Summary
이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.
Abstract
셀 및 전송 전자 현미경 검사 법에서 고배율에서 3 차원 구성 요소 셀을 관찰 표본의 직렬 ultrathin 섹션을 준비 해야 합니다. 직렬 ultrathin 섹션 준비는 매우 어려운 것으로 간주 됩니다, 하지만 그것은 오히려 쉬운 경우 적절 한 메서드를 사용 하입니다. 이 종이에 우리는 안전 하 게 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 단계별 절차를 보여줍니다. 이 방법의 핵심 포인트는: 1)는 시료의 큰 부분을 사용 하 여 견본 표면 및 칼 가장자리; 서로 평행 하 게 되도록 조정 하 2)을 그룹에서 직렬 섹션을 잘라내어 슬릿 격자;에 직렬 섹션의 그룹을 검색할 때 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 3) '섹션 지주 루프'를 사용 하 여 섹션 그룹;의 순서를 혼합 하지 마십시오 4) 사용 하 여 '물 표면 높이 루프' 확인 섹션의 꼭대기에 위치 하는 그들은 터치 그리드 첫째, 격자;에 원하는 위치에 배치 하려면 5) 사용 하 여 지원 영화는 알루미늄 선반에 쉽게 격자에 섹션을 복구 하 고 지원 영화;의 주름을 방지 하 그리고 6) 얼룩 튜브를 사용 하 여 실수로 핀셋으로 지원 영화를 위반을 피하기 위해. 이 새로운 메서드는 어려움 없이 직렬 ultrathin 섹션을 취득 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 3d, 집중 된 이온 빔 전자 현미경 검사 및 직렬 블록-얼굴 또는 자동 테이프 수집 ultramicrotome 메서드를 사용 하 여 얻을 수 없는 높은 해상도에서 미생물의 세포 구조를 분석 가능 하 게.
Introduction
적절 한 직렬 ultrathin 단면 기술은 세포와 세포 구성 요소 전자 현미경 수준에서 3 차원으로 공부에 불가결 이다. 우리 효 모 세포의 세포 주기에서 스핀 들 극 본문의 역학을 공부 하 고 세포 주기 및 중복1,2,3, 의 시간 동안 그들의 열 대권 외의 형태학 변화 공개 4,5. 2006 년에, 우리는 '구조'를 결합해 새로운 단어 'structome'를 만들어낸와 '-오 ', '양적 및 3 차원 구조 정보 전자 현미경 수준에 전체 셀의 ' 6,7로 정의.
Structome 분석, 직렬 ultrathin 단면 기술을 요하는 그것 발견 Saccharomyces cerevisiae 와 Exophiala dermatitidis 효 모 세포 약 200000 리보솜7,8, 는 했다 대장균 셀 26000 리보솜9, 결핵균 셀 했다 1700 리보솜10 고 묘 진 나선형 박테리아만 300 리보솜11했다. 이 정보 뿐만 아니라 각 유기 체 뿐만 아니라 종9의 성장 율을 예측에 유용 합니다.
또한, 새로운 유기 체;의 발견에 지도 하는 structome 분석 Parakaryon myojinensis 는 누구의 셀 구조 원핵생물과 진핵생물12,13,,1415의 그들 사이 중간 했다 일본의 해안 떨어져 깊은 바다에서 발견 되었다. 현재, 직렬 ultrathin 단면 기술 너무 어려운 마스터 오랜 시간이 걸릴 것으로 간주 됩니다. 이 연구에서는 아무도 직렬 ultrathin 단면 어려움 없이 수행할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 개발 했습니다.
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Protocol
참고:이 연구에 사용 된 표본은 미생물, 액체 질소, 프로 판으로 급속 하 게 냉동 동결 2% 오스뮴 tetroxide, 포함 된 아세톤에 대체 및 에폭시 수 지1,2,3,에에서 포함 된 4,5,6,7,,89,10,11,12,13 ,,1415,,1617,18.
1. 지원 영화 (그림 1-3)의 준비
참고: 은색 Formvar 지원 영화 캐스팅에 유리 방법19를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다.
- 100 mL 1.5%의 추가 Formvar Formvar 만드는 장치 (그림 1)을 에틸렌 dichloride에. 공기 고무 공19를 사용 하 여 'a'를 통해 솔루션을 눌러 유리 슬라이드 (76 m m 26 m m x 1.3 m m x) 기구의 상단 열에서 Formvar 솔루션에서의 절반을 찍어.
