Summary
מחקר זה מציג אמין וקל נהלי קבלת טורי ודק במיוחד חלקים מיקרואורגניזם ללא ציוד יקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
Abstract
התבוננות תאים ומרכיבים תא בשלושה ממדים בהגדלה גדולה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מחייב הכנת טורי זגוגית מקטעים של הדגימה. למרות הכנת מקטעים זגוגית טורי נחשב להיות קשה מאוד, זה די קל אם שימוש בשיטה הנכונה. בנייר זה, אנו מראים תהליך צעד אחר צעד בבטחה קבלת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים. נקודות המפתח של שיטה זו הם: 1) כדי להשתמש בחלק גדול הדגימה ולהתאים לקצה משטח והסכין הדגימה כך הם מקבילים זה לזה; 2) כדי לחתוך קטעים טוריים בקבוצות ולהימנע קושי להבחין. בין האיזורים השונים בחשבון בעזרת זוג קווצות שיער בעת אחזור קבוצה של מקטעים טורית על גבי הרשתות שסע; 3) כדי להשתמש לולאה סעיף החזקת ולמנוע ערבוב את הסדר של קבוצות סעיף; 4) כדי להשתמש 'הרמת-מים-פני לולאה' וודא כי הסעיפים ממוקמות על השיא של המים, הם נוגעים הרשת קודם, על מנת למקם אותם במיקום הרצוי על הרשתות; 5) כדי להשתמש הסרט תמיכה על מתלה אלומיניום וכדי שיהיה קל יותר להתאושש הסעיפים על הרשתות וכדי למנוע קמטים של הסרט תמיכה; ו- 6) כדי להשתמש שפופרת מכתימים ולהימנע לשבור את הסרטים תמיכה עם פינצטה. שיטה חדשה זו מאפשרת קבלת מקטעים זגוגית טורי ללא קושי. השיטה מאפשרת לנתח את מבנה התא של מיקרואורגניזמים ברזולוציה גבוהה ב- 3D, אשר אינה יכולה להיות מושגת באמצעות שיטת ultramicrotome איסוף קלטות אוטומטיים, פרצוף-בלוק טורי או יון ממוקדת קרן סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים.
Introduction
טורי זגוגית אופטים הטכניקה הנכונה הוא חיוני ללמוד תאים ומרכיבים תא three-dimensionally ברמה המיקרוסקופית אלקטרון. יש ללמוד את הדינמיקה של גוף קוטב פלך במחזור התא של תאי שמרים, ואנו חשף שינויים מורפולוגיים של ultrastructure שלהם במהלך מחזור התא ואת הזמן של שכפול1,2,3, 4,5. בשנת 2006, אנחנו נטבע מילה חדשה 'structome' על-ידי שילוב 'מבנה', '-הביתה ', והוא הגדיר זאת כ 6,'כמותית ותלת ממדית מבניים מידע של כל תא ברמה המיקרוסקופית אלקטרון'7.
על ידי ניתוח structome, אשר דורשת טכניקה אופטים זגוגית טורי, התברר שיש תא שמרים של האפייה , Exophiala dermatitidis 7,כ-200,000 הריבוזומים8, Escherichia coli תא היה הריבוזומים 26,0009, תא שחפת Mycobacterium הריבוזומים 1,70010 והיה מיוג'ין ספירלה חיידקים הריבוזומים רק 30011. מידע זה שימושי באומדן לא רק את שיעור הצמיחה כל אורגניזם, אלא גם בזיהוי מינים9.
ניתוח structome נוסף, הובילו לגילוי של אורגניזם חדש; Parakaryon myojinensis נמצאה במעמקי הים החוף של יפן, מבנה תאים אשר היו ביניים בין אלה של אאוקריוטים פרוקריוטים ו-12,13,14,15. בזמן הנוכחי, טורי טכניקה אופטים זגוגית נחשב להיות כל כך קשה. שזה ייקח זמן רב להתמחות. במחקר זה, פיתחנו שיטה אמינה שבו כל אחד יכול לבצע חלוקתה זגוגית טורי ללא קושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: דגימות השתמשו במחקר זה היו מיקרואורגניזמים, במהירות קפוא עם גז חנקן נוזלי, להקפיא שהוחלפו ב אצטון המכיל 2% אוסמיום ארבע-חמצני, ומוטבעים אפוקסי שרף1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. הכנת הסרט תמיכה (איור 1-3)
הערה: Formvar בצבע כסף תמיכה הסרט מוכן באמצעות שיטת יצוקה על-זכוכית19.
