزينها أطول من أسبوع واحد قبل تحليلات يفتت.
الجدول 2: تفاصيل دفعات 2 من 15 الخاصة بالفريق التمهيدي أزواج أنشأت كوستر et al. (2013) وزوج التمهيدي Jae28S المصممة حديثا تضخيم مناطق المتاشب 18S أو 28S 16 للمجموعات المستهدفة من ماكروينفيرتيبراتيس المائية. و من الإشعال إلى الأمام؛ r، عكس الإشعال؛ 18S، التمهيدي أهداف فرعية المتاشب 18S؛ 28S، يستهدف التمهيدي في 28S المتاشب وحدة فرعية. " هيدروبيولوجيا، هو فيلوسوس ديكيروجاماروس (قشريات، جاماريداي) ' الجمبري القاتل ' في منظومة "نهر الراين"؟، 768، 2016، الجدول S1، مواد تكميلية الصفحة 2، ميكي كوستر، باستيان باير، رينيه جرجس، (© سبرينغر الدولي نشر سويسرا عام 2015) " بإذن سبرينغر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
- للكشف عن أجزاء مكبرة من كافة التمهيدي 16 مجموعات إجراء تحليلات يفتت الآلي في دفعات 2 الواردة في الجدول 2. استخدام معيار حجم داخلي (الحمض النووي الحجم القياسي كيت--400 [دفعة ب] و-600 [مجموعة A]، على التوالي) لتحديد طول جزء. إعداد لوحة التتابع والتسلسل التلقائي كما هو موضح في الخطوات التالية. علما بأن هذا الإجراء قد يمكن تعديلها إذا كان استخدام منصة أخرى من تلك الواردة في "الجدول المواد"-
- لتشغيل كل دفعة عينة، إعداد خليط يحتوي على الحل تحميل عينة (سلس) وحجم كل منهما القياسية. "الماصة؛" 21.6 ميليلتر من سلس وميليلتر 0.4 من "الحمض النووي الحجم القياسي كيت"-600 كل عينة من المجموعة (أ) وعلى التوالي، 21.7 ميليلتر من سلس وميليلتر 0.3 من "الحمض النووي حجم المجموعة القياسية"- 400 كل عينة من "المجموعة باء"
- منتجات PCR تقارير إتمام المشروعات 8 المنتمين إلى كل دفعة من الثلاجة وإذابة الثلج منها. ضمان أن تكون مسجونة لا يزال في الظلام-
- استخدام ماصة ميكروليتير لتحميل العدد الآبار للوحة تسلسل المطلوبة (عدد عينات تحليلها) مع كل ميليلتر 22 من الخليط كل منهما هو موضح في الخطوة 5.2.1. تدور أسفل المنتجات بكر كل من 8 تقارير إتمام المشروعات باستخدام خيار تشغيل قصيرة الطرد المركزي ميني (لوحة). نقل كل ميليلتر 1 كل منتج PCR كل من تقارير إتمام المشروعات 8 في آبار كل منهما لصفيحة التسلسل مع ماصة ميكروليتير. وتدور أسفل هذا الخليط داخل لوحة التسلسل مع المدى قصير من لوحة مصغرة للطرد المركزي
- بعناية تراكب كل من الآبار التي تستخدم مع قطره واحدة من الزيوت المعدنية. سد الآبار رد فعل كل منهما لصفيحة المخزن المؤقت مع 250-300 ميليلتر من المخزن المؤقت لفصل الحمض النووي-
- استخدام البرمجيات لجهاز التسلسل الشعرية لإنشاء "إعداد عينة" وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. تعيين أساليب التحكم في مجموعات عينة وتحديد تسلسل أساليب لاستخدامها في معالجة البيانات (انظر الجدول 3 لتشغيل ظروف ملائمة للاستخدام مع الحجم القياسي في الجدول المواد). علما بأن من الأهمية بمكان أن توزيع العينات داخل "إعداد نموذج" يطابق تخصيص عينة في لوحة التسلسل (بما في ذلك عناصر إيجابية وسلبية، راجع الخطوة 5.1.1) وأن يحلل الأسلوب الملائم لجزء مع كل منهما يتم اختيار حجم قياسي.
