Summary
Bu çalışmada bir mikroorganizma transmisyon elektron mikroskobu içinde pahalı aletler olmadan seri ultrathin bölümleri elde etmek için güvenilir ve kolay yordamları sunar.
Abstract
Hücreleri ve hücre bileşenleri transmisyon elektron mikroskobu yüksek büyütmede üç boyutlu gözlem ultrathin bölümlerini seri: numune hazırlama gerektirir. Seri ultrathin bölümler hazırlama çok zor olarak kabul edilir, uygun yöntemi kullanılırsa oldukça kolay olsa da. Bu yazıda, güvenli bir şekilde mikroorganizmaların seri ultrathin bölümler elde etmek için bir adım adım yordam göstereceğiz. Bu yöntem anahtar noktaları vardır: 1) numune büyük bölümünü kullanmak ve böylece birbirine; paralel numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlamak için 2) seri grupları bölümlerde kesme ve saç iplikçiklerinin dibinde bir çift yarık Izgaralar üzerine seri bölümler bir grup alınırken kullanma bölümlerine ayırmak zorluk önlemek için; 3) bir 'bölüm-holding loop' kullanın ve bölüm grupları sipariş kadar karıştırma önlemek için; 4) bölümleri su tepe üzerinde konumlandırılmış ve ızgara önce onları Izgaralar üzerinde istediğiniz konuma yerleştirmek için dokundukları olduğunu emin olun ve bir 'su yüzeyi yükselterek loop' kullanmak için; 5) destek film bir alüminyum raf kullanabilir ve Izgaralar bölümleri kurtarmak için ve destek film kırışıklıklar önlemek için kolaylaştırmak için; ve 6) Boyama bir tüp kullanın ve destek filmleri cımbızla yanlışlıkla kesmemek için. Bu yeni yöntem zorluk olmadan seri ultrathin bölümler elde sağlar. Yönteminin Otomatik teyp toplama ultramicrotome yöntemi ve seri blok-yüz veya elektron mikroskobu tarama odaklı iyon ışını kullanarak elde edilemez 3D yüksek çözünürlükte mikroorganizmaların hücre yapıları analiz olanak sağlar.
Introduction
Hücreleri ve hücre bileşenleri üç boyutlu en elektron mikroskobik düzeyde çalışmaya uygun seri ultrathin parça tekniği vazgeçilmezdir. Biz Milli direk vücutta hücre döngüsünün Maya hücreleri dinamikleri okudu ve hücre döngüsü ve çoğaltma1,2,3, saat onların ultrastructure morfolojik değişiklikler ortaya 4,5. 2006'da, biz 'structure' birleştirerek yeni bir kelime 'structome' icat ve '-ome' ve 'nicel ve üç boyutlu yapısal bilgi elektron mikroskobik düzeyde bütün bir hücrenin' 6,7olarak tanımlanır.
Seri ultrathin parça tekniği gerektiren structome analiz, bu Maya hücre Saccharomyces cerevisiae ve Exophiala kemiğin yaklaşık 200.000 ribozomlara7,8, bir vardı bulundu Escherichia coli hücre 26.000 ribozomlara9, Mycobacterium tüberküloz hücre 1,700 ribozomlara10 vardı ve Myojin sarmal bakterilerin vardı sadece 300 ribozomlara11. Bu bilgiler sadece büyüme oranı her organizma, aynı zamanda tür9tanımlaması tahmininde yararlı olur.
Ayrıca, structome analiz yeni bir organizma keşfi yol açtı; Kapalı hücre yapısı vardı bir ara bu12,13,14,15prokaryot ve Ökaryotlar arasında Japonya sahillerine, derin deniz Parakaryon myojinensis bulundu. Şu anda, seri ultrathin parça tekniği master için uzun bir süre süreceğini zor olarak kabul edilir. Bu çalışmada, hangi içinde kimse seri ultrathin zorlanmadan kesit yerine güvenilir bir yöntem geliştirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu çalışmada kullanılan numuneler mikroorganizmaların hızla sıvı azot içinde propanla donmuş, Don % 2 Osmiyum tetroxide içeren aseton içinde değiştirilen ve epoksi reçine1,2,3gömülü olduğunu, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. destek film (Resim 1-3) hazırlanması
Not: Gümüş renkli Formvar destek film19cam üzerinde döküm yöntemi kullanılarak hazırlanır.
