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संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में सूक्ष्मजीवों के धारावाहिक Ultrathin वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक विधि

Published: January 17, 2018 doi: 10.3791/56235
Automatic Translation
1, 1
1Medical Mycology Research Center, Chiba University

Summary

इस अध्ययन के प्रसारण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में महंगे उपकरणों के बिना एक सूक्ष्मजीव के धारावाहिक ultrathin वर्गों को प्राप्त करने के लिए विश्वसनीय और आसान प्रक्रिया प्रस्तुत करता है ।

Abstract

संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में उच्च आवर्धन पर तीन आयामों में कोशिकाओं और कोशिका घटकों अवलोकन नमूना के धारावाहिक ultrathin वर्गों की तैयारी की आवश्यकता है । हालांकि धारावाहिक ultrathin वर्गों की तैयारी के लिए बहुत मुश्किल माना जाता है, यह बजाय आसान है अगर उचित विधि का प्रयोग किया जाता है । इस पत्र में, हम सुरक्षित रूप से सूक्ष्मजीवों के धारावाहिक ultrathin वर्गों को प्राप्त करने के लिए कदम दर कदम प्रक्रिया दिखाते हैं । इस विधि के प्रमुख बिंदु हैं: 1) नमूना के बड़े हिस्से का उपयोग करने के लिए और नमूना सतह और चाकू किनारे को समायोजित करें ताकि वे एक दूसरे के समानांतर हैं; 2) समूहों में धारावाहिक वर्गों में कटौती और भट्ठा ग्रिड पर धारावाहिक वर्गों के एक समूह को वापस लाने जब बाल किस्में की एक जोड़ी का उपयोग कर वर्गों को अलग करने में कठिनाई से बचने के लिए; 3) एक ' अनुभाग होल्डिंग पाश ' का उपयोग करने के लिए और अनुभाग समूहों के आदेश मिश्रण से बचने के लिए; 4) एक ' पानी की सतह स्थापना पाश ' का उपयोग करने के लिए और वर्गों पानी के शीर्ष पर तैनात कर रहे हैं और सुनिश्चित करें कि वे ग्रिड पर वांछित स्थिति में उन्हें जगह के लिए, सबसे पहले, क्रम में उन्हें छूने; 5) एक एल्यूमीनियम रैक पर समर्थन फिल्म का उपयोग करें और यह आसान ग्रिड पर वर्गों को ठीक करने के लिए और समर्थन फिल्म के wrinkling से बचने के लिए बनाने के लिए; और 6) एक धुंधला ट्यूब का उपयोग करें और गलती से चिमटी के साथ समर्थन फिल्मों को तोड़ने से बचने के लिए । इस नई विधि मुश्किल के बिना धारावाहिक ultrathin वर्गों प्राप्त करने में सक्षम बनाता है । विधि यह 3 डी में उच्च संकल्प पर सूक्ष्मजीवों के सेल संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए संभव बनाता है, जो स्वत: टेप का संग्रह ultramicrotome विधि और सीरियल ब्लॉक-चेहरा या केंद्रित आयन बीम का उपयोग करके प्राप्त नहीं किया जा सकता इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग ।

Introduction

उचित धारावाहिक ultrathin सेक्शनिंग तकनीक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म स्तर पर तीन आयामी कोशिकाओं और कोशिका घटकों का अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य है. हम खमीर कोशिकाओं के सेल चक्र में धुरी ध्रुव शरीर की गतिशीलता का अध्ययन किया है, और सेल चक्र के दौरान उनके ultrastructure के रूपात्मक परिवर्तन का पता चला और दोहराव के समय1,2,3, 4,5. २००६ में, हम ' संरचना ' और '-ome ' के संयोजन से एक नया शब्द ' structome ' गढ़ा, और यह ' मात्रात्मक और तीन आयामी इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म स्तर पर एक पूरे सेल के संरचनात्मक जानकारी के रूप में परिभाषित ' 6,7.

द्वारा structome विश्लेषण, जो धारावाहिक ultrathin खंड तकनीक की आवश्यकता है, यह पाया गया कि Saccharomyces cerevisiae और Exophiala dermatitidis के एक खमीर सेल के बारे में २००,००० ribosomes7,8था, एक ई कोलाई सेल था २६,००० ribosomes9, एक माइकोबैक्टीरियम तपेदिक सेल था १,७०० ribosomes10 और Myojin सर्पिल बैक्टीरिया था केवल ३०० ribosomes11। यह जानकारी न केवल प्रत्येक जीव में वृद्धि दर का आकलन करने में उपयोगी है, बल्कि प्रजातियों की पहचान में भी9.

