Summary
Macroinvertebrates의 가장 일반적인 직감 콘텐츠 분석은 시각. 먹이 생물의 형태학 상 다양성에 대 한 강렬한 지식을 요구, 그들은 부드러운 바디 먹이 놓치지 고, 때문에 먹이의 강한 분쇄, amphipods를 포함 한 어떤 유기 체에 대 한 거의 불가능 하다. 우리는 macroinvertebrate에 대 한 자세한, 소설 유전 접근 먹이 amphipods의 식단에 식별을 제공 합니다.
Abstract
음식 웹 분석 생태계의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 예를 들어 식품 웹 상호 작용 비 원주민 종족의 침공으로 인 한 심한 변화를 받을 수 있습니다. 그러나, 필드 약탈자 먹이 상호 작용의 정확한 식별 대부분의 경우에서 어렵습니다. 이러한 분석은 종종 본질적인 내용에 대 한 시각적 평가 또는 안정 동위 원소 비율 (δ15N 그리고 δ13C)의 분석 기반으로 합니다. 이러한 방법이 필요 포괄적인 지식에 대해, 각각, morphologic 다양성 또는 개별 먹이 생물, 먹이 생물의 정확한 식별에서 장애물을 선도에서 동위 원소 서명. 단식, 섭취 및 먹이 생물의 소화 어려울 특정 종의 식별 하기 때문에 비주얼 직감 콘텐츠 분석 특히 부드러운 바디 먹이 생물을 과소 평가. 따라서, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 전략, 예를 들어 그룹-특정 뇌관의 사용 설정, 식품 웹 상호 작용의 수사를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 여기, 우리가 핵 ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA)에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 필드에서 macroinvertebrate 소비자의 본질적인 내용을 조사 하기 위해 상세한 프로토콜을 설명 합니다. DNA 수 (작은 taxa)의 경우 전체 표본에서 추출 하거나 표본 수집 분야에서의 본질적인 내용. 존재와 DNA의 기능 효율성 테스트 개인에서 직접 확인 될 필요가 보편적인 뇌관을 사용 하 여 DNA의 각 소 단위를 대상으로 설정. 우리는 또한 소비 먹이 후속 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤을 사용 하 여 수정 되지 않은 그룹 특정 한 뇌관으로 PCR 통해 종 수준 추가 결합 결정 될 수 있다 보여줍니다. 또한, 우리는 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 자동된 조각 분석을 통해 여러 창 콘텐츠 샘플에서 다른 먹이 그룹의 DNA 파편에 대 한 병렬 심사 수 보여줍니다.
Introduction
약탈자 먹이 상호 작용, 영양 상호 작용 및 음식 웹 역동성의 대부분을 구성 하는 물질과 식품 웹 시간과 생태계 생태학의 주요 목표 중 하나는 사이 걸쳐 에너지의 플럭스 특성 주요 측면은 1. 소스 결정과 탄소와 영양소의 흐름 생태계2사이의 생태 연결의 이해 발전 이다. 그러나, 생태계, 강과 그들의 catchments 같은 생물3의 움직임에 의해 뿐만 아니라 유기 물질과 영양소의 용만 연결 되지 않습니다. 따라서, 그 시스템을 연결 하는 자원의 흐름을 방해 하는 서식 지 변경 변경할 수 있습니다 강력 하 게 두 생태계의 음식 웹 직접 뿐만 아니라 또한 간접적으로 포식 자-먹이 커뮤니티의 각각 구성 변경 하 여. 예를 들어, 음식 웹의 변화 한 포식 종 (예를 들어, 무지개 송어)4의 움직임에 연결 될 표시 되었습니다. 이러한 변화는 잠재적으로 생물 다양성 및 수생 생태계의 기능을 위협 한다. 따라서 필드에 약탈자 먹이 상호 작용 분석 인간 유발 환경 변화, 등 물 관리 관행, 수생 생태계의 네이티브 생물 다양성에 미치는 영향을 결정 필수적 이다.
영양 관계를 추적 하는 것은 어려운 복잡 한 시스템에서 이후 몇 가지 방법은 설립 되었습니다를 사용 하는 필드5에 있는 상호 작용을 먹이의 평가. 전통적으로, 조사 분야에서 상호 작용을 먹이 기의 해 부 용기에 먹이 남아의 시각적 식별에 기반 하 고 형태 론 적 먹이 다양성에 대 한 광범위 한 지식이 필요로. 비주얼 직감 콘텐츠 분석 소비자 (예: 계절 변화 다이어트에 랍스터6 와 물고기7,8 또는 먹이 환경 설정의 copepods의)의 여러 그룹의 리소스 사용에 대 한 통찰력을 제공 했다. 그러나, 소화의 물리적 과정 시각 직감 콘텐츠 분석 어려운 만들고 일반적으로 소프트 바디 먹이 유기 체9를 그리 워 합니다. 액체 섭취에 의해 먹이 종에 대 한 또는 집중적으로 그들의 음식 섭취, amphipods, 같은 전에 comminute 몇몇 무척 추 동물 소비자에 대 한 본질적인 내용에 먹이 종의 시각적 식별 불가능 한10입니다. 이러한 제한으로 인해 분자 분석 유망한 대안을 제공합니다.
분자 분석 이제 본질적인 내용에 신속 하 고 정확한 먹이 탐지를 허용 하는 일반적인 도구 되고있다. 이러한 기술의 범위는 다양 한: 단일 클론 항 체 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 근거를 둔 전략은, 때문에 자주 사용 그들의 높은 특이성 및 감도11. 새로운 단일 클론 항 체의 개발은 시간 및 비용 집중, 그러므로, 다른 분자 기술에의 응용 프로그램은 더 유용 항 체11를 이미 존재 하지 않는 경우. 또 다른 일반적인 접근은 보편적인 뇌관을 사용 하 여 대부분의 종에서 존재 ribosomal ribonucleic 산 (RNA) 유전자 처럼 deoxyribonucleic 산 (DNA)의 증폭 세트12,13이다. 이 기술을 사용 하 여, 그것 불가능 자주 DNA14의 혼합된 소스 내에서 먹이 생물의 전체 범위를 식별 합니다. 이러한 단점을 피하기 위해 효과적인 접근 그룹 특정 뇌관을 사용 하 여 유전 직감 콘텐츠 분석에 대 한 설정입니다. 특정 대상 그룹의 DNA 영역만을 증폭 하 고 모든 다른 종15,16제외 하도록 설계 된, 그룹 전용 프라이 머 사용 없이 지정된 된 그룹의 분류학 수준에 먹이 생물의 식별 시간 및 비용 집약적인 보조 분석입니다. 그러나, 모든 콘텐츠 분석 직감, 같은 같은 분석만 먹이 행동의 스냅샷을 제공 합니다. 따라서, 분석 시간 통합 자연 추적기 (예를 들어, 안정 동위 원소)의 분자 용기 콘텐츠 분석을 결합 하는 것은 유익한1,2간주 됩니다.
여기, 약탈자 먹이 상호 작용 동일한 견본의 안정 동위 원소 분석 결합 될 핵 ribosomal DNA (rDNA) 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 PCR 기반 조사에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법을 통해 단일 먹이 그룹의 DNA의 탐지를 설명합니다. 또한, 선물이 해당 같은 그룹-특정 뇌관의 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석 기회 뇌관 특이성 보다 높은 분류학 해상도 필요할 때마다. 때문에 단일 좌초 DNA (ssDNA) 양식 3 차 conformations 그들의 기본 시퀀스17에 의해 결정 되는 조각, 조각 같은 그룹-특정 뇌관에 의해 증폭에 작은 변화 구조적 변화에 이어질. 이러한 변화는 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤17,18, 먹이 생물 (종 수준)의 더 정확한 id를 사용 하 여 검색할 수 있습니다.
