Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

En metode til at indhente seriel ultratynde sektioner af mikroorganismer i transmissions Elektron Mikroskopi

Published: January 17, 2018 doi: 10.3791/56235
Automatic Translation
1, 1
1Medical Mycology Research Center, Chiba University

Summary

Denne undersøgelse præsenterer pålidelige og lette procedurerne for opnåelse af serielle ultratynde sektioner af en mikroorganisme uden dyrt udstyr i transmissions Elektron Mikroskopi.

Abstract

Observere celler og celle komponenter i tre dimensioner med høj forstørrelse i transmissions Elektron Mikroskopi kræver forberedelse seriel ultratynde dele af modellen. Selvom forbereder seriel ultratynde afsnit anses for at være meget vanskeligt, er det ret nemt, hvis den rette metode bruges. I dette papir vise vi en trinvis procedure for sikkert at opnå seriel ultratynde sektioner af mikroorganismer. De centrale punkter i denne metode er: 1) til at bruge den store del af prøven og justere modellen overflade og kniv kanten, så de er parallelle med hinanden; 2) at skære seriel sektioner i grupper og undgå problemer med adskiller sektioner ved hjælp af et par af hår tråde, når du henter en gruppe af serielle sektioner på slids gitre; 3) til at bruge en sektion-bedrift loop og undgå at blande rækkefølgen af sektionsgrupper; 4) at bruge en 'vand-overflade-raising loop"og sørg for sektionerne er placeret på toppen af vandet og at de rører gitteret først, for at placere dem i den ønskede position på Grid-net; 5) at bruge støtte filmen på en aluminium rack og gøre det lettere at inddrive sektioner på nettene og undgå rynker på filmens støtte; og 6) til at bruge en farvnings-rør og undgå ved et uheld bryde støtte film med pincet. Denne nye metode gør det muligt at opnå seriel ultratynde sektioner uden besvær. Metoden gør det muligt at analysere cellestrukturer af mikroorganismer i høj opløsning i 3D, som ikke kan opnås ved hjælp af automatiske indsamling af tape ultramicrotome metode og seriel blok-ansigt eller fokuseret ion beam scanning Elektron Mikroskopi.

Introduction

Korrekt seriel ultratynde skæring teknik er uundværlig til at studere celler og celle komponenter tre dimensioner på elektron mikroskopisk plan. Vi har studeret dynamikken i spindel pole krop i celle cyklus af gærceller, og afsløret morfologiske ændringer af deres ultrastruktur under cellecyklus og tidspunktet for dobbeltarbejde1,2,3, 4,5. I 2006, vi opfandt et nyt ord 'structome' ved at kombinere 'struktur' og '-ome', og definerede det som 'kvantitative og tre-dimensionelle strukturelle oplysninger af en hele cellen på elektron mikroskopisk plan' 6,7.

Af structome analyse, som kræver serial ultratynde skæring teknik, konstateredes det, at en gær celle af Saccharomyces cerevisiae og Exophiala dermatitidis havde omkring 200.000 ribosomer7,8, en Escherichia coli celle havde 26.000 ribosomer9, en Mycobacterium tuberculosis celle fået 1.700 ribosomer10 og Myojin spiral bakterier havde kun 300 ribosomer11. Disse oplysninger er nyttige i ikke kun estimering vækstrate i hver organisme, men også i identifikation af arter9.

Yderligere, structome analyse førte til opdagelsen af en ny organisme; Parakaryon myojinensis blev fundet i det dybe hav ud for kysten af Japan, hvis cellestruktur var en mellemting mellem dem i prokaryoter og eukaryoter12,13,14,15. I øjeblikket er seriel ultratynde skæring teknik anses for at være så svært, at det ville tage lang tid at mestre. I denne undersøgelse, har vi udviklet en pålidelig metode, hvor nogen kan udføre seriel ultratynde skæring uden besvær.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: De prøver, der anvendes i denne undersøgelse var mikroorganismer, hurtigt frosset med propan i flydende kvælstof, fryse erstattede i acetone indeholdende 2% osmium dinitrogentetraoxid, og indlejret i epoxy harpiks1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.

1. forberedelse af støtte film (figur 1-3)

Bemærk: Sølv-farvet Formvar støtte film er udarbejdet ved hjælp af støbt på glas metode19.

