Summary
Este estudo apresenta procedimentos confiáveis e fácil de obtenção de seções ultra-finas seriais de um microorganismo sem equipamentos caros em microscopia eletrônica de transmissão.
Abstract
Observação de células e componentes da célula em três dimensões em alta ampliação em microscopia eletrônica de transmissão exige a preparação de seções ultra-finas seriais do espécime. Ainda preparar seções ultra-finas seriais é considerado muito difícil, é bastante fácil... se for usado o método adequado. Neste trabalho, mostramos um procedimento passo a passo para a obtenção de segurança seriais seções ultra-finas de microorganismos. Os pontos-chave deste método são: 1) para usar a grande parte da amostra e ajustar a borda de superfície e faca de amostra, de modo que eles são paralelos uns aos outros; 2) para cortar seções seriais em grupos e evitar a dificuldade em separar seções usando um par de fios de cabelo ao recuperar um grupo de seções seriais para as grades de fenda; 3) usar um 'loop' seção-exploração e evitar mistura-se a ordem dos grupos seção; 4) para usar um loop de' água de superfície-sensibilização' e certifique-se que as seções são posicionadas no ápice da água e que tocam a grade em primeiro lugar, a fim de colocá-los na posição desejada nas grades; 5) para usar o suporte de filme em um rack de alumínio e torná-lo mais fácil para recuperar as seções sobre as grades e evitar enrugar-se do filme suporte; e 6) para usar um tubo de coloração e evitar quebrar acidentalmente os filmes de apoio com uma pinça. Este novo método permite a obtenção de seções ultra-finas seriais sem dificuldade. O método torna possível analisar estruturas celulares dos microorganismos em alta resolução em 3D, que não pode ser alcançado usando o método de ultramicrotome de fita de coleta automática e bloco-rosto serial ou microscópio eletrônico de varredura de feixe de íon focalizado.
Introduction
Técnica de corte apropriada serial ultrafino é indispensável para o estudo de células e componentes celulares tridimensionalmente em nível microscópico elétrons. Temos estudado a dinâmica do corpo de polo do eixo no ciclo celular de células de levedura e revelou alterações morfológicas da sua ultra-estrutura durante o ciclo celular e o tempo de duplicação1,2,3, 4,5. Em 2006, cunhou uma nova palavra 'structome' combinando 'estrutura' e '-ome' e definiu-o como o 'informações quantitativas e tridimensional estrutural de uma célula inteira em nível microscópico elétrons' 6,7.
Pela análise de structome, que requer técnica de seccionamento serial ultrafino, verificou-se que uma célula de levedura Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis tinha cerca de 200.000 ribossomos7,8, um Escherichia coli célula tinha 26.000 ribossomas9, uma célula de Mycobacterium tuberculosis tinha 1.700 ribossomas10 e bactérias de espiral Myojin tinham apenas 300 ribossomas11. Esta informação é útil na estimativa não somente a taxa de crescimento em cada organismo, mas também na identificação das espécies9.
Análises posteriores, structome levado à descoberta de um novo organismo; Parakaryon myojinensis foi encontrado no fundo do mar na costa do Japão, cuja estrutura de célula era um intermediário entre aqueles de procariotas e eucariotas12,13,14,15. Presentemente, técnica de corte ultrafino serial é considerada tão difícil que levaria muito tempo para dominar. Neste estudo, nós desenvolvemos um método confiável, no qual qualquer um pode executar seccionamento ultrafinos serial sem dificuldade.
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Protocol
Nota: As amostras utilizadas neste estudo foram microorganismos, rapidamente congelados com propano em nitrogênio líquido, congelam substituídos em acetona contendo 2% de tetróxido de ósmio e incorporado em epóxi resina1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. preparação do filme de apoio (Figura 1-3)
Nota: Filme de suporte prateado Formvar é preparado usando o método de molde-em-vidro19.
- Adicionar 100 mL de 1,5% Formvar no dicloreto de etileno, para um aparelho de fabricação de Formvar (Figura 1). Mergulhe metade de uma lâmina de vidro (76 x 26 x 1,3 mm) em solução de Formvar na coluna superior do aparelho, pressionando a solução com o ar através de 'um' usando uma bola de borracha19.
- Drene a solução da coluna abrindo a torneira de três vias e liberando o ar através de 'b' para reduzir a pressão. Retire a lâmina de vidro do aparelho e seco no ar para formar uma película na superfície do vidro slide. Use uma lâmpada de incandescência para acelerar a secagem do filme Formvar.