Agarose 젤 전기 이동 법 DNA 파편을 시각화 하 고 그들의 대략적인 길이19, 해상도 결정 하는 일반적이 고 저렴 한 도구는 DNA의 금액에 따라 달라 집니다 및 착 색 염료 사용20동안에. 일반적으로, 시각화는 곧장 앞으로 순수한 DNA 샘플을 작업할 때 하지만 잠재적으로 낮은 양의 먹이 소비자의 본질적인 내용에 DNA agarose 젤 전기 이동 법 결과의 점수 복잡 수 있습니다. 아직도,이 검색 메서드는 가능한 한 낮은 필드에서 소비자 표본 수를 화면 또는 몇 먹이 그룹, 하지만 점수에 합병증 샘플의 높은 숫자의 심사 여러 먹이 taxa 매우 시간이 집중 따라서 불가능. 더 민감한 검출 방법의 조각 조각21의 정확한 길이 결정 있습니다 모 세관 전기 이동 법을 통해 자동화 된 분석 이다. 여러 microsatellite 기반 연구 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 그것이 감지 하 여 자동된 조각 분석22,23에 의해 다른 파편의 유사한 길이 결정 24. 따라서, 우리 또한 현재 여러 먹이에서 DNA의 병렬 검색에 대 한 자세한 프로토콜 레이블된 그룹-특정 뇌관 세트와 자동화 된 시퀀서와 자동된 조각 분석을 통해 감지 PCR를 사용 하 여 그룹. 또한, 우리는 자동된 조각 분석을 통해 먹이 DNA의 검출 방식은 또한 섭취 한 먹이의 상대 정량화를 가능 하 게 보여주는 사례 연구에서 결과 제시.
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Protocol
1. 필드에서 Macroinvertebrates를 수집 하 고 유전자 직감 콘텐츠 분석에 대 한 샘플 준비.
각 사이트에서- 수집 macroinvertebrates 개인 소비자 종의 단일 튜브에 대 한 관심의 밖으로 정렬 하 고 직접 액체 질소 나 드라이 아이스 용기 클리어런스 및 DNA의 저하를 방지 하기 위해 그들을 동결.
참고: 알콜, 샘플 저장 일부 macroinvertebrates 알콜 그들을 죽이기 전에 역류 하는 경향이 있기 때문에 피하기. - 만 사용 하는 위장 지역 중간 크기 및 큰 (약 > 3 m m) macroinvertebrate 종 유전 직감 콘텐츠 분석 표본의 나머지 문제는 다른 절차 (예를 들어, 안정 동위 원소에 대 한 사용할 수 있도록 분석)입니다. Note에 해당 물 진드기 처럼 매우 작은 taxa를 조사할 때. 따라서, 1.2.1, 1.2.2 단계를 건너뛸 수 있습니다.
- 약간 개인 녹 하 고 신중 하 게 그것의 위장 지역 좋은 스테인레스 스틸 집게를 사용 하 여 stereomicroscope에서 해 부. 펑크 물질의 손실을 방지 하기 위해 위장 관을 하지 있는지 확인 하십시오.
- 클린 집게 각 위장의 준비 후에 DNA와 RNA 오염 제거 오염 제거 솔루션을 사용 하 여. 따라서, 오염 제거 솔루션에서 10 분 집게를 품 어. 나중에, 잔여 자취를 제거 하 여 보풀 종이 타월로 닦아 살 균 물으로 그들을 씻어.
- 2.0 mL 안전 잠금 반응에 전송 해 부 위 장관 튜브 포함 440 µ L (450 µ L 가능한 반복적인 피 펫의 사용) 소금 추출 버퍼 [셉; 0.4 M 염화 나트륨 (NaCl), 10 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethane 염 산 염 (Tris HCl) pH 8.0, 그리고 2 m m ethylenediaminetetraacetic 산 disodium 소금 탈수 (EDTA) pH 8.0]. 매장에서 샘플을 준비 − DNA 추출까지 즉시 20 ° C. 며칠 내에서 DNA를 추출 됩니다 확인 하십시오.
- 수정된 높은 소금 추출 프로토콜 25를 사용 하 여 DNA를 추출.
- 냉동 실에서 걸릴 샘플
- 입니다. 집게를 사용 하 여 각 샘플 튜브를 한 5 mm 스테인레스 스틸 비드를 추가 하 고 실내 온도 (RT) 해 동에 벤치에 냉동된 샘플을 둡니다. 비드 밀을 사용 하 여 샘플 15 Hz에서 1 분 동안 균질.
- 원심 분리기의 짧은 실행 샘플 아래로 회전합니다. Microliter 펫을 사용 하 여 추가 90 µ L (100 µ L 반복적인 피 펫의 사용 가능) 10% 나트륨 라우릴 황산 염 솔루션 (SDS) 및 5 µ L 10 mg/mL 가수분해 공화국의
- 소용돌이 철저 하 게 샘플링 하 고 일정 한 thermomixer에 400 rpm에서 떨고와 60 ° C에서 1 시간에 대 한 혼합물을 품 어. 또한, 철저 하 게 소용돌이 샘플을 더욱 촉진 세포 마다 10 분.
- 스핀은 원심 분리기의 짧은 실행 샘플 다운 추가 microliter 피펫은와 40 분 동안 약 0.5-1 분 원심 분리기 샘플에 대 한 철저 하 게 소용돌이 5 M NaCl의 350 µ L 16200 x g에서 5 ° c.
참고: 한 행에 여러 집합 할 수 있다면는 원심 분리기의 온도 설정이 필요가 약간 발생 (안 보다 10 ° C) SDS 온도가 너무 낮은 경우 flocculate 경향이 있기 때문에. - 사용 microliter 펫 새로운 1.5 mL 반응 관에 약 600 µ L 표면에 뜨는 전송. 펠 릿에서 아무것도 제거 하지 않도록 주의 하십시오.
- 팁 스테인리스 스테인리스 차 여과기에 반응 관에서 흐르는 물으로 그들을 청소 구슬과 10 분을 철저 하 게 씻어 살 균으로 오염 제거 솔루션에 대 한 오염 제거 솔루션 페 트리 접시에 그들을 품 어 물과 에탄올에 청소 구슬 저장 (> 99%, 펜 실바 니 아 학년) 또는 재사용까지 건조.
참고:이 단계에서 직접 할 수 필요는 없지만 오히려 할 수 있는 다음 단계에서 대기 시간 있을 때마다 구슬의 청소. - 추가 600 µ L의 얼음 처럼 차가운 소 프로 파 놀 (펜 실바 니 아 학년)는 microliter와 상쾌한에 플라스틱 하 고 신중 하 게 반전 튜브 몇 번. -20에서 하룻밤 샘플 저장 ° c.
- 냉동 실에서 샘플을 16200 × g 및 실 온에서 20 분 동안 원심. 신중 하 게 삭제는 상쾌한 고 보풀 휴지와 함께 신중 하 게 튜브를 건조. 주변 온도 (이상 25 ° C), 높은 경우는 상쾌한 삭제 하는 동안 미 끄 러 펠 릿을 피하기 위해 5 ° C에서 원심 참고.
- 세척 포함 DNA 70% 에탄올과 펠 릿. 이렇게 하려면 추가 차가운 에탄올 (70%, 펜 실바 니 아 등급)의 200 µ L 16,200 g 및 실내 온도 (또는 필요한 경우 5 ° C)에서 10 분에 대 한 샘플링 microliter 피 펫 및 원심 분리기를 사용 하 여. 신중 하 게 삭제는 상쾌한 고 보풀 휴지와 함께 신중 하 게 튜브를 건조. 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 나머지 상쾌한에서 플라스틱을 약 8 µ L 조정. 펠 릿을 방해 하는 하지 있는지 확인 하십시오.
- 모든 에탄올 증발 될 때까지 약 5-20 분 또는 벤치에 실 온에서 60 ° C에서의 펠 렛 건조.
- 디졸브 펠 릿 nuclease 무료 50-100 µ L에 (증기 소독 및 DEPC 처리) 물 (ddH 2 O), 적어도 (비록 4 ° C에서 하룻밤 더 나은 결과 얻을 수 것입니다) h 1에 대 한 대기.