- %1,5 100 mL ekleyin Formvar etilen ve için bir Formvar yapma aparatı (şekil 1). Yarım saniyeden Formvar çözüm cihazları üst sütununda bir cam slayt (76 x 26 x 1,3 mm) 'a' bir kauçuk top19kullanarak üzerinden hava ile çözüm basarak daldırma.
- Üçlü stopcock açarak ve basıncı azaltmak için 'b' havada serbest sütun çözümden drenaj. Gelen ve kuru havada cam kaymak dışarı cam slayt için bir film yüzeyinde biçiminde. Bir akkor lamba Formvar film kurutma hızlandırmak için kullanın.
- Bir tıraş bıçağı (şekil 2a) ile cam slaytta filmin dört kenarları kapalı kazıma ve film ayrılması slayt20, kolaylaştırmak için slayda nefes su filmde kapalı cam kaymak içine çeker tarafından float sonra yavaş yavaş bir düşük yatay açı (yaklaşık 10 °, şekil 2b) su.
- (Çapı 4 mm) delikli alüminyum raf (30 x 25 x 3 mm) kullanarak su Formvar filmden kaldırsanız (şekil 3a). Formvar film ile raf bir desiccator kadar kullanmak (şekil 3b) tutmak.
2. numune blok bir ultrasonik kesme bıçağı ve bir stereomicroscope (şekil 4) altında bir jilet 21 ile düzeltme
- Hücre bloğu yüzeyinde bir ışık mikroskobu ile (şekil 4a) blok ucu gözlemleyerek emin olun.
- Chuck (blok sahibi) numune bloğunda mount ve chuck bir düzeltme sahne21 tarihinde (şekil 4b) bağlayabilirsiniz. Bu düzeltme aşamasında numune arkasından bir aydınlatma mekanizması vardır.
- Bir boyut için blok 0.7 mm x 1.0 mm (rakamlar 4 c, 5 d) kırpın. Epoksi reçine çok zor olduğundan, ilk bir ultrasonik kesme bıçağı kullanarak blok döşeme. Ultrasonik kesme bıçağı Yeni tanıtılan bir makinedir ve bloklar kolayca atılır. O zaman daha fazla bir tıraş bıçağı ile blok döşeme. (Bkz: şekil 5 d, şekil 8) kesme doğrultusunda işaretlemek için bir omuz kesti.
3. microtome (şekil 5) kullanarak elmas bıçak ile numune caddenin kırparak
- Numune caddenin chuck ultramicrotome numune sahibinin ayarlayın. Örnek yer 90° saat yönünün tersine seri ultrathin kesit olduğunda gerçek pozisyon karşı gerçekleştirilen (bkz şekil 5 d).
- Blok yüzeyini bir elmas kesme bıçak (bkz şekil 5 d) ile kesmek. Elmas bıçak kenarı örnek blok yüzüne paralel ayarla ve numune yüzeyi herhangi bir numune (şekil 5 d) kaybetmek en az miktarda kesti.
Not: Bu adım numune yüzeyi düzeltmek için yapılır. Numune yüzeyi ince bölümünün parçası değişmeden kalır (Bu nedenle bu bölümü şekil 5 dbir ayna gibi parlıyor değil), bu yüzden örnek herhangi bir bölümünü seri kesit kaybetmemek için. Numune caddenin yüzeyinde maruz olmasıdır. - Bir ayna (Mesa kesim, M) (şekil 5 c) numune blok kesme izlemek için bıçak sahnesinde yerini.
- (Bu Yakası, şekil 5 d, seri kesit içinde örnek olur) bıçak sahne soldaki (şekil 5a) 30 ° döndürerek kesme bıçağı kullanarak blok sol kenarına kesti.
- Bıçak Sahne Alanı'nda 30 ° (şekil 5b) sağa döndürerek (Bu seri kesit, şekil 5 diçinde örnek alt tarafında olur) numune sol kenarına gelen yaklaşık 100 µm blok surata kesti.
Not: Numune yaklaşık 90 ince kısmından seri bölümleri kesilir x 1 mm boyutunda nm. Büyük ölçüde paralel olduklarını öyle ki numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlamak için kullanılır. Bıçak kenarına paralel olmak numune yüzeyi ayarladıktan sonra büyük ölçüde bir tıraş bıçağı ile kaldırılacak. Microtome kullanarak örnek alt ve üst kenarlarında keserek, her iki örnek düz ve kırılmamış şerit bölümler almak gerekli olan düzgün ve tam olarak birbirlerine (şekil 5 d), paralel haline.
