Summary
تقدم هذه الدراسة إجراءات موثوقة وسهلة للحصول على مقاطع سامسونج المسلسل من الكائنات الدقيقة دون معدات باهظة الثمن في مجهر إلكتروني.
Abstract
مراقبة الخلايا ومكونات الخلية في الأبعاد الثلاثة في عالية التكبير في مجهر إلكتروني يتطلب إعداد المقاطع سامسونج التسلسلي للعينة. على الرغم من أن إعداد المقاطع سامسونج المسلسل يعتبر أن تكون صعبة للغاية، فمن السهل بدلاً من ذلك إذا تم استخدام الطريقة الصحيحة. وفي هذه الورقة نعرض إجراء خطوة بخطوة للحصول بأمان على أبواب سامسونج المسلسل من الكائنات الحية الدقيقة. النقاط الرئيسية لهذا الأسلوب: 1) استخدام جزء كبير من العينة وضبط حافة السطح وسكين العينة بحيث تكون موازية لبعضها البعض؛ 2) قطع مقاطع المسلسل في المجموعات وتجنب صعوبة في الفصل بين الفروع باستخدام زوج من خيوط الشعر عند استرداد مجموعة من مقاطع المسلسل على الشبكات الشق؛ 3) استخدام 'حلقة عقد قسم' وتجنب الخلط بين ترتيب مجموعات القسم؛ 4) استخدام 'حلقة رفع مستوى سطح الماء' وتأكد من المقاطع متوضعة في قمة المياه وأن اتصال الشبكة أولاً، بغية وضعها في الموضع المطلوب في الشبكات؛ 5) استخدام الفيلم الدعم على رف ألمنيوم وجعله أسهل لاسترداد الأقسام المتعلقة بالشبكات وتجنب التجاعيد الفيلم الدعم؛ و 6) استخدام أنبوب المصبوغة وتجنب كسر دعم الأفلام بطريق الخطأ مع ملاقط. هذا الأسلوب الجديد من الحصول على المقاطع سامسونج المسلسل دون صعوبة. الأسلوب الذي يجعل من الممكن لتحليل الهياكل الخلية من الكائنات الحية الدقيقة بدقة عالية في ثلاثي الأبعاد، والذي لا يمكن تحقيقه باستخدام أسلوب أولتراميكروتومي جمع الأشرطة التلقائية والوجه كتلة المسلسل أو تركيز أيون شعاع المسح الضوئي المجهر الإلكتروني.
Introduction
الأسلوب تقطيع سامسونج المسلسل السليم أمر لا غنى عنه لدراسة الخلايا ومكونات الخلية ثريديمينسيونالي على المستوى المجهري الإلكترون. لدينا دراسة ديناميات المغزل القطب الهيئة في دورة خلية من خلايا الخميرة، وكشفت عن التغييرات الشكلية لهذه أولتراستروكتوري خلال دورة الخلية والوقت من الازدواجية1،2،3، 4،5. في عام 2006، ونحن صاغ كلمة جديدة 'ستروكتومي' عن طريق الجمع بين 'هيكل' و '-ome'، ويعرف أنه 6،'معلومات كمية وثلاثي الأبعاد الهيكلية خلية كاملة على المستوى المجهري الإلكترون'7.
تحليل ستروكتومي، الأمر الذي يتطلب تقنية تقطيع سامسونج المسلسل، وجد أن خلية خميرة Saccharomyces cerevisiae و اكسوفيالا ديرماتيتيديس ريبوسوم 200,000 حوالي7،8، الإشريكيّة القولونية خلية 26,000 ريبوسوم9، خلية بكتريا السل قد 1,700 ريبوسوم10 والبكتيريا اللولبية ميوجن ريبوسوم فقط 30011. تعتبر هذه المعلومات مفيدة في تقدير معدل النمو في كل كائن حي، ولكن أيضا في تحديد الأنواع9ليس فقط.