- Depois de raspar as quatro bordas do filme sobre a lâmina de vidro com uma lâmina de barbear (Figura 2a) e respirando para o slide para facilitar a separação do filme do slide20, flutuam o filme na água por imersão da lâmina de vidro para o água lentamente em um ângulo horizontal baixo (cerca de 10°, Figura 2b).
- Colher-se o filme de Formvar da água usando um rack de alumínio (30 x 25 x 3 mm) com furos (4 mm de diâmetro) (Figura 3a). Manter o rack com o filme de Formvar num exsicador até à utilização (Figura 3b).
2. corte o bloco de amostra com uma lâmina de corte ultra-sônico e uma lâmina de barbear 21 sob um estereomicroscópio (Figura 4)
- Certifique-se de que existem células na superfície do bloco, observando a ponta do bloco com um microscópio de luz (figura 4a).
- O bloco de amostra no mandril (suporte de bloco) e montagem do mandril em um palco de aparamento21 (figura 4b). Nesta fase de aparamento tem um mecanismo de iluminação na parte de trás do espécime.
- Apare o bloco para um tamanho de 0,7 x 1,0 mm (figuras 4C, 5D). Uma vez que a resina epóxi é muito difícil, apare os blocos primeiro usando uma lâmina de corte ultra-sônico. A lâmina de corte ultra-sônico é uma máquina recém introduzida, e os blocos são facilmente cortados. Então corte o bloco ainda mais com uma lâmina de barbear. Corte um ombro para marcar a direção de corte (consulte a Figura 5 d, Figura 8).
3. corte o bloco de amostra com faca de diamante usando o micrótomo (Figura 5)
- Defina o bloco de amostra chuck no porta-amostra do ultramicrotome. Coloque o espécime 90° no sentido anti-horário contra a posição real quando ultrafinos de seccionamento serial é realizada (ver Figura 5D).
- A superfície do bloco de corte com uma faca de corte de diamante (ver Figura 5 d). Definir a navalha de diamante paralelas na face do bloco de amostra e corte a quantidade mínima da superfície de amostra para não perder qualquer espécime (Figura 5D).
Nota: Este passo é feito para suavizar a superfície da amostra. A parte da superfície do espécime da parte magro permanece intacta (por conseguinte, esta parte não brilha como um espelho, Figura 5D), para não perder nenhuma parte da amostra para seccionamento serial. Isto é porque o espécime é exposto na superfície do bloco. - Coloque um espelho (corte de Mesa, M) no palco faca para monitorar o corte do bloco de amostra (Figura 5C).
- Corte a borda esquerda (isso se torna o lado superior, Figura 5D, da amostra no seccionamento serial) do bloco usando faca de aparar girando o palco faca 30 ° para a esquerda (Figura 5a).
- Corte o rosto de bloco em cerca de 100 µm da borda esquerda da amostra (este torna-se o lado inferior da amostra no seccionamento serial, Figura 5D), rodando o palco faca 30 ° para a direita (Figura 5b).
Nota: As seções seriais serão cortadas da parte magro da amostra de cerca de 90 nm x cerca de 1 mm de tamanho. A grande parte será usada para ajustar a superfície da amostra e a navalha, tal que eles são paralelos. Depois de ajustar a superfície do espécime para ser paralela à borda da faca, o grande parte será removida com uma lâmina de barbear. Cortando os lados superiores e inferiores da amostra usando o micrótomo, ambos os lados da amostra se tornar suave e exatamente paralelos uns aos outros (Figura 5D), que é necessário para obter as seções de fita reta e ininterrupta.
4. ajustar a borda de superfície e faca de espécime para que eles enfrentam paralelo a outro 21
- Remover a faca de corte e rodar o bloco de amostra 90° no sentido horário.
- Defina uma faca de corte ultrafino para a fase de faca.
- Ajuste a superfície da amostra e a navalha para que eles enfrentam paralelos uns aos outros usando a grande parte da superfície do espécime.
Nota: A grande parte da amostra é usada para o ajuste porque a face de corte de seccionamento serial é tão pequena, que dificulta a ajustar a borda de superfície e faca de amostra usando esta parte só, especialmente no sentido vertical. Assim, usando a grande parte da amostra facilita o ajuste.
5. espalhar a solução do neopreno do bloco de amostra (Figura 6)
- Para colocar o chuck espécime em exatamente a mesma posição que a posição original, aplique a fita sobre o chuck e o chuck titular do micrótomo e cortar no limite do (Figura 6a).