- 3-방법으로 자 지를 열고 공기 압력을 줄이기 위해 'b'를 발표 하 여 열에서 솔루션을 배출. 유리 슬라이드 표면에 필름 형태의 유리 슬라이드와 공기에서 건조 장치에서 꺼내 주세요. 백열 램프를 사용 하 여 Formvar 영화의 건조를 가속.
- 영화 (그림 2a), 면도날으로 유리 슬라이드에 4 개의 가장자리에서 근 근이, 슬라이드20에서 영화의 분리를 촉진 하기 위해 슬라이드에 호흡으로 유리 슬라이드를 immersing 하 여 물에 영화에서 부동 하는 후에 물이 천천히 낮은 수평 각도 (약 10 °, 그림 2b).
- 구멍 (지름 4 mm) 알루미늄 랙 (25 m m x 3 m m x 30)를 사용 하 여 물에서 Formvar 영화 올리다 (그림 3a). 사용 (그림 3b)까지 한 desiccator Formvar 영화와 함께 랙 유지.
2. 초음파 트리밍 블레이드와 면도날 21 stereomicroscope (그림 4)에서 표본 블록 트리밍
- 셀 블록의 표면에는 블록의 끝 (그림 4a) 가벼운 현미경으로 관찰 하 여 다는 것을 확인 하십시오.
- 척 (블록 홀더), 표본 블록을 탑재 하 고 트리밍 단계21 (그림 4b)에 물림 쇠를 탑재. 이 트리밍 단계는 표본 뒤쪽에서 조명 메커니즘이 있습니다.
- 0.7 m m x 1.0 m m (그림 4, 5)의 크기에 블록을 잘라. 에폭시 수 지 매우 하드 이기 때문에, 먼저 초음파 트리밍 블레이드를 사용 하 여 블록을 잘라. 초음파 트리밍 블레이드는 새로 도입된 된 기계 이며 블록 쉽게 잘립니다. 다음에 면도날으로 더 블록 트림. (참조 그림 5 d, 그림 8) 절단의 방향을 표시 한 어깨를 잘라.
3. 톰 (그림 5)를 사용 하 여 다이아몬드 칼으로 표본 블록 트리밍
- ultramicrotome의 견본 홀더 척 견본 블록 설정 합니다. 장소는 표본 90도 시계 반대 방향으로 직렬 ultrathin 단면 때 실제 위치에 대 한 수행 (참조 그림 5 d).
- 다이아몬드 트리밍 나이프 (참조 그림 5 d)와 블록의 표면을 잘라. 다이아몬드 칼 날 견본 블록 얼굴에 평행 하 게 설정 하 고 어떤 견본 (그림 5 d)을 잃을 수 없습니다 견본 표면의 최소 금액을 잘라.
참고:이 단계 표본 표면을 매끄럽게 수행 됩니다. 슬림 부분의 견본 표면의 일부는 그대로 (따라서이 부분은 아니라 처럼 빛나는 거울, 그림 5 d), 직렬 단면에 대 한 표본의 일부를 잃을 수 없습니다. 이것은 표본 블록의 표면에 노출 되어 있기 때문 에입니다. - 표본 블록 (그림 5c)의 절단을 모니터링 하는 데 칼 스테이지의 거울 (메사 컷, M)를 배치 합니다.
- 잘라 칼 무대 왼쪽 (그림 5a)에 30 ° 회전 하 여 트리밍 나이프를 사용 하 여 블록의 왼쪽된 가장자리 (이것은 상단에, 그림 5 d, 직렬 단면에 샘플의 된다).
- 칼 무대 오른쪽 (그림 5b)에 30 ° 회전 하 여 표본 (이 됩니다 직렬 단면, 그림 5 d에 견본의 더 낮은 측)의 왼쪽된 가장자리에서 약 100 µ m에서 블록 얼굴을 잘라.
참고: 직렬 섹션은 약 90의 견본의 슬림 부분에서 삭감 될 것 이다 nm 크기에서 약 1 m m x. 큰 부분은 평행 되도록 견본 표면 및 칼 날을 조정 하기 위해 사용 됩니다. 칼 날에 평행 되도록 견본 표면 조정 후 큰 부분 면도날으로 제거 됩니다. 톰을 사용 하 여 견본의 상단 및 하단 측면을 절단 하 여 표본 양쪽 모두 될 원활 하 고 정확 하 게 서로 평행 하 게 (그림 5 d)는 직선과 끊어지지 리본 섹션을 얻을 필요가 있다.