تحليل ستروكتومي علاوة على ذلك، أدت إلى اكتشاف كائن جديد؛ تم العثور على ميوجينينسيس باراكاريون في أعماق البحار قبالة ساحل اليابان، هيكل الخلية التي كانت وسيطة بين أولئك من بدائيات النوى وحقيقيات النوى12،13،،من1415. في الوقت الحاضر، تعتبر تقنية تقطيع سامسونج المسلسل يكون من الصعب أنه سيستغرق وقتاً طويلاً لإتقان. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير أسلوب موثوق فيه أي شخص يمكن أن تؤدي إلى تمزيقها سامسونج المسلسل دون صعوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: العينات المستخدمة في هذه الدراسة تم تجميد الكائنات المجهرية، سرعة تجميد البروبان في النتروجين السائل، المستبدلة في الأسيتون المحتوية على أكسيد الاوزميوم 2 في المائة، وجزءاً لا يتجزأ من الإيبوكسي الراتنج1،2،3، 4،5،،من67،،من89،10،11،12،13 ،،من1415،16،،من1718.
1-إعداد الدعم السينمائي (الشكل 1-3)
ملاحظة: مستعدة اللون الفضي فورمفار دعم الفيلم باستخدام أسلوب المدلى بها على الزجاج19.
- إضافة 100 مل من 1.5% فورمفار في كلوريد الإيثيلين لجهاز صنع فورمفار (الشكل 1). تراجع نصف شريحة زجاجية (76 ملم × 26 مم × 1.3 ملم) في حل فورمفار في العمود العلوي من الجهاز عن طريق الضغط على الحل مع الهواء من خلال 'أ' باستخدام كرة مطاطية19.
- استنزاف الحل من العمود بفتح محبس الحنفية الثلاثية والإفراج عن الهواء من خلال 'ب' لتخفيف الضغط. تأخذ الشريحة الزجاجية من الجهاز والجافة في الهواء لشكل فيلم على السطح الشريحة الزجاجية. استخدام مصباح المتوهجة التعجيل بتجفيف الفيلم فورمفار.
- بعد إلغاء إيقاف أربع حواف الفيلم على الشريحة الزجاجية بشفرة حلاقة (الشكل 2a)، والتنفس على شريحة لتسهيل فصل الفيلم عن شريحة20، تطفو قبالة الفيلم على المياه بغمر الشريحة الزجاجية في المياه ببطء في زاوية أفقية منخفضة (حوالي 10°، الشكل 2).
- حلج القطن يصل الفيلم فورمفار من الماء رف ألومنيوم (30 مم × 25 مم × 3 مم) باستخدام ذات ثقوب (قطرها 4 ملم) (الشكل 3a). الحفاظ على الرف مع الفيلم فورمفار في مجفف حتى استخدام (الشكل 3b).
2-تقليم كتلة العينة مع شفرة تشذيب بالموجات فوق الصوتية و شفرة حلاقة 21 تحت ستيريوميكروسكوبي (الشكل 4)
- تأكد من أن هناك خلايا على سطح الكتلة بمراقبة غيض الكتلة مع مجهر ضوء (الشكل 4 أ).
- جبل كتلة العينة في تشاك (كتلة حامل)، وجبل تشاك على تشذيب مرحلة21 (الشكل 4 باء). ولدى هذه المرحلة التشذيب إليه إضاءة من الجزء الخلفي العينة.
- تقليم كتلة إلى حجم 0.7 مم × 1.0 مم (4 أرقام ج، د 5). منذ الراتنج الإيبوكسي من الصعب جداً، تقليم كتل استخدام شفرة تشذيب بالموجات فوق الصوتية أول مرة. شفرة التشذيب بالموجات فوق الصوتية آلة أدخلت حديثا، ويتم تقسيم القطع بسهولة. ثم تقليم كتلة أخرى بشفرة حلاقة. قص الكتف واحد للاحتفال باتجاه قطع (انظر الشكل 5 د، الشكل 8).
3-تقليم كتلة العينة بسكين الماس باستخدام مبضع (الشكل 5)
- تعيين كتلة العينة تشاك في حامل أولتراميكروتومي عينة. ضع العينة 90 درجة عكس عقارب الساعة ضد الموقف الفعلي عند تقطيع سامسونج المسلسل إجراء (انظر الشكل 5 د).
- قطع سطح الكتلة بسكين تشذيب الماس (انظر الشكل 5 د). تعيين حافة سكين الماس موازية للوجه كتلة العينة، وخفض الحد الأدنى من سطح العينة حتى لا يؤدي إلى فقدان أي عينة (الشكل 5 د).