- 제조 업체에 따르면 마이크로 볼륨 분 광 광도 계, 각 샘플에 포함 된 DNA의 양을 측정 ' s 지시. 약 2-10 ng DNA를 포함 하는 각 샘플의 작업 희석 만들기 / µ L. 냉동 실에 재고 솔루션을 유지. 냉장고에서 작업 솔루션을 유지 하 고 그 추가 샘플 확인 처리 곧 이루어집니다.
2. 최근 섭취 한 먹이의 후속 검색에 대 한 DNA 추출 물의 기능적 효율성 확인.
- 존재 및 서식 파일, 기능 효율성 테스트 각 DNA 추출 (단계 1.1 1.3.11) 되도록 각각 음식 소스에 대 한 적합 한 세트 보편적인 뇌관을 사용 하 여 (예를 들어, 무척 추 동물 16 , 26)를 대상으로 먹이 25 , 27의 후속 검색에 사용 되는 그룹-특정 뇌관으로 같은 핵 소 단위. 다음 단계는 보편적인 뇌관 세트 NSF1419/20 및 NSR1642/16 16 및 LSU D1, D2 fw1와 LSU D1, D2 rev2 또는 LSU D1, D2 rev4 26의 사용을 참조 하십시오. 증명 하기 위해 PCR 반응 성공 했습니다 하 고 오염이 없음 발생 했습니까, 성공적으로 증폭 이미 했다 DNA를 포함 하는 긍정적인 통제와 ddH 2 O 각 PCR 실행 내에서 DNA 대신을 포함 한 컨트롤 샘플 사용.
- 뇌관으로 각각 뇌관 재고 솔루션 및 ddH 2 O (재고 솔루션의 농도)에 따라 적절 한 양의 플라스틱 뇌관의 최종 농도 10 µ M를 포함 하는 작업 솔루션을 준비 하는 micropipettes를 사용 하 여 신선한 1.5 mL 반응 관.
- 뇌관, deoxynucleotide 믹스 (dNTPs), 반응 버퍼, Taq DNA 중 합 효소와 ddH 2 O (샘플 처리 수의 수)에 따라 1.5 또는 2.0 ml에서 반응 관, 후와 동이이 혼합물을 추가합니다. 10 µ L PCR 반응의 표준 반응 혼합물에 대 한 자세한 볼륨 표 1에 주어진 (대 한 화학 물질 사용의 자세한 내용은 재료의 표 참조). DNA의 각 1 µ L 전송
- 사용 microliter 펫의 9 µ L로 추출전자 표준 반응 혼합물 PCR 튜브 (또는 PCR 격판덮개의 우물). 반응 관 또는 플레이트 (모자 줄무늬)와 반응 우물 닫습니다.
- 는 thermocycler 프로그램: NSF1419/20, NSR1642/16 16 뇌관 세트에 대 한 표준 프로토콜은: 30 94 ° C의 30 주기 뒤 4 분 (변성), 94 ° C s, 50 ° C (어 닐 링 온도) 30 s, 72 90 s, 및 최종 확장 10 분 동안 72 ° C에 ° C. 다음을 사용 하 여 LSU 뇌관 세트 26, 대 한: 4 분, 94 ° C 20 94 ° C의 45 주기 다음 s, 20 대 52.5 ° C s, 72 ° C 90에 대 한 s, 그리고 8 분 72 ° C에서 최종 확장
- 장소 PCR 튜브 또는 격판덮개는 thermocycler에 cycler, 뚜껑 닫고 해당 프로그램 시작.
- 준비 1.5 %agarose 젤 기본 트리를 포함 하는 버퍼 솔루션, 붕 고 EDTA (TBE buffer) agarose를 사용 하 여. 1.5 %agarose 젤, 젤 캐스팅 트레이 10 c m × 7.5 c m × 3 c m의 전체 크기와 사용 하 여의 준비에 대 한 원뿔 플라스 크에 0.45 g agarose를 무게, 측정 실린더를 사용 하 여 측정 1 x TBE 버퍼 (89 mM Tris의 30 mL pH 7.6, 붕 89 m m 및 2 m m EDTA, pH 8.0) 원뿔 플라스 크에 붓는 다. 전자 레인지를 사용 하 여 혼합 열. 큰 공기 방울 때마다 전자 레인지를 중지 하 고 솔루션은 하나의 단계 때까지 플라스 크를 신중 하 게 소용돌이.
- 약 60 ° c, 솔루션을 물 욕조에 플라스 크를 소용돌이 친다. 신속 하 게 솔루션 젤 캐스팅 쟁반에 부 어, 공기 방울을 제거 하 고 빗을 삽입. 젤 경화 될 때까지 약 20 분을 기다립니다.
- 채우기 0.5 x TBE와 삽입 젤 캐스팅 트레이 agarose 젤 포함와 전기 단위. 젤 슬롯 무료 공기 방울의 있는지 확인 하십시오.
- 미니 (판) 원심 분리기의 짧은 실행된 옵션을 사용 하 여 PCR 제품 아래로 회전 합니다. 염료 (40% 자당 및 0.25 %bromophenol 블루) 로드 x 6의 1 µ L를 PCR 제품의 각 3 µ L를 혼합 하 여 agarose 젤의 젤 슬롯에 로드 microliter 피 펫을 사용 합니다. 표준 크기로 microliter 피 펫으로 각 줄의 하나의 슬롯에 1.5 µ L 100 bp DNA 사다리의 플라스틱. 올바르게 전기 영동 장치의 뚜껑을 장착 하 고 전원 공급 장치에 연결 하는 리드. 35 분에 대 한 100 V/cm에서 젤 실행
- 얼룩 목욕 준비를 부 어 1000 mL 1의 빛이 스며들 지 않는 사각형 모양의 플라스틱 상자에 x TBE. Ethidium 평범한 사람 microliter 피 펫과의 50 µ L을 추가, 플라스틱 상자 뚜껑 닫고 ethidium 평범한 사람의 동등 하 게 분배 되도록 흔들어.
- 젤 전기 영동 장치에서 제거 하 고 약 10 분 동안 얼룩 욕조에 그것을 배치. 다음, 얼룩 목욕에서 젤 젤 문서 시스템에 그것을 배치 하 고 매뉴얼에 따라 그것을 시각화.
- 긍정적인 결과 (agarose 젤에 시각적 적절 한 크기의 파편) 존재와 최근 섭취 한 먹이의 후속 검색에 대 한 서식 파일의 작동 효율을 보여준 유일한 샘플 분석.
| PCR 혼합 | 농도 작업 솔루션 | 믹스 10 µ l PCR 반응 | PCR에 최종 농도 |
| 뇌관 FW | 10 µ M | 0.5 μ | 0.5 µ M |
| 뇌관 RW | 10 µ M | 0.5 & #956 l | 0.5 µ M |
| 반응 버퍼 (트리 스-HCl, pH 8.55, 16 mM (NH4) 2SO4 및 2 m m MgCl2 최종 농도 20 mM) | 1 µ M | 1 μ | 1 µ M |
| dNTP | 10mm | < t d > 0.25 μ0.25 m m | |
| Taq 중 합 효소 | 5 U | 0.1 μ | 0.05 U |
| ddH 2 0 | 6.65 μ | ||
| < stro ng > 총 금액 반응 혼합물 | 9 μ | ||
| DNA | 1 μ | ||
표 1: 10 µ L PCR 반응에 대 한 표준 반응 혼합물의 준비에 대 한 프로토콜 상세.
3. 최근 섭취 한 먹이/식품 그룹 특정 뇌관 세트 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 감지.
- 실시 PCR를 사용 하 여 추출 하는 DNA의 작업 솔루션 (단계 1.1 1.3.11 따라 준비)와 그룹-특정 뇌관 세트 (레이블이 없는, 즉, 수정 없이) 먹이 그룹 같은 대상에 대 한 적절 한 설명 2.1.1 2.1.3 단계 (각각 뇌관 세트에 대 한 반응 혼합물에 있는 변이, 표 2 참조). 2.1.4 단계에서 주어진 표준 프로토콜을 사용 하 여 PCR을 실행 (각각 뇌관 세트에 대 한 온도, 어 닐 링에 대 한 표 2 참조).
