Summary
Это исследование представляет надежный и простой процедуры получения последовательного ультратонких секции микроорганизмов без дорогостоящего оборудования в просвечивающей электронной микроскопии.
Abstract
Наблюдения клеток и клеточных компонентов в трех измерениях с высоким увеличением в просвечивающей электронной микроскопии требует подготовки серийный ультратонких секции образца. Хотя подготовка серийный ультратонких секции считается очень сложно, это довольно легко, если используется правильный метод. В этой статье мы покажем пошаговые процедуры для безопасного получения последовательного ультратонких разделы микроорганизмов. Ключевые моменты этого метода являются: 1) чтобы использовать большую часть образца и отрегулировать краю образца поверхности и нож, так что они параллельны друг другу; 2) для резки серийный секции в группах и избежать трудностей в отделять разделы, используя пару пряди волос при извлечении группа последовательных секций на щели сетки; 3) использовать петлю раздел Холдинг и избегать смешивания порядок групп разделов; 4) чтобы использовать поверхность водоподъёмного цикл и убедитесь, что разделы располагаются на вершине воды и что они touch сетки во-первых, чтобы поместить их в нужное положение на сетках; 5) использовать поддержку фильма на алюминиевой стойке и сделать его легче восстановить разделы сетки и избежать складок фильма поддержки; и 6) использовать трубу окрашивание и избежать случайного нарушения поддержки фильмов с помощью пинцета. Этот новый метод позволяет получить серийный ультратонких разделы без затруднений. Этот метод делает возможным для анализа структуры клетки микроорганизмов с высоким разрешением в формате 3D, который не может быть достигнуто с помощью автоматического сбора ленты ultramicrotome метода и последовательный блок лицо или сфокусированные ионные пучка сканирующая электронная микроскопия.
Introduction
Надлежащего последовательного ультратонких секущей техника является необходимым для изучения клеток и клеточных компонентов трехмерно на микроскопическом уровне электрона. Мы изучили динамику шпинделя полюс тела в клеточный цикл дрожжевых клеток и выявили морфологические изменения их ультраструктуру во время дублирования1,2,3, и клеточный цикл 4,5. В 2006, мы придумали новое слово «structome» путем объединения «структура» и '-ome' и определил его как «количественные и трехмерных структурная информация всей ячейки на микроскопическом уровне электрон» 6,7.
Structome анализ, который требует последовательного ультратонких секущей технику, было установлено, что клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Exophiala dermatitidis было около 200.000 рибосомы7,8, Кишечная палочка клеток имели 26000 рибосомы9, микобактерии ячейки 1700 рибосомы10 и Мёдзин спираль бактерий было только 300 рибосомы11. Эта информация полезна не только оценки темпов роста в каждом организме, но и в идентификации видов9.
Кроме того анализ structome, привело к открытию нового организма; Parakaryon myojinensis был найден в глубокое море у побережья Японии, чьи клеточной структуры были промежуточным между теми прокариот и эукариот12,13,14,15. В настоящее время серийный ультратонких секущей техника считается так трудно, что он примет долгое время освоить. В этом исследовании мы разработали надежный метод, в котором кто-нибудь может выполнять последовательный ультратонких секционирование без затруднений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Образцы, используемые в данном исследовании были что микроорганизмов, быстро заморожен с пропан в жидком азоте, заморозить замещенных в ацетоне, содержащий 2% осмия тетраоксид и встроенный в эпоксидной смолы1,,2,3, 4,5,6,,78,9,10,11,12,13 ,14,,1516,17,18.
1. Подготовка фильма поддержки (рис. 1-3)
Примечание: Серебряные Formvar поддержка фильм подготовлен с помощью метода cast на стекло19.
- Добавить 100 мл 1,5% Formvar в дихлорэтан Formvar Изготовление аппарата (рис. 1). Окуните половины стеклянное скольжение (76 x 26 x 1,3 мм) в Formvar растворе в верхнем столбце аппарата нажатием решение с воздухом через «» с резиновый мяч19.
- Слейте раствор из столбца, открыв кран трехходовой и выпуская воздух через «b» для снижения давления. Вынимают стекло слайд из аппарата и сухой в воздухе в форме пленки на поверхности стекла слайд. Используйте лампы накаливания для ускорения сушки Formvar фильма.