इसके अलावा, structome विश्लेषण एक नए जीव की खोज के लिए नेतृत्व किया; Parakaryon myojinensis जापान, जिसकी कोशिका संरचना prokaryotes और eukaryotes12,13,14,15के उन लोगों के बीच एक मध्यवर्ती थे के तट से गहरे समुद्र में पाया गया । वर्तमान में सीरियल ultrathin सेक्शनिंग तकनीक को इतना कठिन माना जाता है कि इसमें महारत हासिल करने में काफी समय लगेगा । इस अध्ययन में, हमने एक विश्वसनीय विधि विकसित की है जिसमें कोई भी व्यक्ति बिना कठिनाई के धारावाहिक ultrathin का प्रदर्शन कर सकता है ।

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Protocol

नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल नमूनों सूक्ष्मजीवों, तरल नाइट्रोजन में प्रोपेन के साथ तेजी से जमे हुए थे, 2% आज़मियम tetroxide युक्त एसीटोन में प्रतिस्थापित फ्रीज, और epoxy राल में एंबेडेड1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.

1. सपोर्टिंग फिल्म की तैयारी (चित्रा 1-3)

नोट: सिल्वर रंग का Formvar सपोर्ट फिल्म कास्ट-ऑन-ग्लास विधि19का प्रयोग कर तैयार किया गया है ।

  1. ईथीलीन dichloride में १.५% Formvar की १०० मिलीलीटर को एक Formvar-मेकिंग उपकरण (चित्र 1) में जोड़ें । एक गिलास स्लाइड (७६ मिमी x 26 मिमी x १.३ मिमी) Formvar समाधान में हवा के साथ समाधान दबाकर ' एक ' के माध्यम से एक रबर की गेंद का उपयोग कर के ऊपरी स्तंभ में डुबकी के एक आधे
    1. तीन तरह के टोंटी को खोलकर और दबाव कम करने के लिए ' बी ' के माध्यम से हवा जारी कर कॉलम से समाधान ड्रेन । कांच स्लाइड की सतह पर एक फिल्म बनाने के लिए तंत्र से गिलास स्लाइड बाहर ले और हवा में सूखी । Formvar फिल्म के सूखने में तेजी लाने के लिए गरमागरम लैंप का प्रयोग करें ।
  2. एक उस्तरा ब्लेड (चित्रा 2a) के साथ कांच स्लाइड पर फिल्म के चार किनारों से परिमार्जन के बाद, और स्लाइड पर सांस लेने के लिए स्लाइड20से फिल्म के जुदाई की सुविधा के लिए, पानी पर बंद नाव में गिलास स्लाइड डुबो कर फिल्म एक कम क्षैतिज कोण (के बारे में 10 °, चित्रा बी8) पर धीरे पानी ।
  3. एक एल्यूमीनियम रैक का उपयोग कर पानी से Formvar फिल्म स्कूप (30 मिमी x 25 मिमी x 3 मिमी) छेद के साथ (4 मिमी व्यास में) (चित्र 3ए). रैक एक desiccator में Formvar फिल्म के साथ प्रयोग जब तक रखें (चित्र बी) ।

2. एक stereomicroscope (चित्रा 4) के तहत एक अल्ट्रासोनिक ट्रिमिंग ब्लेड और एक उस्तरा ब्लेड 21 के साथ नमूना ब्लॉक ट्रिमिंग

  1. सुनिश्चित करें कि एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्र 4a) के साथ ब्लॉक की नोक देख कर ब्लॉक की सतह पर कोशिकाओं रहे हैं ।
  2. चक (ब्लॉक धारक) में नमूना ब्लॉक माउंट, और एक ट्रिमिंग स्टेज21 (चित्रा 4b) पर चक माउंट । इस छंटनी चरण नमूना के पीछे से एक रोशनी तंत्र है ।
  3. ब्लॉक को ०.७ mm x १.० mm (आंकड़े 4c, 5d) के आकार में ट्रिम करें । epoxy राल के बाद से बहुत मुश्किल है, ब्लॉक पहले एक अल्ट्रासोनिक ट्रिमिंग ब्लेड का उपयोग कर ट्रिम कर दीजिए । अल्ट्रासोनिक trimming ब्लेड एक नए शुरू की मशीन है, और ब्लॉक आसानी से छंटनी कर रहे हैं । फिर एक उस्तरा ब्लेड के साथ ब्लॉक ट्रिम कर दीजिए । काटने की दिशा को चिह्नित करने के लिए एक कंधे को काटें ( चित्र 5d, चित्र 8) देखें ।

3. microtome का उपयोग कर हीरा चाकू के साथ नमूना ब्लॉक ट्रिमिंग (चित्रा 5)