- 한 컨트롤을 사용 하 여 실행 하는 각 PCR에 소비자 종에서 각각 대상 그룹 (긍정적인 제어) 및 순수한 dna 한 부정적인 제어에 속하는 표본에서 순수한 dna.
- 확인 단계 2.1.6 2.1.11에서에서 설명한 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 PCR 반응의 성공. PCR 반응은 적절 한 길이의 단편 (표 2 참조)가 표시 되어 성공적인 부정적인 컨트롤 아니지만 긍정적인 통제에 대 한. 만약 이러한 기준 중 하나 또는 모두가 성취 하지 않습니다, 반복 PCR.
- 사용 agarose 젤 전기 이동 법, 다른 소비자 표본 (적절 한 길이의 조각 표시 인지 여부의 판단)를 통해 테스트 하 여 대상 먹이 그룹을 소비 했다 여부를 감지 하 2.1.6 2.1.11, 단계에서 설명한 대로. 낮은 시각 해상도 가진 파편을 놓칠 수 없는 있는지 확인 하십시오.
- 경우 추가 분석 할 수 다음 24 시간 이내 4 ° C 또는-20 ° C 분석은 나중에 수행 하는 경우 저장소 PCR 제품.
4. 이후 소비 더 다운스트림으로 사용 하 여 먹이 Polyacrylamide 젤 통해 SSCP 분석 결정.
- SSCP 전기 이동 법에 대 한 9% 아크릴 아 미드 젤을 준비. 실험실 후드에서 작업 솔루션 준비.
- 200 mL 아크릴 작업 솔루션을 준비, 10의 20 mL 측정 실린더를 채워
- x TBE (트리 스 기지의 109 g, 붕 소 산의와 0.50 M EDTA, pH 8.0 ddH 2 O의 1000 mL에 용 해의 40 mL 55 g) 40% (29: 1)의 45 mL와 함께 또 하나 아크릴 믹스입니다. TBE와 아크릴 믹스 (200 mL 마크와 졸업된 유리 병은 또한 적절 한 여기) 졸업된 플라스 크에 부 어 고 추가 ddH 2 O 200 mL 마크까지. 필요할 때까지 냉장고 (4 ° C)에서 솔루션을 작업 계속. 1 주일 보다 오래 된 작업 솔루션을 사용 하지 마십시오.
- 는 DdH 2 O는 졸업까지 추가 하 여 그것은 표시 10 %APS 재고 솔루션을 준비 하는 1 mL 부피 플라스 크와 디졸브 암모늄 persulfate (APS; 사용 적어도 0.01 g 정확도 균형)의 0.1 g 무게. Aliquots (약 350 µ L) 신선한 반응 튜브로 전송.
참고: 한 약 수 각 polyacrylamide 젤 필요 합니다. 나머지 aliqu를 저장-20 ° C에서 ots만 서 리 없애다 aliquots 필요할 직전 고. - 어셈블 젤 카세트 스페이서 (두께 1.5 m m) 그들 사이 두 개의 유리 접시, 한 빈 한 노치 유리 접시 (각 20 cm x 20 cm), 손상 유리의 측면을 실행. 오른쪽과 왼쪽된에 각각 3 배 백 클립 (32 m m)를 사용 하 여 흥분 젤 카세트 ( 그림 1).
- 믹스 5 g agarose 및 2 %agarose 대 한 솔루션을 준비 하는 원뿔 플라스 크에서 1 x TBE 버퍼의 250 mL의 젤. 가 열 하 고 2.1.6-2.1.7 단계에 설명 된 대로 나중에 혼합물을 진정. 신속 하 게 사각 모양 플라스틱 상자에 솔루션을 붓는 다 (21 cm x 6.5 c m x 5 cm) agarose 솔루션에 젤 카세트 (4.1.3 단계)의 아래쪽 끝을 놓습니다. 그들은 사각형 모양의 플라스틱 상자 ( 그림 1)의 가장자리에 앉아서 높이에 젤 카세트의 낮은 끝에 배 다시 클립을 조정 합니다. Agarose 플러그는 완전히 경화 될 때까지 약 20-30 분을 기다립니다.
- 100 mL 60 mL 마크까지 측정 하는 아크릴 작업 솔루션 (4.1.1 단계) 실린더와 비 커에 솔루션을 붓는 다. APS 재고 솔루션 (4.1.2 단계)의 한 약 수의 300 µ L을 추가 하 고 이후 37.5 µ L tetramethylethylenediamine (TEMED)의 추가 micropipette를 사용 합니다. 신속 하 게, 젤 카세트의 유리 접시 사이 솔루션을 붓는 다. 또는, 100 mL 일회용 주사기는 주사기의 주사 머리 조정 1000 µ L 피 펫 팁 유리 접시 사이 솔루션을 주입.
- 신중 하 게 상단 유리 접시 사이 1.5 m m 두께 표준 빗을 삽입합니다. 빗은 polyacrylamide 솔루션으로 묶어야 합니다. Polyacrylamide 젤 생산 될 때까지 약 1 시간 기다립니다. 유해를 젤에 필요한 시간을 증가 하기 때문에 중 합 가능한 동안 환기를 방지.
참고: 그것은 3 일 냉장고에 젖은 티슈로 밀폐 된 비닐 봉지 안에서 casted 젤까지 저장할 수.
그림 1: 설명 하는 그림은 건설 부 어 polyacrylamide 젤. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 장소 polyacrylamide 젤 준비, 수직 전기 장치에 포함 된 젤 카세트. 채우기 0.5 x TBE와 쿨 냉장된 circulator를 사용 하 여 10 ° c 단위 (전기 이동 법 단위의 종류)에 따라 적절 한 금액으로 전기 단위.
- DNA 변성에 대 한 예 열을 열 블록 /-cycler 96 ° C. 준비 변성 버퍼 95 %formamide (99.5% 펜 실바 니 아 등급)와 5% 용액 0.25 %bromophenol 블루 및 40% (w/v) 자당.
- 는 냉장고 또는 냉동 실에서 PCR 제품을가지고 고 그들에 서 리 없애다. 미니 (판) 원심 분리기의 짧은 실행된 옵션을 사용 하 여 PCR 제품 아래로 회전 합니다. 그런 다음, 각 4 µ L를 PCR 제품의 변성 버퍼의 4 µ L 믹스. 96 ° C 10 분 아이스 물에 냉각 단계 바로 뒤에 5 분을 위한 혼합물이 열
참고: 샘플을이 직후 polyacrylamide 젤 (4.5 단계)에 로드 합니다. - 는 Polyacrylamide 젤 (단계 4.1.6)에서 빗을 제거 하 고는 micropipette 완전히 젤 슬롯에 각 예제를 사용 하 여. 분리 되는 파편의 크기에 따라 10 ° C. 실행 시간 필요한 전기 장치를 지속적으로 냉각 하는 동안 8 W 젤 전기 이동 법 실행. 약 210의 조각 크기에 대 한 혈압, 약 3.5 h의 상영 시간 적절 한 간주 됩니다.
- 얼룩 목욕 준비를 부 어 1 x TBE 사각형 모양의 플라스틱으로 빛에 스며들 지 않는 고 추가 염료 (단일 좌초 DNA 얼룩에 적합) 얼룩이의 30 µ L의 1000 mL microliter 피 펫으로. 플라스틱 상자 뚜껑을 닫고 착 색 염료의 동등 하 게 분배 되도록 흔들어.
- 전기 이동 법 약 실에서 젤 카세트를 제거 하 고 신중 하 게 노치 유리 접시 젤에서 분리. 얼룩 목욕으로 빈 유리 접시에서 polyacrylamide 젤을 슬라이드. 일정 한 동요와 20 ~ 30 분 떨고 플랫폼 및 얼룩 젤에 얼룩 목욕 장소.
- 얼룩 목욕에서 신중 하 게 젤 고 문서 시스템의 UV 테이블에 놓습니다.