4. paralel olarak birbirine 21 karşılaştıkları böylece numune yüzeyi ve bıçak kenar ayarlama
- Kesme bıçağı çıkarmak ve numune blok 90 ° saat yönünde döndür.
- Ultrathin bir parça bıçak bıçak Sahne Alanı'na ayarlayın.
- Her numune yüzeyi büyük bölümünü kullanarak diğer paralel karşılaştıkları numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlanır.
Not: seri kesit, kesme yüz numune yüzeyi ve bıçak kenar bu bölüm yalnızca, özellikle dikey yönde kullanarak ayarlamak üzere çok küçük olduğu için örnek büyük kısmı ayarı için kullanılır. Böylece, örnek büyük bölümünü kullanarak ayarlamayı kolaylaştırır.
5. yaymak neopren çözüm örnek blok (şekil 6)
- Özgün konum olarak tam olarak aynı konumda numune chuck yerleştirmek için chuck ve microtome chuck sahibinin teyp uygulayın ve sınırında (şekil 6a) kesti.
- Numune chuck microtome çıkar ve stereomicroscope (şekil 6b) altında yerleştirin. Bir tıraş bıçağı ile numune büyük kısmını kesti, ince parça seri halinde hangi bölümlerden bırakarak elde edilir.
- Pasteur pipet kullanmadan, yaklaşık 1 µL % 0.5 neopren çözüm (şekil 6b) seri kesit için bölüm tarafı yapışkan yapmak için kullanılmak üzere numune bırak. Neopren çözüm ile tüm örnek kapak. Aşırı neopren çözüm hemen filtre kağıdı numune yerleştirilen bir parçası ile absorbe. Bir şerit bölümlerin almak seri halinde hücre bölümleri fotoğrafını çekmek esastır ve neopren tutkal bölümleri birbirine yapışmasını için çok yararlıdır.
- 3-yarık Izgaralar hazırlamak (yırtmaçlı boyutları: Orta, 0.4 mm x 2.2 mm, her iki taraf 0.2 mm x 2.2 mm) (şekil 6 c) 60 ° ila Izgaralar tanıtıcısı bükme tarafından seri bölümleri seçmek için Izgaralar % 0.5 neopren çözüm ile tedavi ve Izgaralar tarafından hidrofilik yapma kızdırma deşarj22.
6. yapım seri bölümler (Şekil 7-9)
- Yer numune caddenin chuck içeri 5.1 (şekil 6a) olarak aynı konumda microtome bantlanmış parçaları hizalayarak. Bu blok yüz ve bıçak kenarı birbirine mükemmel paralel tutar. Sonra örnek yakın bıçak getir.
- Bıçak teknenin su ile doldurun.
- Microtome hava akımı (Şekil 7) önlemek için plastik bir kapak ile kapak.
Not: Hava akımı ultrathin kesit ve sık sık bölümleri alımı sırasında sorunlara neden. Plastik kapak üç delik vardır: tek bir delik için dürbün lensler ve kapağı açıkken işlemi izin vermek silah diğer iki delik vardır. Ahşap kol dayama Izgaralar ile seri bölümleri alma gibi hassas iş yaparken silah yerleştirmek için kullanılır. Ahşap kol dayama operatörün el microtome için titreşim iletimi vermemek için microtome tablo (Şekil 7, oklar), farklı tablolarda yerleştirilir. - 200 nm bölüm kalınlığı (şekil 8) Numune kesme başlatın. 200 nm kalınlık ayarı numune yüzeyinin bıçak getirmekte zaman kazandıracak.
- İlk bölüm kestikten sonra bölüm kalınlığı 70 için ayarla nm (şekil 8).
- Seri bölüm sayısı (tam olarak, yaklaşık 1,8 mm; bölüm sayısı değişir bölümlerinin genişliğini bağlı olarak şerit ulaştığı sonra konuşma) 20 ulaştığında, bölüm kalınlığı 10 değerine ayarlayın kesmeye devam ederken nm (şekil 8).
