Summary
Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.
Abstract
Beobachtung von Zellen und Zellbestandteile in drei Dimensionen bei hoher Vergrößerung im Transmissions-Elektronenmikroskopie erfordert Vorbereitung ultradünne Schnittserien der Probe. Obwohl Vorbereitung ultradünne Schnittserien gilt als sehr schwierig sein, ist es ziemlich einfach, wenn die richtige Methode verwendet wird. In diesem Beitrag zeigen wir eine schrittweise Anleitung für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen sicher. Die wichtigsten Punkte dieser Methode sind: 1) verwenden Sie den großen Teil der Probe und Probe Oberfläche und Messer Rand anpassen, so dass sie parallel zueinander; (2) zu schneiden Schnittserien in Gruppen und vermeiden Schwierigkeiten beim trennen Abschnitte mit ein paar Haarsträhnen, wenn eine Gruppe von Serienschnitte auf den Schlitz-Netzen abgerufen werden; (3) zu verwenden, eine "Abschnitt-Holding-Schleife" und zu vermeiden, mischen Sie die Reihenfolge der Abschnittsgruppen; (4), verwenden Sie eine Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife, und stellen Sie sicher die Abschnitte auf der Spitze des Wassers positioniert sind und dass sie das Raster zuerst berühren, um sie in die gewünschte Position auf den Gittern zu platzieren; (5), verwenden Sie die Trägerfolie auf ein Aluminium-Gestell und machen es einfacher, die Abschnitte auf den Gittern zu erholen und zu vermeiden, von der Trägerfolie Faltenbildung; und 6) verwenden Sie eine Färbung zu vermeiden, versehentlich brechen die Unterstützung-Filme mit einer Pinzette. Diese neue Methode ermöglicht ultradünne Schnittserien ohne Schwierigkeiten. Die Methode ermöglicht die Zellstrukturen von Mikroorganismen mit hoher Auflösung in 3D, zu analysieren, die nicht mithilfe der automatischen Band sammeln regungsloses Methode und serielle Block-Gesicht oder fokussierten Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie erreicht werden kann.
Introduction
Richtige ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik ist unerlässlich, um Zellen und Zellbestandteile dreidimensional auf mikroskopischer Ebene Elektron zu studieren. Wir haben untersucht die Dynamik der Spindel Pol Körper im Zellzyklus von Hefezellen und offenbart morphologische Veränderungen ihrer Ultrastruktur während des Zellzyklus und die Zeit von Doppelarbeit1,2,3, 4,5. Im Jahr 2006 haben wir ein neues Wort "Structome" durch die Kombination von "Struktur" geprägt und "-Ome", und als die 'quantitative und dreidimensionalen Strukturinformationen einer ganzen Zelle auf mikroskopischer Ebene Elektron' 6,7definiert.
Durch eine Structome Analyse, die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik erfordert, wurde festgestellt, dass eine Hefezelle von Saccharomyces Cerevisiae und Exophiala Dermatitidis etwa 200.000 Ribosomen7,8, ein hatte Escherichia coli Zelle 26.000 Ribosomen9, Mycobacterium Tuberculosis Zelle hatte 1.700 Ribosomen10 und Myojin Spirale Bakterien hatten nur 300 Ribosomen11. Diese Informationen sind hilfreich bei der Abschätzung der nicht nur der Wachstumsrate in jedem Organismus, sondern auch bei der Identifizierung von Arten9.
Darüber hinaus Structome Analyse führte zu die Entdeckung eines neuen Organismus; Parakaryon Myojinensis fand in der Tiefsee vor der Küste Japans, deren Zellstruktur waren ein Zwischenprodukt zwischen denen der Prokaryoten und Eukaryoten12,13,14,15. Derzeit gilt die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik so schwer sein, dass es lange, zu meistern dauern würde. In dieser Studie haben wir eine zuverlässige Methode entwickelt, in der jemand serielle ultradünnen Schneiden problemlos durchführen kann.
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Protocol
Hinweis: Die Proben, die in dieser Studie verwendet wurden, Mikroorganismen, schnell mit Propan in flüssigem Stickstoff eingefroren substituierte in Aceton, enthält 2 % Osmium ausgefällt und eingebettet in Epoxy Harz1,2,3Einfrieren, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. Vorbereitung der Trägerfolie (Abbildung 1-3)
Hinweis: Silberne Formvar Trägerfolie wird mit der auf Gußglas Methode19zubereitet.
- 100 mL 1,5 % zugeben Formvar in Ethylen Paraquatdichlorid zu einer Formvar-Herstellung-Apparatur (Abbildung 1). Tauchen Sie die Hälfte einer Glas-Folie (76 x 26 x 1,3 mm) in Formvar Lösung in der oberen Spalte des Geräts durch Drücken der Lösung mit Luft durch "a" mit einem Rubber Ball19.
- Lassen Sie die Lösung aus der Spalte durch die drei-Wege-Absperrhahn öffnen und loslassen Luft durch 'b', Druck zu verringern. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Gerät genommen und trockene Luft zu bilden einen Film auf der Oberfläche der Folie Glas. Verwenden Sie eine weißglühende Lampe zur Beschleunigung der Trocknung des Formvar Films.
- Nachdem die vier Kanten des Films auf dem Objektträger mit einer Rasierklinge (Abbildung 2a) abschaben, und atmen auf der Folie, die Trennung des Films aus der Folie20, zu erleichtern die Folie auf dem Wasser zu schweben, durch Eintauchen der Objektträger in der das Wasser langsam in einem niedrigen horizontalen Winkel (ca. 10°, Abb. 2 b).
- Schöpfe die Formvar Film aus dem Wasser mit einem Alu-Rack (30 x 25 x 3 mm) mit Löcher (4 mm Durchmesser) (Abb. 3a). Halten Sie das Gestell mit dem Formvar Film in den Exsikkator gestellt bis zur Verwendung (Abb. 3 b).
2. Trimmen des Probe-Blocks mit einem Ultraschall trimmen Klinge und eine Rasierklinge 21 unter einem Stereomikroskop (Abbildung 4)
- Stellen Sie sicher, dass gibt es Zellen auf der Oberfläche des Blocks durch die Beobachtung der Spitze des Blocks mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 4a).
- Montieren des Probe-Blocks in das Spannfutter (Block-Halter), und das Futter auf ein trimmen Bühne21 (Abbildung 4 b). Diese trimmen-Etappe hat einen Beleuchtung-Mechanismus von der Rückseite der Probe.
- Schneiden Sie den Block auf eine Größe von 0,7 mm x 1,0 mm (Abb. 4 c, 5d). Da das Epoxidharz sehr hart ist, schneiden Sie die Blöcke zuerst mit einem Ultraschall trimmen Klinge. Die Ultraschall trimmen Klinge ist eine neu eingeführte Maschine, und die Blöcke sind leicht getrimmt. Dann schneiden Sie den Block weiter mit einer Rasierklinge. Schneiden Sie eine Schulter markieren die Richtung des Schneidens (siehe Abbildung 5 d, Abbildung 8).
(3) trimmen des Probe-Blocks mit Diamant Messer mit dem Mikrotom (Abbildung 5)
- Inmitten des Probe Blocks Chuck Probenhalter für die regungsloses. Legen Sie die Probe 90° gegen den Uhrzeigersinn gegen die tatsächliche Position, wenn serielle ultradünnen Schnitt durchgeführt (siehe Abbildung 5-d).
- Schneiden Sie die Oberfläche des Blocks mit einem Diamant Trimmmesser (siehe Abbildung 5 d). Diamant Messerschneide parallel zur Fläche Probe-Block gesetzt, und schneiden Sie den Mindestbetrag der Probenoberfläche um nicht zu verlieren, jede Probe (Abb. 5D).
Hinweis: Dieser Schritt ist getan, um die Probenoberfläche zu glätten. Der Teil der Probenoberfläche schlanke Teil intakt (daher dieser Teil ist nicht glänzend wie ein Spiegel, Abbildung 5 d), um keinen Teil der Probe für serielle Schnitt verlieren. Und zwar deshalb, weil das Muster auf der Oberfläche des Blocks ausgesetzt ist. - Setzen Sie einen Spiegel (Mesa Schnitt, M) auf der Bühne Messer zum Schneiden von der Probe-Block (Abbildung 5 c) überwachen.
- Schneiden Sie den linken Rand (Dies wird die Oberseite, Abbildung 5 d, der Probe im seriellen Schnitt) des Blocks mit Trimmmesser durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach links (Abb. 5a).
- Schneiden Sie die Block-Fläche an etwa 100 µm vom linken Rand der Probe (Dies wird die Unterseite der Probe in seriellen Schnitt, Abbildung 5 d) durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach rechts (Abb. 5 b).
Hinweis: Die Schnittserien schneidet sie aus dem schlanken Teil der Probe von etwa 90 nm x ca. 1 mm groß. Der Großteil wird zur Probenoberfläche und der Messerschneide anpassen, so dass sie parallel sind. Nach dem Einstellen der Probenoberfläche parallel zur Messerschneide sein, wird der große Teil mit einer Rasierklinge entfernt. Von oberen und unteren Rand der Probe mit dem Mikrotom schneiden, werden beide Seiten der Probe glatt und genau parallel zueinander (Abb. 5D), die ist notwendig, um gerade und ununterbrochene Band Abschnitte.
4. anpassen der Probe Oberfläche und Messer Kante, so dass sie Parallel zu einander 21 Gesicht
- Entfernen Sie das Schneidmesser, und drehen Sie den Probe Block 90° im Uhrzeigersinn.
- Legen Sie eine ultradünne Stationspunkte Messer auf der Messer-Bühne.
- Einstellen Sie die Probenoberfläche und der Messerschneide so, dass sie Parallel zueinander mit dem Großteil der Probenoberfläche konfrontiert.
Hinweis: Der Großteil der Probe wird zur Einstellung verwendet, denn das Schneiden Gesicht des seriellen Schnitt so klein ist, macht es schwierig, Probe Oberfläche und Messer Rand mit diesen Teil nur, vor allem in vertikaler Richtung anpassen. So macht mit dem großen Teil der Probe Anpassung leicht.
5. Verbreitung Neopren-Lösung auf die Probe-Block (Abbildung 6)
- Um die Probe Futter an genau der gleichen Position wie die ursprüngliche Position zu platzieren, bringen Sie Klebeband auf das Futter und Futter Inhaber Mikrotom und schneiden Sie an der Grenze (Abb. 6a).
- Nehmen Sie das Präparat Chuck aus Mikrotom, und legen Sie es unter dem Stereomikroskop (Abb. 6 b). Schneiden Sie den Großteil der Probe mit einer Rasierklinge, indem man die schlanken Teil, unter dem Schnittserien erhältlich sind.
- Mit einer Pasteurpipette, fallen Sie ca. 1 µL 0,5 % Neopren Lösung (Abb. 6 b) auf die Probe, für serielle Schnitt verwendet werden, um den Abschnitt Seiten Klebstoff zu machen. Decken Sie die gesamte Probe mit Neopren-Lösung. Absorbieren Sie überschüssige Neopren Lösung sofort mit einem Stück Filterpapier in der Nähe der Probekörpers. Eine Band der Abschnitte ist essentiell für die Bilder von seriellen Zellteile und Neoprenkleber ist sehr nützlich für die Abschnitte zusammenkleben.
- 3-Schlitz-Netze vorzubereiten (Größe der Schlitze: Mitte, 0,4 mm x 2,2 mm, beide Seiten 0,2 mm x 2,2 mm) (Abbildung 6 c) für die Abholung Schnittserien durch Biegen des Griffs der Netze 60°, behandeln die Netze mit 0,5 % Neopren-Lösung, und machen die Netze von hydrophilen Leuchten Sie Entlastung22.
6. Herstellung Serienschnitte (Abbildung 7-9)
- Ort der Probe Block Futter zurück in das Mikrotom an der gleichen Position wie 5.1 (Abb. 6a) durch Ausrichten der aufgezeichneten Teile. Dies hält die Block-Gesicht und die Messerschneide vollkommen parallel zueinander. Dann bringen Sie das Messer in der Nähe der Probe.
- Füllen Sie das Messer-Boot mit Wasser.
- Decken Sie das Mikrotom mit einer Kunststoff-Abdeckung, Luftstrom (Abbildung 7) zu verhindern.
Hinweis: Luftstrom während der ultradünnen schneiden und Abruf der Abschnitte oft Probleme verursachen. Die Kunststoffabdeckung verfügt über drei Löcher: ein Loch ist für das Fernglas Objektive, und die beiden anderen Löcher sind für die Arme um den Betrieb zu ermöglichen, während der Deckel auf. Die hölzerne Armlehne dient für die Platzierung der Arme dabei heikle Arbeit, z. B. Abrufen von Schnittserien mit Gittern. Die hölzerne Armlehne befindet sich auf verschiedene Tabellen aus der Mikrotom-Tabelle (Abbildung 7, Pfeile), um nicht die Schwingung der Hände des Bedieners, Mikrotom zu übertragen. - Fang an zu schneiden die Probe bei 200 nm Dicke (Abbildung 8). Einstellung bei 200 nm Dicke sparen Zeit, darin das Messer an der Oberfläche der Probe.
- Nach den ersten Schnitt gesetzt die Schnittdicke bis 70 nm (Abbildung 8).
- Wenn die Anzahl der Schnittserien erreicht 20 (genau gesagt, nach der Band erreicht etwa 1,8 mm; die Anzahl der Abschnitte abhängig von der Breite der Abschnitte variiert), setzen die Schnittdicke bis 10 nm (Abbildung 8) gleichzeitig schneiden.
Hinweis: Da das Mikrotom 10 nm dicke Abschnitte schneiden kann, keine neuer Abschnitt erscheint, und die zuvor Zuschnitte von der Messerschneide getrennt werden. Es ist wichtig, um getrennte Abschnittsgruppen (Abbildung 9) für die Abholung Serienschnitte, Schwierigkeiten bei der Trennung von Abschnitten, die manuell über ein paar Haarsträhnen zu vermeiden. Da das Sichtfeld in der Transmissions-Elektronenmikroskop 2,0 mm ist, sollte Abschnitte höchstens 1,8 mm lang sein. - Legen Sie die Schnittdicke bis 60 nm (Abbildung 8). Dies wird 70 nm Abschnitte (Abbildung 8) produzieren, weil die Maschine die letzten 10 nm Dicke hinzufügen wird.
- Legen Sie die Schnittdicke wieder auf 70 nm (Abbildung 8) und das Schneiden fortsetzen, bis 1,8 mm lange Abschnitte erhalten sind.
- Wiederholen Sie 6,6-6,8 bis fünf 1,8 mm lange Abschnitte (Abbildung 9) erreicht werden. Wir machen in der Regel fünf Abschnittsgruppen, da gibt es fünf Probenhalter in der Transmissions-Elektronenmikroskop in unserem Labor zur Verfügung, aber fünf nicht das Limit ist.
7. Abholung Serienschnitte (Abbildung 10-12)
- Legen Sie die "Abschnitt-Holding-Schleife"23 (innerer Durchmesser der Schleife: 5,0 mm) (Abb. 10a) auf die dritte Abschnittsgruppe (Abbildung 10).
Hinweis: Es ist erforderlich, um die Abschnitte in der Reihenfolge ihrer schneiden zu fotografieren in der richtigen Reihenfolge abzurufen. Aber da auf dem Messer Boot gibt es fünf Abschnittsgruppen, ruft es oft verwirrend, welche Gruppen sind. Wenn Sie die Schleife auf der dritten Gruppe, wird klar, dass die beiden Gruppen in der Nähe der Betreiber sind die erste und zweite und entfernte zwei vom Betreiber sind die vierten und fünften Gruppen (Abbildung 10). Dadurch wird verhindert, die Reihenfolge vertauschen. - Legen Sie "Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife"23 (WSRL, Innendurchmesser der Schleife: 4,0 mm) (Abb. 11a) auf der Bühne Messer (Abbildung 11 b). Die WSRL wird fest auf der Messer-Bühne stehen, weil es mit einem Magneten an der Unterseite ausgestattet.
- Legen Sie die Schleife der WSRL oberhalb der Schnittserien durch bewegte seinen Schaft und Griff. Senken Sie die Schlaufe des WSRL auf die Wasseroberfläche, so dass die Schleife in den Abschnitten umkreist.
- Drücken Sie die Schleife durch Drehen der Schraube nach unten, so dass die Wasseroberfläche durch Oberflächenspannung (Zahlen 11 c-d) auslöst. Verschieben Sie den Abschnitt in der Mitte der Schleife, positionieren Sie es an die Spitze des Wassers und passen Sie die Richtung des Abschnitts mithilfe einer Haar-Strang-21.
- Abschnittsgruppen durch Berührung mit einem nackten Schlitz-Raster, die von einer Pinzette gehalten und immer parallel zur Wasseroberfläche (Abbildung 11 d) abholen. Es ist wichtig für Abschnitte, das Netz zuerst berühren nicht das Wasser, um Abschnitte genau in der Mitte des Rasters (Abbildung 11 d) zu platzieren.
- Legen Sie die Gitter mit Abschnitten zusammen mit einem Tropfen Wasser auf Formvar Unterstützung Film16 (Abbildung 12), und entfernen Sie überschüssiges Wasser mit Filterpapier.
Hinweis: Faltenbildung der die Trägerfolie ist oft ein Problem wenn Abschnitte mithilfe eines Rasters mit Trägerfolie abgeholt werden, weil Membran (Abschnitte) Membran (Trägerfolie) direkt berührt. Das Problem der immer Falten auf der Trägerfolie wird deutlich reduziert, indem ein Abschnitt tragenden Raster zusammen mit einem Tropfen Wasser auf die Formvar Unterstützung Film16.
(8) Färbung Abschnitte16,24 (Abbildung 13)
- Nach die Abschnitten vollständig getrocknet sind, reißen Sie den Formvar Film von rund um die Netze zu, und entfernen Sie die Gitter mit den Abschnitten.
- Legen Sie die Gitter in die Nut der die Färbung Rohr16 in der richtigen Reihenfolge (Abbildung 13), und Flecken Sie Abschnitte mit Uranyl Acetat und Blei Citrat24.
Hinweis: Befindet sich eine Nut 0,6 mm tief entlang der Längsachse des Rohres mit einer Rasierklinge geschnitten. Die Röhre ist nützlich zur Vermeidung versehentlichen Bruch der Unterstützung Filme Verwendung einer Pinzette, da direkte Handhabung von Grids während der Färbung und waschen Prozess16 entfällt.
9. Beobachtung der Schnittserien (Abbildung 14)
- Legen Sie die 5 Raster im Multi-Probenhalter in der richtigen Reihenfolge (Bild 14a), Ausrichtung der Längsachse der Raster Schlitz senkrecht zur Probe Halter. Die Griffe (Pfeilspitzen) der Netze müssen nicht geschnitten werden, da die Raster-Fixierer die Griffe nicht berührt werden.
- Befestigen Sie die Gitter mit "Raster-Fixierer" (Abb. 14 b) und der Transmissions-Elektronenmikroskop einfügen Sie Probenhalter.
Hinweis: Es ist oft nützlich, geringer Vergrößerung Bilder von allen Zellteile (Abbildung 15), interessante Mikroorganismen oder Zellen in gutem Zustand ohne Kontamination und mit gute Fixierung zu finden nehmen vor dem Fotografieren der Zielzelle. - Machen Sie Fotos von den Zielzellen in allen Zellteile bei hoher Vergrößerung.
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Representative Results
In diesem Protokoll wurden 3-Schlitz-Raster für die Abholung Schnittserien verwendet. Die Gitter sind aus Nickel oder Kupfer gefertigt. Die Schnittserien befinden sich auf den mittleren Schlitz. Die Schlitze auf beiden Seiten sind notwendig, um die Abschnitte anzuzeigen, wenn sie mit dem Netz aufnehmen. Um die Netze parallel mit der Schnittserien halten, wenn sie mit einer Pinzette (Abbildung 11 d) aufnehmen, ist der Griff gebogen (Abb. 6 c, rechts). Ein kleiner Griff ist vorteilhaft, um zu verhindern, Biegen des Hauptteils des Rasters, wodurch schwerwiegende Probleme in den Griff zu Abschnitten, und um zu vermeiden, fallen in den Abschnitten während der Färbung. Dieses Raster hat Vorteile gegenüber der herkömmlichen 2,0 x 1,0 mm Einloch-Raster. Nämlich, Abschnitte werden direkt von zwei Metall-Stangen-Abstand von 0,4 mm unterstützt (schmaler als 1,0 mm) und von der Trägerfolie Formvar in einem drei-Schlitz-Raster, während Abschnitte nur von der Trägerfolie in einem konventionellen Einloch-Raster unterstützt werden. Probe-Drift kann daher verhindert werden, bei hoher Vergrößerung mit einem drei-Schlitz-Raster zu fotografieren.
Abbildung 15 zeigt eine geringe Vergrößerung Ansicht von fünf Rastern, die Schnittserien tragen. Da jeder Abschnitt zusammenhält, ist es einfach die gleiche Zelle im nächsten Abschnitt auch bei stärkerer Vergrößerung zu finden. Abbildung 16 und 17 sind Beispiele für serielle Bilder von Zellteile. Da Teile sicher auf 3-Schlitz-Netze unterstützt werden, sind bei hoher Vergrößerung (x 50,000) leicht ohne Probe Drift fotografiert. Fasern von DNA 2 nm Durchmesser wurden in diesen Studien9,12fotografiert.
Abbildung 1 . Formvar Unterstützung Filmemachen Apparat. Die Hälfte der gläsernen Objektträger ist eingetaucht in Formvar Lösung in der oberen Spalte des Apparates durch die Lösung mit Luft durch "a" mit einem Gummiball drücken. Die Lösung ist aus der Spalte leer, durch die drei-Wege-Absperrhahn öffnen und loslassen Luft durch 'b', Druck zu verringern. (Übernommen aus: Yamaguchi und Adachi, 201119 mit Erlaubnis). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Methode für die Freigabe des Films aus dem Glas gleiten auf dem Wasser. (a) die vier Kanten des Films auf dem Objektträger sind mit Rasierklinge abgekratzt. (b) Formvar Film ist aus auf dem Wasser schwebte, durch eine Senkung der Objektträger in einem flachen Winkel langsam. (Übernommen aus: Yamaguchi und Adachi, 201119 mit Erlaubnis). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Formvar Trägerfolie auf einem Aluminium Gestell. (a) der Formvar Film ist mit einem Aluminium-Gestell aus dem Wasser hob. (b) das Gestell ist in den Exsikkator bis zum Gebrauch aufbewahrt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Trimmen des Probe-Blocks mit einem Ultraschall trimmen Klinge und eine Rasierklinge unter einem Stereomikroskop. (a) das Vorhandensein der Probe wird bestätigt durch die Beobachtung des Probe Blocks unter einem Lichtmikroskop. Der Block gezeigt in der Abbildung enthaltenen Mikroorganismen verbunden mit einer Skala-Wurm Chaeta (ca. 1,7 mm Länge) aus der Tiefsee12,14gesammelt. (b) trimmen Bühne. (c) Gesamtbild eines Stereomikroskops. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Trimmen des Probe-Blocks mit Diamant Messer mit Mikrotom. (a) Abbildung zum linken Rand schneiden. (b) das Block-Gesicht wird geschnitten, an einer Stelle von ca. 100 nm vom linken Rand der Probe. (c) Spiegel (Mesa Schnitt, M) auf der Messer-Bühne platziert. (d) Probenoberfläche. Beachten Sie, dass die Oberseite und der Unterseite des schlanken teils glatt und perfekt parallel sind. Beachten Sie auch, dass die Schulter geschnitten wird, um die Richtung des Schneidens (siehe Abbildung 8) zu markieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Neopren-Behandlung auf der Probenoberfläche. (a), das Futter Probe wieder in genau die ursprüngliche Position zu stellen, das Futter und Futter Inhaber Mikrotom mit einem Band versehen und Schneiden an der Grenze. (b) Benetzung die Probe mit Neopren-Lösung mittels Pasteurpipette. (c) 3-Schlitz Raster für die Abholung Schnittserien. Der Griff ist in 60 Grad Celsius, richtig gebogen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 . Kunststoff-Abdeckung der Mikrotom und hölzerne Armlehne. Die Plastikabdeckung ist nützlich, um Luftstrom während des ultradünnen schneiden zu vermeiden. Die hölzerne Armlehne ist dafür heikle Arbeit wie Abrufen von Schnittserien verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 . Einstellung der Schnittdicke und Abschnitte in die richtige Dicke zu erhalten. Nachdem die Anzahl der Schnittserien 20 erreicht hat, soll Schnittdicke bis 10 nm. Da das Mikrotom 10 nm dicke Abschnitte schneiden kann, keine neuer Abschnitt erscheint, und die zuvor Zuschnitte von der Messerschneide getrennt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9 . Beispiel für ultradünne Abschnitte durch das Protokoll erhalten. Beachten Sie, dass die fünf Gruppen von Schnittserien von etwa 1,8 mm lang nach dem Schneiden bereits getrennt sind. In diesem speziellen Fall ist die Farbe des Zentrums der ultradünnen Abschnitte gelblich wegen des Vorhandenseins der Probe. Die anderen Teile des Abschnitts, die nicht enthalten die Probe und des Harzes nur bestehen, sind in der Farbe Silber. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10 . "Abschnitt-Holding-Schleife". (a) Draufsicht (oberer Teil) und die Ansicht von unten (unterer Teil der Foto) der Schleife. (b) die Abschnitt-Holding-Schleife wird verwendet, um die dritte Gruppe von Schnittserien zu halten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 11 . Abruf von Schnittserien. (a) "Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife" (WSRL). Der Griff der Schleife kann aus dem Schacht entfernt werden, die beweglich ist. Die Schleife kann auch durch Drehen der Schraube oben oben und unten verschoben werden. (b) die WSRL ist auf der Bühne Messer durch einen Magneten fixiert. (c) Nähere Ansicht des (b). (d) schematische Darstellung der Schleife, Wasseroberfläche, Abschnitte und Raster beim Abrufen (Seitenansicht). Ultradünnen Abschnitte können durch eine Senkung der nackten Raster Parallel zu den ultradünnen Abschnitten genau an die Schlitz-Netz abgerufen werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 12 . Das Raster auf Formvar Film platziert. Das Gitter hält die Abschnitte befindet sich zusammen mit einem Tropfen Wasser auf dem Formvar Film auf Aluminium-Gestell. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 13 . Färbung Rohr16. Eine Nut 0,6 mm tief erfolgt entlang der Längsachse mit einer Rasierklinge. Netze werden in die Nut in der richtigen Reihenfolge platziert. Ein Ende des Rohres wird (Pfeilspitze) geschnitten, um seine Richtung zu markieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 14 . Platzieren die Gitter im Probenhalter. (a) die Netze werden im Probenhalter in der richtigen Reihenfolge platziert. (b) die Netze sind dann mit "Raster-Fixierer" fixiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 15 . Serienschnitte auf Schlitz Gitter montiert. Die Abbildung zeigt 18 bis 25 Abschnitte auf ein Gitter montiert. Die Zahlen in jedem Schlitz geben die Sequenz Zahl Anfang aus dem ersten Abschnitt. Der erste Abschnitt ist dicker als die anderen (siehe Abbildung 8). Beachten Sie, dass die Abschnitte miteinander verbunden sind und die gleiche Dicke haben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 16 . Serienschnitte von Parakaryon Myojinensis12. Die Zahlen am linken unteren geben die Reihenfolge gegenüber dem ersten Abschnitt. Die Abbildung zeigt 12 von 67 komplette Abschnitte. Diese Zelle zeigte sich eine große Nucleoid bestehend aus nackte DNA Fasern mit einem einzigen Nucleoid Membran und Endosymbionts, die Bakterien, aber keine Mitochondrien ähneln. Somit scheint dieses Organismus eine Zwischenform Leben von intramolekulare Eukaryote12weiterentwickelt werden. N, Nucleoid. Übernommen aus: Yamaguchi und Worman, 2014. 14 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 17 . Serienschnitte von Escherichia coli9. Die Zahlen am linken unteren geben die Reihenfolge gegenüber dem ersten Abschnitt. Die Abbildung zeigt 12 komplette Abschnitte. Diese Zelle wurde gefunden, um 21.700 Ribosomen9enthalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die hier vorgestellte Methode erfordert keine teure Ausrüstung. Es erfordert nur ein Alu-Rack (Abbildung 3), 3-Schlitz-Raster (Abbildung 6 c), Abschnitt-Holding Schleifen (Abb. 10a), Wasser-Oberfläche-Anhebung Schleife (Abbildung 11a) und eine