ملاحظة: تتم هذه الخطوة لتنعيم سطح العينة. ترك الجزء من سطح العينة جزء سليم سليمة (ولهذا الجزء ليست مشرقة مثل مرآة، الرقم 5 د)، حتى لا يؤدي إلى فقدان أي جزء من العينة لتقطيع المسلسل. يرجع ذلك إلى أن يتم كشفها العينة على سطح الكتلة. - ضع مرآة (قص ميسا، M) على المسرح سكين لرصد قطع كتلة العينة (الشكل 5 ج).
- قطع الحافة اليسرى (ويصبح هذا الجانب العلوي،، الرقم 5 دالعينة في تقطيع المسلسل) كتلة باستخدام سكين التشذيب بالتناوب مرحلة سكين 30 ° إلى اليسار (الشكل 5a).
- قص الوجه كتلة في حوالي 100 ميكرون من الحافة اليسرى للعينة (ويصبح هذا الجانب السفلي من العينة في تقطيع المسلسل، الشكل 5 د) عن طريق تناوب المرحلة سكين 30 درجة إلى اليمين (الشكل 5 (ب)).
ملاحظة: سوف يتم خفض المقاطع المسلسل من الجزء ضئيلة من العينة حوالي 90 نانومتر حوالي 1 مم في الحجم. سيتم استخدام جزء كبير لضبط سطح العينة وحافة سكين مثل أن تكون متوازية. وبعد تعديل سطح العينة لتكون متوازية على حافة سكين، ستتم إزالة جزء كبير مع شفرة حلاقة. بقطع الطرفين العلوي والسفلي من العينة باستخدام مبضع، أصبح كلا الجانبين من العينة السلس والضبط موازية لبعضها البعض (الشكل 5 د)، هو أمر ضروري للحصول على مقاطع الشريط مباشرة ومتواصلة.
4-تعديل على حافة السطح وسكين العينة بحيث أنهم يواجهون موازية لبعضها البعض 21
- إزالة سكين التشذيب، واستدارة كتلة العينة 90° باتجاه عقارب الساعة.
- تعيين سكين تقطيع سامسونج إلى مرحلة السكين.
- ضبط سطح العينة وحافة السكين بحيث أنهم يواجهون موازية لبعضها البعض باستخدام جزء كبير من سطح العينة.
ملاحظة: يتم استخدام جزء كبير من العينة للتكيف نظراً على وجه القطع لتقطيع المسلسل صغيرة جداً، مما يجعل من الصعب على ضبط حافة السطح وسكين العينة باستخدام هذا الجزء فقط، لا سيما في الاتجاه العمودي. وهكذا، باستخدام جزء كبير من العينة يسهل التكيف.
5-نشر الحل النيوبرين على كتلة العينة (الشكل 6)
- وضع تشاك العينة في نفس الموقف بالموقف الأصلي، تطبيق الشريط تشاك وحامل تشاك مبضع وقطع في الحدود (الشكل 6a).
- أخذ العينة تشاك من مبضع، ووضعها تحت ستيريوميكروسكوبي (الشكل 6b). اقتطاع جزء كبير من العينة مع شفرة حلاقة، تاركاً الجزء ضئيلة، من الذي سيتم الحصول على مقاطع المسلسل.
- استخدام ماصة باستور، إسقاط حوالي 1 ميليلتر الحل النيوبرين 0.5% (الشكل 6b) على العينة التي ستستخدم لتقطيع المسلسل، جعل لاصقة الجانبين القسم. وتشمل العينة كاملة مع الحل النيوبرين. استيعاب الحل النيوبرين الزائدة فورا بقطعة من ورق الترشيح التي وضعت بالقرب من العينة. الحصول على يط مقاطع ضروري لالتقاط صور لأقسام الخلية المسلسل، وغراء النيوبرين مفيد جداً للخلاف في الفروع معا.
- إعداد شبكات 3-الشق (أحجام الشقوق: الأوسط، 0.4 مم × 2.2 ملم، كلا الجانبين 0.2 مم × 2.2 مم) (الشكل 6 ج) لالتقاط المقاطع المسلسل بالانحناء مقبض الشبكات إلى 60 °، علاج الشبكات مع الحل النيوبرين 0.5%، ومما يجعل ماء بالشبكات توهج التفريغ22.
6-جعل أبواب المسلسل (الشكل 7-9)
- تشاك مكان كتلة العينة مرة أخرى في مبضع في نفس موقف 5.1 (الشكل 6a) بمحاذاة أجزاء مسجلة. هذا يبقى الوجه كتلة وحافة السكين موازية تماما لبعضهما البعض. ثم جلب سكين القرب من العينة.