- ملء علبة ترطيب مع المياه وإدراج تسلسل لوحة، لوحة المخزن المؤقت وعلبة التبول في التسلسل الشعرية. إدراج خرطوشة جل يحتوي على كمية كافية من الطازجة هلام فصل الحمض النووي الذي يعتبر ضروريا لتشغيل العينة. تشغيل تسلسل لوحة باستخدام "الإعداد عينة" استعداد.
| التي | تؤذي | منفصلة | الشعرية | حقن | |||
| درجة الحرارة | وقت | الجهد | الوقت | الجهد | الوقت | ||
| حجم 600 القياسي | 90 درجة مئوية | 120 s | 4.8 كيلو فولت | 60 دقيقة | 50 درجة مئوية انتظر Temp: نعم | 2.0 كيلو فولت | 30 s |
| حجم قياسي 400 | 90 درجة مئوية | 120 s | 6 كيلو فولت | 45 دقيقة | 50 درجة مئوية انتظر Temp: نعم | 2.0 كيلو فولت | 30 s |
الجدول 3: شروط محددة لتحليلات يفتت عليها المنظم الآلي باستخدام معايير الحجم الواردة في "الجدول المواد".
- لتحليل النتائج تصدير البيانات الخام، وإيداع تلك البيانات إلى برنامج تحليل الشظايا. اختر القياسية صبغ لون أوامر من الشركة المصنعة لكل منها مجموعة قنوات لون الصبغة.
- إنشاء مجموعات لوحة تحدد النطاق المتوقع لطول الجزء تضخيم بالتمهيدي الخاصة بمجموعة واحدة ضمن دفعة وفقا لدليل المستخدم للبرنامج- حدد الفريق كل منهما ومعيار الحجم المناسب، والألوان القياسية، ونوع من التحليل
- لمعالجة البيانات، وتشغيل الإجراء. اختر خيار اليكتروفيروجرام عرض كثافة إشارة الفلورسنت من الصكوك التفريد الشعرية كعملية تتبع خط واحد لكل لون صبغة. سيتم عرض مجموعات علامات/التمهيدي التي تشير إلى نطاق جزء منها وسيتم تمييز الضبط طول الجزء المكتشف المرتبطة بمركز كل ذروة يسمى (في معظم البرامج التي تلون أو الاسم المعين) تلقائياً.
- لكل عينة، حساب مدى قرب العينة ' s الداخلية حجم قياسي يتطابق مع معيار الحجم المحدد طمأنة نجاح الدعوة إلى الحجم. معظم البرامج تحليلات يفتت لديها خيار تلقائياً حساب ووضع تصور لهذه المباراة. إذا فشل استدعاء الحجم، كرر يفتت تحليلات لتلك العينات.
- بصريا إعادة فحص اليكتروفيروجرام لكل عينة وتأكيد أونكونفيرم ذروة كل طالب للعلامة/التمهيدي كل مجموعة على حدة. إدراج قمم لا مبرر لها التي تتناسب مع معايير مجموعة علامة/التمهيدي أو حذف منها خاطئة وفقا لدليل المستخدم للبرنامج المستخدم يدوياً. تطبيق اسم زوج قاعدي في الحجم أو بن ' "تسمية اليل" '. حساب وعرض مواصفات الذروة في ' "الجدول ذروة" '.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أننا استخدمت بنجاح الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول لتحليل النظام الغذائي ضمن دراسات مختلفة. في هذا القسم، نقدم أمثلة تصف مدى انطباق مقاطع مختلفة من البروتوكول.