Not: microtome 10 nm-kalın kesitler kesemezsin beri yeni bölüm yok görünür ve daha önce kesme bölümleri bıçak kenarından ayrılmış olmak. El ile bir çift saç iplikçiklerinin kullanma bölümlerine ayırmak zorluk önlemek seri bölümleri seçmek için ayrılmış bölüm grupları (Şekil 9) almak önemlidir. Transmisyon elektron mikroskop görüş alanı 2.0 mm olduğu için bölümler en az 1.8 mm uzunluğunda olmalıdır. - Bölüm kalınlığı 60'a ayarla nm (şekil 8). Makine önceki 10 nm kalınlığı eklediğinden bu 70 nm bölümler (şekil 8) üretecektir.
- Bölüm kalınlığı 70 için ayarla nm (şekil 8) ve kesim 1,8 mm uzun bölümler elde edilen kadar devam edin.
- Beş 1.8 mm uzun bölümler (Şekil 9) elde edilen kadar 6,6-6.8 yineleyin. Biz genellikle beş bölüm grupları mevcuttur beş örnek sahipleri transmisyon elektron mikroskobu bizim laboratuarımızda, ancak beş sınırı değil yapmak.
7. alarak seri bölümler (şekil 10-12)
- 'Bölüm-holding loop'23 yerleştirin (döngü iç çapı: 5.0 mm) (şekil 10a) üçüncü bölüm grubu (şekil 10b) üzerinde.
Not: Uygun sırada fotoğraf çekmek için onların kesit sırasına göre bölümler almak gereklidir. Bıçak teknede beş bölüm grupları olduğundan, ancak, bu kez hangi grupları olan kafa karıştırıcı alır. Üçüncü grup üzerinde döngü yerleştirerek, iki grup işleci yakın olduğunu ortaya çıkıyor ve operatör üzerinden uzak iki ilk ve ikinci dördüncü ve beşinci gruplarının (şekil 10b) vardır. Bu-ecek önlemek sipariş karıştırma. - 'Su yüzeyi yükselterek loop'23 yerleştirin (WSRL, döngü iç çap: 4.0 mm) (şekil 11a) (şekil 11b) bıçak sahnede. Alt bir mıknatıs ile donatılmış WSRL sıkıca bıçak sahnede stand.
- WSRL döngü sadece seri bölümler onun mili ve kolu hareket ettirerek yerleştirin. Böylece döngü bölümleri çevreleyen su yüzeyine WSRL döngü indirin.
- Böylece su yüzeyi yüzey gerilimi (rakamlar 11 c-d) tarafından arttıracak vidayı aşağı doğru çevirerek döngü bastır. Bölümü döngünün ortasına doğru taşımak, su tepe üzerinde konumlandırın ve bir saç strand21kullanarak bölümü yönünü ayarlayın.
- Bölüm grupları ile bir çıplak yarık-cımbız tarafından düzenlenen ve su yüzeyine (Şekil 11 d) paralel tutulan GRID, dokunarak seçin. İlk olarak, grid dokunmak değil su bölümleri tam olarak ızgara (Şekil 11 d) ortasına yerleştirmek için bölümler için önemlidir.
- Bölümleri ile birlikte küçük bir damla su ile Izgaralar Formvar destek film16 üzerinde (şekil 12) yerleştirin ve aşırı su filtre kağıdı kullanarak kaldırın.
Not: bölümler membran (bölümler) membran (destek film) doğrudan dokunuyor çünkü bir destek film ile kullanılması çekildiği zaman destek film kırışıklıklar genellikle bir sorundur. Destek filmde kırışıklar çıkıyor sorun Formvar destek film16üzerinde küçük bir damla su ile birlikte bir bölümü taşıyan kılavuz yerleştirerek önemli ölçüde azalır.
8. bölüm16,24 (şekil 13) Boyama
- Sonra bölümleri tamamen kurutulur, Formvar filmin Izgaralar çevresinde gözyaşı ve bölümleri taşıyan ızgaraları kaldırmak.
- Doğru sırada (şekil 13) Boyama tüp16 oluk Izgaralar ayarlayın ve uranyl asetat ve kurşun sitrat24bölümlerle leke.
Not: Bir oluk 0.6 mm derin 's tüp uzun ekseni boyunca kesilmiş bir tıraş bıçağı ile. Tüp doğrudan ızgaraları kullanımı boyama ve yıkama işlemi16sırasında gerekli olmadığından cımbız, kullanırken destek filmlerin yanlışlıkla kırılma önlemek için yararlıdır.