- Retire o espécime chuck do micrótomo e colocá-la sob o microscópio estereoscópico (Figura 6b). Corte a grande parte da amostra com uma lâmina de barbear, deixando a parte de magro, do qual seriais seções serão obtidas.
- Com uma pipeta Pasteur, solte cerca de 1 µ l 0.5% do neopreno solução (Figura 6b) para a amostra a ser usada para o seccionamento serial, para fazer o adesivo de lados de seção. Cobrir o espécime com solução de neopreno. Absorva a solução de neopreno excesso imediatamente com um pedaço de papel de filtro colocado perto da amostra. Uma fita de seções é essencial para tirar fotos das seções de celular serial e cola neopreno é muito útil para furar as seções junto.
- Preparar 3 fenda grades (tamanhos de fendas: médio, 0,4 mm x 2,2 mm, ambos os lados 0,2 x 2,2 mm) (Figura 6C) para pegar seriais seções dobrando o punho das grades para 60 °, tratando as grades com solução de neoprene de 0,5% e fazendo as grades hidrofílico por de descarga do fulgor22.
6. fazer seções seriais (Figura 7-9)
- Lugar do bloco de amostra chuck volta em micrótomo na mesma posição como 5.1 (Figura 6a), alinhando as peças gravadas. Isso mantém a face do bloco e o fio da navalha perfeitamente paralelos uns aos outros. Depois trago a faca perto da amostra.
- Encha o barco de faca com água.
- Cubra o micrótomo com uma tampa de plástico para impedir o fluxo de ar (Figura 7).
Nota: O fluxo de ar durante o seccionamento ultrafinos e recuperação das seções, muitas vezes causar problemas. A tampa de plástico tem três buracos: um buraco é para as lentes do binóculos, e outros dois furos são para os braços permitir a operação enquanto a tampa estiver ligada. O braço de madeira é usado para a colocação de braços enquanto fazia um trabalho delicado, como recuperar seriais seções com grades. O braço de madeira é colocado em tabelas diferentes da tabela micrótomo (Figura 7, setas), para não transmitir a vibração das mãos do operador para o micrótomo. - Comece a cortar a amostra em espessura de corte de 200 nm (Figura 8). Configuração em espessura de 200 nm poupará tempo em trazer a faca para a superfície da amostra.
- Após a primeira seção é cortada, definir a espessura de corte de 70 nm (Figura 8).
- Quando o número de seções seriais atinge 20 (precisamente falando, depois os alcances de fita cerca de 1,8 mm; o número de seções varia de acordo com a largura das seções), definir a espessura de corte de 10 nm (Figura 8), continuando a cortar.
Nota: Desde o micrótomo não pode cortar 10 nm de espessura seções, nenhuma nova seção aparece, e as seções previamente cortadas se separaram da borda de faca. É importante obter grupos de seções separadas (Figura 9) para pegar seriais seções para evitar a dificuldade em separar seções manualmente usando um par de fios de cabelo. Desde o campo de visão no microscópio de elétron da transmissão é de 2,0 mm, seções devem ser no máximo 1,8 mm de comprimento. - Definir a espessura de corte de 60 nm (Figura 8). Isto produzirá 70 seções nm (Figura 8), porque a máquina irá adicionar a espessura de nm 10 anterior.
- Definir a espessura de corte para 70 nm (Figura 8) e continue o corte até 1.8 mm-longo seções são obtidas.
- Repita 6,6-6,8 até cinco seções longas de 1,8 mm são obtidas (Figura 9). Geralmente fazemos cinco grupos de seção, desde há cinco suportes de amostra no microscópio eletrônico de transmissão disponíveis em nosso laboratório, mas cinco não é o limite.
7. pegar seriais seções (Figura 10-12)
- Coloque a 'seção-exploração loop'23 (diâmetro interno do loop: 5,0 mm) (Figura 10a) sobre o terceiro grupo de seção (Figura 10b).
Nota: É necessário recuperar as seções na ordem de sua corte para tirar fotos na ordem correta. No entanto, desde há cinco grupos de seção do barco de faca, isso muitas vezes Obtém confundindo quais os grupos que são. Colocando o loop no terceiro grupo, torna-se claro que os dois grupos perto do operador são o primeiro e o segundo e os dois distantes do operador são os grupos IV e v (Figura 10b). Isto impedirá que mistura-se a ordem. - Coloque a ''água de superfície-sensibilização loop23 (WSRL, diâmetro interno do loop: 4,0 mm) (Figura 11a) na fase de faca (Figura 11b). O WSRL vai ficar firmemente no palco faca porque é equipado com um imã na parte inferior.