وكمثال على ذلك، أجريت تجربة تغذية لإثبات فعالية مجموعات التمهيدي المعينة لمجموعة أنشأها المؤلف28 وإمكانات المزيد من التحليلات المصب من منتجات PCR بتحليلات SSCP،. تم القبض على أفراد من فيلوسوس ديكيروجاماروس كالحيوانات المفترسة واليرقات spp. كينس كفريسة في "نهر الراين" والمناطق النائية قرب كارلسروه (ألمانيا). في المختبر، الأصناف المفترسة والفريسة تم الاحتفاظ بها بشكل منفصل في المصفاة تيار المياه في 20 درجة مئوية، وكانت تفتقر لمدة 36 ساعة. للتجربة، تم وضع العينات خولا في قنينة بالماء تيار المصفاة (100 مل) كل على حدة، تتغذى على يرقات كينس شهرين أو ثلاثة لمدة 30 دقيقة، وفيما بعد تجميدها في نيتروجين سائل. وكان تشريح الجهاز الهضمي من كل فيلوسوس دال- وتم استخراج الحمض النووي كما هو موضح في "البروتوكول الأول". مقتطفات الحمض النووي تم اختباره مع التمهيدي Caep28S تعيين مناسبة للكشف عن كينس spp. باستخدام بروتوكول PCR المناسبة28 كما هو موضح في البروتوكول 3. للتحقق من الفروق بين أجزاء مكبرة من مختلف الأنواع كاينيس ، أجرى بكر مع عينات محتويات القناة الهضمية وعينات الحمض النووي نقية كاينيس مرجع الأنواع الثلاثة. [اغروس] هلام التفريد أدت إلى العصابات واحدة مزدوجة من الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل، التي لا تميز بين مختلف الأنواع كينس مع هذا النوع من التفريد (الشكل 2A). وفي المقابل، بالتفريد جل SSCP، كما هو موضح في البروتوكول 4، كان من الممكن تحديد الكائنات فريسة لمستوى الأنواع بمقارنة عينات محتويات القناة الهضمية مع العينات المرجعية (الشكل 2). نمط جزء SSCP من الأنواع المرجعية ثلاثة بيسكيدينسيس كينس (الشكل 2B، لين 1)، هوراريا كينس (الشكل 2B، لين 2)، و لوكتوسا كينس (الشكل 2B، لين 3) وتتألف من أربعة نطاقات مع اختلاف أنماط. وكان عينتين محتويات القناة الهضمية (الشكل 2B، لين 4 و 5) نمط جزء مساو جيم-لوكتوسا (الشكل 2B، لين 3). وكان نمط جزء عينة محتوى الأمعاء الثالث (الشكل 2B، لين 6) مطابق جيم-هوراريا (الشكل 2B، لين 2). تحليل تسلسل من الاثنين القناة الهضمية محتوى عينات C. لوكتوسا C. هوراريا (الشكل 2B، لين 4 و 6) وأنواع مرجع كل منها التحقق من هذه النتيجة (انظر الملحق الإلكترونية المحاذاة fasta الملف).
رقم 2: الصورة الأصلية من (أ) [اغروس] هلام التفريد و SSCP (ب) تحليل PCR وشظايا من محتويات القناة الهضمية والعينات المرجعية مع مجموعة التمهيدي Caep28S. حارات 1-3 إظهار عينات مرجعية من الأنواع بيسكيدينسيس كينس (1)، هوراريا كينس (2) و لوكتوسا كينس (3). وترد في حارات 4-6، نمط جزء من عينات خولا فيلوسوس ديكيروجاماروس محتوى القناة الهضمية المختلفة. 7 لين يبين نمط جزء من سلم الحمض النووي bp 100. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وعلاوة على ذلك، أجريت تجربة مختبرية في المياه التي تم تغذية عث تنتمي إلى الأنواع استرجون هيجروباتيس في تشيرونوميد اليرقات ليس فقط تحديد إذا كان يمكن الكشف عن الحمض النووي للأفراد تشيرونوميد المستهلكة في العث المياه، ولكن أيضا اختبار ما إذا كان الكشف عن كمية الحمض النووي يعتمد على الوقت المنقضي منذ استهلاك الفريسة29. بعد تجويع العث لمدة أسبوع تقريبا، عرضت كل سوس واحد تشيرونوميد اليرقة كغذاء. تم إصلاح كل الأفراد سوس المياه 3-4 في الإيثانول (المطلقة) للتحليل الوراثي باستخدام مجموعة التمهيدي Chiro18S محددة إلى تشيرونوميداي الأسرة ديبتيران28 في 1، ح 2، 3، 7، 9، 24 و 32 و 50 بعد تغذيتها29. كدرجة من استهلاك الأفراد سوس المياه، صنفت