  1. Der tilsættes 100 mL 1,5% Formvar i ethylen dichloride til en Formvar-gør apparater (figur 1). Dyp halvdelen af et glas dias (76 mm x 26 mm x 1,3 mm) i Formvar løsning i kolonnen øverste i apparatet ved at trykke på løsningen med luft gennem 'a' ved hjælp af en rubber ball19.
    1. Afløb løsning fra kolonnen ved at åbne tre-vejs stophane og frigive luft gennem 'b' til at mindske presset. Tage ud glas dias fra apparatet og tør luft til at danne en film på overfladen af glas dias. Brug en glødelampe til at fremskynde tørring af filmens Formvar.
  2. Efter at skrabe de fire kanter af folie på glas dias med et barberblad (figur 2a), og vejrtrækning i diaset til lette adskillelsen af filmen fra dias20, flyde ud af filmen på vandet ved at nedsænke glas dias i den vandet langsomt ved en lav vandret vinkel (omkring 10°, figur 2b).
  3. Øse op Formvar filmen fra vandet ved hjælp af en aluminium rack (30 mm x 25 mm x 3 mm) med huller (4 mm i diameter) (figur 3a). Holde rack med Formvar film i en ekssikkator indtil brug (figur 3b).

2. trimning modellen blokken med en ultralyds trimning kniv og et barberblad 21 under et stereomikroskop (figur 4)

  1. Sørg for, at der er celler på overfladen af blokken ved at observere spidsen af blokken med et lysmikroskop (figur 4a).
  2. Montere modellen blokken i chuck (blok indehaveren), og montere chuck på en trimning scene21 (figur 4b). Denne trimningsfasen har en belysning ordning fra bagsiden af modellen.
  3. Trim blok til en størrelse af 0,7 mm x 1,0 mm (tal 4 c, 5d). Da epoxyharpiks er meget svært, trim blokke først ved hjælp af en ultralyds trimning kniv. Ultralyd trimning kniv er et nyligt indførte maskine, og blokke er let beskæres. Derefter trim blok yderligere med et barberblad. Skære ene skulder for at markere retningen for at skære (Se figur 5 d, figur 8).

3. afpudsning modellen blokken med diamantkniven ved hjælp af mikrotomen (figur 5)

  1. Sat modellen blokken chuck i prøveholder af ultramicrotome. Placer modellen 90° mod uret mod den faktiske position når seriel ultratynde skæring er udført (Se fig. 5 d).
  2. Skære overfladen af blokken med en diamant trimning kniv (Se fig. 5 d). Sæt diamant knivsæg parallelt med modellen blok ansigt, og skære det minimumsbeløb for modellen overfladen for ikke at miste nogen modellen (fig. 5 d).
    Bemærk: Dette trin er gjort for at udjævne modellen overflade. Del af modellen overfladen af den slanke del er overladt intakt (derfor denne del ikke skinner som et spejl, fig. 5 d), for ikke at miste nogen del af modellen for serielle skæring. Dette skyldes, at modellen er udsat på overfladen af blokken.
  3. Placere et spejl (Mesa cut, M) på kniv fase at overvåge skæring af prøven blok (figur 5 c).
  4. Skære blokken ved hjælp af trimning kniv af roterende kniv Stadium 30 ° til venstre (figur 5a) venstre kant (dette bliver den øverste side, figur 5 d, af prøven i serie skæring).
  5. Skære blok ansigt på omkring 100 µm fra den venstre kant af prøven (dette bliver den lavere side af modellen i serie skæring, fig. 5 d) ved at dreje kniven Stadium 30 ° til højre (figur 5b).
    Bemærk: De serielle sektioner vil blive skåret fra den slanke del af prøven af omkring 90 nm x ca 1 mm i størrelse. Den store del vil blive brugt til at justere modellen overflade og knivsæg, således at de er parallelle. Efter justering modellen overfladen for at være parallel med knivsæg, vil en stor del fjernes med et barberblad. Ved at skære de øverste og nederste sider af prøven af med mikrotomen, bliver begge sider af modellen glat og præcis parallelt med hinanden (figur 5 d), som er nødvendige for at få lige og ubrudt bånd sektioner.