- ملء القارب السكين بالماء.
- وتغطي مبضع مع غطاء من بلاستيك لمنع تدفق الهواء (الشكل 7).
ملاحظة: تدفق الهواء خلال تمزيقها سامسونج واسترجاع الأقسام غالباً ما يسبب مشاكل. الغطاء من البلاستيك له ثلاث فتحات: فتحه واحدة لعدسات مجهر، واثنين من الثقوب للأسلحة للسماح للعملية بينما الغطاء على. مسند خشبي يستخدم لوضع الأسلحة أثناء القيام بالعمل الحساسة، مثل استرداد المقاطع المسلسل مع الشبكات. مسند خشبي يوضع على جداول مختلفة من الجدول مبضع (الشكل 7، أسهم)، حتى لا يؤدي إلى إحالة الاهتزاز لليدين للمشغل إلى مبضع. - بدء قطع العينة على 200 نانومتر قسم سمك (الشكل 8). الإعداد في 200 نانومتر سمك سيوفر الوقت في جلب السكين على سطح العينة.
- بعد أن يتم قطع المقطع الأول، تعيين سمك مقطع إلى 70 نانومتر (الشكل 8).
- عندما يصل عدد المقاطع المسلسل إلى 20 (دقة حديثة، بعد وصول الشريط حوالي 1.8 مم؛ عدد أقسام يختلف اعتماداً على عرض المقاطع)، تعيين سمك الباب إلى 10 نانومتر (الشكل 8) مع الاستمرار في قص.
ملاحظة: منذ مبضع لا يمكن قطع 10 نانومتر سميكة المقاطع، يظهر لا قسم جديد، وأصبح فصل المقاطع بقطع سابقا من حافة السكين. من المهم الحصول على مجموعات المقاطع المنفصلة (الشكل 9) لالتقاط مقاطع المسلسل لتجنب صعوبة في فصل المقاطع يدوياً باستخدام زوج من خيوط الشعر. نظراً لمجال الرؤية في المجهر الإلكتروني انتقال 2.0 مم، ينبغي المقاطع 1.8 مم طويل على الأكثر. - تعيين سمك مقطع إلى 60 نانومتر (الشكل 8). هذا سوف ينتج 70 نانومتر المقاطع (الشكل 8) لأن الجهاز سيتم إضافة سمك nm 10 السابقة.
- تعيين سمك مقطع إلى 70 نانومتر (الشكل 8) ومواصلة خفض حتى يتم الحصول على مقاطع طوله 1.8 ملم.
- كرر 6.6-6.8 حتى يتم الحصول على خمسة أقسام طويلة 1.8 مم (الشكل 9). نحن عادة ما جعل المجموعات الخمس في القسم منذ هناك خمس العينة أصحاب في المجهر الإلكتروني انتقال المتوفرة في المختبر لدينا، ولكن خمسة ليس الحد الأقصى.
7-التقاط المقاطع المسلسل (الشكل 10-12)
- ضع 'قسم-عقد حلقة'23 (القطر الداخلي للحلقة: 5.0 ملم) (الشكل 10a) على مجموعة القسم الثالث (الشكل 10 باء).
ملاحظة: من الضروري لاسترداد المقاطع حسب ترتيب على تقطيع لالتقاط الصور بالترتيب الصحيح. بيد أن هناك خمس مجموعات المقاطع على متن القارب سكين، أنه كثيرا ما يحصل الخلط بين المجموعات التي يتم فيها. عن طريق وضع الحلقة في المجموعة الثالثة، يصبح من الواضح أن هاتين المجموعتين قريبة من المشغل الأولى والثانية، وهما بعيدة من المشغل هي المجموعات الرابعة والخامسة (الشكل 10 باء). سيمنع هذا الخلط بالترتيب. - ضع 'رفع مستوى سطح الماء حلقة'23 (وسرل، القطر الداخلي للحلقة: 4.0 ملم) (الشكل 11 ألف) في مرحلة سكين (الشكل 11 باء). سوف وسرل الوقوف بحزم في مرحلة سكين نظراً لأنها مجهزة بمغناطيس في الجزء السفلي.