- После соскабливания четырех краев пленки на стекла слайд с лезвием бритвы (рис. 2a) и дыхание на слайд, чтобы облегчить разделение фильма от слайд20, плавать покинуть фильм на воде, погружая стеклянное скольжение в вода медленно низкой горизонтальный угол (около 10°, Рисунок 2b).
- Зачерпнуть Formvar фильм из воды с помощью алюминиевой стойке (30 мм x 25 мм x 3 мм) с отверстиями (4 мм в диаметре) (рис. 3a). Держите каре с Formvar фильм в эксикатор до использования (рис. 3b).
2. Обрезка блока образца с ультразвуковым ножом и лезвием 21 под стереомикроскопом (рис. 4)
- Убедитесь, что есть клетки на поверхности блока, наблюдая за кончик блока с световой микроскоп (рисунок 4a).
- Смонтировать блок образца в патроне (блок держатель) и смонтировать зажимный патрон на обрезки этапе21 (рис. 4В). Этот этап отделки имеет механизм освещения от задней части образца.
- Отделка блок размером 0,7 x 1.0 мм (рисунки 4 c, 5d). Так как эпоксидная смола является очень тяжело, обрезки блоков, сначала с помощью ультразвуковым ножом. Ультразвуковым ножом это новые машины, и блоки легко удаляются. Затем обрежьте блок далее с лезвием бритвы. Вырежьте одно плечо чтобы отметить направление резки (см. рис. 5 d, рис. 8).
3. Обрезка блока образца с алмазным ножом, используя микротом (рис. 5)
- Установите блок образца Чак в держатель образца ultramicrotome. Место образца 90° против часовой стрелки против фактической позиции когда серийный ультратонких секционирование выполнена (см. рис. 5 d).
- Вырежьте на поверхности блока с ножом обрезки алмаз (см. рис. 5 d). Установите алмазной грани параллельно образца блок лица и сократить минимальный объем образца поверхности так, чтобы не потерять любого образца (рис. 5 d).
Примечание: Этот шаг делается для сглаживания поверхности образца. Часть поверхности образца тонкий части остается без изменений (поэтому эта часть не сияют как зеркало, Рисунок 5 d), чтобы не потерять любой частью образца для последовательного секционирование. Это потому, что образец подвергается на поверхности блока. - Поместите зеркало (Меса вырезать, M) на сцене нож для мониторинга режущего блока образца (рис. 5 c).
- Вырежьте левого края (это становится верхней стороне, Рисунок 5 d, образца в серийный секционирование) блока с помощью обрезки нож, поворачивая нож этап 30 ° влево (рис. 5a).
- Вырежьте блок лицо на примерно 100 мкм от левого края образца (это становится нижнюю сторону образца в серийный секционирование, Рисунок 5 d), поворачивая нож этап 30 ° вправо (Рисунок 5b).
Примечание: Последовательный секции будет вырезать из тонкий частью образца около 90 Нм x размером около 1 мм. Большая часть будет использоваться для корректировки поверхности образца и острие ножа, таким образом, чтобы они параллельны. После корректировки поверхности образца быть параллельно к краю ножа, большая часть будут удалены с лезвием бритвы. Путем разрезания верхней и нижней сторонах образца, используя микротом, обе стороны образца стать гладко и ровно параллельно друг другу (рис. 5 d), которая необходима для получения прямых и непрерывной ленты разделов.
4. Настройка образца поверхности и ножом края таким образом, чтобы они сталкиваются параллельно друг другу 21
- Извлеките нож обрезки и вращать блок образца 90° по часовой стрелке.
- Установите ультратонких секущей нож нож стадии.
- Отрегулируйте поверхности образца и острие ножа, таким образом, чтобы они сталкиваются параллельно друг другу, используя большую часть поверхности образца.
Примечание: Большая часть образца используется для регулировки потому что резки лицом серийный секционирование настолько мал, что делает его трудно настроить образец поверхности и ножом края с помощью этой части только, особенно в вертикальном направлении. Таким образом используя большую часть образца легко перестройки.
5. распространение неопрена решение на блоке образца (рис. 6)
- Чтобы поместить патрон образца на точно таком же положении как исходное положение, применять ленту на патрон и патрон держателя микротома и сократить на границе (рис. 6a).
- Возьмите образец патрона из микротома и поместите его под стереомикроскопом (Рисунок 6b). Отрежьте большую часть образца с лезвием бритвы, оставляя тонкий часть, из которого будут получены последовательные секции.