참고: 젤의 불안정으로 인해 그것은 두 사람과 이전 단계를 처리 하는 것이 좋습니다. 한 사람이 한다 UV 테이블 옆 얼룩 목욕 누른 다른 하나, 그것을 밖으로 양손으로 젤 아래에 도달 해야 하며 UV 테이블에 그것을 슬라이드. - 뚜껑 또는 문서 시스템의 문을 닫고 제조 업체에 따라 사진을 ' s 설명서.
5. 다중 최근 섭취 먹이 그룹 자동된 조각 분석을 사용 하 여 병렬로 검색.
- 분석 용기 콘텐츠 DNA 추출 16 그룹 특정 뇌관을 사용 하 여 설정 얼룩 염료와 수정으로 인해 표시 된의 한 뇌관과 표 2에 주어진 (표 2 열 제목 수정 참조), 그리고 병렬 검색 방법을 사용 하 여 자동화 된 시퀀서의.
- DNA 추출 물 (단계 1.1 1.3.11 따라 준비)과 행위의 작업 솔루션 분리 PCRs 각 뇌관 같은 설정에 대 한 사용 단계 2.1.1 2.1.5 (유사 혼합물에 표 2에 주어진)에서 설명 합니다. 하나 이상의 컨트롤을 사용 하 여 실행 하는 각 PCR에 소비자 종에서 각각 대상 그룹 (긍정적인 제어) 및 순수한 dna 한 부정적인 제어에 속하는 표본에서 순수한 dna.
- 실행 PCRs에 thermocycler 단계 2.1.4에서 주어진 표준 PCR 프로토콜을 사용 하 여 표 2에 주어진 설정 각 뇌관을 위해 각각 어 닐 링 온도 (와 사이클 수) 조정.
참고: 각 일괄 처리에 대 한 PCR 제품의 후속 풀링 단순화 하기 위해 16 다른 뇌관 세트의 PCR 파편 분석 자동 반응 우물의 동일한 DNA 할당 사용. - 저장소 PCR 제품 자동된 조각 분석 완료 (표 2 참조)에 대 한 하나의 일괄 처리에 속하는 모든 PCRs까지-20 ° C에서. 어둠 속에서 PCR 제품을 유지 하 고 그들을 조각 분석 전에 1 주 이상 보관 하지 마십시오.
표 2: 15 그룹 특정 뇌관 쌍의 2 배치의 세부 사항 Koester 그 외 여러분에 의해 설립 (2013)과 새로 설계 된 Jae28S 뇌관 쌍 수생 macroinvertebrates의 16 대상 그룹에서 28S 또는 18S rDNA의 지구를 증폭. f, 앞으로 뇌관; r, 역방향 뇌관; 18S, 뇌관 대상 18S rDNA 소 단위; 28S, 뇌관 목표는 28S rDNA 소 단위입니다. " Hydrobiologia, Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae)은 한 ' 살인자 새우 ' 라인 시스템에?, 768, 2016, 테이블 S1, 보충 자료 페이지 2, Koester Meike, 바이엘 바스 티, Gergs 르네, (© 스프링 거 국제 출판 스위스 2015) " Springer의 허가로. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 모든 16 뇌관 세트의 증폭 된 파편 검출 하기 표 2에 주어진 2 배치에 자동된 조각 분석 실시. 사용 하는 내부 크기 표준 (DNA 크기 표준 키트-400 [일괄 처리 B]와-600 [일괄 A], 각각) 조각 길이 결정 하. 다음 단계에 설명 된 대로 시퀀싱 플레이트와 자동 시퀀서를 준비 합니다. 참고가이 절차는 자료 테이블에 주어진 보다 다른 플랫폼을 사용 하는 경우 조정 해야 할 수도 있습니다.
- 실행 하는 각 일괄 처리 샘플, 샘플 로드 솔루션 (SLS)와 표준 각 크기를 포함 하는 혼합물을 준비 하. SLS의 21.6 µ L 및 0.4 µ L의 DNA 크기 표준 키트-배치의 샘플과, 각각, SLS의 21.7 µ L 및 DNA 크기 표준 키트의 0.3 µ L 당 600-플라스틱 일괄 처리 b 샘플 당 400
- 냉동 실에서 각 일괄 처리에 속하는 8 PCRs의 PCR 제품을가지고 고 그들에 서 리 없애다. 그들은 여전히 어둠 속에 보관 됩니다 확인 하십시오.
- 는 시퀀싱 접시 필요 (분석할 샘플 수)의 우물의 수 로드 microliter 피 펫을 사용 하 여 5.2.1 단계에서 설명한 각 혼합물의 각 22 µ L로. 각 미니 (판) 원심 분리기의 짧은 실행된 옵션을 사용 하 여 8 PCRs의 PCR 제품 아래로 회전 합니다. Microliter 피 펫으로 시퀀싱 플레이트의 각 우물에 각각 8 PCRs의 PCR 제품 당 각 1 µ L 전송.
- 신중 하 게 미네랄 오일 한 방울과 함께 사용 하는 우물의 각 오버레이 및 미니 플레이트 원심 분리기의 단기적으로 시퀀싱 배지 내의이 혼합물이 아래로 회전. 250-300 µ L의 DNA 분리 버퍼 버퍼 플레이트의 각 반응 우물 채우십시오.
- 모 세관 시퀀서에 대 한 소프트웨어를 사용 하 여 제조 업체에 따라 샘플 설치를 만들려고 ' s 지시. 샘플 세트를 제어 하 고 데이터 (자료 테이블에 주어진 크기 표준 조건 사용에 대 한 적절 한를 실행 하기 위한 표 3 참조)를 처리 하는 데 사용 되는 방법의 순서를 결정 하는 방법을 지정 합니다. 그것은 중요 한 샘플 설치 내에서 샘플의 할당 등 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 참조 단계 5.1.1 시퀀싱 접시에서 샘플 할당 일치 하 고 조각에 대 한 적절 한 메서드를 각각 분석 크기 표준 선택.
- 이온된 수와 일로 트레이 모 세관 시퀀서에 시퀀싱 접시, 버퍼 플레이트와 습윤 트레이 삽입. 포함 하는 신선한 DNA 분리 젤 샘플 실행에 필요한 충분 한 양의 젤 카트리지를 삽입 합니다. 실행 준비 샘플 설치 프로그램을 사용 하 여 시퀀싱 접시.
| 변성 | 별도 | 모 세관 | 주사 | ||||
| 온도 | 시간 | 전압 | 시간 | 전압 | 시간 | ||
| 크기 표준 600 | 90 ° C | 120 s | 4.8 kV | 60 분 | 50 ° C 대기 온도 대 한: 예 | 2.0 kV | 30 s |
| 크기 표준 400 | 90 ° C | 120 s | 6 kV | 45 분 | 50 ° C 대기 온도 대 한: 예 | 2.0 kV | 30 s |
표 3: 조각 분석 자료 테이블에 주어진 크기 표준을 사용 하 여 자동화 된 시퀀서에 대 한 특정 조건.
- 분석 결과
- 원시 데이터 내보내고 조각 분석 프로그램에 그 데이터를 업로드. 선택 표준 염료 염료 색상 채널을 설정 하는 각 제조 업체의 색상 주문.
- 만들기 조각 길이 단일 그룹 특정 뇌관에 의해 증폭의 예상된 범위를 설명 하는 패널 프로그램의 사용자 설명서에 따라 일괄 처리 내에서 설정 합니다.
- 데이터를 처리 하는 각각 패널, 적절 한 크기 표준, 표준 색상, 및 분석의 유형 선택 하 고 프로시저 실행. 각 염료 색상에 대 한 한 줄 추적으로 모 세관 전기 이동 법 악기에서 형광 신호 강도 표시 하려면 electropherogram 옵션을 선택 합니다. 마커/뇌관 세트 각각 조각 범위를 나타내는 표시 됩니다 및 각 라는 피크의 센터와 관련 된 검색 된 조각의 정확한 길이 (대부분 프로그램에서 채색 또는 지정 된 이름으로) 강조 될 것 이다 자동으로.