- مكان الحلقة وسرل فقط فوق مقاطع المسلسل بالانتقال رمح والتعامل. أقل في الحلقة وسرل إلى سطح الماء حيث أن التكرار الحلقي يطوق المقاطع.
- دفع الحلقة أسفل عن طريق تحويل المسمار أسفل حيث أنه سيتم رفع سطح الماء بالتوتر السطحي (أرقام 11 ج-د). نقل المقطع إلى وسط الحلقة ووضعه على قمة المياه وضبط اتجاه المقطع باستخدام حبلا شعر21.
- التقاط مجموعات المقاطع التي لمسها مع عارية شق-شبكة، الذي عقد بملاقط وأبقى موازية لسطح الماء (د الشكل 11). من المهم للمقاطع اتصال الشبكة أولاً، لا الماء، لوضع المقاطع أدق على مركز الشبكة (د الشكل 11).
- وضع الشبكات مع الأقسام جنبا إلى جنب مع قطره صغيرة من الماء على فورمفار الدعم السينمائي16 (الشكل 12)، وإزالة المياه الزائدة باستخدام ورق الترشيح.
ملاحظة: تجعد الفيلم الدعم مشكلة غالباً عندما يتم انتقاؤها المقاطع إلى استخدام شبكة مع دعم الفيلم لأنه يمس غشاء (المقاطع) غشاء (دعم فيلم) مباشرة. مشكلة الحصول على التجاعيد في الفيلم الدعم انخفض انخفاضا كبيرا بوضع شبكة الحاملة للقسم جنبا إلى جنب مع قطره صغيرة من الماء على الفيلم الدعم فورمفار16.
8-تلطيخ الأبواب16،24 (رقم 13)
- بعد المقاطع هي تجفف تماما، المسيل للدموع الفيلم فورمفار من حول الشبكات، وإزالة الشبكات إذ تضع المقاطع.
- تعيين الشبكات في الاخدود الأنبوبة المصبوغة16 في الترتيب الصحيح (رقم 13)، ووصمة عار الأقسام مع اليورانيل خلات والرصاص سترات24.
ملاحظة: يوجد أخدود عميق 0.6 مم على طول محور الأنبوب الطويل قطع بشفرة حلاقة. الأنبوب مفيد لمنع الكسر العرضي لدعم الأفلام عند استخدام الملقط، نظراً للتعامل مباشرة مع شبكات ليس من الضروري أثناء عملية الغسيل والمصبوغة16.
9-مراقبة أقسام المسلسل (الشكل 14)
- تعيين الشبكات 5 في حامل عينات متعددة بالترتيب الصحيح (الرقم 14a)، توجيه المحور الطويل لشق شبكة متعامدة على محور صاحب العينة. لم يكن لديك المقابض (رؤوس) للشبكات أن تقطع، لأنه لا يمس 'المثبتون الشبكة' المقابض.
- إصلاح الشبكات مع 'الشبكة المثبتون' (الرقم 14b) وإدراج صاحب العينة في المجهر الإلكتروني الإرسال.
ملاحظة: أنه مفيد غالباً لالتقاط صور تضخم منخفضة لجميع أقسام الخلية (الشكل 15) تجد مثيرة للاهتمام من الكائنات الدقيقة أو الخلايا في حالة جيدة مع أي تلوث ومع التثبيت جيدا، قبل التقاط الصور للخلية الهدف. - التقاط صور للخلايا الهدف في جميع أقسام الخلية في التكبير عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول، استخدمت فتحه ثلاث شبكات لالتقاط مقاطع المسلسل. الشبكات مصنوعة من النيكل أو النحاس. يتم وضع المقاطع المسلسل في الشق الأوسط. الشقوق على جانبي ضرورية لعرض المقاطع عند التقاط لهم مع الشبكة. للحفاظ على الشبكات بالتوازي مع مقاطع المسلسل عند التقاط لهم مع ملاقط (د الشكل 11)، عازمة التعامل مع (الشكل 6 ج، حق). مقبض صغير مفيد لمنع الانحناء من الجزء الرئيسي للشبكة، الذي يسبب مشاكل خطيرة في التقاط المقاطع، ومنع إسقاط الأقسام أثناء التلوين. ومزايا هذه الشبكة عبر الشبكة حفرة واحدة التقليدية 2.0 x 1.0 مم. إلا وهي أقسام معتمدة مباشرة من قبل اثنين من قضبان معدنية 0.4 ملم وبصرف النظر (أضيق من 1.0 مم) والفيلم الدعم فورمفار في شبكة شق ثلاثة، بينما أبواب معتمدة فقط في الفيلم الدعم في شبكة حفرة واحدة تقليدية. ولذلك يمكن منع الانجراف العينة في تصوير في عالية التكبير باستخدام شبكة شق ثلاثة.