4. justering modellen overflade og kniv kanten, således at de ansigt parallelt med hinanden 21

  1. Fjerne trimning kniv, og rotere modellen blokken 90° med uret.
  2. Angiv en ultratynde skære kniv til stadiet kniv.
  3. Justere modellen overflade og knivsæg, så de står parallelt med hinanden ved hjælp af den store del af prøven overflade.
    Bemærk: Den store del af modellen anvendes til justering fordi skæring ansigt seriel skæring er så lille, hvilket gør det vanskeligt at tilpasse modellen overflade og kniv kant ved hjælp af denne del, især i lodret retning. Således, ved hjælp af den store del af modellen gør justering nemt.

5. spredning neopren løsning på modellen blokken (figur 6)

  1. For at placere modellen chuck på nøjagtigt samme sted som den oprindelige position, anvende tape på chuck og chuck indehaveren af mikrotomen og skære på grænsen (figur 6a).
  2. Tag prøven chuck fra mikrotomen, og Placer den under stereomikroskopet (fig. 6b). Afskære den store del af modellen med et barberblad, forlader den slanke del, fra hvilke seriel afsnit vil blive opnået.
  3. Ved hjælp af Pasteurs pipette, slip omkring 1 µL 0,5% neopren løsning (fig. 6b) modellen bruges til seriel skæring, til at lave afsnit sider klæbemiddel. Dække hele modellen med neopren løsning. Absorbere overskydende neopren løsning straks med et stykke filtrerpapir placeret i nærheden af modellen. Få et bånd af sektioner er afgørende for at tage billeder af serielle celle sektioner, og neopren lim er meget nyttigt til at holde sektionerne sammen.
  4. Forbered 3 Slids gitre (størrelser af slidser: midterste, 0,4 mm x 2,2 mm, begge sider 0.2 mm x 2,2 mm) (figur 6 c) for opsamle seriel sektioner ved at bøje håndtaget af gitrene til 60 °, behandling af gitre med 0,5% neopren løsning, og at gøre nettene hydrofile af glød decharge22.

6. gør serielle sektioner (figur 7-9)

  1. Sted modellen blokken chuck tilbage på mikrotom på den samme position som 5.1 (figur 6a) ved at tilpasse de tapede dele. Dette holder blok ansigt og knivsæg helt parallelt med hinanden. Derefter bringe kniv tæt på modellen.
  2. Fyld kniv båden med vand.
  3. Dække mikrotom med et plastlåg at forhindre luftstrømmen (figur 7).
    Bemærk: Luftstrøm under ultratynde afsnitsinddeling og hentning af dele ofte forårsage problemer. Den plast dækslet har tre huller: et hul er for de kikkert linser, og de andre to huller til våben til at tillade drift, mens coveret er på. Den træ armlæn bruges til at placere våben imens delikat arbejde, som henter serielle sektioner med gitre. Den træ armlæn er placeret på forskellige borde fra tabellen mikrotomen (figur 7, pile), for ikke at overføre vibrationer af operatørens hænder til mikrotomen.
  4. Begynde at skære modellen på 200 nm snittykkelse (figur 8). Indstilling på 200 nm tykkelse vil spare tid i at bringe kniven til overfladen af modellen.
  5. Efter den første sektion er skåret, indstillet snittykkelse til 70 nm (figur 8).
  6. Når antallet af serielle sektioner når 20 (netop talte, efter at båndet når omkring 1,8 mm; antallet af sektioner varierer afhængigt af sektioner bredde), indstillet snittykkelse til 10 nm (figur 8) samtidig med at skære.
    Bemærk: Da mikrotomen ikke kan skære 10 nm tykke sektioner, ingen ny sektion vises, og de tidligere skåret afsnit blive adskilt fra knivsæg. Det er vigtigt at få adskilt sektionsgrupper (figur 9) for opsamle seriel sektioner til at undgå problemer med adskiller sektioner manuelt ved hjælp af et par af hår tråde. Da synsfelt i transmissions-elektronmikroskop er 2,0 mm, skal sektioner være 1,8 mm lang på de fleste.
  7. Indstillet snittykkelse til 60 nm (figur 8). Dette vil producere 70 nm sektioner (figur 8), fordi maskinen vil tilføje de foregående 10 nm tykkelse.
  8. Indstillet snittykkelse tilbage til 70 nm (figur 8) og fortsat skære indtil 1,8 mm lange afsnit er opnået.
  9. Gentag 6,6-6,8 indtil fem 1,8 mm lange strækninger er opnået (figur 9). Vi plejer at gøre fem sektionsgrupper da der er fem modellen indehavere i transmissions-elektronmikroskop tilgængelige i vores lab, men fem er ikke grænsen.