9. gözlem seri bölümler (Şekil 14)
- Numune tutucu eksenine dikey kılavuz slit uzun ekseninin yönlendirme 5 Izgaralar çok numune tutucu (şekil 14a), doğru sırayla ayarlayın. 'Kılavuz-fixers' tutamaçları dokunmatik değil çünkü Izgaralar kolları (ok uçları) kesilecek, yok.
- Izgaralar 'kılavuz-fixers ile' (şekil 14b) düzeltmek ve numune tutucu transmisyon elektron mikroskobu yerleştirin.
Not: Hedef hücre Fotoğraf çekmeden önce tüm hücre bölümleri (iyi fiksasyon ile hayır kirlenme ile iyi durumda ilginç mikroorganizmaların veya hücreleri bulmak için,şekil 15) düşük büyütme görüntüleri almak yararlıdır. - Yüksek büyütmede tüm hücre bölümlerde hedef hücreleri resimlerini çekmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol için üç-yarık Izgaralar seri bölümleri seçmek için kullanılmıştır. Izgaralar nikel veya bakır yapılmıştır. Seri bölümleri orta slit yerleştirilir. Her iki tarafta yırtmaçlı kılavuzla aldığın zaman bölümleri görüntülemek gereklidir. Izgaralar seri bölümleri ile paralel (Şekil 11 d) cımbızla almaya devam etmek, kolu bükülmüş (şekil 6 c, sağ). Küçük bir kolu ciddi sorunlara neden olan bölümleri toplama, kılavuz, ana parçası bükme engellemek ve boyama sırasında bölümleri bırakarak önlemek için avantajlıdır. Bu kılavuz geleneksel 2.0 mm x 1.0 mm tek delikli kılavuz üzerinde avantajları vardır. Yani, doğrudan iki metal çubuklarla 0.4 mm ayrı bölümlerde desteklenir (1.0 mm daha dar) ve Formvar destek film bölümleri destek film geleneksel tek delikli kılavuzunda yalnızca tarafından desteklenen iken bir üç-yarık kılavuzda. Numune drift bu nedenle üç yarık kılavuz olarak kullanarak yüksek büyütme oranında çekim önlenebilir.
Şekil 15 seri kesitler taşıyan beş Izgaralar düşük büyütme görünümünü gösterir. Her bölüm birlikte sopa beri bile daha yüksek büyütmede sonraki bölümde aynı hücreyi bulmak kolaydır. Şekil 16 ve 17 hücre bölümleri seri görüntülerin örnektir. Bölüm 3-yarık Izgaralar üzerinde güvenli bir şekilde desteklendiği için yüksek büyütme (x 50,000) fotograflara kolayca numune drift alınır. DNA 2 nm çapında liflerinin bu çalışmalar9,12' çekildi.
Resim 1 . Formvar destek film yapma aparatı. Cam slayt yarısı daldırma cihazları üst sütun Formvar çözümde çözüm 'a' bir kauçuk top kullanarak üzerinden hava ile basarak. Çözüm sütundan üç yollu stopcock açarak ve basıncı azaltmak için 'b' havada serbest drene. (Yamaguchi ve Adachi, 201119 izni ile yayınlanmıştır). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Yöntemi cam film serbest bırakmak için slayt üzerinde su. (a) cam slayt film dört Kenarları jilet kullanarak kapalı alıntı. (b) Formvar film kapalı su cam slayt düşük bir açıyla yavaş yavaş azaltarak süzülüyor. (Yamaguchi ve Adachi, 201119 izni ile yayınlanmıştır). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Formvar destek film bir alüminyum raf. (a) Formvar filmin bir alüminyum raf ile sudan scooped. (b) raf içinde desiccator kadar kullanmak tutulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Ultrasonik kesme bıçağı ve bir stereomicroscope altında bir tıraş bıçağı ile numune bloğunu kırparak. (a) numune varlığı ışık mikroskobu numune bloğum gözlemci tarafından onaylanır. Derin deniz12,14toplanan bir ölçek-solucan chaeta (yaklaşık 1.7 mm uzunluğunda) ile ilişkili bulunan rakam mikroorganizmaların gösterilen blok. (b) düzeltme sahne. (c) bir stereomicroscope tüm görüntü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Numune bloğunu microtome kullanarak elmas bıçak ile kesme. (a) resimde sol kenar kesme. (b) blok yüz yaklaşık 100 bir konumda kesme nm numune sol kenarından. (c) bir ayna (Mesa kesim, M) bıçak Sahne Alanı'nda yerleştirilir. (d) numune yüzey. Üst tarafı ve en ince