15 الرقم يظهر عرض تكبير منخفض للشبكات الخمس التي تحمل مقاطع المسلسل. نظراً لكل مقطع العصي معا، فمن السهل العثور على نفس الخلية في المقطع التالي حتى في أعلى التكبير. الرقم 16 و 17 أمثلة على صور المسلسل من أقسام الخلية. لأن المقاطع معتمدة بشكل أمن على شبكات 3-الشق، تؤخذ صور في تضخم عالية (x 50,000) بسهولة دون الانجراف العينة. تم تصوير ألياف الحمض النووي 2 نيوتن متر في القطر في هذه الدراسات9،12.
الشكل 1 . جهاز صناعة الأفلام الدعم فورمفار- هو انخفض نصف الشريحة الزجاجية في حل فورمفار في العمود العلوي من الجهاز عن طريق الضغط على الحل مع الهواء من خلال 'أ' باستخدام كرة مطاطية. الحل هو ينضب من العمود بفتح محبس الحنفية الثلاثية والإفراج عن الهواء من خلال 'ب' لتخفيف الضغط. (مستنسخة من ياماغوتشي واداتشي، 201119 مع إذن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . أسلوب للإفراج عن الفيلم من الزجاج الانزلاق على المياه- (أ) أربع حواف الفيلم على الشريحة الزجاجية وهي كشط قبالة باستخدام شفرة حلاقة. (ب) هو طرح الفيلم فورمفار قبالة على المياه عن طريق خفض الشريحة الزجاجية ببطء في زاوية منخفضة. (مستنسخة من ياماغوتشي واداتشي، 201119 مع إذن). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . فورمفار دعم الفيلم على رف ألمنيوم. (أ هو حصدت السينما فورمفار) من الماء مع رف ألومنيوم. (ب) حامل يحتفظ في مجففة حتى استخدام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . تقليم كتلة العينة شفرة تشذيب بالموجات فوق الصوتية وشفرة حلاقة تحت ستيريوميكروسكوبي. (أ) وجود العينة تؤكد مراقبة كتلة العينة تحت مجهر خفيفة. كتلة تظهر في الشكل الوارد الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بحجم دودة كيتا (حوالي 1.7 مم في الطول) التي تم جمعها من أعماق البحار12،14. (ب) خفض المرحلة. (ج) كل صورة ستيريوميكروسكوبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . تقليم كتلة العينة بسكين الماس باستخدام مبضع. (أ) رسم توضيحي لقطع الحافة اليسرى. (ب الوجه كتلة) هو قطع في موضع من حوالي 100 نانومتر من الحافة اليسرى للعينة. (ج) مرآة (قص ميسا، م) وضعت على المسرح سكين. (د) عينة السطح. علما أن الجانب العلوي والجانب السفلي من الجزء ضئيلة على نحو سلس ومتوازية تماما. لاحظ أيضا أن يتم قطع الكتف للاحتفال باتجاه قطع (انظر الشكل 8). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . العلاج النيوبرين على سطح العينة. (أ) من أجل وضع تشاك العينة مرة أخرى في الموضع الأصلي بالضبط، تشاك تشاك حائز مبضع ملحوظ مع شريط وقص على الحدود. (ب) ترطيب العينة مع النيوبرين الحل باستخدام ماصة باستور. (ج) ثلاثة-شق شبكات لالتقاط مقاطع المسلسل. هي بنت المقبض إلى 60 درجة (ج) حق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 . غطاء من البلاستيك مبضع ومسند خشبي. الغطاء من البلاستيك مفيد لمنع تدفق الهواء خلال تمزيقها سامسونج. مسند خشبي يستخدم للقيام بأعمال حساسة مثل استرداد المقاطع المسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8 . تحديد سمك الفرع والحصول على المقاطع في سمك مناسب. بعد عدد المقاطع المسلسل وصلت إلى 20، يتم تعيين سمك الباب 10 نانومتر. منذ مبضع لا يمكن قطع 10 نانومتر سميكة المقاطع، يظهر لا قسم جديد، وأصبح فصل المقاطع بقطع سابقا من حافة السكين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 9 . مثال للمقاطع سامسونج الحصول عليها عن طريق البروتوكول. علما بأن المجموعات الخمس للمسلسل مقاطع طويلة حوالي 1.8 مم بالفعل فصل بعد القطع. في هذه الحالة بالذات، لون وسط الأقسام سامسونج مصفر بسبب وجود العينة. الأجزاء الأخرى من القسم، التي لا تحتوي على العينة ويتكون من راتنج فقط، فضية اللون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 10 . 