  1. ultramicrotome के नमूना धारक में नमूना ब्लॉक चक निर्धारित करें । जब सीरियल ultrathin अनुभाग किया जाता है, तो वास्तविक स्थिति के विरुद्ध नमूना ९० ° की सुइयों को रखें ( चित्र 5d) देखें ।
  2. ब्लॉक की एक हीरे trimming चाकू के साथ की सतह में कटौती ( चित्र 5dदेखें) । हीरा चाकू नमूना ब्लॉक चेहरे के समानांतर किनारे सेट करें, और नमूना सतह की ंयूनतम राशि में कटौती के रूप में किसी भी नमूना (चित्रा 5d) खोना नहीं है ।
    नोट: यह कदम नमूना सतह smoothen करने के लिए किया जाता है । स्लिम भाग के नमूना सतह का हिस्सा बरकरार छोड़ दिया है (इसलिए इस भाग के एक दर्पण की तरह चमक नहीं है, चित्रा 5d), तो के रूप में धारावाहिक के लिए नमूना के किसी भी भाग को खोना नहीं है । इसका कारण यह है कि नमूना ब्लॉक की सतह पर दिखाया गया है ।
  3. नमूना ब्लॉक (चित्रा 5c) के काटने की निगरानी करने के लिए चाकू मंच पर एक दर्पण (Mesa कट, एम) प्लेस.
  4. बाएं किनारे में कटौती (यह ऊपरी पक्ष, चित्रा 5d, सीरियल अनुभाग में नमूना के) के लिए छोड़ दिया चाकू चरण 30 ° घूर्णन द्वारा चाकू ट्रिमिंग का उपयोग कर (आंकड़ा 5) ।
  5. नमूना के बाएँ किनारे से लगभग १०० µm पर ब्लॉक चेहरा काटें (यह सही करने के लिए चाकू चरण 30 ° घूर्णन द्वारा धारावाहिक अनुभाग, चित्रा 5d) में नमूना के निचले ओर हो जाता है) (चित्रा 5b).
    नोट: धारावाहिक वर्गों के बारे में ९० एनएम एक्स के नमूने के स्लिम हिस्सा से आकार में 1 मिमी के बारे में कटौती की जाएगी । बड़े हिस्से के लिए नमूना सतह और चाकू किनारे ऐसी है कि वे समानांतर है समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । नमूना सतह को समायोजित करने के बाद चाकू धार के समानांतर हो, बड़ा हिस्सा एक उस्तरा ब्लेड के साथ हटा दिया जाएगा । microtome का उपयोग कर नमूना के ऊपरी और निचले पक्षों को काटने से, नमूना के दोनों ओर चिकनी और एक दूसरे के लिए बिल्कुल समानांतर हो (चित्रा 5d), जो सीधे और अटूट रिबन वर्गों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।

4. नमूना सतह और चाकू किनारे समायोजन इतना है कि वे एक दूसरे के समानांतर चेहरा 21

  1. ट्रिमिंग करने वाला चाकू निकालें, और नमूना ब्लॉक ९० ° दक्षिणावर्त घुमाएं ।
  2. चाकू मंच के लिए एक ultrathin खोदी चाकू सेट करें ।
  3. नमूना सतह और चाकू बढ़त को समायोजित करें ताकि वे नमूना सतह के बड़े हिस्से का उपयोग कर एक दूसरे के समानांतर चेहरा ।
    नोट: नमूना का बड़ा हिस्सा समायोजन के लिए प्रयोग किया जाता है, क्योंकि सीरियल अनुभाग के काटने चेहरा इतना छोटा है, यह मुश्किल नमूना सतह और चाकू बढ़त को समायोजित करने के लिए केवल इस भाग का उपयोग कर, विशेष रूप से ऊर्ध्वाधर दिशा में कर रही है । इस प्रकार, नमूना के बड़े हिस्से का उपयोग समायोजन आसान बनाता है ।

5. नमूना ब्लॉक (चित्रा 6) पर neoprene समाधान फैल

  1. मूल स्थिति के रूप में बिल्कुल उसी स्थिति में नमूना चक जगह, चक और microtome के चक धारक पर टेप लागू करें और सीमा पर कटौती (चित्रा 6a) ।
  2. नमूना चक microtome से बाहर ले लो, और stereomicroscope (चित्रा घमण्ड) के तहत जगह है । एक उस्तरा ब्लेड के साथ नमूना के बड़े हिस्से में कटौती, स्लिम हिस्सा है, जो से धारावाहिक वर्गों प्राप्त किया जाएगा जा रहा है ।
  3. एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग, के बारे में 1 µ एल ०.५% neoprene समाधान (चित्रा घमण्ड) धारावाहिक अनुभाग के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए, अनुभाग पक्षों चिपकने वाला बनाने के लिए ड्रॉप । neoprene समाधान के साथ पूरे नमूना कवर । नमूना के पास रखा फिल्टर कागज का एक टुकड़ा के साथ तुरंत अतिरिक्त neoprene समाधान को अवशोषित । वर्गों के एक रिबन हो रही धारावाहिक सेल वर्गों के चित्र लेने के लिए आवश्यक है, और neoprene गोंद वर्गों एक साथ चिपके के लिए बहुत उपयोगी है ।
  4. 3-भट्ठा ग्रिड तैयार करें (slits के आकार: मध्य, ०.४ मिमी x २.२ मिमी, दोनों पक्षों ०.२ मिमी x २.२ मिमी) (चित्रा 6c) को ग्रिड के संभाल झुका द्वारा धारावाहिक वर्गों के लिए ६० °, ०.५% neoprene समाधान के साथ ग्रिड के इलाज, और ग्रिड हाइड्रोफिलिक से बना चमक निर्वहन22।