- С помощью пипетки Пастера, перетащите образец использоваться для последовательного секционирование, чтобы сделать раздел стороны клей около 1 мкл 0,5% неопрен раствора (рис. 6b). Покрывают весь образец раствором из неопрена. Поглощают избыток неопрена решение немедленно с кусок фильтровальной бумаги, расположенный неподалеку от образца. Получение лента секций имеет важное значение для съемки последовательных ячеек секций, и клея неопрен является весьма полезным для склеивая секции.
- Подготовка 3-щелевой сетки (размеры щелей: среднего, 0,4 мм x 2,2 мм, обе стороны 0,2 мм x 2,2 мм) (рис. 6 c) для собирание последовательных секций, сгибая ручки сеток до 60 °, рассматривая сетки с 0,5% раствором из неопрена и делая сетки гидрофильные, свечение разряд22.
6. Создание последовательных секций (рис. 7-9)
- Место блок образца Чак обратно в микротом на той же позиции 5.1 (рис. 6А), совместив тесьмой частей. Это держит блок лицо и острие ножа идеально параллельны друг другу. Затем довести нож недалеко от образца.
- Заполните лодки нож с водой.
- Обложка микротом с пластиковой крышкой для предотвращения потока воздуха (рис. 7).
Примечание: Воздушный поток во время ультратонких секционирование и извлечения разделов часто вызывают проблемы. Пластиковая крышка имеет три отверстия: одно отверстие для бинокулярного линзы, и другие два отверстия для оружия разрешить операции, пока крышка на. Деревянные подлокотник используется для размещения оружия при этом тонкая работа, такие как извлечение последовательных секций с сетками. Деревянные подлокотник помещается на различных таблиц из таблицы микротом (рис. 7, стрелки), чтобы не передавать вибрации рук оператора в микротома. - Начните сокращать образца в разделе толщина 200 Нм (рис. 8). Установка на 200 Нм толщина позволит сэкономить время в результате чего нож к поверхности образца.
- После того, как первый раздел режется, установите толщина среза до 70 Нм (рис. 8).
- Когда количество последовательных секций достигает 20 (точнее говоря, после ленты достигает около 1.8 мм; количество секций зависит от ширины секции), установить секции толщиной до 10 Нм (рис. 8) продолжая резать.
Примечание: Поскольку микротома нельзя вырезать 10 Нм толстые разделов, не новый раздел появляется, и ранее сократить разделы стали отделены от края ножа. Важно получить отдельный раздел группы (рис. 9) для собирание серийный разделы избежать трудностей в отделять разделы вручную с помощью пары пряди волос. Поскольку поле зрения в просвечивающий электронный микроскоп 2,0 мм, сечение должно быть длиной 1,8 мм в большинстве. - Значение толщины среза 60 Нм (рис. 8). Это будет производить 70 нм секции (рис. 8), потому что машина будет добавить толщину предыдущие 10 Нм.
- Значение толщины среза 70 Нм (рис. 8) и продолжить резки до получения секции длиной 1,8 мм.
- Повторите 6,6-6,8 до тех пор, пока пять секций длиной 1,8 мм получены (рис. 9). Мы обычно делают пять групп разделов, так как имеются пять держатели образца в просвечивающий электронный микроскоп в нашей лаборатории, но пять это не предел.
7. собирание серийный секции (рис. 10-12)
- Место «раздел Холдинг петля»23 (внутренний диаметр цикла: 5,0 мм) (Рисунок 10А) на третьей секции группы (рис. 10б).
Примечание: Это необходимо для извлечения разделов в порядке их секционирование принимать фотографии в нужном порядке. Однако поскольку существует пять групп секции на лодке, нож, он часто получает запутанным, какие группы, которые. Размещая петли на третьей группы, становится ясно, что эти две группы рядом с оператором являются первый и второй и далекие два оператора являются четвертой и пятой группы (рис. 10б). Это позволит предотвратить смешение порядок. - Место «поверхности водоподъёмного петля»23 (WSRL, внутренний диаметр цикла: 4,0 мм) (рис. 11А) на сцене ножа (рис. 11b). WSRL будет твердо стоять на сцене нож, потому что она оснащена магнитом в нижней.
- Место цикл WSRL чуть выше серийный разделы, перемещая его вала и ручку. Нижняя петля WSRL на поверхность воды, так что цикла окружает разделы.
- Нажмите петлю поворотом винта вниз так, что поверхность воды будет поднять на поверхностное натяжение (цифры 11c-d). Переместить раздел в центре петли, расположите его на вершине воды и отрегулировать направление секции с помощью прядь волос21.
- Подобрать группы разделов, прикоснувшись с голыми щели сеткой, которая проводится с помощью пинцета и держал параллельно поверхности воды (рис. 11 d). Это важно для секций во-первых, прикоснуться к сетке не воду, чтобы поместить разделы точно по центру сетки (Рисунок 11 d).
- Место сетки с разделами наряду с крошечной капли воды на Formvar поддержки фильм16 (рис. 12) и Удалите лишнюю воду с помощью фильтровальной бумаги.
Примечание: Морщение фильма поддержки часто является проблемой, когда разделы выбираются с помощью сетки с поддержкой фильм потому что мембрана (разделы) непосредственно затрагивает мембраны (поддержка фильм). Проблема получения морщины на поддержку фильма значительно уменьшается, поместив раздел подшипник сетки вместе с крошечной капли воды на Formvar поддержки фильм16.
8. Окрашивание разделов16,24 (рис. 13)
- После секции полностью высох, слезной пленки Formvar от вокруг сетки и снимите решетки с учетом разделов.
- Установка сетки в groove окрашивание трубку16 в правильном порядке (рис. 13) и пятно секции с уранила ацетат и свинца цитрат24.
Примечание: Есть паз глубиной 0,6 мм вдоль длинной оси трубки вырезать с лезвием бритвы. Трубка является полезным для предотвращения случайного обрыва поддержки фильмов, когда с помощью пинцета, поскольку прямой обработке сеток не является необходимым во время окрашивания и промывки процесса16.
9. наблюдение за последовательные секции (рис. 14)
- Установите 5 сетки в держатель образца мульти в правильном порядке (рис. 14А), ориентация длинной оси сетки разрезом перпендикулярно оси держателя образца. Ручки (стрелок) сеток не должны быть сокращены, потому что «ГРИД пройдохи» не будет трогать ручки.
- Исправьте сетки с «ГРИД пройдохи» (Рисунок 14b) и вставьте держатель образца в просвечивающий электронный микроскоп.
Примечание: Это часто полезно принимать низкий масштаб изображения всех слоев клеток (рис. 15), чтобы найти интересные микроорганизмов или клеток в хорошем состоянии, без загрязнения и с хорошей фиксации, прежде чем принимать фотографии целевой ячейки. - Возьмите фотографии клеток-мишеней во всех разделах клеток с высоким увеличением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе три щелевой сетки использовались для собирание последовательных секций. Сетки изготавливаются из никеля или меди. Серийный разделы размещаются на среднем щели. Прорези на обеих сторон необходимы для просмотра разделов, когда их собирать с сеткой. Чтобы сохранить сетки параллельно с секциями по последовательным, когда собирание их пинцетом (Рисунок 11 d), согнуты ручки (рис. 6 c, право). Небольшой ручкой выгодно для предотвращения изгиба основную часть сетки, которая вызывает серьезные проблемы в собирание разделов, и чтобы предотвратить удаление разделов во время окрашивания. Эта сетка имеет преимущества над сеткой одно отверстие обычных 2,0 x 1,0 мм. А именно, разделы поддерживаются непосредственно двумя металлическими прутьями 0.4 мм друг от друга (меньше 1,0 мм) и Formvar поддержки фильм в сетке 3 щель, в то время как разделы поддерживаются только поддержку фильма в сетке обычных одно отверстие. Дрейф образца таким образом могут быть предотвращены в фотографировании в большом увеличении, с помощью трех щелевой сетки.
Рисунок 15 показано представление малое увеличение пяти решеток, которые осуществляют последовательный секций. Поскольку каждый раздел палочки вместе, это легко найти ту же ячейку в следующем разделе даже на увеличение. Рисунок 16 и 17 являются примерами последовательных изображений участков клетки. Поскольку разделы надежно поддерживаются на сетках 3-щель, фотографии с высоким увеличением (x 50,000) легко принимаются без образца дрейфа. Волокна ДНК 2 Нм в диаметре были сфотографированы в эти исследования9,12.
Рисунок 1 . Formvar поддержка Съемочный аппарат. Половина стеклянное скольжение погружается в Formvar растворе в верхнем столбце аппарата нажатием решение с воздухом через «» с резиновым мячиком. Решение осушена от столбца, открыв кран трехходовой и выпуская воздух через «b» для снижения давления. (Воспроизводится от Ямагучи и Адати,19 2011 с разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Метод для освобождения фильм из стекла Авто на воде. () четыре края фильма на слайде стекла соскрести с помощью лезвия бритвы. (b) Formvar фильм Плавающая покинуть на воде, снижая стеклянное скольжение медленно под небольшим углом. (Воспроизводится от Ямагучи и Адати,19 2011 с разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Formvar поддержка фильм на алюминиевой стойке. () Formvar фильм зачерпнул воды с алюминиевой стойке. (b стойку хранится в эксикаторе до использования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Обрезка блока образца с ультразвуковым ножом и лезвием бритвы под стереомикроскопом. (a) наличие образца подтверждается наблюдения блока образец под микроскопом света. Блок, показано на рисунке содержит микроорганизмы, связанные с масштаба червь chaeta (около 1,7 мм в длину), собранных из глубоководных12,14. (b) обрезки этапе. (c) все изображение стереомикроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Обрезка блока образца с алмазным ножом, используя микротом. (a) Иллюстрация для резки левого края. (b) блок лицо вырезать в позиции около 100 Нм от левого края образца. (c) зеркало (Меса вырезать, M) размещены на сцене нож. (d) образца поверхности. Обратите внимание, что стороне верхней и нижней части тонкий гладкая и совершенно параллельно. Также, обратите внимание, что плечо режется пометить направление резки (см. рис. 8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Неопрен лечение на поверхности образца. () для того чтобы поместить патрон образца обратно на точно первоначальное положение, Чак и патрон держателя микротома отмеченные ленты и режут на границе. (b) увлажнение образца с неопрен решения с помощью пипетки Пастера. (c) 3 щелевой сетки для собирание последовательных секций. Рукоятка согнута до 60 градусов (c, справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 . Пластиковая крышка микротома и деревянные подлокотник. Пластиковая крышка является полезным для предотвращения потока воздуха при резании ультратонких. Деревянные подлокотник используется для выполнения деликатной работы такие как извлечение последовательных секций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 . Настройка толщины среза и получения секций на надлежащей толщины. После того, как количество последовательных секций достигло 20, толщина среза имеет значение 10 Нм. Так как микротома нельзя вырезать 10 Нм толстые разделов, не новый раздел появляется, и ранее сократить разделы стали отделены от края ножа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9 . Пример ультратонких секций, полученные через протокол. Обратите внимание, что пять групп последовательных участков около 1,8 мм длиной уже разделены после резки. В данном конкретном случае цвет центра ультратонких секций желтоватым вследствие наличия образца. Другие части секции, которые не содержат образец и состоят из смолы только, являются серебро в цвете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10 . «Цикл секции Холдинг». (а) вид сверху (верхняя часть) и вид снизу (Нижняя часть фото) цикла. (b) раздела Холдинг цикла используется для хранения третья группа последовательных секций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 11 . Извлечение последовательных секций. () ' поверхности водоподъёмного петля» (WSRL). Ручки, петли могут быть удалены от вала, который является перемещаемой. Цикл также могут быть перемещены вверх и вниз, поворачивая завинчивающейся крышкой. (b WSRL на сцене нож фиксируется магнит. (c) ближе зрения (b). (d) схема цикла, поверхность воды, секции и сетки во время извлечения (вид сбоку). Ультратонких разделы могут быть получены именно к сетке щели, опустив голые сетки параллельно в ультратонких разделы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 12 . Размещение сетки на пленке Formvar. Холдинг разделы сетки помещается вместе с крошечной капли воды на Formvar пленке на алюминиевые стойки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 13 . Пятнать трубки16. Паз глубиной 0,6 мм производится вдоль длинной оси с помощью лезвия бритвы. Сетки, помещаются в паз в надлежащем порядке. Один конец трубки cut (голова стрелка) в ознаменование его направление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 14 . Размещение сетки в держатель образца. () сетки, помещаются в держатель образца в надлежащем порядке. (b сетки затем фиксируются с «ГРИД пройдохи». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 15 . Серийный разделы монтируются на щели сетки. На рисунке 18-25 разделы смонтированы на одной сетки. Числа в каждой щели указывают последовательность чисел начиная с первого раздела. Первый раздел толще, чем другие (см. рис. 8). Обратите внимание, что секции крепятся вместе и имеют такой же толщины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 16 . Серийный секции Parakaryon myojinensis12. Цифры в левом нижнем указывают последовательность по отношению к первой части. На рисунке 12 из 67 полных разделов. Эта ячейка было установлено большое nucleoid, состоящий из голая ДНК волокон, с одной nucleoid мембраны и endosymbionts, которые похожи на бактерии, но не митохондрий. Таким образом этот организм, как представляется, развивается от прокариот эукариоты12промежуточная форма жизни. N, nucleoid. Приводимый от Ямагучи и Уорман, 2014. 14 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 17 . Серийный участков Escherichia coli9. Цифры в левом нижнем указывают последовательность по отношению к первой части. На рисунке 12 полных разделов. Было установлено, что эта ячейка содержит 21 700 рибосомы9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленные здесь метод требует не дорогое оборудование. Он требует только алюминиевые стойки (рис. 3), три щелевой сетки (рис. 6 c), раздел Холдинг петли (Рисунок 10А), поверхность водоподъёмного петлю (рис. 11А) и окрашивание трубку (рис. 13). Есть много особенностей нынешнего метода. Большая часть образца используется для настройки образца поверхности и ножом края таким образом, чтобы они сталкиваются параллельно друг другу. Серийный секции разрезаются в группах, чтобы избежать трудностей в разделения секций с помощью пары пряди волос при извлечении группа последовательных секций на щели сетки. Петлю раздел Холдинг используется во избежание смешения порядок групп разделов. Поверхность водоподъёмного цикла используется для убедитесь, что разделы располагаются на вершине воды и что они touch сетки во-первых, чтобы поместить их в нужное положение на сетках. Formvar поддержка фильм на алюминиевые стойки используется чтобы сделать его проще для восстановления разделов на сетках и избежать складок поддержку фильма. Окрашивание трубка используется чтобы избежать случайного нарушения поддержки фильмов с помощью пинцета.
Недавно автоматический сбор ленты ultramicrotome был25 развитых собирать секции автоматически растровая электронная микроскопия (SEM) изображений на электронно непрозрачные пластиковые ленты. Этот метод можно надежно вырезать тысячи ультратонких разделы26, который не возможно нынешнего метода. Кроме того, последовательный блок лицо (SBF) 27 и фокус ионного пучка (FIB)-SEM28 используются для сбора 3D информации клеток и тканей животных. В этих методах секционирование с Алмазный нож или фокус ионно-лучевые интегрированы внутри SEM микроскопа и осуществляется в полностью автоматический манере, которая требует без специальных методов. Хотя эти методы полезны, аппарат является настолько дорого, что не многие учреждения покупают эти машины. Кроме того поскольку эти методы используют SEM фотография разделы, резолюция микроскопии уступает нынешнего метода, который использует просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). Эти методы не удается разрешить отдельные рибосома частицы, микротрубочки, микрофиламенты и ДНК волокон в настоящее время.
Для structome анализа микроорганизмов и ультраструктурная исследование неизвестного микроорганизмов необходимо соблюдать клеток и клеточных компонентов клеточной стенки, плазматической мембраны, митохондрии, ядро, ядерной мембраны эндоплазматического ретикулума, хлоропластов, пластид, аппарат Гольджи, рибосомы и нитевидные элементы с высоким разрешением. ТЕА наблюдения серийный ультратонких разделов является одним из нескольких методов, чтобы сделать такой анализ можно в трех измерениях. Потому что ультратонких разделы остаются после наблюдения в этом методе, той же области могут наблюдаться неоднократно; Это не возможно в SBF или FIB-SEM, поскольку области наблюдаемых теряется после наблюдения. Эта функция имеет важное значение для изучения глубоководных микроорганизмов, где это необходимо для поиска интересных организмов при низком увеличении сначала и затем принимать фотографии серийно на целевой организм при большом увеличении.
В заключение последовательный метод ультратонких секущей теперь могут быть выполнены в простой, недорогой, и relaible путь в настоящем исследовании, которая необходима для 3D ultrastructual изучение микроорганизмов с высоким разрешением в электронной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы искренне благодарим Шигео Kita за его ценные предложения и обсуждения. Мы также благодарим Джон и Sumire Eckstein за их критического чтения рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