'قسم-عقد حلقة'. (أ) عرض (الجزء العلوي) من أعلى وأسفل طريقة العرض (الجزء السفلي من الصورة) من الحلقة. (ب) حلقة عقد قسم يستخدم للاحتفاظ بالمجموعة الثالثة من مقاطع المسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 11 . استرجاع مقاطع المسلسل. (أ) رفع مستوى سطح الماء حلقة ' (وسرل)- يمكن إزالة المقبض للحلقة من مدخل المنجم، ومنقولة. يمكن أيضا نقل الحلقة صعودا وهبوطاً عن طريق تحويل رأس المسمار. (ب) وسرل يحددها في مرحلة سكين مغناطيس. (ج) توثيق عرض الفقرة (ب). (د) رسم تخطيطي لحلقة والمياه السطحية، والأقسام، والشبكة أثناء استرداد (جانب العرض). يمكن استرداد المقاطع سامسونج تحديداً إلى شق شبكة عن طريق خفض خط الشبكة العارية للمقاطع سامسونج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 12 . وضع الشبكة على الفيلم فورمفار- يتم وضع الشبكة القابضة المقاطع جنبا إلى جنب مع قطره صغيرة من الماء على الفيلم فورمفار على الرف الألومنيوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 13 . تلوين أنبوب16. أخدود عميق 0.6 مم مصنوع على طول المحور الطويل باستخدام شفرة حلاقة. يتم وضع شبكات في groove بالترتيب الصحيح. واحدة من نهاية الأنبوب قطع (رأس السهم) وضع علامة على اتجاهه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 14 . وضع الشبكات في صاحب العينة. (أ) الشبكات يتم وضعها في حامل العينة في الترتيب الصحيح. (ب) شبكات ثابتة ثم مع 'الشبكة-المثبتون'. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 15 . مقاطع المسلسل شنت على شبكات ذبح. يظهر الرقم 18 إلى 25 المقاطع التي شنت على شبكة واحدة. تشير الأرقام في كل شق إلى بداية رقم تسلسل من القسم الأول. القسم الأول أكثر سمكا من الآخرين (انظر الشكل 8). علما بأن الأجزاء المرتبطة معا ولها نفس سمك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 16 . مقاطع المسلسل من ميوجينينسيس باراكاريون12. الأرقام في أسفل اليمين تشير إلى تسلسل بالنسبة إلى القسم الأول. ويبين الشكل 12 من أصل 67 مقاطع كاملة. تم العثور على هذه الخلية أن يكون نوكليويد كبيرة تتكون من ألياف الحمض النووي عارية، مع غشاء نوكليويد واحد، واندوسيمبيونتس التي تشبه البكتيريا، ولكن لا توجد الميتوكوندريا. وهكذا، يبدو هذا الكائن نموذج الحياة متوسطة المتطورة من بروكاريوتي إلى يوكاريوتي12. N, نوكليويد. مستنسخة من ياماغوتشي و Worman، 2014. 14 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 17 . مقاطع المسلسل من الإشريكيّة القولونية9. الأرقام في أسفل اليمين تشير إلى تسلسل بالنسبة إلى القسم الأول. ويبين الشكل 12 مقاطع كاملة. تم العثور على هذه الخلية تحتوي على ريبوسوم 21,7009. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتطلب الأسلوب الذي قدم هنا لا معدات غالية الثمن. أنه يتطلب فقط رف ألومنيوم (الشكل 3) وشق ثلاث شبكات (الشكل 6 ج) وقسم-عقد الحلقات (الشكل 10a)، وحلقة رفع مستوى سطح الماء (الشكل 11 ألف) وأنبوب المصبوغة (الشكل 13). وهناك العديد من الميزات لهذا الأسلوب. يتم استخدام جزء كبير من العينة لضبط حافة السطح وسكين العينة بحيث أنهم يواجهون موازية لبعضها البعض. يتم قطع المقاطع المسلسل في مجموعات لتجنب صعوبة في فصل الأقسام باستخدام زوج من خيوط الشعر عند استرداد مجموعة من مقاطع المسلسل على الشبكات الشق. حلقة عقد قسم يستخدم لتجنب الخلط بين ترتيب مجموعات القسم. يستخدم 'حلقة رفع مستوى سطح الماء' للتأكد من المقاطع متوضعة في قمة المياه وأن اتصال الشبكة أولاً، بغية وضعها في الموضع المطلوب في الشبكات. فورمفار دعم الفيلم على رف ألومنيوم يستخدم لجعله أسهل لاسترداد الأقسام المتعلقة بالشبكات وتجنب التجاعيد الفيلم الدعم. ويستخدم أنبوب المصبوغة لتجنب كسر دعم الأفلام بطريق الخطأ مع ملاقط.