- 각 샘플에 대 한 얼마나 밀접 하 게 계산 샘플 ' s 내부 크기 표준 일치 선택한 크기 표준 크기 전화의 성공 안심. 대부분의 조각 분석 프로그램 옵션을 자동으로 계산 하 고이 경기를 시각화 있다. 크기 호출에 실패 한 경우 그 샘플에 대 한 조각 분석을 반복.
- 시각 각 샘플의 electropherogram를 다시 확인 하 고 각 피크 각 마커/뇌관 별도로 설정에 대 한 호출을 확인/unconfirm. 수동으로 지 껄된 봉우리 마커/뇌관 세트의 기준에 맞게 또는 사용 하는 프로그램의 사용자 설명서에 따라 잘못 된 것 들을 삭제 하는 삽입 합니다. 기본적인 쌍 크기 또는 빈 이름에 적용 된 ' 대립 유전자 레이블 '. 계산 하 고 표시에서 피크 규격은 ' 피크 테이블 '.
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Representative Results
우리는 성공적으로 다른 연구에서 다이어트 분석이 프로토콜에 설명 된 단계를 사용 합니다. 이 섹션에서 우리는 프로토콜의 다른 섹션의 적용을 설명 하는 예제를 제시.
예를 들어, 저자28 및 SSCP 분석에 의해 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석의 잠재력에 의해 설립 하는 그룹-특정 뇌관 세트의 효과 설명 하는 먹이 실험 실시 했다. 포식 자와 먹이로 체니스 종 애벌레로 Dikerogammarus villosus 의 개인 라인 backwaters 카를스루에 (독일) 근처에서 체포 했다. 실험실에서 포식 자와 먹이 taxa는 20 ° C에서 필터링 된 스트림 물에 별도로 보관 했다 하 고 36 시간 동안 굶 어 했다. 실험에 대 한 amphipod 표본 필터링 된 스트림 물 (100 mL) 개별적으로, 30 분, 2 ~ 3 체니스 애벌레 먹이 하 고 그 후 액체 질소에서 냉동 비 커에 배치 했다. 각 디 villosus 의 위장 이었다 해 부 그리고 DNA 프로토콜 1에 설명 된 대로 추출 되었다. DNA 추출 물 Caep28S 뇌관 체니스 종 프로토콜 3에 설명 된 대로 적절 한 PCR 프로토콜28 를 사용 하 여 검출에 적합 한 설정으로 테스트 되었습니다. 증폭 된 파편 체니스 종 간의 차이 확인 하려면 PCR 콘텐츠 샘플 용기와 순수한 DNA 샘플 3 체니스 참조 종의 실시 됐다. Agarose 젤 전기 영동이이 유형의 전기 이동 법 (그림 2A)와 체니스 종 사이 구별 될 수 없는 두 배 좌초 DNA의 단일 밴드를 이끌어 반면, SSCP 젤 전기 이동 법, 프로토콜 4에 설명 된 대로 했다 참조 샘플 (그림 2B)와 창 자 콘텐츠 샘플을 비교 하 여 종 수준 먹이 생물을 식별할 수 있습니다. SSCP 조각 패턴 3 참조 taxa 체니스 beskidensis (그림 2B, 레인 1), (그림 2B, 레인 2) 체니스 시간대 의, 와 체니스 luctuosa (그림 2B, 3 차선) 미분 가능 패턴 4 밴드의 구성 되어 있습니다. 2 창 자 콘텐츠 샘플 (그림 2B, 레인 4와 5) C. luctuosa (그림 2B, 3 차선)의 동일한 조각 패턴을 했다. 세 번째 창 콘텐츠 샘플 (그림 2B, 6 레인)의 조각 패턴 C. 시간대 (그림 2B, 레인 2)와 동일 했다. 두 시퀀스 분석 직감 콘텐츠 샘플 C. luctuosa , C. 시간대 (그림 2B, 4와 6 차선)로 식별 하 고 해당 참조 종이이 결과 확인 (전자 보충 맞춤 fasta 파일 참조).
그림 2: (A) agarose 젤 전기 이동 법의 원본 이미지와 PCR의 (B) SSCP 분석 콘텐츠 직감의 조각 하 고 참조 샘플 Caep28S 뇌관 세트와 증폭. 차선 1-3 종의 체니스 beskidensis (1), 체니스 시간대 (2)와 체니스 luctuosa (3) 참조 샘플을 표시합니다. 레인 4-6 amphipod Dikerogammarus villosus 의 다른 창 콘텐츠 샘플의 조각 패턴 되 게 됩니다. 레인 7 100 bp DNA 사다리의 조각 패턴을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
또한, 실험실 실험 진드기 종 Hygrobates fluviatilis 에 속하는 chironomid에 먹 힌 물 애벌레 뿐만 아니라 결정 물 진드기에 소비 chironomid 개인의 DNA를 감지할 수 경우에 실시 그러나 또한 DNA 검출의 양을 먹이29의 소비 이후 경과 시간에 따라 테스트 하. 진드기 약 1 주일 배 고 파, 후 각 진드기는 음식으로 한 chironomid 애벌레를 제안 되었다. 각 3-4 물 진드기 개인 (절대) 1에서 dipteran 가족 Chironomidae28 에 특정 Chiro18S 뇌관 세트를 사용 하 여 유전 분석을 위해, 에타 놀에서 2, 3, 7, 9, 24, 32, 50 h29를 먹이 되 고 후 고정 했다. 정도의 물 진드기 개인 소비로 각각 먹이 개인 다음 5 먹이 범주에 분류 되었다: 1 = 완전히 비운, 밖으로 완전히 빨려 외피 (> 90%), 2 = 거의 완전 하 게 밖으로 빨려 (> 75-90%), 3 = 밖으로 빨려 하는 세미 (> 50-75%), 4 = 부분적으로 밖으로 빨려만 (> 5-50%), 5 = 먹이 몸 구조 (≤ 5%)29에 보이는 변화. DNA (1.2.1, 1.2.2 단계) 없이 프로토콜 1에 설명 된 대로 물 진드기에서 추출 된 고 프로토콜 2에 설명 된 대로 추출에 18S rDNA의 존재와 서식 파일의 기능 효율성 확인 했다. DNA 프로토콜 4만 Chiro18S를 사용 하 여 뇌관 앞으로 뇌관 설정 표시에 따라 수행 하는 먹이의 탐지는 형광 염료 ( 표 2참조)와 DNA 크기 표준 키트-400. 샘플 사이의 비교 분석 자동화 된 시퀀서, 샘플 피크 높이의 피크 높이 사이 비율의 다른 실행 내에서 수 있도록는 내부 기준에 가장 가까운 (즉, 360이 경우에서 혈압) 각 샘플의 계산 하 고 사용 했다 감지 하는 DNA 양을 프록시입니다. 결과는 chironomid DNA Hygrobates fluviatilis chironomid 애벌레29에 먹이의 거의 모든 개인에서 감지 되었다 보여주었다. 긴 기간 짧은 간격 (1 시간 수 유 후)에서 후 먹이 (50 시간) 감지 먹이 DNA의 상대적인 양을 크게 감소 (그림 3A)29. 또한, DNA 수 먹이의 섭취 금액에 대 한 프록시 수 유 후 시간과 먹이 분류 사이 관계 확인 (그림 3B)29. 감소 먹이 시간 후 가장 가능성이 먹이 발견 DNA DNA의 저하와 먹이의 소화에 의해 완전히 반영의 egestion 먹이 DNA 때문에 물 진드기29항문의 부족으로 인해 매우 그럴 듯 하 게 하지 않습니다. 이러한 결과 섭취 한 먹이의 정량화를 위한이 방법의 적합성을 확인합니다.