7. pluk op serielle sektioner (figur 10-12)

  1. Placere 'sektion-bedrift loop'23 (indre diameter af løkken: 5,0 mm) (figur 10a) på den tredje sektionsgruppe (figur 10b).
    Bemærk: Det er nødvendigt at hente afsnittene i den rækkefølge deres skæring for at tage billeder i den rigtige rækkefølge. Men da der er fem sektionsgrupper på kniv båd, det ofte bliver forvirrende hvilke grupper er der. Ved at placere løkken på den tredje gruppe, bliver det klart, at de to grupper tæt på operatøren er først og anden og de fjerne to fra operatøren er de fjerde og femte grupper (figur 10b). Dette vil forhindre blande rækkefølgen.
  2. Placere 'vand-overflade-raising loop'23 (WSRL, indvendige diameter af løkken: 4,0 mm) (fig. 11a) på kniv fase (fig. 11b). WSRL vil stå fast på stadiet kniv, fordi det er udstyret med en magnet i bunden.
    1. Placer sløjfe i WSRL lige over de serielle sektioner ved at flytte sin skaft og håndtag. Lavere loop af WSRL på vandoverfladen, således at løkken omslutter dele.
    2. Skubbe sløjfen ved at dreje skruen nedad, således at vandoverfladen vil rejse af overfladespænding (tal 11c-d). Flytte sektionen til midten af løkken, Placer den på toppen af vandet, og justere retningen af afsnittet ved hjælp af en hår strand21.
    3. Afhente sektionsgrupper ved at røre den med en nøgne slids-grid, som er afholdt af pincet og føres parallelt med vandoverfladen (Figur 11 d). Det er vigtigt for sektioner at røre gitteret først, ikke vand til at placere dele præcist på midten af nettet (Figur 11 d).
  3. Placer gitre med sektioner sammen med en lille dråbe vand på Formvar støtte film16 (figur 12), og Fjern overskydende vand ved hjælp af filtrerpapir.
    Bemærk: Rynker på støtte film er ofte et problem når sektioner samles op ved hjælp af et gitter med støtte film fordi membran (sektioner) rører membran (støtte film) direkte. Problemet med at få rynker på filmens støtte reduceres betydeligt ved at placere et afsnit-bærende gitter sammen med en lille dråbe vand på Formvar støtte film16.

8. farvning afsnit16,24 (Figur 13)

  1. Efter afsnittene er helt tørret, rive Formvar filmen fra omkring gitrene, og fjern gitrene forsynet med afsnittene.
  2. Gitrene i groove farvning rør16 i den rigtige rækkefølge (Figur 13), og plette sektioner med uranyl acetat og bly citrat24.
    Bemærk: Der er en groove 0,6 mm dybt langs længdeaksen på røret skåret med et barberblad. Røret er nyttigt for at forhindre utilsigtet brud af støtte film, når du bruger pincet, da direkte håndtering af gitre ikke er nødvendigt under farvning og vaske proces16.

9. observation af serielle sektioner (Figur 14)

  1. Sæt 5 gitrene i den multi prøveholder i den rigtige rækkefølge (figur 14a), orientere gitter slids vinkelret på modellen indehaveren akse længdeakse. Håndtag (pilespidser) af gitrene har ikke skal skæres, fordi 'gitter-fiksersalte' ikke vil røre håndtag.
  2. Fastsætte gitrene med 'gitter-fiksersalte' (figur 14b) og indsætte præparatholderen i transmissions-elektronmikroskop.
    Bemærk: Det er ofte nyttigt at tage lav forstørrelse billeder af alle celle sektioner (Figur 15) for at finde interessante mikroorganismer eller celler i god stand med ingen forurening og med god fiksering, før du tager billeder af målcellen.
  3. Tage billeder af target-cellerne i alle celle sektioner på høj forstørrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokol anvendtes tre slids gitre for opsamle seriel sektioner. Gitrene er lavet af nikkel og kobber. De serielle sektioner er placeret på den midterste spalte. Spalter på begge sider er nødvendige for at se afsnittene når afhente dem med gitteret. For at holde gitrene parallelt med seriel sektioner, når picking dem med pincet (Figur 11 d), håndtaget er bøjet (figur 6 c, højre). Et lille håndtag er fordelagtige at forhindre bøjning af den vigtigste del af nettet, som giver alvorlige problemer i picking up sektioner, og forhindre droppe sektionerne under farvning. Dette gitter har fordele i forhold til konventionelle 2,0 mm x 1,0 mm enkelt-hullers gitter. Nemlig sektioner understøttes direkte af to metalstænger 0,4 mm fra hinanden (smallere end 1,0 mm) og af Formvar støtte filmen i en tre-spalten gitter, mens sektioner understøttes kun af støtte filmen i en konventionelle single-huls gitter. Modellen drift kan derfor forhindres i at fotografere på høj forstørrelse ved hjælp af en tre-spalten gitter.