في الآونة الأخيرة، كان أولتراميكروتومي جمع الأشرطة تلقائية المتقدمة25 لجمع المقاطع تلقائياً للمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) التصوير على الأشرطة البلاستيكية إلكترون-كامد. ويمكن هذا الأسلوب موثوق قطع آلاف المقاطع سامسونج26، التي لا يمكن بهذا الأسلوب. أيضا، كتلة المسلسل الوجه (SBF) 27 وتركيز أيون شعاع (التعزيز)-وزارة شؤون المرأة28 المستخدمة في تجميع معلومات ثلاثية الأبعاد للخلايا والأنسجة من الحيوانات. في هذه الأساليب، تمزيقها مع الماس سكين أو تركيز أيون شعاع المتكاملة داخل المجهر SEM، ونفذت بطريقة أوتوماتيكية بالكامل يتطلب لا تقنيات خاصة. على الرغم من أن هذه الأساليب مفيدة، إلى أجهزة مكلفة جداً أن مؤسسات كثيرة لا شراء هذه الآلات. أيضا، منذ هذه الأساليب تستخدم وزارة شؤون المرأة لأجزاء الصورة، القرار ميكروجرافس أدنى من الأسلوب الحالي الذي يستخدم مجهر إلكتروني (TEM). لا يمكن حل هذه الأساليب الجسيمات الريبوسوم الفردي، ميكروتوبوليس، ميكروفيلامينتس، وألياف الحمض النووي في الوقت الحاضر.
لتحليل ستروكتومي للكائنات الحية الدقيقة ودراسة ultrastructural للكائنات الدقيقة غير معروفة، من الضروري التقيد بخلايا ومكونات الخلية مثل جدار الخلية، وغشاء البلازما، الميتوكوندريا، ونواة، والأغشية النووية، هيولى، الجبيلة، للبلاستيده، جهاز غولجي، ريبوسوم، وعناصر الخيطية بدقة عالية. تيم المراقبة الأقسام سامسونج المسلسل واحدة من عدد قليل من الطرق لجعل مثل هذا التحليل ممكناً في ثلاثة أبعاد. ولما تبقى أبواب سامسونج بعد المراقبة باستخدام هذا الأسلوب، يمكن ملاحظة نفس المنطقة مرارا وتكرارا؛ هذا غير ممكن في SBF أو التعزيز-وزارة شؤون المرأة، منذ فقدت المنطقة لوحظ بعد الملاحظة. هذه الميزة غير هامة لدراسة الكائنات الدقيقة في أعماق البحار حيث من الضروري البحث عن كائنات مثيرة للاهتمام في التكبير المنخفض أولاً، وثم التقاط الصور متسلسل على الكائن المستهدف في التكبير عالية.
وفي الختام، أسلوب تقطيع سامسونج المسلسل يمكن الآن أن يؤديها في وسيلة سهلة، غير مكلفة، ودراسة طريقة ريلايبلي من هذه الدراسة، هو أمر أساسي أولتراستروكتوال 3D الكائنات المجهرية بدقة عالية في الميكروسكوب الإلكتروني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر بإخﻻص كيتا شيجييو على اقتراحات قيمة ومناقشة. ونشكر أيضا جون واكستين Sumire للقراءة الحرجة من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
