Summary
Cette étude présente des procédures fiables et faciles pour obtenir des coupes sériées ultraminces d’un micro-organisme sans matériel coûteux en microscopie électronique à transmission.
Abstract
Observer les cellules et les composants de la cellule en trois dimensions à fort grossissement en microscopie électronique à transmission nécessite préparation ultraminces sériées du spécimen. Bien que la préparation des coupes sériées ultraminces est considéré comme très difficile, il est assez facile si on utilise la méthode appropriée. Dans cet article, nous montrons une procédure étape par étape pour obtenir en toute sécurité séries ultraminces de micro-organismes. Les points essentiels de cette méthode sont : 1) d’utiliser une partie importante de l’échantillon et ajuster les bords de surface et couteau de spécimen afin qu’ils soient parallèles entre eux ; 2) de la coupe des coupes sériées dans les groupes et éviter des difficultés à séparer les sections à l’aide d’une paire de mèches de cheveux lors de la récupération d’un groupe de coupes sériées sur les grilles de la fente ; 3) à utiliser une « boucle de Section-holding » et éviter de mélanger l’ordre des groupes de section ; 4) à utiliser une « boucle de l’eau de surface-sensibilisation » et s’assurer que les sections sont positionnées sur l’apex de l’eau et qu’ils touchent la grille en premier lieu, afin de les mettre dans la position désirée sur les grilles ; 5) d’utiliser le film support sur un rack en aluminium et rendre plus facile de récupérer les sections sur les grilles et pour éviter les plis du film soutien ; et 6) à utiliser un tube de coloration et d’éviter de casser accidentellement les films de soutien avec des pincettes. Cette nouvelle méthode permet d’obtenir des coupes sériées ultraminces sans difficulté. La méthode permet d’analyser les structures cellulaires des microorganismes à haute résolution en 3D, qui ne peut être atteint en utilisant la méthode d’ultramicrotome collecte ruban automatique et la série îlot ou le faisceau ionique focalisé, microscopie électronique à balayage.
Introduction
Technique de sectionnement ultramince série appropriée est indispensable pour étudier les cellules et les composants de la cellule en trois dimensions à l’échelle microscopique de l’électron. Nous avons étudié la dynamique du corps polaire du fuseau dans le cycle cellulaire des cellules de levure et révèle des changements morphologiques de leur ultrastructure au cours du cycle cellulaire et l’heure de répétition1,2,3, 4,,5. En 2006, nous avons inventé un nouveau mot « structome » en combinant la « structure » et '-ome' et défini comme le « informations structurelles quantitatives et en trois dimensions d’une cellule entière à l’échelle microscopique de l’électron » 6,7.
Par l’analyse structome, qui requiert la technique sérielle de sectionnement ultramince, il a été constaté qu’une cellule de levure de Saccharomyces cerevisiae et Exophiala dermatitidis avait environ 200 000 ribosomes7,8, un Escherichia coli cellule avait 26 000 ribosomes9, une cellule de Mycobacterium tuberculosis a 1 700 ribosomes10 et Myojin spirale bactéries avaient seulement 300 ribosomes11. Cette information est utile pour évaluer non seulement le taux de croissance dans chaque organisme, mais aussi dans l’identification des espèces9.
En outre, structome analyse conduit à la découverte d’un nouvel organisme ; Parakaryon myojinensis a été trouvé dans l’eaux profondes au large des côtes du Japon, dont la structure cellulaire étaient intermédiaires entre ceux des procaryotes et des eucaryotes12,13,14,15. À l’heure actuelle, série technique sectionnement ultramince est considérée comme si difficile qu’il faudrait beaucoup de temps à maîtriser. Dans cette étude, nous avons développé une méthode fiable dans lequel n’importe qui peut effectuer des coupes ultraminces série sans difficulté.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Remarque : Les spécimens utilisés dans cette étude étaient des microorganismes, congelés rapidement de propane dans l’azote liquide, gel substitués dans l’acétone contenant 2 % le tétroxyde d’osmium et incorporé à l’époxy résine1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. préparation du support film (Figure 1-3)
NOTE : Le film support argenté Formvar est établi à l’aide de la méthode cast sur verre19.
- Ajouter 100 mL de 1,5 % Formvar de dichlorure d’éthylène à un appareil de fabrication de Formvar (Figure 1). Tremper la moitié d’une lame de verre (76 x 26 x 1,3 mm) en solution de Formvar dans la colonne supérieure de l’appareil en appuyant sur la solution avec de l’air par le biais de « a » en utilisant un ballon de caoutchouc19.
- La solution de la colonne de vidange en ouvrant le robinet à trois voies et libérant air par « b » pour réduire la pression. Retirez la lame de verre de l’appareil et sec dans l’air pour former une pellicule à la surface de la lame de verre. Utiliser une lampe à incandescence pour accélérer le séchage du film Formvar.
- Après racler les quatre bords du film sur la lame de verre avec une lame de rasoir (Figure 2 a) et la respiration sur le toboggan pour faciliter la séparation du film de la diapo20, flottent hors du film sur l’eau en plongeant la lame de verre dans le l’eau lentement à un angle horizontal faible (environ 10°, Figure 2 b).
- Ramasser le film Formvar de l’eau à l’aide d’une grille en aluminium (30 x 25 x 3 mm) avec des trous (4 mm de diamètre) (Figure 3 a). Empêchent la grille avec le film de Formvar dans un dessicateur jusqu'à utilisation (Figure 3 b).
2. tailler le bloc de spécimen avec une lame de tondeuse par ultrasons et une lame de rasoir 21 sous un stéréomicroscope (Figure 4)
- Assurez-vous qu’il y a des cellules à la surface du bloc en observant l’extrémité du bloc avec un microscope optique (Figure 4 a).
- Montez le bloc du spécimen dans le mandrin (titulaire de bloc) et monter le mandrin sur une coupe étape21 (Figure 4 b). Cette étape de la coupe dispose d’un mécanisme d’éclairage à l’arrière de l’échantillon.
- Couper le bloc à une taille de 0,7 x 1,0 mm (Figures 4 c, 5d). Étant donné que la résine époxy est très dure, tailler les blocs tout d’abord à l’aide d’une lame de tondeuse à ultrasons. Le couteau ultrasonique est une machine nouvellement introduite, et les blocs sont facilement taillés. Couper ensuite le bloc plus loin avec une lame de rasoir. Couper une épaule pour marquer la direction de coupe (voir Figure 5 d, Figure 8).
3. tailler le bloc de spécimen avec couteau diamant utilisant le microtome (Figure 5)
- Définir le bloc de spécimen chuck dans le porte-échantillon de l’ultramicrotome. Placer le spécimen 90° vers la gauche contre la position effective quand des coupes ultraminces série est effectuée (voir Figure 5 d).
- Couper la surface du bloc avec un couteau de coupe de diamant (voir la Figure 5 d). Mettre la lame de couteau diamant parallèle à la face du bloc spécimen et découper le montant minimum de surface de l’échantillon pour ne pas perdre tout spécimen (Figure 5 d).
Remarque : Cette étape est faite pour lisser la surface de l’échantillon. La partie de la surface de l’échantillon de la partie mince est laissée intacte (c’est pourquoi cette partie ne brille pas comme un miroir, Figure 5 d), pour ne pas perdre une partie de l’échantillon pour le sectionnement serial. C’est parce que le spécimen est exposé à la surface du bloc. - Placez un miroir (coupe de Mesa, M) sur la scène du couteau pour suivre la Coupe du bloc spécimen (Figure 5C).
- Couper le bord gauche (cela devient la face supérieure, Figure 5 d, de l’échantillon en sectionnant série) du bloc à l’aide de couteau de coupe en faisant tourner la scène couteau 30 ° vers la gauche (Figure 5 a).
- Couper la face du bloc à environ 100 µm entre le bord gauche de l’échantillon (cela devient la face inférieure de l’échantillon en sectionnant serial, Figure 5 d) en tournant la scène couteau 30 ° vers la droite (Figure 5 b).
Remarque : Les coupes sériées seront coupés de la partie mince de l’échantillon d’environ 90 nm x taille d’environ 1 mm. La grande partie servira à ajuster la surface de l’échantillon et le bord de couteau, tels qu’ils sont parallèles. Après avoir ajusté la surface de l’échantillon pour être parallèle à la lame de couteau, la grande partie est enlevée avec une lame de rasoir. En coupant les côtés supérieures et inférieures de l’échantillon à l’aide du microtome, les deux côtés de l’échantillon devient lisse et parfaitement parallèles les uns aux autres (Figure 5 d), qui est nécessaire pour obtenir des sections droites et ininterrompue de ruban.
4. réglage du bord de surface et couteau de spécimen afin qu’ils doivent faire face parallèle à l’autre : 21
- Retirer le couteau de parage et font tourner le spécimen dans le sens horaire de 90°.
- Réglé un couteau coupe ultra-mince au niveau du couteau.
- Ajuster la surface de l’échantillon et la lame de couteau pour qu’ils doivent faire face parallèlement les uns aux autres à l’aide d’une partie importante de la surface de l’échantillon.
Remarque : Une partie importante de l’échantillon est utilisée pour l’ajustement parce que le visage de découpage de sectionnement série est si petit, rendant difficile d’ajuster le bord à l’aide de cette partie seulement, en particulier dans le sens vertical de la surface et couteau spécimen. Ainsi, à l’aide de la grande partie de l’échantillon, réglage facile.
5. matelassage en néoprène sur le bloc de l’échantillon (Figure 6)
- Pour placer le mandrin de spécimen à exactement la même position que la position d’origine, appliquer du ruban adhésif sur le mandrin et le détenteur de mandrin du microtome et coupées à la limite (Figure 6 a).
- Retirez le spécimen mandrin du microtome et placez-le sous le stéréomicroscope (Figure 6 b). Couper une partie importante de l’échantillon avec une lame de rasoir, laissant la partie mince, d'où proviendra coupes sériées.
- À l’aide d’une pipette Pasteur, déposer environ 1 µL 0,5 % de solution de néoprène (Figure 6 b) sur le spécimen à être utilisée pour le sectionnement de série, pour faire l’adhésif de côtés de section. Couvrir le spécimen entier avec solution de néoprène. Absorber la solution néoprène excès immédiatement avec un morceau de papier filtre placé près de l’échantillon. Obtenir un ruban de sections est essentiel pour prendre des photos des sections de la série de cellules, et la colle néoprène est très utile pour coller les sections.
- Préparer la fente 3 grilles (tailles des fentes : milieu, 0,4 mm x 2,2 mm, les deux côtés de 0,2 mm x 2,2 mm) (Figure 6C) pour ramasser les coupes sériées par la poignée des grilles de flexion à 60 °, traiter les grilles solution à 0.5 % néoprène et rendant les grilles hydrophile par lueur décharge22.
6. faire des coupes sériées (Figure 7-9)
- Place le bloc de spécimen chuck dans le microtome à la même position que le 5.1 (Figure 6 a) en alignant les pièces collées. Ceci maintient la face du bloc et la lame de couteau parfaitement parallèles les uns aux autres. Puis mettre le couteau à proximité de l’échantillon.
- Le bateau de couteau remplissez-le d’eau.
- Couvrir le microtome avec un couvercle en plastique pour empêcher la circulation de l’air (Figure 7).
NOTE : Débit d’air pendant les coupes ultraminces et de récupération des articles souvent causer des problèmes. Le couvercle en plastique a trois trous : un trou est pour les lentilles binoculaires, et les deux autres trous sont pour les bras permettre un fonctionnement lorsque le couvercle est en marche. L’accoudoir en bois est utilisée pour placer les bras tout en faisant un travail délicat, tels que des coupes sériées avec grilles de récupération. L’accoudoir en bois est placé sur une table différente de la table microtome (Figure 7, flèches), donc de ne pas transmettre la vibration des mains de l’utilisateur pour le microtome. - Commencer à couper l’échantillon à l’épaisseur de coupe 200 nm (Figure 8). Réglage à 200 épaisseur nm gagnerez du temps en apportant le couteau sur la surface de l’échantillon.
- Après la première section est coupée, définissez l’épaisseur de coupe à 70 nm (Figure 8).
- Lorsque le nombre de coupes sériées atteint 20 (précisément parlant, après les tronçons de ruban environ 1,8 mm ; le nombre de sections varie en fonction de la largeur des sections), définissez l’épaisseur de coupe à 10 nm (Figure 8) tout en continuant à couper.
NOTE : Puisque le microtome ne coupes 10 nm d’épaisseur, aucun nouvel article n’apparaît, et les sections précédemment coupées sont séparent de la lame de couteau. Il est important d’obtenir des groupes de sections séparées (Figure 9) pour ramasser les coupes sériées afin d’éviter des difficultés à séparer les sections manuellement à l’aide d’une paire de mèches de cheveux. Étant donné que le champ de vision dans le microscope électronique en transmission est à 2,0 mm, sections doivent être au maximum 1,8 mm de long. - Définir l’épaisseur de coupe à 60 nm (Figure 8). Cela produira 70 sections nm (Figure 8) parce que la machine va ajouter l’épaisseur des nm 10 du précédent.
- Définir l’épaisseur de la section retour à 70 nm (Figure 8) et continuer la coupe jusqu'à obtient des sections de 1,8 mm-long.
- Répétez de 6,6 à 6,8 jusqu'à obtient des cinq sections de long de 1,8 mm (Figure 9). Nous faisons généralement cinq groupes de sections puisqu’il y a cinq porte-spécimens dans le microscope électronique à transmission disponible dans notre laboratoire, mais cinq n’est pas la limite.
7. ramasser les coupes sériées (Figure 10-12)
- Placer la « boucle de la porte-Section »23 (diamètre intérieur de la boucle : 5,0 mm) (Figure 10 a) sur le troisième groupe de sections (Figure 10 b).
Remarque : Il faut récupérer les sections de l’ordre de leur coupe pour prendre des photos dans l’ordre approprié. Cependant, puisqu’il y a cinq groupes de sections sur le bateau de couteau, il souvent obtient déroutant quels groupes sont qui. En plaçant la boucle sur le troisième groupe, il devient évident que les deux groupes près de l’opérateur sont le premier et deuxième et les deux éloignés de l’opérateur sont les quatrième et cinquième groupes (Figure 10 b). Cela évitera de mélanger vers le haut de l’ordre. - Placer « boucle d’eau de surface-sensibilisation »23 (WSRL, diamètre intérieur de la boucle : 4,0 mm) (Figure 11 a) sur la scène de couteau (Figure 11 b). La WSRL tiendrai fermement sur la scène de couteau parce qu’il est équipé d’un aimant au fond.
- Placer la boucle de la WSRL juste au-dessus des coupes sériées en déplaçant son arbre et la poignée. Abaissez la boucle de la WSRL sur la surface de l’eau pour que la boucle entoure les sections.
- Poussez la boucle vers le bas en tournant la vis vers le bas afin que la surface de l’eau augmentera de tension superficielle (Figures 11c-d). Déplacer la section vers le centre de la boucle, positionnez-le sur l’apex de l’eau et ajuster la direction de la section en utilisant une mèche de cheveux21.
- Ramasser les groupes de sections par le toucher avec une fente nue-grid, qui est tenu par une pince à épiler et reste parallèle à la surface de l’eau (Figure 11d). Il est important pour les sections de toucher la grille tout d’abord, pas l’eau, pour déposer les éléments avec précision sur le centre de la grille (Figure 11d).
- Placez les grilles avec des sections ainsi qu’une petite goutte d’eau sur la Formvar support film16 (Figure 12) et enlever l’excès d’eau à l’aide de papier filtre.
Remarque : Le froissement du support film est souvent un problème lorsque les sections sont captées à l’aide d’une grille avec film support car membrane (sections) touche la membrane (film support) directement. Le problème d’avoir des rides sur le film support est considérablement réduit en plaçant une grille section portant ainsi qu’une petite goutte d’eau sur la Formvar support film16.
8. coloration des sections16,24 (Figure 13)
- Après que les sections sont complètement séchées, déchirer le film de Formvar de près les grilles et enlevez les grilles portant les sections.
- Définir les grilles dans la gorge de la coloration de tube16 dans l’ordre approprié (Figure 13) et tacher les sections avec uranyle acétate et plomb citrate24.
Remarque : Il y a une rainure de 0,6 mm de profondeur le long de l’axe longitudinal du tube coupé avec une lame de rasoir. Le tube est utile pour empêcher un bris accidentel des films de prise en charge lorsque vous utilisez la pince à épiler, car la manipulation directe des grilles n’est pas nécessaire pendant le processus de coloration et lavage16.
9. l’observation de coupes sériées (Figure 14)
- Définissez les 5 grilles dans le porte-échantillon multiples dans l’ordre approprié (Figure 14 a), orientant l’axe long de la fente de grille perpendiculaire à l’axe de support du spécimen. Les poignées (flèches) des grilles n’ont pas à être coupé, parce que les « grille-fixateurs » ne touchent pas les poignées.
- Fixer les grilles avec « grille-fixateurs » (Figure 14 b) et insérez le porte-échantillon dans le microscope électronique à transmission.
Remarque : Il est souvent utile de prendre des images de faible grossissement de toutes les sections de la cellule (Figure 15) pour trouver intéressant de micro-organismes ou de cellules en bon état sans la contamination et à la bonne fixation, avant de prendre des photos de la cellule cible. - Photographier les cellules cibles dans toutes les sections de la cellule à fort grossissement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans le présent protocole, les grilles de trois-fente ont été utilisés pour ramasser les coupes sériées. Les grilles sont en nickel ou cuivre. Les coupes sériées sont placés sur la fente centrale. Les fentes des deux côtés sont nécessaires pour afficher les sections en les ramassant avec la grille. Pour garder les grilles en parallèle avec les coupes sériées en les ramassant avec des pincettes (Figure 11d), la poignée est courbée (Figure 6 c, droite). Une petite poignée est avantageuse pour éviter la flexion de la partie principale de la grille, ce qui provoque des problèmes graves à ramasser les sections, et pour éviter de laisser tomber les sections pendant la coloration. Cette grille a des avantages par rapport à la grille de mélangeur conventionnel 2,0 x 1,0 mm. À savoir, les sections sont pris en charge directement par deux barres métalliques 0,4 millimètres (inférieure à 1,0 mm) et par le film de support Formvar dans une grille de trois-fente, tandis que les sections sont pris en charge uniquement par le film de support dans une grille de mélangeur conventionnel. Dérive de spécimen peut donc être évitée dans la photographie à fort grossissement, à l’aide d’une grille de trois-fente.
La figure 15 montre une vue faible grossissement de cinq grilles qui transportent des coupes sériées. Puisque chaque section colle, il est facile de trouver la même cellule dans la section suivante, même à fort grossissement. Figure 16 et 17 sont des exemples d’images séries des sections de la cellule. Parce que les sections sont solidement appuyées sur fente 3 grilles, photos à fort grossissement (x 50,000) sont facilement prises sans dérive de spécimen. Fibres d’ADN 2 nm de diamètre ont été photographiés dans ces études9,12.
Figure 1 . Appareil de cinématographie de soutien formvar. La moitié de la lame de verre est plongé dans la solution de Formvar dans la colonne supérieure de l’appareil en appuyant sur la solution avec de l’air par le biais de « a » en utilisant une balle de caoutchouc. La solution est vidée de la colonne en ouvrant le robinet à trois voies et libérant air par « b » pour réduire la pression. (Repris du Yamaguchi et Adachi, 2011 de19 avec autorisation). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Méthode pour libérer le film du verre glisser sur l’eau. (a) les quatre bords du film sur la lame de verre sont raclées à l’aide d’une lame de rasoir. (b) Formvar film est flottait au large sur l’eau en abaissant la lame de verre lentement à un angle faible. (Repris du Yamaguchi et Adachi, 2011 de19 avec autorisation). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Film support formvar sur un rack en aluminium. (a) le film de Formvar est ramassé de l’eau avec un rack en aluminium. (b) le panier est conservé dans le dessiccateur jusqu'à utilisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Coupe du bloc spécimen avec une lame de tondeuse par ultrasons et une lame de rasoir sous un stéréomicroscope. (a) la présence du spécimen est confirmée en observant le bloc de spécimen sous un microscope optique. Le bloc est illustré dans les microorganismes chiffres indiqués associées à une chaeta d’échelle-ver (environ 1,7 mm de longueur) prélevé dans la profonde mer12,14. (b) stade de coupe. (c) toute l’image d’un stéréomicroscope. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Coupe du bloc spécimen avec couteau diamant utilisant microtome. b illustration pour couper le bord gauche. (b) la face du bloc est coupée à une position d’environ 100 nm entre le bord gauche du spécimen. (c) un miroir (coupe de Mesa, M) placés sur la scène de couteau. (d) surface de l’échantillon. Notez que le dessus et le dessous de la partie mince sont lisses et parfaitement parallèles. Notez également que l’épaule est coupé pour marquer la direction de coupe (voir Figure 8). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Traitement de néoprène sur la surface de l’échantillon. (a) afin de placer le mandrin de spécimen à exactement la position d’origine, le mandrin et le détenteur de mandrin du microtome sont marqués avec un ruban et couper à la limite. (b) mouiller l’échantillon avec une solution en néoprène à l’aide de la pipette Pasteur. (c) trois-fente grilles pour ramasser les coupes sériées. La poignée est pliée à 60 degrés (c, droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 . Couvercle en plastique du microtome et accoudoir en bois. Le couvercle en plastique est utile pour empêcher le flux d’air lors des coupes ultraminces. L’accoudoir en bois est utilisé pour faire des travaux délicats tels que la récupération des coupes sériées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 . Réglage épaisseur de coupe et d’obtenir des sections à l’épaisseur appropriée. Après le nombre de coupes sériées a atteint 20, épaisseur de coupe est définie à 10 nm. Puisque le microtome ne coupes 10 nm d’épaisseur, aucun nouvel article n’apparaît, et les sections précédemment coupées sont séparent de la lame de couteau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 . Exemple de coupes ultrafines obtenues par le biais du protocole. Notez que les cinq groupes de coupes sériées d’environ 1,8 mm de long sont déjà séparés après la coupe. Dans ce cas précis, la couleur du Centre des sections ultra-minces est jaunâtre due à la présence de l’échantillon. Les autres parties de la section, qui ne pas contenir l’échantillon et se composent de résine seulement, sont en argent en couleur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 . « Boucle de section-holding ». (a) vue de dessus (partie supérieure) et la vue de dessous (partie inférieure de la photo) de la boucle. (b) la boucle porte-Section est utilisée pour contenir le troisième groupe de coupes sériées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 11 . Récupération de coupes sériées. (a) ' boucle d’eau de surface-sensibilisation » (WSRL). La poignée de la boucle peut être retirée de l’arbre, qui est mobile. La boucle peut également être déplacée de haut en bas en tournant la vis supérieure. (b) la WSRL est fixé sur la scène de couteau par un aimant. (c) vue plus de (b). (d) le schéma de la boucle, surface d’eau, sections et grille pendant l’extraction (vue latérale). Ultraminces peuvent être récupérés avec précision à la grille de la fente en abaissant le parallèle de grille nus aux sections ultra-minces. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 12 . Placer la grille sur le film de Formvar. La grille en tenant les sections est placée avec une petite goutte d’eau sur le film Formvar sur rack en aluminium. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 13 . Tube de coloration16. Une rainure de 0,6 mm de profondeur se faite le long de l’axe longitudinal à l’aide d’une lame de rasoir. Grilles sont placées dans la rainure dans le bon ordre. Une extrémité du tube est coupée (tête de flèche) à l’occasion de sa direction. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 14 . Placer les grilles dans le porte-échantillon. (a) les grilles sont placées dans le porte-échantillon dans le bon ordre. (b) les grilles sont alors fixés avec « grille-fixateurs ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 15 . Coupes sériées montés sur des grilles de la fente. La figure montre les articles 18 à 25 montés sur une grille. Les nombres dans chaque fente indiquent le début de numéro de séquence de la première section. La première section est plus épaisse que les autres (voir Figure 8). Notez que les sections sont attachées ensemble et ont la même épaisseur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 16 . Coupes sériées du Parakaryon myojinensis12. Les numéros en bas à gauche indiquent l’ordre par rapport à la première section. La figure montre 12 sur 67 sections complètes. Cette cellule s’est avérée pour avoir un nucléoïde grand composé de fibres d’ADN nus, avec une membrane unique nucléoïde et endosymbiontes qui ressemblent à des bactéries, mais sans mitochondries. Ainsi, cet organisme semble être une forme de vie intermédiaire en évolution de procaryote eucaryote12. N, nucléoïde. Reproduit de Yamaguchi et Worman, 2014. 14 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 17 . Coupes sériées d’Escherichia coli9. Les numéros en bas à gauche indiquent l’ordre par rapport à la première section. La figure montre 12 sections complètes. Cette cellule s’est avérée pour contenir 21 700 ribosomes9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La méthode présentée ici ne nécessite aucun équipement coûteux. Il nécessite seulement un rack en aluminium (Figure 3), trois-fente grilles (Figure 6C), section porte-boucles (Figure 10 a), eau de surface-sensibilisation boucle (Figure 11 a) et un tube de coloration (Figure 13). Il y a plusieurs caractéristiques de la méthode actuelle. La grande partie de l’échantillon est utilisée pour ajuster les bords de surface et couteau de spécimen afin qu’ils doivent faire face parallèlement les uns aux autres. Coupes sériées sont coupées dans des groupes afin d’éviter des difficultés dans les sections de séparation à l’aide d’une paire de mèches de cheveux lors de la récupération d’un groupe de coupes sériées sur les grilles de la fente. Une « boucle de section-holding » est utilisée pour éviter le mélange vers le haut de l’ordre des groupes de sections. Une « boucle de l’eau de surface-sensibilisation » est utilisée pour s’assurer que les sections sont positionnées sur l’apex de l’eau et qu’ils touchent la grille en premier lieu, afin de les mettre dans la position désirée sur les grilles. Film support formvar sur une grille en aluminium est utilisé pour rendre plus facile de récupérer les sections sur les grilles et pour éviter les plis du support film. Un tube de coloration est utilisé pour éviter de casser accidentellement les films de soutien avec des pincettes.
Récemment, un ultramicrotome collecte ruban automatique a été développés25 pour recueillir les sections automatiquement pour la microscopie électronique (SEM) d’imagerie sur des bandes de plastique opaque aux électrons. Cette méthode ne peut sûrement couper des milliers ultraminces26, qui n’est pas possible de la méthode actuelle. En outre, bloc série visage (SBF) 27 et focus faisceau d’ions (FIB)-SEM28 sont utilisés pour collecter des informations 3D de cellules et de tissus d’animaux. Dans ces méthodes, le sectionnement avec un faisceau d’ions diamant couteau ou de discussion est intégré à l’intérieur de la loupe de SEM et réalisé de façon entièrement automatique qui ne nécessite aucune technique spéciale. Bien que ces méthodes sont utiles, l’appareil est tellement cher que pas beaucoup d’établissements acheter ces machines. En outre, étant donné que ces méthodes emploient SEM aux sections de la photographie, résolution de la microscopie est inférieure à la présente méthode qui utilise la microscopie électronique à transmission (TEM). Ces méthodes ne peuvent pas résoudre les particules individuelles ribosome, microtubules, microfilaments et fibres d’ADN à l’heure actuelle.
Structome analyse des micro-organismes et pour une étude ultrastructurale des micro-organismes inconnus, il est nécessaire d’observer les cellules et les composants cellulaires tels que la paroi cellulaire, la membrane plasmique, mitochondrie, noyau, membranes nucléaires, réticulum endoplasmique, les chloroplastes, plastes, appareil de Golgi, les ribosomes et éléments filamenteux à haute résolution. TEM observation de coupes sériées ultraminces est un des quelques méthodes pour permettre une telle analyse en trois dimensions. Parce que les coupes ultrafines restent après observation dans cette méthode, la même zone peut être observée à plusieurs reprises ; ce n’est pas possible dans le SBF ou FIB-SEM, puisque la zone observée est perdue après observation. Cette fonctionnalité est importante pour l’étude des microorganismes en eau profonde où il est nécessaire de rechercher d’abord les organismes intéressants à faible grossissement et puis prendre des photos en série sur l’organisme cible à fort grossissement.
En conclusion, METHODE de sectionnement ultramince série peut désormais être réalisée dans un format facile, peu coûteux, et relaible moyen de la présente étude, ce qui est essentielle pour la 3D ultrastructual étude des microorganismes à haute résolution en microscopie électronique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions sincèrement Shigeo Kita pour ses précieuses suggestions et discussion. Nous remercions également John et Sumire Eckstein pour leur lecture critique du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