6. धारावाहिक वर्गों (चित्रा 7-9) बनाना

  1. नमूना ब्लॉक चक वापस microtome में ५.१ के रूप में एक ही स्थान पर प्लेस (चित्रा 6a) टेप भागों संरेखित करके । यह ब्लॉक चेहरा और चाकू बढ़त एक दूसरे के लिए पूरी तरह से समानांतर रहता है । तो चाकू के पास नमूना लाने के लिए ।
  2. पानी के साथ चाकू नाव भरें ।
  3. airflow (चित्रा 7) को रोकने के लिए एक प्लास्टिक कवर के साथ microtome को कवर करें ।
    नोट: ultrathin के दौरान Airflow अनुभाग और वर्गों की पुनर्प्राप्ति अक्सर समस्याओं का कारण है । प्लास्टिक कवर तीन छेद है: एक छेद दूरबीन लेंस के लिए है, और अंय दो छेद हथियारों के लिए कर रहे है आपरेशन की अनुमति जबकि कवर पर है । लकड़ी armrest इस तरह ग्रिड के साथ धारावाहिक वर्गों को पुनः प्राप्त करने के रूप में नाजुक काम कर रही है, जबकि हथियार रखने के लिए प्रयोग किया जाता है । लकड़ी के armrest microtome मेज (चित्रा 7, तीर) से अलग टेबल पर रखा गया है, तो के रूप में microtome के लिए ऑपरेटर के हाथों की कंपन संचारित नहीं ।
  4. २०० एनएम अनुभाग मोटाई (चित्रा 8) पर नमूना काटने शुरू करते हैं । २०० एनएम मोटाई पर सेटिंग नमूना की सतह के लिए चाकू लाने में समय की बचत होगी ।
  5. पहला खंड कट जाने के बाद, अनुभाग मोटाई को ७० एनएम (चित्र 8) पर सेट करें ।
  6. जब धारावाहिक वर्गों की संख्या 20 तक पहुंचता है (ठीक बोल रहा है, के बाद रिबन के बारे में १.८ mm तक पहुंच जाता है; अनुभागों की संख्या चौड़ाई के आधार पर भिंन होती है), अनुभाग मोटाई को 10 एनएम (चित्र 8) पर सेट करें, जबकि कटौती जारी है ।
    नोट: चूंकि microtome 10 एनएम-मोटी वर्गों में कटौती नहीं कर सकते, कोई नया अनुभाग प्रकट होता है, और पहले कटौती वर्गों चाकू बढ़त से अलग हो जाते हैं । यह अनुभाग समूहों को अलग करने के लिए मैंयुअल रूप से बाल किस्में की एक जोड़ी का उपयोग कर वर्गों को अलग करने में कठिनाई से बचने के लिए धारावाहिक वर्गों उठा के लिए (चित्रा 9) के लिए पृथक करना महत्वपूर्ण है । ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में देखने के क्षेत्र के बाद से २.० मिमी है, वर्गों १.८ मिमी सबसे अधिक समय होना चाहिए.
  7. ६० एनएम (चित्रा 8) के लिए खंड मोटाई सेट करें । यह ७० एनएम वर्गों (चित्रा 8) का उत्पादन होगा क्योंकि मशीन पिछले 10 एनएम मोटाई जोड़ देगा ।
  8. ७० एनएम (चित्रा 8) के लिए खंड मोटाई वापस सेट और १.८ मिमी लंबे वर्गों तक प्राप्त कर रहे है काटना जारी है ।
  9. दोहराएँ 6.6-6.8 जब तक पांच १.८ मिमी लंबे वर्गों प्राप्त कर रहे हैं (चित्र 9). हम आमतौर पर पाँच अनुभाग समूह बनाते हैं चूँकि वहाँ पाँच नमूना धारक हमारी प्रयोगशाला में उपलब्ध ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में हैं, लेकिन पाँच की सीमा नहीं है.

7. धारावाहिक वर्गों उठा (चित्र 10-12)