Figur 15 viser en lav forstørrelse af fem gitre, der bærer seriel sektioner. Da hver sektion sticks sammen, er det nemt at finde den samme celle i næste afsnit selv ved højere forstørrelse. Figur 16 og 17 er eksempler på serie billeder af celle sektioner. Fordi sektioner understøttes sikkert på 3 Slids gitre, taget billeder på høj forstørrelse (x 50,000) nemt uden modellen drift. Fibre af DNA 2 nm i diameter blev fotograferet i disse undersøgelser9,12.

Figure 1
Figur 1 . Formvar støtte filmproduktion apparater. Halvdelen af glas dias er dyppet i Formvar løsning i kolonnen øverste i apparatet ved at trykke på løsningen med luft gennem 'a' ved hjælp af en gummibold. Løsningen er drænet fra kolonnen ved at åbne tre-vejs stophane og frigive luft gennem 'b' til at mindske presset. (Gengivet fra Yamaguchi og Adachi, 201119 med tilladelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Metode for at frigive film fra glasset glider på vand. a de fire kanter af folie på glas dias skrabes bruger barberblad. (b) Formvar film er flød ud på vandet ved at sænke glas diasset langsomt med en lav vinkel. (Gengivet fra Yamaguchi og Adachi, 201119 med tilladelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Formvar støtte film på en aluminium rack. (a) Formvar film er skovlede op fra vandet med en aluminium rack. b rack er holdt i en ekssikkator indtil brug. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Trimning af prøven blok med en ultralyds trimning kniv og et barberblad under et stereomikroskop. a forekomsten af modellen er bekræftet ved at observere modellen blokken under et lysmikroskop. Blokken vist i figur indeholdt mikroorganismer, som er forbundet med en skala-orm chaeta (ca. 1,7 mm i længden) indsamlet fra de dybe hav12,14. b trimningsfasen. (c) hele billedet af et stereomikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Trimning af prøven blok med diamantkniven brug af mikrotomen. a en illustration til at skære den venstre kant. b blok ansigt er skåret på en position cirka 100 nm fra den venstre kant af modellen. (c) et spejl (Mesa cut, M) placeret på stadiet kniv. (d) modellen overflade. Bemærk at den øverste side og den nedre side af den slanke del er glat og perfekt parallel. Bemærk også, at skulderen er skåret for at markere retningen for at skære (Se figur 8). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Neopren behandling på modellen overflade. (a) for at placere modellen chuck tilbage på præcis den oprindelige position, er chuck og chuck indehaveren af mikrotomen markeret med et bånd og skære på grænsen. b fugtning af prøven med neopren løsning ved hjælp af Pasteurs pipette. c tre slids gitre for opsamle seriel sektioner. Håndtaget er bøjet til 60 grader (c, højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 . Plast dække af mikrotomen og træ armlæn. Plastic coveret er nyttigt til at forhindre luftstrømmen under ultratynde skæring. Træ armlæn bruges til at gøre vanskelige arbejde som henter serielle sektioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 . Indstilling af snittykkelse og opnå sektioner på den rette tykkelse. Efter antallet af serielle sektioner har nået 20, Snittykkelsen indstilles til 10 nm. Da mikrotomen ikke kan skære 10 nm tykke sektioner, ingen ny sektion vises, og de tidligere skåret afsnit blive adskilt fra knivsæg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9 . Eksempel på ultratynde sektioner opnået gennem protokollen. Bemærk, at de fem grupper af serielle sektioner af ca. 1,8 mm lang er allerede adskilt efter opskæring. I dette tilfælde er farven på midten af de ultratynde sektioner gullig på grund af tilstedeværelsen af prøven. De andre dele af afsnittet, som ikke indeholder modellen og består af harpiks kun, er sølv i