kısmı alt tarafı düzgün ve mükemmel paralel olduğunu unutmayın. Ayrıca omuz (bkz. şekil 8) kesme doğrultusunda işaretlemek için kestiğine dikkat edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . Numune yüzeyi neopren tedavisi. (a) numune chuck geri tam olarak yer alan özgün konuma yerleştirmek için chuck ve microtome chuck sahibinin bir bant ile işaretlenmiş olup sınırında kesti. (b) numune Pasteur pipet kullanarak neopren Çözümle ıslatma. (c) 3-yarık seri bölümleri toplama duvar kağıtları. Kolu 60 derece (c, doğru) eğildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 . Plastik kapak microtome ve ahşap kol dayama. Plastik kapak ultrathin kesit sırasında hava akışı önlemek yararlıdır. Ahşap kol dayama seri bölümleri alma gibi hassas iş yapmak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 . Bölüm kalınlığı ayarlama ve uygun kalınlık bölümleri alma. Seri bölüm sayısı 20 ulaştığında, bölüm kalınlığı 10'a ayarlanır nm. Microtome 10 nm-kalın kesitler kesemezsin beri yeni bölüm yok görünür ve daha önce kesme bölümleri bıçak kenarından ayrılmış olmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9 . Örnek ultrathin bölümlerin elde protokolü ile. Not 1.8 mm uzun seri bölümlerini beş grupları zaten kesmek sonra ayrılır. Bu özel durumda ultrathin bölümler center örnek varlığı nedeniyle sarımsı rengidir. Numune içeren ve reçine sadece oluşur, diğer parçaları bölümünün gümüş renkli vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10 . 'Bölüm-holding loop'. (a) Üstten Görünüm (üst kısım) ve döngü alt görünümü (alt kısmı fotoğraf). (b) bölümü-holding döngünün seri bölümler üçüncü grup tutmak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 11 . Seri bölümleri alma. (a) ' su yüzeyi yükselterek loop' (WSRL). Döngü işleci hareketli şaft kaldırılabilir. Döngünün aynı zamanda yukarı ve aşağı vida üst çevirerek taşınabilir. (b) WSRL bıçak Sahne Alanı'nda bir mıknatıs tarafından giderilmiştir. (c) (b) daha yakın bir bakış. (d) diyagram döngü, su yüzeyi, bölümler ve kılavuz alma (yan görünümü) sırasında. Ultrathin bölümleri tam olarak yarık kılavuzuna çıplak kılavuz paralel ultrathin bölümlerine düşürerek alınabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 12 . Izgara üzerinde Formvar film yerleştirmek. Izgarayı bölümleri holding ile birlikte küçük bir damla su Formvar film alüminyum raf üzerinde yer alıyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 13 . Tüp boyama16. Bir oluk 0.6 mm derin bir jilet kullanarak uzun ekseni boyunca yapılır. Izgaralar groove uygun sırayla yerleştirilir. Tüp bir ucunu (ok başı) yönünü işaretlemek için kesilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 14 . Kılavuzlar içinde numune sahibinin yerleştirerek. (a) kılavuzlar numune sahibi uygun sırayla yerleştirilir. (b) Izgaralar sonra 'kılavuz-fixers' sabitlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 15 . Seri bölümler yarık Izgaralar monte edilmiş. Şekilde bir ızgara üzerinde monte edilmiş 18-25 bölümleri gösterilmiştir. Her yarık rakamlarla sıra numarası ilk bölümünden belirtmek. İlk bölüm (bkz. şekil 8) diğerlerinden daha kalındır. Bu bölümleri birlikte bağlı ve aynı kalınlıkta var unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 16 . Parakaryon myojinensisseri bölümlerini12. Sol alt sayılar dizisi ilk bölümü göre gösterir. Şekil 12 dışarı-in 67 tam bölümleri gösterir. Bu hücrenin bir tek çevrili membran ve bakteri ama hiçbir mitokondri benzer endosymbionts çıplak DNA liflerinin oluşan bir büyük çevrili olması bulundu. Böylece, bu organizma ökaryot12' ye prokaryotlar gelişen bir ara yaşam formu gibi görünüyor. N, hemen. Yamaguchi ve Worman, 2014 çoğaltılamaz. 