4. 조정 견본 표면 및 칼 가장자리를 서로 21 병렬 마주
- 트리밍 나이프를 제거 하 고 표본 블록 시계 방향으로 90 ° 회전.
- 칼 단계로 ultrathin 단면 나이프를 설정 합니다.
- 서로 견본 표면의 큰 부분을 사용 하 여 병렬 마주 견본 표면 및 칼 날을 조정 합니다.
참고: 큰 표본 부분의 사용 됩니다 조정 직렬 단면 절단 얼굴 너무 작습니다, 어렵게 견본 표면 및 칼 지만,이 부분을 사용 하 여 수직 방향에 특히 조정 때문에. 따라서, 표본의 큰 부분을 사용 하 여 쉽게 조정 합니다.
5. 견본 블록 (그림 6)에 네오프렌 솔루션 확산
- 원래 위치와 정확히 같은 위치에 견본 척을 배치 하는 척 척 홀더는 톰의에 테이프를 적용 하 고 경계 (그림 6a)에서 잘라.
- 톰에서 표본 척 밖으로 하 고 stereomicroscope (그림 6b)에서 그것을 배치. 면도날으로 견본의 큰 부분을 잘라, 슬림 부분 직렬 섹션에서 떠나는 것입니다 얻을 수 있습니다.
- 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 섹션 측 접착제 있도록 직렬 단면에 사용할 표본에 약 1 µ L 0.5 %neoprene 솔루션 (그림 6b) 드롭. 커버 neoprene 솔루션 전체 표본. 필터 종이 시료 근처에 배치와 함께 과잉 neoprene 솔루션을 즉시 흡수. 섹션의 리본을 얻기 직렬 셀 섹션의 사진 촬영을 위한 필수적 이며 neoprene 접착제 섹션을 함께 튀어나와 매우 유용.
- 준비 3-슬릿 격자 (슬릿의 크기: 중간, 0.4 m m x 2.2 m m, 모두 양쪽 0.2 m m x 2.2 m m) (그림 6c) 60 ° 격자의 핸들 여 직렬 섹션을 따기 위한 치료 0.5 %neoprene 솔루션, 격자 및 격자에 의해 친수성 만들기 글로우 방전22.
6. 직렬 섹션 (그림 7-9)
- 장소 견본 블록 녹화 부분을 정렬 하 여 5.1 (그림 6a)와 같은 위치에서 톰에 다시 척. 이 블록 얼굴과 칼 날 완벽 하 게 서로 평행 하 게 유지합니다. 다음에 견본에 가까운 칼가지고.
- 물으로 칼 보트를 채우십시오.
- 공기 (그림 7)를 방지 하기 위해 플라스틱 커버는 톰을 커버.
참고: 공기 ultrathin 단면화 및 섹션의 자주 검색 하는 동안 문제가 발생할. 플라스틱 덮개는 3 개의 구멍: 한 구멍 쌍 안 렌즈 이며 다른 두 구멍 덮개에 사용 하는 동안 작업을 허용 하도록 무기에 대 한. 나무 팔걸이 격자와 직렬 섹션을 검색 하는 등 섬세 한 작업을 하 고 있는 동안 무기를 배치 하는 데 사용 됩니다. 나무 팔걸이 톰 연산자의 손의 진동 전송 수 없습니다 톰 테이블 (그림 7, 화살표), 다른 테이블에 배치 됩니다. - 200 nm 섹션 두께 (그림 8)에 시료를 절단 시작 합니다. 200 nm 두께 시료의 표면에 칼을 데 려에 시간을 절약할 것 이다.
- 첫 번째 섹션을 잘라 후 설정 섹션 두께 70 nm (그림 8).
- 직렬 섹션의 수에 (정확 하 게 말하기, 약 1.8 m m; 섹션의 수에 따라 섹션의 폭의 리본에 도달 후) 20를 도달 하는 경우, 설정 섹션 두께 10 nm (그림 8)을 계속 하는 동안.