- Coloque o loop do WSRL acima as seções seriais movendo seu eixo e o punho. Baixe o loop do WSRL na superfície da água para que o laço circunda as seções.
- Empurre o loop através do parafuso para baixo para que a superfície da água irá disparar pela tensão de superfície (figuras 11-c-d). Mover a seção para o centro do laço, posicioná-lo no ápice da água e ajustar a direção da seção usando um fio de cabelo21.
- Buscar grupos de seção de tocá-lo com uma fenda-grade nua, que é realizada por uma pinça e mantida paralelo à superfície da água (Figura 11 d). É importante para as seções tocar na grelha em primeiro lugar, não a água, colocar seções precisamente no centro da grade (Figura 11 d).
- Coloque as grelhas com seções juntamente com uma pequena gota de água sobre o Formvar suporte filme16 (Figura 12) e remover o excesso de água usando papel de filtro.
Nota: Enrugamento do filme suporte é muitas vezes um problema quando seções são captadas usando uma grade com suporte de filme, porque a membrana (seções) toca a membrana (filme de apoio) diretamente. O problema de ficar com rugas no filme de apoio é significativamente reduzido, colocando uma grade de seção-rolamento juntamente com uma pequena gota de água sobre o suporte de Formvar filme16.
8. coloração de seções16,24 (Figura 13)
- Após as seções são completamente seco, rasgar o filme de Formvar ao redor das redes e retire as grades as seções do rolamento.
- Definir as grades na ranhura do tubo coloração16 na ordem correta (Figura 13) e mancha seções com uranilo acetato e chumbo citrato24.
Nota: Há um sulco de 0,6 mm de profundidade ao longo do eixo do tubo de corte com uma lâmina de barbear. O tubo é útil para impedir a quebra acidental de suporte filmes quando usando uma pinça, uma vez que a manipulação direta de grades não é necessária durante o processo de coloração e lavagem16.
9. observação das seções seriais (Figura 14)
- Defina as 5 grades no porta-amostra multi na ordem correta (Figura 14a), orientando o eixo longo da grade fenda perpendicular ao eixo de suporte do espécime. As alças (setas) das grades não tem que ser cortado, porque os 'grade-fixadores' não tocará as alças.
- Fixar as grelhas com 'grade-fixadores' (Figura 14b) e introduza o suporte de amostra o microscópio eletrônico de transmissão.
Nota: Muitas vezes é útil tomar baixa ampliação de imagens de todas as seções de célula (Figura 15) para achar interessante microorganismos ou células em bom estado com nenhuma contaminação e com boa fixação, antes de tirar fotos da célula alvo. - Tire fotos das células alvo em todas as seções de célula em alta ampliação.
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Representative Results
Neste protocolo, fenda três grades foram usados para pegar seriais seções. As grades são feitas de níquel ou cobre. As seções seriais são colocadas na ranhura do meio. As fendas em ambos os lados são necessárias para ver as seções quando pegá-los com a grade. Para manter as grades paralelas com as seções seriais quando pegá-los com uma pinça (Figura 11 d), o punho é dobrado (Figura 6C, direita). Uma pequena alça é vantajosa para evitar a flexão da parte principal da grade, que provoca sérios problemas em pegar seções, e para evitar derrubando as seções durante a coloração. Esta grade tem vantagens sobre a grade do único-furo convencionais 2,0 x 1,0 mm. Ou seja, as seções são suportadas diretamente por duas barras de metal afastados de 0,4 mm (inferior a 1,0 mm) e pelo apoio Formvar filme em uma grade de três-fenda, enquanto as seções são suportadas apenas pelo filme de suporte em uma grade convencional do único-furo. Deriva do espécime, portanto, pode ser prevenida em fotografar em alta ampliação usando uma grade de três-fenda.
Figura 15 mostra uma visão de baixa ampliação de cinco grades que carregam seções seriais. Desde que cada seção fura junto, é fácil encontrar a mesma cela na secção seguinte, mesmo a maior ampliação. Figura 16 e 17 são exemplos de imagens seriais de seções de célula. Porque seções firmemente são suportadas em redes de 3-fenda, fotos em alta ampliação (x 50,000) são facilmente tomadas sem deriva do espécime. Fibras de DNA 2 nm de diâmetro foram fotografadas nesses estudos9,12.