Färbung Rohr (Abbildung 13). Es gibt viele Features des vorliegenden Verfahrens. Der große Teil der Probe wird verwendet, um die Probe Oberfläche und Messer Kante so einstellen, dass sie Parallel zueinander stehen. Serienschnitte werden in Gruppen zu Schwierigkeiten bei der trennende Abschnitte mit ein paar Haarsträhnen, wenn eine Gruppe von Serienschnitte auf den Schlitz-Netzen abgerufen werden geschnitten. Eine "Abschnitt-Holding-Schleife" wird verwendet, um zu vermeiden, mischen Sie die Reihenfolge der Abschnittsgruppen. Eine "Wasser-Oberfläche-Anhebung Schleife" wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Abschnitte auf der Spitze des Wassers positioniert sind und dass sie das Raster zuerst berühren, um sie in die gewünschte Position auf den Gittern zu platzieren. Formvar Trägerfolie auf ein Aluminium-Gestell wird verwendet, um die Abschnitte auf den Gittern zu erholen und zu vermeiden, Faltenbildung der die Trägerfolie erleichtert. Eine Färbung Röhre wird verwendet, um zu vermeiden, versehentlich brechen die Unterstützung-Filme mit einer Pinzette.
Vor kurzem wurde eine automatische Band sammeln regungsloses entwickelten25 Abschnitte automatisch für Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Bildgebung am Elektron-opak-Kunststoff-Bänder zu sammeln. Diese Methode kann zuverlässig Schnitt Tausende ultradünnen Abschnitte26, was nicht durch das vorliegende Verfahren möglich ist. Auch serielle Block Gesicht (SBF) 27 und Fokus Ionenstrahl (FIB)-SEM28 werden verwendet, um 3D Informationen von Zellen und Gewebe von Tieren sammeln. In diesen Methoden ist schneiden mit einer Diamant-Messer oder Fokus Ionenstrahl integriert in die SEM-Mikroskop und vollautomatisch, das erfordert keine speziellen Techniken durchgeführt. Obwohl diese Methoden nützlich sind, ist das Gerät so teuer, dass nicht viele Institutionen diese Maschinen zu kaufen. Auch, da diese Methoden SEM Foto Abschnitten beschäftigen, ist die Auflösung von den Mikrographen schlechter als das vorliegende Verfahren, das Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) beschäftigt. Diese Methoden können die einzelnen Ribosom Partikel, Mikrotubuli, beschäftigt und DNA Fasern derzeit nicht lösen.
Für die Structome Analyse von Mikroorganismen und für Ultrastrukturforschung Studie von unbekannten Mikroorganismen ist es notwendig, die Zellen und Zellbestandteile wie Zellwand, Plasmamembran, endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, Zellkern, Kernmembran beobachten, Chloroplasten, Plastiden, Golgi-Apparat, Ribosomen und faserigen Elementen mit hoher Auflösung. TEM Beobachtung der ultradünnen Schnittserien ist eine der wenigen Methoden, um eine solche Analyse in drei Dimensionen möglich. Da ultradünnen Abschnitte nach Beobachtung bei dieser Methode bleiben, kann der gleichen Gegend wiederholt beobachtet werden; Dies ist nicht möglich in SBF oder FIB-SEM, da die beobachteten Bereich nach Beobachtung verloren geht. Diese Funktion ist wichtig, Tiefsee Mikroorganismen zu studieren, es notwendig ist, suchen interessante Organismen bei kleiner Vergrößerung zuerst, und dann fotografieren seriell auf den Zielorganismus bei hoher Vergrößerung.
Zusammenfassend, serielle ultradünnen Stationspunkte Methode kann jetzt durchgeführt werden in eine einfache, preiswerte und Relaible Weg durch die vorliegende Studie, die für 3D Ultrastructual Studie der Mikroorganismen in hoher Auflösung in der Elektronenmikroskopie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken herzlichst Shigeo Kita für seine wertvollen Anregungen und Diskussionen. Wir danken auch John und Sumire Eckstein für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
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