الأفراد فريسة كل منهما في تغذية الفئات الخمس التالية: 1 = امتص تماما، أهاب تفرغ تماما (> 90%)، 2 = امتص تماما تقريبا خارج (> 75-90%)، 3 = شبه امتص بها (> 50-75 ٪)، 4 = فقط امتص جزئيا خارج (> 5-50%)، 5 = أي تغيير مرئي في فريسة الهيئة هيكل (دي فايف ٪)29. تم استخراج الحمض النووي من العث المياه كما هو موضح في "البروتوكول الأول" (بدون خطوات 1.2.1 و 1.2.2) وتم التحقق من وجود المتاشب 18S في الاستخراج والكفاءة الوظيفية للقالب كما هو موضح في البروتوكول 2. الكشف عن فريسة الحمض النووي أجريت وفقا للبروتوكول 4 باستخدام فقط في Chiro18S المسمى التمهيدي مع التمهيدي إلى الأمام مع صبغ نيون (انظر الجدول 2) و "الحمض النووي الطقم حجم قياسي"-400. للسماح بتحليل مقارنات بين العينات ضمن تشغيل مختلفة المنظم الآلي، والنسبة بين عينة ذروة الارتفاع وارتفاع الذروة أقرب المعايير الداخلية (أي360 بي بي في هذه الحالة) لكل عينة تم حسابها واستخدامها ك وكيل مبلغ الكشف عن الحمض النووي. وأظهرت النتائج أنه يمكن اكتشافها في تقريبا جميع الأفراد من استرجون هيجروباتيس تتغذى على اليرقات تشيرونوميد29تشيرونوميد الحمض النووي. من فترة أقصر (ح 1 بعد الرضاعة) لفترة أطول بعد الرضاعة (ح 50) المبلغ النسبي فريسة الكشف عن الحمض النووي كان إلى حد كبير تخفيض (الشكل 3A)29. وعلاوة على ذلك، أكدت العلاقة بين الوقت بعد الرضاعة وتصنيف فريسة كوكيل لمقدار بلعها الجارحة يمكن أن يكون الحمض النووي (الشكل 3B)29. الحد من فريسة الحمض النووي الكشف مع زيادة الوقت بعد التغذية على الأرجح تعكس تماما بتدهور الحمض النووي وهضم الفريسة، لأن فريسة اجيستيون من الحمض النووي العالية غير قابلة للتصديق بسبب الافتقار فتحه الشرج في المياه عث29. وتؤكد هذه النتائج مدى ملاءمة هذا النهج للتحديد الكمي لفريسة بلعها.
الشكل 3: العلاقات بين ln الوطنية نسبة الارتفاع (عينة ذروة مرتفعات/معيار360 ذروة الارتفاع) و (أ) الوقت بعد تغذية العث والفئة (ب) تغذية (n = 23). "التجريبية وتطبيق أكارولوجي، الكشف عن أول فريسة الحمض النووي في استرجون هيجروباتيس (هيدراتشنيديا، سوس): نهج جديد لتحديد علاقات الفرائس في المياه العث، 67، 376، مارتن ص، كوستر م.، ل. شينوى، ر. جرجس، (© الدولي سبرينغر النشر سويتزيرلوعام 2015) "بإذن سبرينغر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
للتحقيق في أهمية اﻻفتراس من قبل خولا الغازية فيلوسوس دال- في تحليل النظائر المستقرة الميدان، مكثفة من δ13ج و δ15كانت تعزز ن فيلوسوس د والموارد الغذائية المحتملة قبل الجزيئية الكشف عن فريسة بلعها مؤخرا ضمن محتويات القناة الهضمية الضبط نفس الأفراد. في المجموع، جمعت الأفراد فيلوسوس دال- 206 من مواقع مختلفة وتم تشريح الجهاز الهضمي لكل فرد وتم استخراج الحمض النووي وفقا للبروتوكول 1. وأكد وجود والكفاءة الوظيفية للقوالب المستخدمة كما هو موضح في البروتوكول 2. تم اختبار اﻻفتراس مؤخرا من قبل الأفراد فيلوسوس دال على العديد من الأصناف فريسة ماكروينفيرتيبراتي كما هو موضح في 4 البروتوكول. عموما، سوى 16 في المائة محتويات القناة الهضمية فيلوسوس دال- اختبار إيجابي للحمض النووي المنتمين إلى أي من الأصناف فريسة مستهدفة ماكروينفيرتيبراتي 16، ويؤيد نتائج تحليل النظائر المستقرة التي أشارت إلى سلوك تغذية مفترس منخفضة خولا الغازية في حقل27. بينما ضمن التحليلات الجينية، تم العثور على الحمض النووي من 12 فريسة اختبار الأصناف في عينة محتوى الأمعاء على الأقل 1، الحمض النووي للأصناف فريسة 4 لم يكن تم الكشف عنها (الشكل 4)27.
4 الرقم: الرسم البياني يوضح عدد الأفراد فيلوسوس د من كل عشرة مواقع محتويات القناة الهضمية التي اختبرت إيجابية بالنسبة ماكروينفيرتيبراتي كل منهما فريسة الحمض النووي- بكر أجريت مع 16 الخاصة بالفريق التمهيدي مجموعات كما هو مبين. "هيدروبيولوجيا، هو فيلوسوس ديكيروجاماروس (قشريات، جاماريداي)' الجمبري قاتل 'في منظومة" نهر الراين "؟، 768، 2016، 310، ميكي كوستر،" باستيان باير "، رينيه جرجس، (© سبرينغر النشر الدولي سويسرا) عام 2015" بإذن من سبرينغر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الملف التكميلي. Sequence_alignement_feeding_trial.fasta اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهنا نقدم طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة للتصميم القائم على بكر من التفاعلات الفرائس من العينات الميدانية عن طريق الإشعال الخاصة بالمجموعة لمناطق المتاشب، التي يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع غيرها من التحليلات غير الجزيئية للعينة نفسها. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول. أولاً، من الضروري ضمان خصوصية الإشعال المستخدمة. ثانيا، من المهم تجنب التلوث وفقدان المواد محتوى الأمعاء أثناء إعداد القناة الهضمية واستخراج الحمض النووي اللاحقة. بينما يمكن أن يؤدي التلوث عبر عينة للكشف إيجابية كاذبة من الحمض النووي فريسة، خسارة للقناة الهضمية محتوى المواد قد يؤدي إلى فقدان نادراً ما استهلاك الأنواع الفريسة. تحقق وجود المتاشب ينتمون إلى وحدة فرعية كل منها والكفاءة الوظيفية للقوالب المستخدمة للتحليلات (المادة 2 من البروتوكول) ضروري لجمع المعلومات التمثيلية حول الفريسة المستهلكة. وهذا وجه الخصوص حاسمة، إذا كان يمكن أن يكون لا الحمض النووي لمجموعات فريسة للمستهلك من المفترض أن تتغذى على الكشف عن25،27. وعلاوة على ذلك، عند إعداد تقارير إتمام المشروعات (الخطوات 3.1 و 5.1.1 و 5.1.2) من الأهمية بمكان أن الخليط والبروتوكول المستخدم بالضبط تتناسب مع المعايير التي تم تحديد التمهيدي كل منهما إلى مجموعة معينة من الأصناف. خلاف ذلك، أما تضخيم الحمض النووي ضمن تفاعل PCR قد يفشل تماما، أو قد يكون تضخيم الحمض النووي للأنواع غير المستهدفة، فضلا عن. ولذلك، وجوب استخدام إيجابي وتشغيل عناصر التحكم سلبية داخل كل بكر أن أؤكد أن رد فعل PCR عملت وحدوث أي تلوث. بالإضافة إلى ذلك، من الضروري أن مجموعة العينات لكل تشغيل PCR هو موثقة تماما لتمكين التعيين الصحيح الجارحة المستهلكة بالعينة المستهلك كل منهما. لهذه المهمة، يجب الحذر بصفة خاصة أن يؤخذ أثناء تجميع منتجات PCR للكشف عن العديد من المجموعات فريسة عبر تحليلات يفتت الآلي (الخطوة 5.2.3) موازية.
للكشف عن الأجزاء التي تم تضخيم [اغروس] هلام استشراد (خطوات 3.2 و 3.3) [اغروس] باستخدام المواد الهلامية ينبغي أن تكون رقيقة قدر الإمكان ويكون الحرص أثناء التفتيش البصري للصورة لتجنب الشظايا مع الدقة البصرية المنخفضة في عداد المفقودين. للنتائج وإبرام مناسبة حول استهلاك الفريسة بمستهلك، من الأهمية بمكان أن تحظى باعتراف الأصناف المستهلكة حتى نادراً فريسة. الجل سميكة [اغروس] يقلل من التعريف بكميات قليلة يحتمل أن تكون فريسة الحمض النووي وبالتالي تقليل الاحتمال يغيب فريسة نادراً ما يستهلك والأخذ بأوجه عدم اليقين في النتائج المستخلصة من التحليل. وعلاوة على ذلك، من وجهة نظر صحية، استخدام بديلاً أقل أو غير سامة من اثيديوم بروميد لتلطيخ المواد الهلامية قد يكون من المستصوب. ويشمل البروتوكول من أجل مزيد المصب التحليل اللاحق لتضخيم أجزاء عن طريق التحليلات SSCP استخدام المواد الهلامية polyacrylamide بعض الخطوات التي ينبغي أن يقوم بحذر خاص. من المهم أن جل كاسيت تجميعها مانعة للتسرب (الخطوة 4.1.3) والحل بولياكريلاميدي هو إعطاء وقت كاف بلمرة تماما (الخطوة 4.1.6). فتح الكاسيت في وقت مبكر جداً سوف يؤدي إلى تسرب السائل الاكريلاميد الحل، وعلى الرغم من حقيقة أن التحضير البدء من البداية، واسعة النطاق تنظيف ينبغي القيام به، وكذلك. وعلاوة على ذلك، نقل جل بولياكريلاميدي في الحمام المصبوغة (الخطوة 4، 7)، ومن هناك إلى الأشعة فوق البنفسجية الجدول (الخطوة 4، 8) يلزم القيام به بعناية شديدة بسبب عدم استقرار هذه المواد الهلامية. خلاف ذلك، قد تمزق الهلام ويمكن أن تعطل الشظايا، الأمر الذي يؤدي إلى ضرورة تكرار هذا الإجراء.
واحد المتطلبات الرئيسية لمعالجة البيانات الواردة من تحليلات يفتت الآلي بنجاح أن معيار الحجم الداخلي للعينة تطابقاً مع النمط القياسي الحجم تقدمها الشركة المصنعة (الخطوة 5.3.3) لتمكين تصميم طول بلغة مناسبة. يرجع أهمية حاسمة خاصة خلاف ذلك، أجزاء مختلفة، المسمى مع الفلورسنت نفس تلطيخ صبغ، قد يتم تعيين للأصناف فريسة خاطئة وبالتالي تؤدي إلى سوء التقدير كامل للتفاعلات الفرائس. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تظهر اليكتروفيروجرامس الضوضاء الخلفية. لإرساء الثقة في التفسير، من الضروري أن قمم معيار حجم الداخلية أعلى بكثير من ضجيج الخلفية للعينة. ونتيجة لذلك، إلا ينبغي أن يحسب الذروة لكل علامة/التمهيدي إذا كانت أعلى بكثير من ضجيج الخلفية.
يمكن تعديل هذا البروتوكول للكشف عن عدة مجموعات من الأنواع الفريسة من الاهتمام داخل مختلف المستهلكين بالفائدة. من المسلم به أن الإشعال الخاصة بالمجموعة قد الفعل لا تتوفر لكل الأصناف فريسة محتملة للفائدة. ومع ذلك، تتوفر الإشعال الخاصة بالفريق ليس فقط لعدة ماكروينفيرتيبراتي المياه العذبة [تاكسوم]28، بل أيضا لمجموعة واسعة من الأصناف الأخرى (مثلاً، عدة ماكروينفيرتيبراتي البحرية الأصناف16،30 و الأنواع الشائعة لطيران الحشرات31). وبالتالي، يحدد اختيار التمهيدي مجموعة محددة مناسبة لتضخيم الحمض النووي لجميع الأنواع فريسة للأصناف المعطاة، ولكن غير ناجحة في تضخيم الحمض النووي من الأنواع التي لا تنتمي إلى هذا الصنف، أساسي32. تم تحديد العديد من أجهزة الإشعال الخاصة بالمجموعة التي أصبحت الآن متاحة لمجموعة معينة من الأصناف (مثلاً، الأصناف 130 من ماكروينفيرتيبراتيس المياه العذبة المشتركة في منظومة "نهر الراين"28). ولذلك، لتجنب النتائج السلبية الكاذبة أو إيجابية كاذبة، ينبغي فحصها خصوصية هذه كبسولة تفجير لمجموعة الأصناف الشائعة في النظام الإيكولوجي للفائدة قبل تطبيقها على الأنواع المستهدفة وغير المدرجة في مجموعة الأصناف للمستهلكين الذي كان قد أنشئ في الإشعال. وعلاوة على ذلك، إذا لم تقترن بتلك التحليلات الجزيئية قد تخطي تحليلات أخرى لتشريح الفردية، نفس الدقيق من الجهاز الهضمي.
ومع ذلك، تشريح الجهاز الهضمي من عينات أكبر أيضا يمنع فشل استخراج الحمض النووي بسبب الكثير من المواد، ويقلل من وجود الحمض النووي المستهلك في استخراج عينة. ومع ذلك، وقد أظهرت الدراسات أن استخدام كبسولة تفجير حظر محددة، التي نعلق على الحمض النووي للمستهلك، ومما منعه، لأن رد فعل بكر يمكن أن تعزز فعالية التضخيم تسلسلات نادرة في عينات مختلطة33. ولذلك، تشريح الجهاز الهضمي يمكن تجنبها، حتى عند التعامل مع عينات أكبر من المستهلكين، عن طريق استخدام كبسولة تفجير حظر محددة. للكشف عن متوازي أمبليكونس المستمدة من عدة مجموعات التمهيدي خاصة بالمجموعة عبر تحليلات يفتت الآلي، ينبغي الحرص في اختيار تلطيخ صبغ كتسمية. وبالتالي، ينبغي أن المسمى مجموعات التمهيدي تضخيم أجزاء من نفس الطول تقريبا مع الأصباغ الفلورية يمكن تمييزها الواضح. وعلاوة على ذلك، هناك مجموعة من أنظمة التفريد الشعرية المتاحة من العديد من الشركات المصنعة. يفترض أن بعض هذه النظم تسمح تحديد أجزاء متعددة حتى عن طريق الأصباغ غير محدد. يمكن بسهولة تعديل البروتوكول المعروضة هنا للكشف عن أجزاء مكبرة مع أي من تلك النظم. وعلاوة على ذلك، لتقليل الوقت اللازم ل tأنه يحلل، فسيكون من الممكن تحسين فحوصات واحد متعدد-بكر لتضخيم الحمض النووي لمجموعات فريسة لدفعة تحليل جزء واحد في وقت واحد (على سبيل المثال، تزامن التضخيم 12 فريسة الكائنات من الخنافس34 أو حتى حلقت ست الحشرات 31من الأصناف).
عيب محتمل للقناة الهضمية تحليل المحتوى بشكل عام، وبالتالي أيضا التحليلات المبينة في هذا البروتوكول، الأزمنة منخفضة. مع مثل هذه الأساليب، من الممكن فقط تحديد الكائنات بلعها مؤخرا، والتي قد تؤدي إلى أوجه عدم اليقين في أهمية الكائنات الحية فريسة واحدة2. ومع ذلك، أثبتنا أن التحليل الجيني وفقا لهذا البروتوكول يمكن أن يقترن بسهولة تحليل النظائر (δ15N و δ13ج) الضبط نفس المستهلك العينات25،27. دمج الوقت طبيعي الراسم التفاعلات الفرائس، كثيرا ما تستخدم تحليل النظائر المستقرة تميز هياكل الشبكة الغذائية1، بل غالباً ما تعوق قيم النظائر المتداخلة المحتملين من فريسة مختلفة الأنواع الضبط تعريف الفرائس التفاعلات2. ولذلك، استخدام هذا البروتوكول للتحليلات الجينية في تركيبة مع تحليل النظائر المستقرة للتغلب على مساوئ كل طريقة يمكن زيادة فهمنا للشبكات الغذائية وعلاقتها بتدفق المغذيات أو الطاقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر كلاسين سيلك من معهد البحوث لتحليل النظام الإيكولوجي وتقييم (جايك)، "الجامعة التقنية الراينية آخن" لمساعدتها في إنشاء مجموعات التمهيدي المجموعة الخاصة المستخدمة في هذا البروتوكول. ونشكر أيضا بيتر مارتن ولورا شيناوا من جامعة كيل للتعاون في تجارب المياه العث. ونشكر أيضا مساعدين مختبر تقني لحفظ المختبر بسلاسة، وإعداد سجل الشركات وأرقام فهرس. وأيد هذا العمل "مؤسسة البحوث الألمانية" (DFG؛ المشروع "شركة جنرال الكتريك" 2219/3-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
References
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
- Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
- Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
- Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
- Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
- Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
- Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
- Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
- Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
- Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
- Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
- Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
- Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
- Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
- Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
- Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
- Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
- Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
- Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
- Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
- Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
- Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
- Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6 (2007).
- Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
- Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
- Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
- Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831 (2007).
- Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501 (2014).
- Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
- Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12 (2008).
- Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).