참고: 이후는 톰 10 nm 두꺼운 섹션을 잘라낼 수 없는, 아니 새로운 섹션 나타나고 이전 컷된 섹션에서 칼 날 분리 되. 그것은 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 수동으로 섹션 구분에 어려움을 피하기 위해 직렬 섹션을 따기 위한 분리 된 섹션 그룹 (그림 9)를 얻는 것이 중요. 전송 전자 현미경에서 시야 2.0 m m 이므로, 섹션에서 가장 긴 1.8 m m 이어야 한다. - 설정 섹션 두께 60 nm (그림 8). 이 기계는 이전 10 nm 두께 추가 합니다 때문에 70 nm 섹션 (그림 8)을 생산할 예정 이다.
- 섹션 두께 70 다시 설정 nm (그림 8) 절단 1.8 m m 긴 섹션 얻을 때까지 계속.
- 6.6-6.8를 반복 하 여 1.8 m m 긴 섹션 5 (그림 9) 얻을 수 있습니다. 우리가 일반적으로 이후 5 견본 홀더 전송 전자 현미경에서 우리의 실험실에서 사용할 수 있지만 5도 아니다 5 섹션 그룹을 확인 합니다.
7. 직렬 섹션 (그림 10-12)를 따기
- '루프 섹션 지주'23 장소 (루프의 내부 직경: 5.0 m m) (그림 10a)에 세 번째 섹션 그룹 (그림 10b).
참고: 그것은 적절 한 순서로 사진을 찍을 그들의 단면 순서 섹션을 검색 하는 데 필요한입니다. 그러나 칼 보트에 5 섹션 그룹 이후, 그것은 종종 되 면 혼동 그룹은. 세 번째 그룹에는 루프를 두어서, 그것은 분명해 연산자 가까이 두 그룹은 첫 번째 및 두 번째, 그리고 연산자에서 먼 2는 네 번째 및 다섯 번째 그룹 (그림 10b). 이 순서를 혼합 되지 것입니다. - '물 표면 높이 루프'23 장소 (WSRL, 루프의 내부 직경: 4.0 m m) (그림 11a) 칼 스테이지 (그림 11b). WSRL 하단에 자석으로 되어 있기 때문에 칼 무대에 굳게 설 것 이다.
- 그것의 축과 핸들을 이동 하 여 직렬 섹션 바로 위에 WSRL의 루프를 배치 합니다. 낮은 물 표면에 WSRL의 루프는 루프 encircles 섹션.
- 물 표면 표면 장력 (그림 11 c-d)에 의해 발생 합니다 있도록 나사를 아래쪽으로 선회 하 여 루프를 아래로 누릅니다. 섹션 루프의 중심을 이동, 물의 꼭대기에 위치 하 고 머리 가닥21을 사용 하 여 섹션의 방향을 조정 합니다.
- 벌 거 벗은 슬릿-그리드, 핀셋에 의해 개최 되 고 (그림 11 d) 물 표면에 평행 하 게 유지 하는 그것을 만져 섹션 그룹을 선택 합니다. 그것은 섹션 그리드를 먼저 터치 하는 물, 격자 (그림 11 d)의 중앙에 정확 하 게 섹션을 배치 하는 것이 중요.
- 물 작은 방울과 함께 섹션 격자를 Formvar 지원 영화16 (그림 12)에 놓고 필터 종이 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다.
참고: 지원 영화의 주름 때 종종 문제가 섹션 선택 사용 하 여 그리드 지원 영화 막 (섹션) 막 (지원 영화)를 직접 접촉 하기 때문에. 지원 영화에 주름을 지 고의 문제는 Formvar 지원 영화16에 물 작은 방울과 함께 섹션 베어링 그리드를 배치 하 여 크게 감소 된다.
8. 얼룩 섹션16,24 (그림 13)
- 섹션은 완전히 건조 후 격자, 주위에서 Formvar 영화 눈물 고 섹션 베어링 격자를 제거 합니다.
- (그림 13), 적절 한 순서로 얼룩 튜브16 의 홈에 격자를 설정 하 고 얼룩 uranyl 아세테이트 및 리드 시트르산24섹션.
참고: 저기 홈 깊이 0.6 m m 튜브의 긴 축을 따라 면도날으로 잘라. 튜브는 격자의 직접 처리 얼룩 및 세탁기 과정16동안 필요 하지 않습니다 이후 핀셋를 사용 하는 경우 지원 영화의 실수로 파손을 방지 하기 위한 유용 합니다.
9. 직렬 섹션 (그림 14)의 관찰
- 방향을 견본 홀더 축에 수직 그리드 슬릿의 긴 축에 적절 한 순서로 (그림 14a), 멀티 견본 홀더 5 격자를 설정 합니다. 격자의 핸들 (화살촉) 할 필요가 없습니다 수 컷, ' 그리드 설치 ' 핸들 건드리지 않을 때문에.
- ' 그리드-설치 ' (그림 14b)와 격자를 해결 하 고 전송 전자 현미경 견본 홀더를 삽입.
참고: 그것은 종종 목표 셀의 사진을 복용 하기 전에 모든 셀 섹션 (그림 15) 좋은 조건 좋은 고정과 오염 없이 재미 있는 미생물 또는 세포를 찾을 수의 낮은 확대 이미지를 유용 합니다. - 높은 확대에 모든 셀 섹션에 대상 셀의 사진을 찍을.
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Representative Results
이 프로토콜에서는 3-슬릿 격자 직렬 섹션을 따기 위해 사용 되었다. 격자는 니켈 이나 구리의 만들어집니다. 직렬 섹션 중간 슬릿에 배치 됩니다. 양쪽에 슬릿 그리드와 그들을 따기 때 섹션을 볼 필요가 있습니다. 핀셋 (그림 11 d)으로 그들을 따기 때 격자를 직렬 섹션으로 병렬 계속 핸들 굽습니다 (그림 6 c, 오른쪽). 작은 핸들은 섹션을 따기에 심각한 문제가 발생, 그리드의 주요 부분의 굽 힘을 방지 하 고 얼룩 동안 섹션을 삭제 방지 하기 위해 유리 하다. 이 그리드는 기존의 2.0 m m x 1.0 m m 단일 구멍 격자에 이점이 있다. 즉, 섹션 2 개의 금속 바 0.4 m m 간격에 의해 직접 지원 됩니다 (1.0 m m 보다 좁은)와 섹션 지원 영화 기존의 단일 구멍에 의해서만 지원 됩니다 3-슬릿 격자에서 Formvar 지원 영화. 표본 드리프트 3-슬릿 격자를 사용 하 여 높은 확대 촬영에 따라서 예방할 수 있습니다.
그림 15 는 직렬 섹션 5 격자의 낮은 확대 보기를 보여 줍니다. 이후 각 섹션 스틱 함께, 높은 배율 에서도 다음 섹션에서 동일한 셀을 찾을 수 쉽습니다. 그림 16 과 17 셀 섹션의 직렬 이미지의 예입니다. 섹션 3-슬릿 격자에 안전 하 게 지원 하기 때문에 높은 확대 (x 50,000)에서 사진은 쉽게 견본 드리프트 없이 가져옵니다. DNA 2 nm 직경에서의 섬유는 이러한 연구9,12에 촬영 했다.
그림 1 . Formvar 지원 영화 제작 기구. 유리 슬라이드의 절반은 공기는 고무공을 사용 하 여 'a'를 통해 솔루션을 눌러 기구의 상단 열에서 Formvar 솔루션에서 감소 했다. 솔루션 3 방향 자 지를 열고 공기 압력을 줄이기 위해 'b'를 발표 하 여 열에서 탈진 상태입니다. (야마구치와 아다치, 201119 동의 재현). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 유리에서 영화를 출시에 대 한 방법에 물에서 슬라이드. (a) 유리 슬라이드에 영화의 4 개의 가장자리 떨어져 면도날을 사용 하 여 긁어 있습니다. (b) Formvar 영화 낮은 각도로 천천히 유리 슬라이드를 낮추어 물에 떨어져 배치 됩니다. (야마구치와 아다치, 201119 동의 재현). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 알루미늄 선반에 Formvar 지원 영화. (a) Formvar 영화는 알루미늄 랙 물에서 특 종. (b) 랙 사용까지는 desiccator에 보관 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 초음파 트리밍 블레이드와는 stereomicroscope에서 면도날 견본 블록의 트리밍. (a)는 시료의 존재는 가벼운 현미경 견본 블록을 관찰 하 여 확인 된다. 깊은 바다12,14에서 수집 규모 웜 chaeta (길이 약 1.7 m m)와 관련 된 그림 포함 된 미생물에 표시 된 블록. (b) 트리밍 단계입니다. (c) 모든 이미지는 stereomicroscope의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 톰을 사용 하 여 다이아몬드 칼으로 표본 블록의 트리밍. (a) 왼쪽된 가장자리 절단에 대 한 그림. (b) 블록 얼굴에서 약 100의 위치에 컷는 시료의 왼쪽된 가장자리에서 nm. (c) 거울 (메사 컷, M) 칼 스테이지에 배치합니다. (d) 견본 표면입니다. 참고 위 측 및 슬림 부의 더 낮은 측은 부드럽고 완벽 하 게 평행. 또한 유의 하십시오 어깨 ( 그림 8참조) 절단의 방향 표시를 잘라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 견본 표면에 네오프렌 치료. (a)에 정확 하 게 원래 위치에 다시 표본 척을 배치, 물림 쇠는 톰의 물림 쇠 홀더는 테이프 표시와 경계에서 잘라. (b) 네오프렌 솔루션 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 표본을 흐른다. (c) 3-슬릿 직렬 섹션을 따기 위한 격자. 핸들은 60도 (c, 오른쪽) 구 부 러. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 . 톰와 나무 팔걸이의 플라스틱 커버입니다. 플라스틱 커버 ultrathin 단면 동안 공기 흐름을 방지 하기 위해 유용 합니다. 나무 팔걸이 직렬 섹션을 검색 하는 등 섬세 한 작업을 수행 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 . 섹션 두께 설정 하 고 적절 한 두께 섹션을 얻기. 섹션 두께 10 설정 후 직렬 섹션의 수는 20에 도달 했습니다, nm. 이후는 톰 10 nm 두꺼운 섹션을 잘라낼 수 없는, 아니 새로운 섹션 나타나고 이전 컷된 섹션 칼 날에서 분리 되. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9 . 프로토콜을 통해 얻은 ultrathin 섹션의 예. 참고 약 1.8 m m 긴의 직렬 섹션의 5 개 그룹 이미 절단 후 분리 합니다. 이 특정 한 경우, ultrathin 섹션의 중심의 색 표본의 존재로 인해 노란입니다. 다른 섹션의 표본을 포함 하지 고 수 지만의 구성, 부품은 실버 색상에서입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10 . ' 섹션 지주 루프 '입니다. (a) 평면도 (상단 부분)와 루프의 아래쪽 보기 (아래쪽 사진). (b) 섹션 지주 루프는 직렬 섹션의 세 번째 그룹을 보유 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11 . 직렬 섹션의 검색입니다. (a) ' 물 표면 높이 루프' (WSRL). 루프의 핸들은 이동식 축에서 제거할 수 있습니다. 루프도 나사 상단으로 위아래로 이동할 수 있습니다. (b) WSRL 칼 무대에는 자석으로 고정 됩니다. ((b)의 c) 가까이 볼 수 있습니다. (d) 루프, 수 면, 섹션, 및 검색 (측면 보기) 동안 그리드의 다이어그램. Ultrathin 섹션 ultrathin 섹션 맨 그리드 병렬 낮추어 슬릿 격자에 정확 하 게 검색할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 12 . Formvar 영화에 격자 배치. 섹션을 잡고 그리드 알루미늄 선반에 Formvar 영화에 물 작은 방울과 함께 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 13 . 튜브를 얼룩16. 홈 깊이 0.6 m m 면도칼 블레이드를 사용 하 여 긴 축을 따라 이루어집니다. 격자는 적절 한 순서로 홈에 배치 됩니다. 튜브의 한쪽 끝의 방향 표시 (화살표 머리)를 잘라입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 14 . 격자에 견본 홀더 배치. (a) 격자에 견본 홀더 적절 한 순서로 배치 됩니다. (b) 격자 다음 ' 그리드-설치 '와 함께 고정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 15 . 직렬 섹션 슬릿 격자에 장착. 그림 18 ~ 25 섹션에 한 표. 각 틈새에 숫자는 시퀀스 번호에서 시작을 하 여 첫 번째 섹션을 나타냅니다. 첫 번째 섹션은 다른 사람 보다 두꺼운 ( 그림 8참조). 참고 섹션 함께 연결 하 고 같은 두께가지고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 16 . Parakaryon myojinensis의 직렬 섹션12. 왼쪽 아래에 숫자는 첫 번째 섹션에 상대적인 순서를 나타냅니다. 그림 12의 67 완료 섹션입니다. 이 셀 단일 핵양체 막, 및 박테리아, 하지만 아무 미토 콘 드리 아를 닮은 endosymbionts 벌 거 벗은 DNA 섬유의 구성 된 큰 핵양체는 발견 됐다. 따라서,이 유기 체 진핵생물12부피에서 진화 하는 중간 생활 형태로 나타납니다. N, 핵양체입니다. 야마구치와 Worman, 2014을 재현. 허가로 14 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 17 . 대장균의 직렬 섹션9. 왼쪽 아래에 숫자는 첫 번째 섹션에 상대적인 순서를 나타냅니다. 그림 12 완전 한 섹션입니다. 이 셀 21,700 리보솜9포함 하도록 발견 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 제시 된 방법을 비싼 장비를 요구 한다. 그것은 필요로 한 알루미늄 랙 (그림 3), 3-슬릿 격자 (그림 6c), 섹션 지주 루프 (그림 10a), 루프 물 표면 높이 (그림 11a), 및 얼룩 튜브 (그림 13). 현재 방법의 많은 기능을 확인 하 고 있습니다. 시료의 큰 부분 그들은 얼굴을 서로 병렬 견본 표면 및 칼 가장자리를 조정 하는 데 사용 됩니다. 직렬 섹션을 슬릿 격자에 직렬 섹션의 그룹을 검색할 때 머리 가닥의 쌍을 사용 하 여 분리 섹션에서 어려움을 피하기 위해 그룹에서 잘립니다. '섹션 지주 루프' 섹션 그룹의 순서를 혼합 하지 않도록 하는 데 사용 됩니다. '물 표면 높이 루프' 섹션의 꼭대기에 위치 하 고는 그들은 터치 그리드 첫째, 격자에 원하는 위치에 그들을 두기 위하여 확인 하는 데 사용 됩니다. 알루미늄 랙 Formvar 지원 영화 쉽게 격자에 섹션을 복구 하 고 지원 영화의 주름을 방지 하는 데 사용 됩니다. 얼룩 튜브는 실수로 핀셋으로 지원 영화를 위반을 피하기 위해 하는 데 사용 됩니다.
최근에, 자동 테이프 수집 ultramicrotome 개발된25 자동으로 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 전자 불투명 플라스틱 테이프에 이미징에 대 한 섹션을 수집 했다. 이 방법은 수 안정적으로 컷 수천 ultrathin 섹션26는 현재 방법으로 불가능. 또한, 직렬 블록 얼굴 (SBF) 27 및 초점 이온 빔 (FIB)-sem의28 동물의 조직과 세포의 3 차원 정보를 수집 하는 데 사용 됩니다. 이러한 방법에 다이아몬드 칼 또는 초점 이온 빔과 단면 SEM 현미경 내부 통합 이며 아무 특별 한 기술이 필요로 하는 완전 자동 방식으로 실시. 이러한 메서드는 유용, 기구는 많은 기관이이 기계를 구입 너무 비 싸. 또한, 이러한 방법을 사진 섹션을 SEM을 사용, 이후는 현미경의 해상도 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 현재 방법에 열 등입니다. 이 메서드는 현재 개별 리보솜 입자, microtubules, microfilaments, 및 DNA 섬유를 해결할 수 없습니다.
미생물의 structome 분석에 대 한 알 수 없는 미생물의 ultrastructural 연구에 대 한, 그것은 세포와 세포 벽, 원형질 막, 미토 콘 드리 아, 핵, 핵 막, 바인딩과 그물, 셀 구성 요소를 관찰 하는 데 필요한 엽록체, plastids, Golgi 기구, 리보솜, 그리고 높은 해상도 filamentous 요소. TEM 관찰 직렬 ultrathin 섹션의 이러한 분석을 3 차원에 가능 하 게 하는 몇 가지 방법 중 하나입니다. 같은 지역 ultrathin 섹션 후 관찰이이 방법에 남아 있기 때문에 반복적으로; 관찰 될 수 있다 이 불가능 SBF 또는 거짓말-SEM 관찰 후 관찰된 지역 없어지기 때문. 이 기능을 낮은 확대율에서 재미 있는 유기 체를 먼저 검색 다음 사진을 순차적으로 높은 확대 대상 생물에 필요한 심해 미생물 연구 중요 하다.
결론적으로, 직렬 ultrathin 단면 방법 지금에서 수행할 수 있습니다 쉽게, 저렴 한, 그리고 전자 현미경에서 높은 해상도 3D ultrastructual를 위해 근본적 이다 현재 연구에 의해 relaible 방법 연구.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 진심으 그의 귀중 한 제안 및 토론을 위한 시게오 기타 감사합니다. 우리 또한 그들의 중요 한 독서의 원고에 대 한 존과 스미 레 크 스 테 인을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
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