farve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10 . «Afsnit-bedrift loop». (a) Top view (øverste del) og underside (nederste del af billedet) af løkken. b afsnit-bedrift løkke bruges til at holde den tredje gruppe af serielle sektioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11 . Hentning af serielle sektioner. «a» vand-overflade-raising loop» (WSRL). Håndtag af løkken kan fjernes fra skaft, som er bevægelige. Løkken kan også flyttes op og ned ved at dreje skruen top. b WSRL er fast på kniv scenen af en magnet. (c) tættere visning af (b). (d) diagram af løkke, vandoverfladen, sektioner og gitter under ophalingen (sidekig). Ultratynde sektioner kan hentes netop til gitteret slids ved at sænke det nøgne gitter parallelt med de ultratynde sektioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12 . Placere grid på Formvar film. Gitteret holding sektionerne er placeret sammen med en lille dråbe vand på Formvar folie på aluminium rack. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13 . Farvning tube16. En groove 0,6 mm dyb er lavet langs den lange akse ved hjælp af et barberblad. Gitre er placeret i rillen i den rigtige rækkefølge. Ene ende af røret er skåret (pil hoved) for at markere sin retning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 14
Figur 14 . Placere gitrene i en prøveholder. (a) gitrene er placeret i en prøveholder i den rigtige rækkefølge. (b) gitrene er derefter fast med 'gitter-fiksersalte'. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 15
Figur 15 . Seriel afsnit monteret på slids gitre. Figur viser 18 til 25 dele monteret på en gitter. Tallene i hver spalte indikere sekvens nummer begynder fra den første sektion. Den første sektion er tykkere end de andre (Se figur 8). Bemærk, at sektionerne er knyttet sammen og har samme tykkelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 16
Figur 16 . Seriel afsnit af Parakaryon myojinensis12. Tal nederst til venstre angiver sekvensen i forhold til det første afsnit. Figuren viser 12 ud af 67 komplet sektioner. Denne celle fandtes for at have en stor nucleoid bestående af naked DNA fibre, med en enkelt nucleoid membran, og endosymbionts, der ligner bakterier, men ingen mitokondrier. Således, denne organisme synes at være en mellemliggende form for liv udvikler sig fra prokaryot til eukaryote12. Nielsen, nucleoid. Gengivet fra Yamaguchi og Worman, 2014. 14 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 17
Figur 17 . Seriel sektioner af Escherichia coli9. Tal nederst til venstre angiver sekvensen i forhold til det første afsnit. Figuren viser 12 komplette sektioner. Denne celle fandtes for at indeholde 21,700 ribosomer9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden præsenteres her kræver ikke dyrt udstyr. Det kræver kun en aluminium rack (figur 3), tre-spalten gitre (figur 6 c), afsnit-bedrift loops (figur 10a), vand-overflade-raising loop (fig. 11a) og en farvning røret (Figur 13). Der er mange funktioner i den aktuelle metode. Den store del af modellen bruges til at justere modellen overflade og kniv kanten, så de står parallelt med hinanden. Seriel sektioner er skåret i grupper for at undgå problemer med adskiller sektioner ved hjælp af et par af hår tråde, når du henter en gruppe af serielle sektioner på slids gitre. En 'sektion-bedrift loop' bruges til at undgå at blande rækkefølgen af grupperne sektion. En 'vand-overflade-raising loop' bruges for at sikre sektionerne er placeret på toppen af vandet og at de rører gitteret først, for at placere dem i den ønskede position på Grid-net. Formvar støtte film på en aluminium stativ bruges til at gøre det lettere at inddrive sektioner på Grid-net og for at undgå rynker på støtte filmen. En farvning rør bruges til at undgå ved et uheld bryde støtte film med pincet.