Figura 1 . Formvar suporte cinematográfico aparelhos. Metade da lâmina de vidro é mergulhado em solução de Formvar na coluna superior do aparelho, pressionando a solução com o ar através de 'um' usando uma bola de borracha. A solução é drenada da coluna abrindo a torneira de três vias e liberando o ar através de 'b' para reduzir a pressão. (Reproduzido do Yamaguchi e Adachi, 201119 com permissão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Método para liberar o filme do vidro deslizar na água. (a) as quatro bordas do filme sobre a lâmina de vidro são raspadas usando a lâmina de barbear. (b) Formvar filme é flutuou fora na água diminuindo a lâmina de vidro lentamente em um ângulo baixo. (Reproduzido do Yamaguchi e Adachi, 201119 com permissão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Filme de apoio Formvar em um rack de alumínio. o filme de Formvar é apanhado da água com um rack de alumínio. (b) o rack é mantido no exsicador até o uso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Aparamento do bloco de amostra com uma lâmina de corte ultra-sônico e uma lâmina de barbear sob um estereomicroscópio. (a) a presença da amostra é confirmada pela observação do bloco de amostra sob um microscópio de luz. O bloco mostrado em microorganismos figura contida associados com um chaeta escala-worm (cerca de 1,7 mm de comprimento) coletada de mar profundo12,14. (b) aparamento de palco. (c) toda a imagem de um estereomicroscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Aparamento do bloco de amostra com faca de diamante utilizando micrótomo. (a) ilustração para a borda esquerda do corte. (b) a face do bloco é cortada em uma posição de aproximadamente 100 nm da borda esquerda do espécime. (c) um espelho (corte de Mesa, M) colocado no palco a faca. (d) superfície do espécime. Observe que o lado superior e o lado inferior da parte magro são suave e perfeitamente paralelas. Observe também que o ombro é cortado para marcar a direção de corte (ver Figura 8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Tratamento de neopreno na superfície do espécime. (a) a fim de colocar o espécime chuck volta em exatamente na posição original, o chuck e o chuck titular do micrótomo, são marcados com uma fita e corte no limite do. (b) molhando a amostra com solução de neopreno com pipeta Pasteur. (c) fenda três grades para pegar seriais seções. O punho é dobrado para 60 graus (c, certo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 . Tampa plástica do micrótomo e braço de madeira. a tampa de plástico é útil para evitar o fluxo de ar durante o corte ultrafinos. O braço de madeira é usado para fazer trabalho delicado como recuperar seriais seções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 . Definindo a espessura de corte e obtenção de secções na espessura adequada. Depois que o número de seções seriais atingiu 20, espessura de corte é definida como 10 nm. Desde o micrótomo não pode cortar 10 nm de espessura seções, nenhuma nova seção aparece, e as seções previamente cortadas se separaram da borda de faca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 . Exemplo de seções ultra-finas obtidos através do protocolo. Note que os cinco grupos de seções seriais de cerca de 1,8 mm já são separados após o corte. Neste caso, a cor do centro das seções ultrathin é amarelada devido à presença do espécime. As outras partes da seção, que não conterá a amostra e consistem de resina só, são prata na cor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10 . 'Seção-exploração 'loop. (a) vista superior (parte superior) e vista inferior (parte de baixo da foto) do loop. (b) retenção de seção loop é usado para segurar o terceiro grupo de seções seriais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11 . Recuperação de seções seriais. (a) 'água de superfície-sensibilização loop' (WSRL). A alça do laço pode ser removida do eixo, que é móvel. O loop também pode ser movido acima e para baixo, girando o parafuso superior. (b) o WSRL é fixado na fase de faca por um ímã. (c) ver perto de (b). (d) diagrama de laço, superfície da água, seções e grade durante a recuperação (vista lateral). Seções ultra-finas podem ser recuperadas precisamente à grade de fenda abaixando o paralelo de grade próprias para as seções ultra-finas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12 . Colocação da grelha no filme Formvar. A grade segurando as seções é colocada junto com uma pequena gota de água sobre o filme de Formvar na prateleira de alumínio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13 . Tubo de coloração16. Um sulco de 0,6 mm de profundidade é feito ao longo do eixo longo, usando uma lâmina de barbear. Eixos são colocadas no sulco na ordem correta. Uma das extremidades do tubo é cortada (cabeça de seta) para marcar a sua direção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 14 . Colocação das grelhas no porta-amostra. (a) os eixos são colocadas no suporte de amostra na ordem correta. (b) as grades são então fixo com 'grade-fixadores'. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 15 . Seções seriais montagem em grades de fenda. a figura mostra seções de 18 a 25, montadas em uma grade. Os números em cada fenda indicam o início de número de sequência da primeira seção. A primeira seção é mais grossa do que os outros (ver Figura 8). Observe que as seções são ligadas em conjunto e tem a mesma espessura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 16 . Seriais seções de Parakaryon myojinensis12. Os números no canto inferior esquerdo indicam a sequência em relação à primeira seção. A figura mostra a 12 de 67 seções completas. Esta célula foi encontrada para ter um grande nucleoide, constituído por fibras de DNA nus, com uma membrana única nucleoide e endossimbiontes que se assemelham a bactérias, mas sem mitocôndrias. Assim, este organismo parece ser uma forma de vida intermediária, evoluindo de procarionte-Eukaryota12. N, nucleoide. Reproduzido de Yamaguchi e Worman, 2014. 14 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 17 . Seriais seções de Escherichia coli9. Os números no canto inferior esquerdo indicam a sequência em relação à primeira seção. A figura mostra 12 seções completas. Esta célula foi encontrada para conter 21.700 ribossomas9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método apresentado aqui não requer nenhum equipamento caro. Requer apenas um rack de alumínio (Figura 3), grades de três-fenda (Figura 6C), seção-exploração loops (Figura 10a), loop de água de superfície-sensibilização (Figura 11a) e um tubo de coloração (Figura 13). Há muitas características do presente método. A grande parte da amostra é usada para ajustar a borda de superfície e faca de espécime para que eles enfrentam paralelos uns aos outros. Cortam-se em grupos para evitar a dificuldade em separar seções usando um par de fios de cabelo ao recuperar um grupo de seções seriais para as grades de fenda seções seriais. Um 'loop' seção-exploração é usado para evitar a mistura-se a ordem dos grupos de seção. Um água de superfície-sensibilização 'loop' ' é usado para garantir que as seções são posicionadas no ápice da água e que tocam a grade em primeiro lugar, a fim de colocá-los na posição desejada nas grades. Formvar suporte de filme em um rack de alumínio é usada para tornar mais fácil para recuperar as seções sobre as grades e evitar enrugar-se do suporte de filme. Um tubo de coloração é usado para evitar acidentalmente quebrar os filmes de apoio com uma pinça.
Recentemente, um ultramicrotome automático de fita de coleta foi desenvolvidos25 para recolher seções automaticamente por microscopia eletrônica (SEM) de imagem em fitas de plástico de elétron-opaco. Esse método pode confiantemente corte milhares de seções ultra-finas26, que não é possível pelo presente método. Além disso, bloco serial cara (SBF) 27 e foco feixes de iões (FIB)-SEM28 são usados para coletar informações 3D de células e tecidos dos animais. Em um desses métodos, o corte com um feixe de iões de faca ou foco de diamante é integrado dentro do microscópio SEM e realizada de forma totalmente automática que não requer nenhuma técnica especial. Embora esses métodos são úteis, o aparelho é tão caro que não muitas instituições compram estas máquinas. Também, desde que estes métodos empregam SEM seções de fotografia, resolução das micrografias é inferior do presente método que emprega a microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Esses métodos não é possível resolver as partículas individuais Ribossoma, microtúbulos, microfilamentos e fibras de DNA neste momento.
Para análise de structome de microorganismos e estudo ultraestrutural de microorganismos desconhecidos, é necessário observar células e componentes celulares tais como parede celular, membrana plasmática, mitocôndrias, núcleo, membrana nuclear, retículo endoplasmático, cloroplastos, plastídeos, complexo de Golgi, ribossomos e elementos filamentosos em alta resolução. Observação TEM de seções ultra-finas seriais é um dos poucos métodos para viabilizar tal análise em três dimensões. Porque seções ultra-finas permanecem após observação neste método, a mesma área pode ser observada repetidamente; Isto não é possível em SBF ou FIB-SEM, desde que a área observada é perdida após a observação. Esse recurso é importante para o estudo de microorganismos em alto mar, onde é necessário pesquisar organismos interessantes na ampliação baixa primeiro, e depois, tirar fotos em série no organismo alvo em alta ampliação.
Em conclusão, método de seccionamento ultrafino serial pode agora ser executado em um fácil, barato, e premiamos caminho pelo presente estudo, que é essencial para 3D ultrastructual estudo de microorganismos em alta resolução em microscopia eletrônica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente Shigeo Kita, por suas valiosas sugestões e discussão. Agradecemos também a John e Sumire Eckstein para sua leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
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