14 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 17 . Seri bölümler Escherichiacoli9. Sol alt sayılar dizisi ilk bölümü göre gösterir. Şekil 12 tam bölümleri gösterir. Bu hücre 21,700 ribozomlara9içeren bulundu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntem hiçbir pahalı ekipman gerektirir. Sadece bir alüminyum raf (şekil 3), üç-yarık Izgaralar (şekil 6 c), bölüm-holding döngüler (şekil 10a), su yüzeyi yükselterek döngü (şekil 11a) ve boyama tüp (şekil 13) gerektirir. Mevcut yöntemin birçok özellikleri vardır. Numune büyük bölümünü birbirine paralel karşılaştıkları numune yüzeyi ve bıçak kenarı ayarlamak için kullanılır. Seri bölümler zorluk ayıran bölümlerde bir grup yarık Izgaralar üzerine seri bölümlerin alınırken saç iplikçiklerinin bir çift kullanarak önlemek için gruplar halinde kesilir. 'Bölüm-holding loop' bölüm grupları sipariş kadar karıştırma önlemek için kullanılır. Bir 'su yüzeyi yükselterek loop' bölümleri su tepe üzerinde konumlandırılmış ve ızgara önce onları Izgaralar üzerinde istediğiniz konuma yerleştirmek için dokundukları olduğunu emin olmak için kullanılır. Formvar destek film bir alüminyum raf üzerinde kılavuzlar bölümleri kurtarmak için ve destek film kırışıklıklar önlemek için kolaylaştırmak için kullanılır. Bir boyama tüp destek filmleri cımbızla yanlışlıkla kesmemek için kullanılır.
Son zamanlarda, bir Otomatik teyp toplama ultramicrotome bölümleri elektron mikroskobu (SEM) elektron opak plastik kasetlerde Imaging tarama için otomatik olarak toplamak için gelişmiş25 oldu. Bu yöntem olabilir güvenilir bir şekilde kesilmiş binlerce ultrathin bölüm26, hangi mevcut yöntemle mümkün değildir. Ayrıca, seri blok yüz (SBF) 27 ve odak iyon demeti (yalan)-SEM28 3B bilgileri hücre ve dokulara hayvanların toplamak için kullanılır. Bu yöntemleri, SEM mikroskop içinde entegre bir elmas bıçak ya da odak iyon demeti ile kesit ve hiçbir özel teknikler gerektirir tam otomatik bir şekilde yürütülmektedir. Bu yöntemlerin yararlı olmakla birlikte, aparatı değil birçok kurum bu makineler satın almak çok pahalı olduğu. Ayrıca, bu yöntemler SEM fotoğrafı bölümlerine istihdam beri Filmler çözünürlüğe transmisyon elektron mikroskobu (TEM) istihdam mevcut yönteme aşağı kalır yanı yok. Bu yöntemler şu anda bireysel ribozom parçacıklar, mikrotübüller, microfilaments ve DNA iplikleri çözümlenemiyor.
Structome analiz mikroorganizmaların ve bilinmeyen mikroorganizmaların ultrastructural çalışma, hücreleri ve hücre duvarı, plazma zarı, mitokondri, çekirdek, nükleer membran, endoplazmik retikulum gibi hücre bileşenleri gözlemlemek gereklidir, kloroplast, plastitler, Golgi aygıtı, ribozomlar ve yüksek çözünürlükte ipliksi öğeleri. TEM gözlem seri ultrathin bölümlerin böyle analiz üç boyutlu olarak mümkün kılmak için bir kaç yöntemlerinden biridir. Bu yöntemde gözlem sonra Ultrathin bölümleri kaldıkları için aynı bölgede tekrar tekrar görülebilir; gözlenen alan Gözlemden sonra kayıp olduğundan bu SBF veya FIB-SEM, mümkün değildir. Derin deniz mikroorganizmalar düşük büyütmede ilginç canlılar ilk arama ve sonra fotoğraf seri olarak yüksek büyütmede hedef organizma üzerinde çekmek gerekli olduğu eğitim önemli bir özelliktir.
Sonuç olarak, seri ultrathin parça yöntemi şimdi kolay bir ucuz gerçekleştirilebilir ve relaible 3D ultrastructual için gerekli olan çalışmada, bu arada çalışma elektron mikroskobu yüksek çözünürlükte mikroorganizmaların.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz içtenlikle Shigeo Kita onun değerli öneriler ve tartışma için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca John ve Sumire Eckstein el yazması onların eleştirel okuma için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