  1. ' खंड-होल्डिंग लूप '23 (पाश के भीतरी व्यास: ५.० मिमी) (चित्रा 10a) तीसरे खंड समूह (चित्रा 10b) पर रखें ।
    नोट: यह उनके अनुभाग के क्रम में वर्गों को पुनः प्राप्त करने के लिए उचित क्रम में तस्वीरें लेने के लिए आवश्यक है । हालांकि, के बाद से वहां चाकू नाव पर पांच अनुभाग समूह हैं, यह अक्सर भ्रमित हो जाता है जो समूहों रहे हैं । तीसरे समूह पर पाश रखकर, यह स्पष्ट हो जाता है कि दो समूहों के पास ऑपरेटर के लिए पहली और दूसरी है, और दूर दो ऑपरेटर से चौथे और पांचवें समूहों (चित्रा 10b) हैं । यह आदेश मिश्रण को रोकने जाएगा ।
  2. जगह ' पानी सतह स्थापना पाश '23 (WSRL, पाश के भीतरी व्यास: ४.० मिमी) (चित्रा 11a) चाकू मंच पर (चित्रा 11b). यह नीचे में एक चुंबक के साथ सुसज्जित है क्योंकि WSRL चाकू मंच पर मजबूती से खड़ा होगा ।
    1. बस अपने शाफ्ट और संभाल ले जाकर धारावाहिक वर्गों के ऊपर WSRL के पाश प्लेस । पानी की सतह पर WSRL के पाश इतना कम है कि पाश वर्गों को घेरे ।
    2. पेंच नीचे की ओर इतना है कि पानी की सतह सतह तनाव (आंकड़े 11c-डी) द्वारा उठाना होगा मोड़ से नीचे लूप पुश । पाश के केंद्र में अनुभाग हटो, यह पानी के शीर्ष पर स्थिति है, और एक बाल कतरा21का उपयोग करके खंड की दिशा समायोजित करें ।
    3. एक नंगे भट्ठा-ग्रिड, जो चिमटी द्वारा आयोजित किया जाता है और पानी की सतह (चित्रा 11d) के समानांतर रखा है के साथ यह छू द्वारा अनुभाग समूहों उठाओ । यह वर्गों के लिए महत्वपूर्ण है ग्रिड को छूने के लिए पहले, नहीं पानी, ग्रिड के केंद्र पर ठीक वर्गों जगह (चित्रा 11d) ।
  3. Formvar समर्थन फिल्म16 (चित्रा 12) पर पानी की एक छोटी बूंद के साथ वर्गों के साथ ग्रिड प्लेस, और फिल्टर कागज का उपयोग कर अतिरिक्त पानी को हटा दें ।
    नोट: समर्थन फिल्म के Wrinkling अक्सर एक समस्या है जब वर्गों का समर्थन फिल्म के साथ एक ग्रिड का उपयोग कर रहे हैं, क्योंकि झिल्ली (वर्गों) छू झिल्ली (समर्थन फिल्म) सीधे । सपोर्टिंग फिल्म पर झुर्रियां होने की समस्या गौरतलब है कि Formvar सपोर्ट फिल्म16पर पानी की एक छोटी बूंद के साथ साथ एक सेक्शन बेयरिंग ग्रिड रखकर कम है ।

8. धुंधला वर्गों16,24 (चित्र 13)

  1. के बाद वर्गों पूरी तरह से सूख रहे हैं, चारों ओर से ग्रिड Formvar फिल्म आंसू, और ग्रिड वर्गों असर हटा दें ।
  2. उचित क्रम (चित्रा 13) में धुंधला ट्यूब16 की नाली में ग्रिड सेट, और uranyl एसीटेट और सीसा साइट्रेट24के साथ दाग वर्गों ।
    नोट: एक नाली ०.६ मिमी एक उस्तरा ब्लेड के साथ ट्यूब कटौती की लंबी धुरी के साथ गहरी है । ट्यूब चिमटी का उपयोग करते समय समर्थन फिल्मों के आकस्मिक टूटना को रोकने के लिए उपयोगी है, के बाद से ग्रिड के प्रत्यक्ष हैंडलिंग धुंधला और वाशिंग प्रक्रिया16के दौरान आवश्यक नहीं है ।

9. धारावाहिक वर्गों का प्रेक्षण (चित्र 14)

  1. उचित क्रम (चित्रा 14a) में बहु नमूना धारक में 5 ग्रिड सेट, ग्रिड के लंबे अक्ष उंमुख नमूना धारक धुरी को सीधा भट्ठा । ग्रिड्स के हैंडल्स (ऐरोहेड) को काटना नहीं पड़ेगा, क्योंकि ' ग्रिड-दलाल ' हैंडल्स को टच नहीं करेंगे ।
  2. ग्रिड ' के साथ ग्रीड फिक्स-' तरक्की कर (चित्रा 14b) और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में नमूना धारक डालें.
    नोट: यह अक्सर सभी सेल वर्गों की कम आवर्धन छवियों को लेने के लिए उपयोगी है (चित्रा 15) कोई संदूषण के साथ अच्छी हालत में और अच्छा निर्धारण के साथ दिलचस्प सूक्ष्मजीवों या कोशिकाओं को खोजने के लिए, लक्ष्य सेल के चित्र लेने से पहले ।
  3. उच्च आवर्धन पर सभी कक्ष अनुभागों में लक्ष्य कक्षों की तस्वीरें लें ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, तीन भट्ठा ग्रिड धारावाहिक वर्गों उठा के लिए इस्तेमाल किया गया । ग्रिड निकल या तांबे के बने होते हैं । धारावाहिक वर्गों मध्य भट्ठा पर रखा जाता है । दोनों पक्षों पर slits जब उंहें ग्रिड के साथ उठा वर्गों को देखने के लिए आवश्यक हैं । उन्हें चिमटी के साथ उठा जब धारावाहिक वर्गों के साथ समानांतर ग्रिड रखने के लिए (चित्रा 11d), संभाल तुला है (चित्रा 6c, सही). एक छोटे से संभाल करने के लिए ग्रिड के मुख्य भाग के झुकने को रोकने के लाभप्रद है, जो वर्गों उठा में गंभीर समस्याओं का कारण बनता है, और धुंधला के दौरान वर्गों को छोड़ने को रोकने के । इस ग्रिड से अधिक लाभ है पारंपरिक २.० mm x १.० mm सिंगल-होल ग्रिड । अर्थात्, वर्गों से सीधे समर्थित है दो धातु सलाखों ०.४ mm के अलावा (१.० मिमी से संकरा) और एक तीन भट्ठा ग्रिड में Formvar समर्थन फिल्म द्वारा, जबकि वर्गों केवल समर्थन फिल्म द्वारा एक पारंपरिक एकल छेद ग्रिड में समर्थित हैं । नमूना बहाव इसलिए एक तीन भट्ठा ग्रिड का उपयोग कर उच्च आवर्धन पर फोटो खिंचवाने में रोका जा सकता है ।