For nylig var en automatisk indsamling af tape ultramicrotome udviklede25 at indsamle sektioner automatisk til scanning elektronmikroskopi (SEM) imaging på elektron-uigennemsigtig plastik bånd. Denne metode kan pålideligt cut tusindvis ultratynde afsnit26, der er ikke muligt med den nuværende metode. Også, seriel blok ansigt (SBF) 27 og fokus ion beam (FIB)-SEM28 bruges til at indsamle 3D oplysninger af celler og væv af dyr. I disse metoder, er skæring med en diamant kniv eller fokus ion stråle integreret indeni SEM mikroskopet, og gennemføres på en fuldautomatisk måde, der kræver ingen særlige teknikker. Selv om disse metoder er nyttige, er apparatet så dyre, at ikke mange institutioner køber disse maskiner. Også, da disse metoder beskæftiger SEM til fotografi sektioner, opløsning af micrographs er ringere end den nuværende metode, der beskæftiger transmissions elektronmikroskopi (TEM). Disse metoder kan ikke løse individuelle ribosomet partikler, mikrotubuli, microfilaments og DNA fibre i øjeblikket.

Structome analyse af mikroorganismer og ultrastrukturelle undersøgelse af ukendt mikroorganismer er det nødvendigt at observere celler og celle komponenter såsom cellevæg, plasma membran, mitokondrier, nucleus, nukleare membraner, endoplasmatiske reticulum, kloroplaster, plastids, Golgi apparatet, ribosomer og fintrådede elementer med høj opløsning. TEM observation af serielle ultratynde sektioner er en af et par metoder til at muliggøre en sådan analyse i tre dimensioner. Da ultratynde sektioner forbliver efter observation i denne metode, kan det samme område der konstateres gentagne gange; Det er ikke muligt i SBF eller FIB-SEM, da de observerede område er tabt efter observation. Denne funktion er vigtigt at studere dybhavsfiskeri mikroorganismer hvor det er nødvendigt at søge interessante organismer ved lav forstørrelse først, og derefter tage billeder seriefremstillede på målorganismen på høj forstørrelse.

Afslutningsvis seriel ultratynde skæring metode kan nu udføres i en nem, billig og relaible måde af den foreliggende undersøgelse, som er afgørende for 3D ultrastructual undersøgelse af mikroorganismer i høj opløsning i Elektron Mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Shigeo Kita for hans værdifulde forslag og diskussion. Vi takker også John og Sumire Eckstein for deres kritiske læsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar making apparatus Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 652 W 180 x D 180 x H 300 mm
Glass slide Matsunami Co. Ltd., Osaka - 76 x 26 x 1.3 mm
Aluminum rack with 4-mm holes Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 658 W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper
Stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo - SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo - SM-LW 61 Ji
Trimming stage Sunmag Co.Ltd., Tokyo - Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage Sunmag Co.Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Ultrasonic trimming blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 5240 EM-240, Refer to this paper
Diamond knife for trimming Diatome Co. Ltd., Switzerland - 45°
Diamond knife for ultrathin sectioning Diatome Co. Ltd., Switzerland - 45°
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna - Ultracut S
Mesa cut Leica Microsystems, Vienna - Mirror
0.5% Neoprene W solution Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 605
Special 3-slit nickel grid Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2458 Refer to this paper
Special 3-slit copper grid Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2459 Refer to this paper
Section-holding loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 526 Refer to this paper
Water-surface-raising loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 527 Refer to this paper
Staining tube Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 463 Refer to this paper
Multi-specimen holder JEOL Co. Ltd., Tokyo - EM-11170
JEM-1400 JEOL Co. Ltd., Tokyo - Transmission electron microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
  2. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
  3. Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
  4. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
  5. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
  6. Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
  7. Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
  8. Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
  9. Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
  10. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
  11. Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
  12. Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
  13. Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
  14. Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
  15. Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
  16. Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
  17. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
  18. Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
  19. Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
  20. Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216 (2000).
  21. Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
  22. Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
  23. Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
  24. Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
  25. Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
  26. Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
  27. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  28. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).

Tags

Engineering sag 131 fryse-substitution høj opløsning loop mikroorganismer mikrotom seriel ultratynde skæring structome 3D analyse transmissions Elektron Mikroskopi ultrastruktur
En metode til at indhente seriel ultratynde sektioner af mikroorganismer i transmissions Elektron Mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, M., Chibana, H. A Method… More

Yamaguchi, M., Chibana, H. A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56235, doi:10.3791/56235 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter