Summary
Denne studien gir pålitelig og enkel prosedyrer for å få føljetong ultrathin deler av en microorganism uten dyrt utstyr i overføring elektronmikroskop.
Abstract
Observere celler og celle komponenter i tre dimensjoner på forstørring i overføring elektronmikroskop krever klargjør fortsettelsene ultrathin deler av prøven. Selv om forbereder føljetong ultrathin deler anses å være svært vanskelig, er det ganske lett hvis den passende metoden brukes. I dette papiret viser vi en fremgangsmåte for trygt å skaffe føljetong ultrathin deler av mikroorganismer. De viktigste punktene av denne metoden er: 1) store deler av prøven og justere prøven overflate og kniven kanten slik at de er parallelle med hverandre; 2) å kutte føljetong deler i grupper og unngå problemer med å skille delene med en hårstrå når du henter en gruppe føljetong deler på slit rutenettene; 3) bruke en "delen holder loop" og unngå å blande opp rekkefølgen på inndelingsgrupper; 4) for å bruke en "vann-overflaten-raising loop" og kontroller at delene er plassert på toppen av vannet og at de berører rutenettet først for å plassere dem i ønsket posisjon på nett; 5) bruke støtte filmen på en aluminium stativ og gjøre det enklere å gjenopprette avsnittene om rutenettene og å unngå rynker i støtte filmen. og 6) å bruke en flekker rør og unngå uhell bryte støtte filmene med pinsett. Denne nye metoden kan skaffe føljetong ultrathin inndelinger uten problemer. Metoden gjør det mulig å analysere celle strukturer av mikroorganismer i høy oppløsning i 3D, som kan oppnås ved hjelp av automatisk tape-innsamling ultramicrotome metode og føljetong blokk-ansikt eller fokusert ion strålen skanning elektronmikroskop.
Introduction
Riktig serielle ultrathin snitting teknikk er uunnværlig celler og celle komponenter tredimensjonalt på elektron mikroskopisk nivå. Vi har studert dynamikken i spindel pole kroppen i cellen syklus av gjærceller, og viste morfologiske endringer av deres ultrastructure under cellen syklus og tid duplisering1,2,3, 4,5. I 2006 vi laget et nytt ord "structome" ved å kombinere "structure" og "-ome', og omtaler det som"kvantitative og tredimensjonale strukturell informasjon for en hel celle på elektron mikroskopisk nivå" 6,7.
Av structome analyse, som krever føljetong ultrathin snitting teknikk, ble det funnet at en gjær celle Saccharomyces cerevisiae og Exophiala dermatitidis hadde ca 200.000 ribosomer7,8, en Escherichia coli celle hadde 26.000 ribosomer9, en Mycobacterium tuberculosis celle hadde 1700 ribosomer10 og Myojin spiral bakterier hadde kun 300 ribosomer11. Denne informasjonen er nyttig ikke bare beregne veksten i hver organisme, men også i identifisering av artene9.
Videre structome analysen ledet til oppdagelsen av en ny organisme; Parakaryon myojinensis ble funnet i den dype sjøen utenfor kysten av Japan, som cellestruktur var et mellomledd mellom de av prokaryoter og eukaryoter12,13,14,15. I dag anses føljetong ultrathin snitting teknikk så vanskelig at det ville ta lang tid å mestre. I denne studien har vi utviklet en pålitelig metode der alle kan utføre føljetong ultrathin snitting uten problemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Prøvene brukt i denne studien var mikroorganismer, raskt frosset med propan i flytende nitrogen, fryse erstattet i aceton som inneholder 2% osmium tetroxide og innebygd i epoxy harpiks1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,,14,,15,,16,,17,,18.
1. forberedelse støtte film (figur 1-3)
Merk: Sølvfargede Formvar støtte film laget av cast-på-glass metoden19.
- Legge til 100 mL 1,5% Formvar i etylen dichloride til en Formvar-making apparater (figur 1). Dypp halvparten av et glass lysbilde (76 mm x 26 x 1.3 mm) i Formvar løsning i den øverste kolonnen i apparatet ved å trykke løsningen med luft gjennom 'a' bruker en gummi ball19.
- Drain løsningen fra kolonnen ved å åpne treveis stopcock og slippe ut luft gjennom 'b' for å redusere trykket. Ta ut av objektglass fra apparatet og tørr luft å danne en film på overflaten av av objektglass. Bruk en glødepære for å akselerere tørking av Formvar filmen.
- Etter skrape av de fire kantene på filmen på objektglass med et barberblad (figur 2a), og puste inn i lysbildet til rette for separasjon av filmen fra lysbilde20, flyter ut filmen på vann ved leve av objektglass i den vann sakte på en lav horisontal vinkel (ca 10°, figur 2b).
- Scoop opp Formvar filmen fra vannet med en aluminium stativ (30 mm x 25 x 3 mm) med hull (4 mm i diameter) (figur 3a). Holde brettet med Formvar filmen i en desiccator til bruk (figur 3b).
2. trimming prøveblokken med en ultralyd trimming blad og barberblad 21 under en stereomicroscope (Figur 4)
- Kontroller at det er celler på overflaten av blokken ved å observere spissen av blokken med lys mikroskop (figur 4a).
- Montere prøveblokken i chuck (blokk holderen), og montere chuck på trimming scenen21 (figur 4b). Denne trimmetrinn har en belysning mekanisme fra baksiden av prøven.
- Trim blokken til en størrelse med 0,7 x 1.0 mm (tall 4 c, 5d). Siden epoxy harpiks er svært vanskelig, trim blokkene først bruker en ultralyd trimming blad. Ultralyd trimming bladet er en nylig introduserte maskin blokkene fjernes lett. Deretter trim blokken videre med et barberblad. Skjær en skulder for å markere retning kutte (se figur 5 d, Figur 8).
3. trimming prøveblokken med diamant kniv bruker mikrotomen (figur 5)
- Angi prøveblokken chuck i prøveholderen av ultramicrotome. Plasser prøven 90° mot klokken mot den faktiske posisjonen når føljetong ultrathin snitting er utført (se figur 5 d).
- Skjær overflaten av blokken med en diamant trimming kniv (se figur 5 d). Angi kniveggen diamant parallelt prøven blokk ansiktet, og kuttet minimum av prøveoverflaten for ikke å miste noen prøven (figur 5 d).
Merk: Dette trinnet er gjort for å smoothen prøveoverflaten. Delen av prøveoverflaten av slim er intakt (derfor denne delen ikke skinner som et speil, figur 5 d), for ikke å miste deler av prøven føljetong snitting. Dette skyldes at prøven er utsatt på overflaten av blokken. - Plassere et speil (Mesa kutt, M) på kniv scenen å overvåke skjæringen av prøveblokken (figur 5 c).
- Kuttet venstre kant (dette blir oversiden, figur 5 d, i eksemplet i seriell snitting) av blokken med trimming kniven ved å rotere kniv scenen 30 ° til venstre (figur 5a).
- Kuttet blokk ansiktet på rundt 100 µm fra venstre kant av prøven (dette blir nedre side av prøven i seriell snitting figur 5 d) ved å rotere kniv scenen 30 ° til høyre (figur 5b).
Merk: Føljetong delene vil bli kuttet fra den slanke delen av prøven på 90 nm x ca 1 mm i størrelse. Den store delen brukes til å justere prøveoverflaten og kniveggen slik at de er parallelle. Etter justering prøveoverflaten for å være parallell kniveggen, fjernes store deler med et barberblad. Ved å kutte de øvre og nedre sidene av prøven ved hjelp av mikrotomen, blir begge sider av prøven jevn og nøyaktig parallell til hverandre (figur 5 d), som er nødvendig for å få rett og ubrutt bånd deler.
4. justere prøven overflate og kniven kanten slik at de står overfor parallelt med hverandre 21
- Fjerne trimming kniven, og roter prøveblokken 90 grader med klokken.
- Angi en supertynn snitting kniv kniv scenen.
- Juster prøveoverflaten og kniveggen slik at de står overfor parallelt med hverandre ved hjelp av store deler av prøveoverflaten.
Merk: Store deler av prøven brukes for justering fordi kutte overfor føljetong snitting er så liten, gjør det vanskelig å justere prøven overflaten og kniv kant med denne delen, spesielt i vertikal retning. Dermed enkelt bruker store deler av prøven justering.
5. spre neopren løsning på prøveblokken (figur 6)
- For å plassere prøven chuck på nøyaktig samme sted som den opprinnelige posisjonen, bruke tape på chuck og chuck innehaver av mikrotomen og klipp grensen (figur 6a).
- Ta prøven chuck ut av mikrotomen, og plassere den under stereomicroscope (figur 6b). Kuttet av store deler av prøven med et barberblad, forlater den slanke delen, som føljetong deler oppnås.
- Bruker en Pasteur pipette, slipp ca 1 µL 0,5% neopren løsning (figur 6b) på å brukes Føljetong snitting for å lage delen sider limet. Dekk hele prøven med neopren løsning. Absorbere overflødig neopren løsning umiddelbart med filter papir plassert nær prøven. Får et bånd av deler er avgjørende for å ta bilder av føljetong celle deler neopren lim er svært nyttig for stikker delene sammen.
- Forberede 3-spalte rutenett (størrelser av åpninger: midten 0.4 mm x 2,2 mm, begge sider 0,2 x 2,2 mm) (figur 6 c) for å plukke opp serielle inndelinger ved å bøye håndtaket på rutenettet til 60 °, behandle rutenett med 0,5% neopren løsning, og gjør rutenettene hydrofile av glød utslipp22.
6. å gjøre føljetong deler (figur 7-9)
- Sted prøveblokken kaste tilbake på mikrotomen på samme sted som 5.1 (figur 6a) ved å justere teipet deler. Dette holder blokk ansiktet og kniveggen perfekt parallell til hverandre. Så ta kniven nær prøven.
- Fylle kniv båten med vann.
- Dekk mikrotomen med et plastdeksel å hindre luftstrømmen (figur 7).
Merk: Luftstrømmen ultrathin snitting og henting av ofte føre til problemer. Plastdekselet har tre hull: ett hull er for kikkert linser, og de andre to hullene for armene å tillate operasjon mens dekselet er på. Tre armrest brukes til å plassere armene mens de gjør delikat arbeid, som henting av føljetong seksjoner med rutenett. Tre armrest er plassert på forskjellige tabeller fra mikrotomen tabellen (figur 7, piler), for ikke å overføre vibrasjoner i hender til mikrotomen. - Begynne å klippe prøven på 200 nm snittykkelsen (Figur 8). Innstillingen på 200 nm tykkelse vil spare tid med å bringe kniven på overflaten av prøven.
- Etter den første delen er kuttet, angi snittykkelsen til 70 nm (Figur 8).
- Når antall serielle deler når 20 (nøyaktig sett, etter den bånd når ca 1,8 mm; antall deler varierer avhengig av bredden på deler), satt snittykkelsen til 10 nm (Figur 8) mens du fortsetter å kutte.
Merk: Siden mikrotomen kan klippe ut 10 nm-tykk seksjoner, ingen ny del vises, og delene tidligere kuttet atskilt fra kniveggen. Det er viktig å få atskilt inndelingsgrupper (figur 9) for å plukke opp serielle deler å unngå problemer med å skille delene manuelt ved hjelp av et par hårstrå. Siden synsfelt i elektronmikroskop overføring er 2.0 mm, bør deler være 1,8 mm lang høyst. - Angi snittykkelsen til 60 nm (Figur 8). Dette vil gi 70 nm deler (Figur 8) fordi maskinen vil legge forrige 10 nm tykkelsen.
- Angi snittykkelsen tilbake til 70 nm (Figur 8) og fortsette kutte til 1,8 mm lange deler er oppnådd.
- Gjenta 6.6-6.8 til fem 1,8 mm lange deler hentes (figur 9). Vi gjør vanligvis fem inndelingsgrupper siden det finnes fem prøven holdere i elektronmikroskop overføring i vår lab, men fem er ikke grensen.
7. plukke opp serielle deler (Figur 10-12)
- Plasser "delen holder loop"23 (indre diameter av loopen: 5.0 mm) (figur 10a) på den tredje gruppen (figur 10b).
Merk: Det er nødvendig å hente delene i deres snitting å ta bilder i riktig rekkefølge. Men siden det er fem inndelingsgrupper på kniv båten, blir det ofte forvirrende hvilke grupper er som. Ved å plassere loopen på den tredje gruppen, blir det klart at de to gruppene nær operatøren er først og andre, og fjerne to fra operatøren er de fjerde og femte gruppene (figur 10b). Dette hindrer blander opp rekkefølgen. - Plasser "vann-overflaten-raising loop"23 (WSRL, indre diameter av loopen: 4.0 mm) (figur 11a) på kniv scenen (figur 11b). WSRL vil stå fast på kniv scenen fordi den er utstyrt med en magnet i bunnen.
- Plass løkken av WSRL like over delene føljetong ved å flytte sin aksling og håndtak. Senk løkken av WSRL på vannflaten slik at løkken omkranser delene.
- Skyv loopen ned ved å dreie skruen nedover slik at vannflaten vil heve av overflatespenning (tall 11c-d). Flytte avsnittet til midten av loopen, plasser den på toppen av vannet og Juster retningen for inndelingen ved hjelp av hår strand21.
- Plukke opp inndelingsgrupper ved å berøre det et nakent slit-rutenett, som er holdt av pinsett og holdt parallelt vannflaten (Figur 11 d). Det er viktig for deler å berøre rutenettet først ikke vannet, plassere deler nettopp på midten av rutenettet (Figur 11 d).
- Plasser rutenettene inndelinger sammen med en liten dråpe vann på Formvar støtte filmen16 (Figur 12), og fjerne overflødig vann med filter papir.
Merk: Rynker i støtte filmen er ofte et problem når delene er plukket opp med et rutenett med støtte filmen fordi membran (avdelinger) berører membran (støtte film) direkte. Problemet med å få rynker på støtte filmen reduseres betydelig ved å plassere et delen rentebærende rutenett med en liten dråpe vann på Formvar støtte filmen16.
8. farging deler16,24 (figur 13)
- Når delene er helt tørket, rive den Formvar filmen fra rundt rutenettene og fjerne rutenettene bærende delene.
- Angi rutenettene i sporet av flekker tube16 i riktig rekkefølge (figur 13), og flekken deler med uranyl acetate og bly citrate24.
Merk: Det er en groove 0.6 mm dyp langs den lange aksen av røret kuttet med et barberblad. Røret er nyttig for å hindre utilsiktet brudd støtte filmer når ved hjelp av pinsett, siden direkte håndtering av rutenett ikke er nødvendig under flekker og vask prosessen16.
9. observasjon av føljetong deler (figur 14)
- Angi 5 rutenettene i flere prøveholderen i riktig rekkefølge (figur 14a), orientere den lange aksen av rutenettet slit vinkelrett på den prøve holderen aksen. Håndtakene (pilspisser) av rutenettene har ikke kuttes, fordi "rutenett-fiksere" ikke vil røre håndtakene.
- Fastsette rutenettet med "rutenett-fiksere" (figur 14b) og sett prøveholderen inn transmission elektron mikroskop.
Merk: Det er ofte nyttig å lav forstørrelse bilder av alle cellen inndelinger (Figur 15) å finne interessante mikroorganismer eller celler i god stand med ingen forurensning og god fiksering, før du tar bilder av målcellen. - Ta bilder av målcellene i alle celle deler på forstørring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen, ble tre-spalte rutenett brukt for å plukke opp serielle deler. Rutenettet er laget av nikkel eller kobber. Delene føljetong plasseres midt slit. Åpninger på begge sider er nødvendig å vise avsnittene når plukke dem opp med rutenett. Håndtaket er bøyd for å holde rutenettene parallelt med delene føljetong når plukke dem opp med pinsett (Figur 11 d), (figur 6 c, høyre). En liten hånd er en fordel å hindre bøye av hoveddelen av rutenettet, som fører til alvorlige problemer med å plukke opp deler, og å hindre slippe delene under fargingen. Dette rutenettet har fordeler fremfor konvensjonelle 2,0 x 1.0 mm single-hull rutenettet. Nemlig inndelinger støttes direkte av to metallstenger 0.4 mm fra hverandre (smalere enn 1.0 mm) og Formvar støtte filmen i et tre-spalte rutenett, mens deler støttes bare av støtte filmen i et vanlig single-hull rutenett. Prøven drift kan derfor forebygges i fotografere på forstørring ved hjelp av en tre-spalte rutenettet.
Figur 15 , viser en lav forstørrelse visning av fem rutenett som bærer føljetong deler. Siden hver del pinner sammen, er det lett å finne samme celle i avsnittet selv på høyere forstørrelse. Figur 16 og 17 er eksempler på serielle bilder av cellen. Fordi inndelinger støttes sikkert på 3-spalte rutenett, tas lett bilder på forstørring (x 50,000) uten prøven drift. Fibre av DNA 2 nm i diameter ble fotografert i disse studiene9,12.
Figur 1 . Formvar støtte filmregissør apparater. Halvparten av av objektglass er dyppet i Formvar løsning i den øverste kolonnen i apparatet ved å trykke løsningen med luft gjennom 'a' bruker en gummi ball. Løsningen er drenert fra kolonnen ved å åpne treveis stopcock og slippe ut luft gjennom 'b' for å redusere trykket. (Gjengitt fra Yamaguchi og Adachi, 201119 med tillatelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Metoden for å slippe filmen fra glass skyve vann. (a) fire kanter av filmen på av objektglass er skrapt av bruker barberblad. (b) Formvar filmen er fløt av på vannet ved å senke av objektglass sakte på en lav vinkel. (Gjengitt fra Yamaguchi og Adachi, 201119 med tillatelse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Formvar støtte filmen på en aluminium stativ. (a) Formvar filmen er øses opp fra vannet med en aluminium rack. (b) rack er holdt i desiccator før bruk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Trimming av prøveblokken med en ultralyd trimming blad og et barberblad under en stereomicroscope. (a) tilstedeværelsen av prøven bekreftes ved å observere prøveblokken under lys mikroskop. Blokken vises i figur inneholdt mikroorganismer knyttet en skala-orm chaeta (ca 1,7 mm i lengde) samlet fra de dype sjø12,14. (b) trimmetrinn. (c) hele bildet av en stereomicroscope. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Trimming av prøveblokken med diamant kniv bruker mikrotomen. (a) illustrasjon oppklippsm venstre kant. (b) blokk ansiktet er skåret på en posisjon på ca 100 nm fra venstre kant av prøven. (c) en speilet (Mesa kutt, M) plassert på kniv scenen. (d) prøveoverflaten. Merk at siden øvre og nedre side av den slanke delen er myk og perfekt parallell. Merk også at skulderen er kuttet til å markere retning kutte (se Figur 8). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Neopren behandling på prøveoverflaten. (a) for å plassere prøven chuck tilbake på nøyaktig den opprinnelige posisjonen, er chuck chuck innehaver av mikrotomen merket med et bånd og klipp grensen. (b) wetting prøven med neopren løsning bruker Pasteur pipette. (c) tre-spalte rutenett for å plukke opp serielle deler. Håndtaket er bøyd til 60 grader (c, høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 . Plastdekselet mikrotomen og tre armrest. Plastdekselet er nyttig å hindre luftstrømmen under ultrathin snitting. Tre armrest brukes gjør delikat arbeid som henter føljetong deler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 . Angi snittykkelse og få deler riktig tykkelse. Etter antall serielle deler har nådd 20, snittykkelsen stilles til 10 nm. Siden mikrotomen kan klippe ut 10 nm-tykk seksjoner, ingen ny del vises, og delene tidligere kuttet atskilt fra kniveggen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 . Eksempel på ultrathin deler innhentet via protokollen. Merk at i fem grupper av seriell ca 1,8 mm lang er allerede delt etter klipping. I dette tilfellet er fargen på midten av delene ultrathin gulaktig av prøven. Andre deler av inndelingen som ikke inneholder prøven og består av harpiks bare, er sølv i farge. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10 . "Delen holder loop". (a) ovenfra (øverst) og nedenfra (nedre del av bildet) av løkken. (b) delen holder loop brukes til å holde den tredje gruppen av føljetong. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11 . Henting av føljetong. (a) "vann-overflaten-raising loop" (WSRL). Håndtaket av loopen kan fjernes fra akslingen, som er bevegelig. Løkken kan også flyttes opp og ned ved å dreie skruen toppen. (b) WSRL er fast på kniv scenen av en magnet. (c) nærmere utsikt over (b). (d) diagram av loopen, vannflaten, deler og rutenett under henting (sidevisning). Supertynn inndelinger kan hentes til splitten rutenettet ved å senke den nakne rutenett parallelt ultrathin delene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12 . Plassere rutenettet på Formvar film. Rutenettet holdt seksjonene plasseres sammen med en liten dråpe vann på Formvar filmen på aluminium stativ. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13 . Farging rør16. En groove 0.6 mm dyp gjøres langs den lange aksen med et barberblad. Rutenett er plassert i sporet i riktig rekkefølge. Ene enden av røret er kuttet (pilen leder) for å markere sin retning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 14 . Plassere rutenettene i prøveholderen. (a) rutenettene er plassert i prøveholderen i riktig rekkefølge. (b) rutenett er så fast med "rutenett-fiksere". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 15 . Seriell deler montert på slit rutenett. Figuren viser 18 til 25 deler montert på et rutenett. Tallene i hver spalte angi sekvens tall begynnelsen fra den første delen. Den første delen er tykkere enn de andre (se Figur 8). Merk at delene er knyttet sammen og har samme tykkelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 16 . Seriell deler av Parakaryon myojinensis12. Numrene nederst til venstre angir sekvensen i forhold til den første delen. Figuren viser 12 av 67 hele inndelinger. Denne cellen ble funnet for å ha en stor nucleoid bestående av nakne DNA fibre, med en enkelt nucleoid membran, og endosymbionts som ligner bakterier, men ingen mitokondrier. Derfor synes denne organismen å være en mellomliggende livsform utvikler seg fra ifølge eukaryoter12. N, nucleoid. Gjengitt fra Yamaguchi og Worman, 2014. 14 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 17 . Seriell deler av Escherichia coli9. Numrene nederst til venstre angir sekvensen i forhold til den første delen. Figuren viser 12 hele inndelinger. Denne cellen ble funnet for å inneholde 21,700 ribosomer9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteres her krever ingen dyrt utstyr. Det krever bare en aluminium stativ (Figur 3), tre-spalte rutenett (figur 6 c), delen holder looper (figur 10a), vann-overflaten-raising loop (figur 11a) og en flekker tube (figur 13). Det er mange funksjoner i metoden finnes. Store deler av prøven brukes til å justere prøven overflate og kniven kanten slik at de står overfor parallelt med hverandre. Seriell deler er kuttet i grupper for å unngå problemer med skiller inndelingene med et par hårstrå når du henter en gruppe føljetong deler på slit rutenettet. En "delen holder loop" brukes til å unngå å blande opp rekkefølgen av inndelingsgruppene. En "vann-overflaten-raising loop" brukes til å sikre delene er plassert på toppen av vannet og at de berører rutenettet først for å plassere dem i ønsket plassering på rutenettet. Formvar støtte filmen på en aluminium stativ brukes til å gjøre det enklere å gjenopprette avsnittene om rutenettene og å unngå rynker i støtte filmen. En flekker rør brukes til å unngå uhell bryte støtte filmene med pinsett.
Nylig var en automatisk tape-innsamling ultramicrotome utviklet25 å samle deler for automatisk skanning elektronmikroskop (SEM) imaging på elektron-ugjennomsiktig plast bånd. Denne metoden kan pålitelig kutt tusenvis ultrathin avsnitt26, hvilke er ikke mulig ved metoden finnes. Også seriell blokk ansiktet (SBF) 27 og fokus ion strålen (FIB)-SEM28 brukes til å samle 3D-informasjon celler og vev av dyr. I disse metodene, er snitting med en diamant kniv eller fokus ion strålen integrert i SEM mikroskopet og gjennomført på en helt automatisk måte som krever ingen spesielle teknikker. Selv om disse metodene er nyttige, er apparatet så dyrt at ikke mange institusjoner kjøpe disse maskinene. Også, siden disse metodene ansetter SEM fotografi delene, oppløsning av micrographs er dårligere enn nåværende metoden som benytter overføring elektronmikroskop (TEM). Disse metodene kan ikke løse den personlige ribosom partikler, piskehale som henger, microfilaments og DNA fiber i dag.
Structome analyse av mikroorganismer og ultrastructural studie av ukjent mikroorganismer er det nødvendig å observere celler og celle komponenter som cellen vegg, plasma membran, mitokondrier, kjernen, kjernefysiske membraner, endoplasmatiske retikulum, Chloroplasts, plastids, Golgi apparatet, ribosomer og trådformede elementer med høy oppløsning. TEM observasjon av føljetong ultrathin deler er en av noen metoder for å muliggjøre slik analyse i tre dimensjoner. Fordi ultrathin inndelinger beholdes etter observasjon i denne metoden, kan samme område observeres gjentatte ganger; Dette er ikke mulig i SBF eller LØGN-SEM, siden observert området går tapt etter observasjon. Denne funksjonen er viktig å studere havfiske mikroorganismer der det er nødvendig å søke interessant organismer på lav forstørrelse først, og deretter ta bilder serielt på målet organismen forstørring.
Avslutningsvis føljetong ultrathin snitting metoden kan nå utføres i en enkel, billig, og relaible måte av studien, som er avgjørende for 3D ultrastructual studie av mikroorganismer i høy oppløsning i elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker hjertelig Shigeo Kita for hans verdifulle forslag og diskusjon. Vi også takke John og Sumire Eckstein for deres kritisk lesning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