चित्र 15 पांच ग्रिड के एक कम आवर्धन दृश्य दिखाता है कि धारावाहिक वर्गों ले । चूंकि प्रत्येक अनुभाग एक साथ चिपक जाता है, यह भी उच्च आवर्धन पर अगले खंड में एक ही सेल खोजने के लिए आसान है । चित्र 16 और 17 कक्ष अनुभागों की सीरियल छवियों के उदाहरण हैं । क्योंकि वर्गों को सुरक्षित रूप से 3-भट्ठा ग्रिड पर समर्थित हैं, उच्च आवर्धन (एक्स ५०,०००) पर तस्वीरें आसानी से नमूना बहाव के बिना लिया जाता है । डीएनए के तंतुओं 2 एनएम व्यास में इन अध्ययनों में9,12फोटो थे ।

Figure 1
चित्र 1 . Formvar समर्थन फिल्म बनाने के उपकरण । एक गिलास स्लाइड के आधे उपकरण के ऊपरी कॉलम में ' एक ' के माध्यम से हवा के साथ समाधान दबाकर एक रबर की गेंद का उपयोग करके Formvar समाधान में डूबा हुआ है । इसका समाधान तीन तरह के टोंटी खोलकर और दबाव कम करने के लिए ' बी ' के जरिए हवा जारी करने से कॉलम से सूखा पड़ जाता है । (यामागुची और Adachi, अनुमति के साथ २०११19 से reproduced) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . पानी पर कांच स्लाइड से फिल्म रिलीज करने के लिए विधि । (क) काँच की स्लाइड पर फिल्म के चार किनारों को रेजर ब्लेड का प्रयोग करके नोच डाला जाता है. (ख) Formvar फिल्म के पानी पर बंद गिलास स्लाइड धीरे से कम कोण पर मंगाई है । (यामागुची और Adachi, अनुमति के साथ २०११19 से reproduced) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . Formvar एक एल्यूमीनियम रैक पर समर्थन फिल्म । (क) Formvar फिल्म एक एल्यूमीनियम रैक के साथ पानी से ऊपर स्कूप है । (ख) रैक का उपयोग होने तक desiccator में रखा जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . एक अल्ट्रासोनिक ट्रिमिंग ब्लेड और एक stereomicroscope के तहत एक उस्तरा ब्लेड के साथ नमूना ब्लॉक की trimming । (क) नमूना की उपस्थिति एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत नमूना ब्लॉक देख कर की पुष्टि की है । खंड में दिखाया गया आंकड़ा एक पैमाने के साथ जुड़े सूक्ष्मजीवों-कृमि chaeta (लंबाई में के बारे में १.७ मिमी) गहरे समुद्र12,14से एकत्र । (ख) स्टेज ट्रिमिंग । (ग) एक stereomicroscope की पूरी छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . microtome का उपयोग कर हीरा चाकू के साथ नमूना ब्लॉक के trimming. (क) बाएँ किनारे को काटने के लिए चित्रण. (ख) ब्लॉक चेहरा नमूना के बाएँ किनारे से लगभग १०० एनएम की स्थिति में कटौती कर रहा है. (ग) एक दर्पण (Mesa कट, एम) चाकू मंच पर रखा । (घ) नमूना सतह. ध्यान दें कि ऊपरी पक्ष और स्लिम भाग के निचले हिस्से चिकनी और पूरी तरह से समानांतर हैं । यह भी ध्यान रखें कि कंधे काटने की दिशा को चिह्नित करने के लिए काटा जाता है ( चित्र 8देखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 . नमूना सतह पर Neoprene उपचार । (क) आदेश में बिल्कुल मूल स्थिति पर वापस नमूना चक जगह के लिए, चक और microtome के चक धारक एक टेप के साथ चिह्नित और सीमा पर काट रहे हैं । (ख) पाश्चर पिपेट का उपयोग कर neoprene समाधान के साथ नमूना गीला । (ग) धारावाहिक वर्गों उठा के लिए तीन भट्ठा ग्रिड । संभाल ६० डिग्री (सी, सही) करने के लिए कटिबद्ध है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 . microtome और लकड़ी के armrest के प्लास्टिक कवर । ultrathin के दौरान airflow को रोकने के लिए प्लास्टिक कवर उपयोगी है । लकड़ी के armrest इस तरह के धारावाहिक वर्गों को पुनः प्राप्त करने के रूप में नाजुक काम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 . अनुभाग मोटाई की स्थापना और उचित मोटाई पर वर्गों प्राप्त करने. धारावाहिक वर्गों की संख्या 20 तक पहुंच गया है के बाद, अनुभाग मोटाई 10 एनएम के लिए सेट है । चूंकि microtome 10 एनएम-मोटी वर्गों में कटौती नहीं कर सकते, कोई नया अनुभाग प्रकट होता है, और पहले कटौती वर्गों चाकू धार से अलग हो जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 . प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त ultrathin अनुभागों का उदाहरण । नोट करें कि लगभग १.८ mm लंबे धारावाहिक के वर्गों के पांच समूहों को काटने के बाद पहले से ही अलग कर रहे हैं । इस विशेष मामले में, ultrathin वर्गों के केंद्र का रंग नमूना की उपस्थिति के कारण पीले है । अनुभाग के अंय भागों, जो नमूना शामिल नहीं है और केवल राल से मिलकर बनता है, रंग में चांदी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10 . ' अनुभाग-होल्डिंग लूप ' । (a) शीर्ष दृश्य (ऊपरी भाग) और निचला दृश्य (फ़ोटो का निचला भाग) लूप का । (ख) खंड-होल्डिंग लूप धारावाहिक वर्गों के तीसरे समूह को धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11 . धारावाहिक वर्गों की पुनः प्राप्ति । (क) ' जल-सतह-स्थापना पाश ' (WSRL). पाश की संभाल शाफ्ट, जो चल रहा है से हटाया जा सकता है । पाश भी ऊपर और नीचे ले जाया जा सकता है पेंच शीर्ष मोड़ । (ख) WSRL एक चुंबक द्वारा चाकू मंच पर तय की है । (c) (b) के करीब दृश्य. (घ) पाश के आरेख, पानी की सतह, वर्गों, और ग्रिड के दौरान पुनर्प्राप्ति (पक्ष देखें). Ultrathin वर्गों ठीक Ultrathin वर्गों के लिए समानांतर नंगे ग्रिड को कम करके भट्ठा ग्रिड के लिए प्राप्त किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12 . Formvar फिल्म पर ग्रिड रखकर. वर्गों होल्डिंग ग्रिड एल्यूमीनियम रैक पर Formvar फिल्म पर पानी की एक छोटी बूंद के साथ साथ रखा गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 13
चित्र 13 . धुंधला ट्यूब16। एक नाली ०.६ mm गहरी लंबी धुरी एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर के साथ किया जाता है । ग्रिड को उचित क्रम में नाली में रखा जाता है । ट्यूब के एक छोर कट (तीर सिर) को अपनी दिशा निशान है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 14
चित्र 14 . नमूना धारक में ग्रिड रखकर । (क) ग्रिडों को उचित क्रम में नमूना धारक में रखा जाता है. (ख) ग्रिड तो ' ग्रिड के साथ तय कर रहे है ' तरक्की कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 15
चित्र 15 . धारावाहिक खंड भट्ठा ग्रिड पर घुड़सवार । आंकड़ा एक ग्रिड पर घुड़सवार 18 से 25 वर्गों को दर्शाता है । प्रत्येक भट्ठा में संख्या पहले खंड से शुरू अनुक्रम संख्या से संकेत मिलता है । पहला खंड दूसरों की तुलना में मोटा है ( चित्र 8देखें) । ध्यान दें कि अनुभाग एक साथ संलग्न है और एक ही मोटाई है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 16
चित्र 16 . Parakaryon myojinensisके धारावाहिक वर्गों12। निचली बाईं ओर की संख्याएं पहले अनुभाग के सापेक्ष अनुक्रम को इंगित करती हैं । आंकड़ा ६७ पूरा वर्गों में से 12 से पता चलता है । इस सेल के लिए एक बड़े नग्न डीएनए फाइबर से मिलकर nucleoid पाया गया था, एक एकल nucleoid झिल्ली के साथ, और endosymbionts कि बैक्टीरिया के समान है, लेकिन कोई mitochondria । इस प्रकार, इस जीव को एक मध्यवर्ती जीवन prokaryote से यूकेरियोट12से विकसित रूप प्रतीत होता है । एन, nucleoid. यामागुची और Worman, २०१४ से reproduced । 14 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 17
चित्र 17 . ई कोलाईके धारावाहिक वर्गों9। निचली बाईं ओर की संख्याएं पहले अनुभाग के सापेक्ष अनुक्रम को इंगित करती हैं । यह आंकड़ा 12 पूर्ण वर्गों को दर्शाता है । इस कक्ष में २१,७०० ribosomes9शामिल पाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

विधि यहां प्रस्तुत कोई महंगा उपकरण की आवश्यकता है । यह केवल एक एल्यूमीनियम रैक (चित्रा 3) की आवश्यकता है, तीन भट्ठा ग्रिड (चित्रा 6c), खंड-होल्डिंग छोरों (चित्रा 10a), पानी की सतह स्थापना पाश (चित्रा 11a), और एक धुंधला ट्यूब (चित्रा 13). वहां वर्तमान विधि की कई विशेषताएं हैं । नमूना का बड़ा हिस्सा नमूना सतह और चाकू किनारे इतना है कि वे एक दूसरे के समानांतर चेहरा समायोजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । धारावाहिक वर्गों समूहों में काट रहे है बाल किस्में की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए वर्गों अलग जब भट्ठा ग्रिड पर धारावाहिक वर्गों के एक समूह को पुनः प्राप्त करने में कठिनाई से बचने के लिए । अनुभाग समूहों के क्रम को मिलाने से बचने के लिए एक ' सेक्शन-होल्डिंग लूप ' का प्रयोग किया जाता है । एक ' पानी की सतह स्थापना पाश ' वर्गों के पानी के शीर्ष पर तैनात है और है कि वे पहले ग्रिड को छूने के लिए सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ताकि उन्हें ग्रिड पर वांछित स्थिति में जगह के लिए । एक एल्यूमीनियम रैक पर Formvar समर्थन फिल्म यह आसान ग्रिड पर वर्गों को ठीक करने के लिए और समर्थन फिल्म के wrinkling से बचने के लिए बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक दाग ट्यूब गलती से चिमटी के साथ समर्थन फिल्मों को तोड़ने से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

हाल ही में, एक स्वत: टेप-संग्रह ultramicrotome25 विकसित किया गया इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) इमेजिंग-अपारदर्शी प्लास्टिक टेप पर स्कैनिंग के लिए स्वचालित रूप से वर्गों को इकट्ठा । इस विधि से मज़बूती से हजारों ultrathin वर्गों में कटौती कर सकते हैं26, जो वर्तमान विधि द्वारा संभव नहीं है । इसके अलावा, सीरियल ब्लॉक चेहरा (SBF) 27 और फोकस आयन बीम (मिथ्या)-SEM28 कोशिकाओं और पशुओं के ऊतकों की 3 डी जानकारी एकत्र करने के लिए उपयोग किया जाता है । इन तरीकों में, एक हीरे की चाकू या ध्यान आयन बीम के साथ अनुभाग SEM माइक्रोस्कोप के अंदर एकीकृत है, और एक पूरी तरह से स्वचालित तरीके से है कि कोई विशेष तकनीक की आवश्यकता है में किया जाता है । हालांकि इन तरीकों उपयोगी होते हैं, तंत्र इतना महंगा है कि नहीं कई संस्थानों इन मशीनों को खरीदते हैं । इसके अलावा, के बाद से इन तरीकों फोटो वर्गों को SEM रोजगार, माइक्रोग्राफ के संकल्प वर्तमान विधि है कि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) को रोजगार के लिए हीन है । इन विधियों व्यक्तिगत ribosome कणों, microtubules, microfilaments, और डीएनए फाइबर वर्तमान में हल नहीं कर सकता ।

सूक्ष्मजीवों और अज्ञात सूक्ष्मजीवों के ultrastructural अध्ययन के लिए structome विश्लेषण के लिए, यह सेल दीवार, प्लाज्मा झिल्ली, mitochondria, नाभिक, परमाणु झिल्ली, endoplasmic जालिका के रूप में कोशिकाओं और सेल घटकों का पालन करने के लिए आवश्यक है, chloroplasts, plastids, Golgi तंत्र, ribosomes, और उच्च संकल्प पर रेशा तत्वों । सीरियल ultrathin वर्गों के उनि अवलोकन तीन आयामों में इस तरह के विश्लेषण संभव बनाने के लिए कुछ तरीकों में से एक है. क्योंकि ultrathin वर्गों इस विधि में अवलोकन के बाद रहते हैं, एक ही क्षेत्र में बार मनाया जा सकता है; यह SBF या मिथ्या-SEM में संभव नहीं है, के बाद से मनाया क्षेत्र अवलोकन के बाद खो दिया है । इस सुविधा का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है गहरे समुद्र सूक्ष्मजीवों जहां यह पहले कम आवर्धन पर दिलचस्प जीवों खोज करने के लिए आवश्यक है, और फिर उच्च आवर्धन पर लक्ष्य जीव पर चित्र प्रश्नपत्र ले ।

अंत में, धारावाहिक ultrathin अनुभाग विधि अब वर्तमान अध्ययन, जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में उच्च संकल्प पर सूक्ष्मजीवों के 3d ultrastructual अध्ययन के लिए आवश्यक है द्वारा एक आसान, सस्ती और relaible तरीके से किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम ईमानदारी से अपने बहुमूल्य सुझाव और चर्चा के लिए Shigeo Kita धंयवाद । हम भी धंयवाद जॉन और पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए सुमिरे Eckstein ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar making apparatus Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 652 W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide Matsunami Co. Ltd., Osaka - 76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 658 W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo - SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo - SM-LW 61 Ji
Trimming stage Sunmag Co.Ltd., Tokyo - Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage Sunmag Co.Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 5240 EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming Diatome Co. Ltd., Switzerland - 45°
Diamond knife for ultrathin sectioning Diatome Co. Ltd., Switzerland - 45°
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna - Ultracut S
Mesa cut Leica Microsystems, Vienna - Mirror
0.5% Neoprene W solution Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 605
Special 3-slit nickel grid Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2458 Refer to this paper
Special 3-slit copper grid Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2459 Refer to this paper
Section-holding loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 526 Refer to this paper
Water-surface-raising loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 527 Refer to this paper
Staining tube Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 463 Refer to this paper
Multi-specimen holder JEOL Co. Ltd., Tokyo - EM-11170
JEM-1400 JEOL Co. Ltd., Tokyo - Transmission electron microscope

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References

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Yamaguchi, M., Chibana, H. A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56235, doi:10.3791/56235 (2018).

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