그림 3: 진드기 및 (B) 먹이 카테고리의 먹이 후 시간 국가 ln 높이 비율 (샘플 최대 높이/표준360 피크 높이) 및 (A) 간의 관계 (n = 23). "실험 및 적용 Acarology의 첫 검출 DNA Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari)에 먹이: 물 진드기에 포식 자-먹이 관계를 결정 하기 위한 새로운 접근 67, 376, P. 마틴, M. Koester, L. Schynawa, R. Gergs, (© 스프링 거 국제 Switzerl 게시그리고 2015) "Springer의 허가로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Δ13C의 침략 amphipod D. villosus 필드, 집중 안정 동위 원소 분석에 의해 포식의 중요성 및 δ15조사 하 디 villosus 및 잠재적인 음식 자원의 N 분자에 의해 발전 했다 정확한 동일한 개인의 본질적인 내용 최근 섭취 한 먹이의 탐지. 총에서 206 D. villosus 개인 다른 사이트에서 수집 된 하 고 각 개인의 위장 했다 해 부 프로토콜 1에 따르면 DNA 추출 되었다. 존재와 사용 하는 서식 파일의 기능 효율성 프로토콜 2에 설명 된 대로 안심 했다. 여러 macroinvertebrate 먹이 taxa에 D. villosus 개인에 의해 최근 포식 프로토콜 4에 설명 된 대로 테스트를 했다. 전반적으로, D. villosus 본질적인 내용의 16%만 16 대상된 macroinvertebrate 먹이 taxa의에 속하는 DNA에 대 한 긍정적인 테스트 하 고 따라서 낮은 predacious 먹이 행동을 표시 하는 안정 동위 원소 분석의 결과 지원 필드27침략 amphipod. 반면, 유전자 분석, 내 12 테스트 먹이 taxa의 DNA 1 창 콘텐츠 샘플에서 발견 되었다, 4 다른 먹이 taxa의 DNA 발견된 (그림 4)27못했다.
그림 4: 디 villosus 개인 본질적인 내용이 macroinvertebrate에 대 한 양성 하는 모든 10 개의 사이트에서 각각 수를 보여주는 히스토그램 먹이 DNA. PCR 수행 되었다 16 그룹 특정 뇌관 세트와 같이. "Hydrobiologia, 라인 시스템 '살인자 새우' Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae)은?, 768, 2016, 310, Koester Meike, 바이엘 바스 티, Gergs 르네 (© 스프링 거 국제 게시 스위스 2015)"의 허가 스프링 거입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 파일. Sequence_alignement_feeding_trial.fasta 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 동일한 견본의 다른 비 분자 분석 결합 될 수 있는 rDNA 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 통해 필드 샘플에서 약탈자 먹이 상호 작용의 PCR 기반 결정에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 방법 제시. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜 내에서 있다. 첫째, 사용 하는 뇌관의 특이성을 확보 필수적 이다. 둘째,는 위장의 준비 및 후속 DNA 추출 하는 동안 오염 및 창 자 콘텐츠 자료의 손실을 피하기 위해 결정적 이다. 크로스-샘플 오염 먹이 DNA의 거짓인 긍정적인 탐지를 이어질 수 있습니다, 하는 동안 창 소재는 거의 실종으로 이어질 수도 있습니다 콘텐츠 손실 먹이 종의 소비. 각 소 단위 및 분석 (제 2의 프로토콜) 사용 하는 서식 파일의 기능 효율성에 속하는 rDNA의 존재의 확인은 소비 하는 먹이 대 한 대표적인 정보 수집을 위한 필수적입니다. 이것은 특히 중요 한 소비자 먹이로 되어 먹이 그룹의 아무 DNA 검출된25,27수 경우에. 또한 PCRs (3.1, 5.1.1, 5.1.2 단계)를 준비할 때 그 혼합물 및 정확 하 게 사용 하는 프로토콜 각각 뇌관 taxa의 특정 그룹에 지정 된 조건에 맞는 결정적 이다. 그렇지 않으면, PCR 반응 내에서 DNA의 증폭, 완전히 실패할 수 있습니다 하거나 하지 대상으로 하는 taxa의 DNA도 증폭 될 수도 있습니다. 따라서, 그것은 긍정적인 사용 의무 고 각 PCR 부정적인 컨트롤 실행 보장 PCR 반응에 근무 하 고 아무 오염 발생. 또한, 각 PCR 실행에 대 한 샘플의 배열 각각 소비자 견본을 소비 하는 먹이의 정확한 할당 수 있도록 정확 하 게 문서화가 필요 하다. 이 작업에 대 한 특정 주의 자동된 조각 분석 (5.2.3 단계)를 통해 여러 먹이 그룹의 병렬 검출을 위한 PCR 제품을 풀링 하는 동안 이동 해야 합니다.
Agarose 젤 전기 이동 법 (3.2 및 3.3 단계) agarose를 사용 하 여 증폭 된 파편의 탐지를 위해 젤 가능한 얇은 고 낮은 시각 해상도 조각 누락 방지 하려면 이미지의 시각적 검사를 관리 했다. 결과 소비자에 의해 먹이 소비에 대 한 적절 한 결론, 그것도 거의 소비 먹이 taxa를 인식 되 고 있다 중요 하다. 두꺼운 agarose 젤 먹이 DNA의 잠재적으로 낮은 금액의 가시성을 축소 하 고 이렇게 거의 소비 먹이 놓치지 소개 분석에서 도출 하는 결론에 불확실성을 확률을 감소 시킨다. 또한, 건강의 관점에서는 젤을 얼룩이 지기 위한 ethidium 평범한 사람 보다 덜-또는 비-독성 대안을 사용 하 여 수 있습니다 것이 좋습니다. 이후 추가 분석을 위해 하류 SSCP 분석 polyacrylamide 젤을 사용 하 여를 통해 증폭 된 파편의 프로토콜 특정 주의 하 여 수행 해야 하는 몇 가지 단계가 포함 됩니다. 그것은 중요 한 조립 젤 카세트 누출 방지 (4.1.3 단계) 이며 polyacrylamide 솔루션은 완전히 유해를 충분 한 시간을 부여 (4.1.6 단계). 카세트를 너무 일찍 열기 액체 아크릴 솔루션을 유출 하 고, 준비, 광범위 한 청소도 할 수 있어야부터에서 시작 하는 사실에도 불구 하 고 이어질 것입니다. 또한, 얼룩 목욕 (단계 4.7)으로 UV 테이블 (단계 4.8) 요구 해야 할 매우 신중 하 게 이러한 젤의 불안정성 때문에 거기에서 polyacrylamide 젤을 전송 합니다. 그렇지 않으면, 젤 수 찢 어 하 고 절차를 반복 하는 필요성에 이르게 조각 중단 될 수 있습니다.
성공적으로 자동화 된 조각 분석에서 받은 데이터를 처리에 대 한 주요 요구 사항 중 하나는 샘플의 내부 크기 표준에 일치 크기 표준 패턴의 결정 수 있도록 (단계 5.3.3) 제조 업체에 의해 주어진 그는 적절 한 조각 길이입니다. 그렇지 않으면, 다른 조각, 같은 형광 염료, 얼룩으로 표시 잘못 먹이 taxa에 할당 될 수 및 따라서 약탈자 먹이 상호 작용의 완전 한 오판으로 이어질 때문에 특히 중요 한 방법입니다. 또한, electropherograms는 종종 배경 잡음을 표시합니다. 해석에 자신감을 설정 하기 위해 내부 크기 표준의 봉우리는 샘플의 배경 잡음 보다 상당히 높은 필수적 이다. 따라서, 각 마커/뇌관에 대 한 봉우리 배경 잡음 보다 크게 높은 경우 계산만 한다.
내 관심의 다양 한 소비자의 먹이 taxa의 여러 그룹을 감지 하이 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 명백 하 게, 그룹-특정 뇌관 않을 수 있습니다 이미 관심의 모든 잠재적인 먹이 taxon에 사용할 수 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그룹-특정 뇌관 여러 민물 macroinvertebrate taxa28, 뿐만 아니라 다른 taxa의 광범위 한 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 여러 해양 macroinvertebrate taxa16,30 과 일반적인 taxa31곤충 비행). 따라서, 그룹 특정 뇌관의 선택 세트 주어진된 taxon의 모든 먹이 종의 DNA 증폭에 적합 하지만 하지이 taxon에 속하는 종에서 DNA의 증폭에 성공, 필수32하지 않습니다. 사용할 수 있는 많은 그룹-특정 뇌관 taxa (예를들면, 라인 시스템28에 일반적인 민물 macroinvertebrates의 130 taxa)의 주어진된 범위에 지정 되었습니다. 따라서, false 네거티브 또는 허위-긍정적인 결과 방지 하려면 같은 뇌관의 특이성 해야 될 다시 확인 대상 taxa 및 소비자에 대 한 taxa의 범위에 포함 되지 않습니다에 대 한 그들의 응용 전에 관심의 생태계에서 일반적인 taxa의 범위에 대 한 이 프라이 머를 설립 했다. 또한, 그 분자 분석은과 결합 될 경우 위장의 정확한 동일한 개별, 해 부의 다른 분석 생략 수 있습니다.
그럼에도 불구 하 고, 더 큰 표본의 위장을 해 부 또한 너무 많은 재료 때문에 DNA 추출의 실패를 방지 하 고 소비자-DNA 샘플 추출에서의 존재를 감소. 그러나, 연구는 특정 차단 뇌관을 사용 하는 소비자의 DNA를 연결 하 고 그로 인하여 차단, PCR 반응에 대 한 효과적으로 향상 시킬 수 있는 혼합된 샘플33에서 희소 한 순서 증폭 나타났습니다. 따라서 위장의 해 부 피할 수 있습니다, 더 큰 소비자 표본 처리 하는 경우에 특정 차단 뇌관의 사용에 의해. 병렬 검색 amplicons 자동된 조각 분석을 통해 여러 그룹 특정 뇌관 세트에서 파생 된의 레이블로 염료를 얼룩이 지기의 선택에 배려를가지고 한다. 따라서, 뇌관 세트 대략 동일한 길이의 단편 증폭 명확 하 게 구별할 수 형광 염료 이라는 한다. 또한, 여러 제조 업체에서 사용할 수 있는 모 세관 전기 이동 법 시스템의 범위가 있다. 이러한 시스템 중 일부는 살 일 걸 요도 난다 염료를 통해 여러 조각의 결정을 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 수 쉽게 감지 시스템의 증폭 된 파편을 조정할 수 있습니다. 그 외에, t에 필요한 시간을 줄이기 위해그 분석, 최적화 하는 동시에 조각 하나의 분석 배치의 먹이 그룹의 DNA를 증폭 한 멀티플렉스 PCR 분석 실험 수 있을 것 이다 (예를 들어, 동시 증폭 12 먹이 생물 딱정벌레34 의 또는 6 비행의 곤충 taxa31)입니다.
단점이 직감 콘텐츠 분석 일반적으로, 그리고 그러므로 또한이 프로토콜에서 설명 하는 분석은 낮은 시간적 해상도. 이러한 방법으로 단일 먹이 유기 체2의 중요성에 불확실성으로 이어질 수도 있는 최근에 섭취 유기 체를 식별 수는. 그러나, 우리는이 프로토콜에 따라 유전자 분석은 정확한 동일한 소비자 표본25,27의 안정 동위 (δ15N 그리고 δ13C)의 분석 쉽게 결합 될 수 있다 설명 했다. 한 시간 통합 자연 추적기 약탈자 먹이 상호 작용의 안정 동위 원소 분석은 식품 웹 구조1, characterise에 자주 사용 하지만 종종 다른 먹이 종에서 잠재적인 겹치는 동위 원소 값 방해는 정확한 약탈자 먹이 상호 작용2의 정의입니다. 따라서 식품 웹 및 영양소 또는 에너지 플럭스와의 관계에 대 한 우리의 이해 더 각 방법의 단점을 극복 하 안정 동위 원소 분석에 유전자 분석을 위해이 프로토콜 사용.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사는 연구소에서 Silke Classen 생태계 분석 및 평가 (gaiac), RWTH 아 헨이이 프로토콜에 사용 되는 그룹-특정 뇌관 세트의 설립에 있는 그녀의 원조에 대 한. 우리는 또한 감사 피터 마틴과 협력에 대 한 Kiel의 대학에서로 라 Schynawa 물 진드기 실험에. 우리는 또한 원활 하 게 실행 하 고 회사와 카탈로그 번호의 등록을 준비 하 고 실험실 유지에 대 한 기술 실험실 조 수를 감사 합니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG; 프로젝트 GE 2219/3-1)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| liquid nitrogen | Any | NA | For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory. |
| 1.5 ml reaction tubes - Safelock | Any | NA | For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle. |
| Stereomicroscope | Any | NA | Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest. |
| Petri dishes | Any | NA | To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 | Bioform | B40d | This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract. |
| Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 | Bioform | B40b | This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens. |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations |
| fuzz-free paper towel | Any | NA | |
| Lab scale | Any | NA | Precision needs to be at least 0.01 g. |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml | VWR | 211-2164 | It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)! |
| Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA. |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris | carlroth | 4855.2 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer |
| Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO | carlroth | 6943.2 | For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | carlroth | 4360.1 | For extraction of DNA |
| Proteinase K lyophil. | carlroth | 7528.1 | Prepare a working solution containing 10 mg/ml. |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | Bead mill for homogenization of the samples. |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Quiagen | 69989 | For homogenization of samples. |
| Heating Thermoshaker | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Any | NA | |
| Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE | Hitachi | NA | Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1). |
| Isopropanol | carlroth | 6752.5 | |
| Ethanol 99.8 %, p.a. | Any | NA | |
| Water Molecular biology grade (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript |
| Unmodified Olegonucleotides | Eurofins MWG Operon | NA | Primers unlabeled |
| Modified olegonucleotides | Metabion International AG | NA | Primers labelled |
| peqGOLD Taq all inclusive | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2) |
| Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient | Peqlab | NA | Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine. |
| Standard 96 Well PCR Plates | VWR Peqlab | 732-2879 | Used for PCR reactions. |
| Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes | VWR Peqlab | 732-3223 | Cap stripes used to close the PCR plates. |
| Agarose | Peqlab | 35-1020 | Used for gel electrophoresis. |
| Microwave | Any | NA | |
| Conical flask | Any | NA | |
| Measuring cylinder | Any | NA | |
| Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth | Any | NA | For agarose gel electrophoresis. |
| Electrophoresis Power Supply PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | Used to prepare staining bath for agarose gels. |
| Formamide | carlroth | 6749.1 | Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses. |
| Bromphenol blue | AppliChem | A3640.0010 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| Sucrose | carlroth | 4621.1 | Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis. |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | As size standard for agarose gel electrophoresis. |
| UV-Documentation system | Any | NA | To visualize gel electrophoresis results. |
| Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Ammonium peroxydisulphate | carlroth | 9592.2 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| foldback clips (32 mm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) | Any | NA | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | carlroth | 23.67.1 | For the preparation of polyacrylamid gels. |
| Beaker | Any | NA | |
| RC 10 Digital chiller | VWR | 462-0138 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Notched glass plate | VWR | 730-0261 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Blank glass plate | VWR | 730-0260 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Spacers | VWR | 730-0262 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Comb with 25 teeth | VWR | 730-0294 | For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis. |
| Shaking platform | Any | NA | For constant shaking of the staining bath. |
| GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) | Biozym | 850535 (50535) | For staining of polyacrylamide gels. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp | AB Sciex | 608098 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B. |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp | AB Sciex | 608095 | For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A. |
| Sample Loading Solution (SLS) | AB Sciex | 608082 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate | Costar | 6551 | For automated fragment analyses. |
| Plate centrifuge, PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | mini plate centrifuge used to spin down PCR products. |
| Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate | Corning | 9017 | For automated fragment analyses. |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | For automated fragment analyses. |
| Separation Gel - LPAI | AB Sciex | 608010 | For automated fragment analyses. |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | Beckman Coulter | NA | For automated fragment analyses. |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | To analyze results of automated fragment analyses. |
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