- להוסיף 100 מ של 1.5% Formvar של-אתילן dichloride אל מנגנון יצירת Formvar (איור 1). טובלים חצי אחד של שקופית מזכוכית (76 מ מ x 26 מ"מ x 1.3 מ"מ) בתמיסה Formvar בעמודה העליון של המנגנון על ידי לחיצה על הפתרון עם האוויר דרך 'a' באמצעות כדור גומי19.
- סוחטים את הפתרון מן העמודה על-ידי פתיחה של צימוד-כיוונית של שחרור האוויר דרך 'b' כדי להפחית את הלחץ. להוציא את השקופית זכוכית מן המנגנון ויבש באוויר כדי ליצור סרט על פני השטח של השקופית זכוכית. השתמש מנורת להט להאיץ הייבוש של הסרט Formvar.
- לאחר מגרדים ארבעת הקצוות של הסרט בשקופית זכוכית עם סכין גילוח (איור 2 א), ונשימה אותן לשקופית כדי להקל על ההפרדה של הסרט שקופית20, ימחאו הסרט על המים במועט השקופית זכוכית לתוך מים לאט בזווית אופקית נמוכה (בערך 10°, איור 2b).
- תגרדו את הסרט Formvar מן המים באמצעות ארון תקשורת של אלומיניום (30 מ מ x 25 מ"מ x 3 מ"מ) עם חורים (4 מ מ קוטר) (איור 3 א). שמור על האצטבה עם הסרט Formvar desiccator עד לשימוש (איור 3b).
2. קיצוץ הרחוב דגימה של להב חיתוך אולטראסוניות, גילוח 21 תחת stereomicroscope (איור 4)
- ודא כי ישנם תאים על פני השטח של גוש על ידי התבוננות קצה הרחוב עם מיקרוסקופ אור (איור 4a).
- הר הרחוב דגימה ב הצ'אק (בלוק מחזיק), והר הצ'אק על הבמה זמירה21 (איור 4b). בשלב זה זמירה יש מנגנון תאורה מהחלק האחורי של הדגימה.
- חתוך שאבן בגודל של 0.7 מ"מ x 1.0 מ"מ (איורים 4 c, 5d). מאז שרף אפוקסי הוא מאוד קשה, לקצץ את אבני הראשון באמצעות להב חיתוך אולטרה סאונד. להב חיתוך אולטראסוניות מכונה הציג לאחרונה, הבלוקים, נסגרים בקלות. אז לקצץ את גוש נוסף עם סכין גילוח. חותכים כתף אחת כדי לסמן את הכיוון של חיתוך (ראה איור 5 d, איור 8).
3. זמירה את הרחוב דגימה בסכין יהלום באמצעות את האזמל הקטן (איור 5)
- להגדיר הרחוב דגימה צ'אק הדגימה האוחז ultramicrotome. מקם את הדגימה ב- 90° נגד כיוון השעון בניגוד לעמדת בפועל בעת חלוקתה זגוגית טורי שבוצעה (ראה איור 5 d).
- חותכים את השטח של גוש עם סכין חיתוך יהלום (ראה איור 5-d). להגדיר את קצה סכין יהלום מקביל פני בלוק הדגימה, לחתוך את הכמות המינימלית של משטח הדגימה כדי לא לאבד את כל הדגימה (איור 5 d).
הערה: שלב זה נעשית להחליק פני השטח הדגימה. חלק משטח הדגימה של החלק הדק הוא נותר ללא פגע (לכן החלק הזה לא זורחת כמו מראה, איור 5 d), כדי לא לאבד חלק כלשהו של הדגימה על חלוקתה טורי. הסיבה לכך היא הדגימה נחשף על פני הרחוב. - להציב מראה (Mesa קאט, ז) על הבמה את הסכין כדי לנטר את חיתוך הרחוב דגימה (איור 5 c).
- חותכים את הקצה השמאלי (זה הופך סייד, איור 5 d, המדגם ב טורי חלוקתה) של גוש באמצעות סכין חיתוך על ידי סיבוב על הבמה סכין 30 מעלות שמאלה (איור 5a).
- חתכו את הפנים בלוק-כ-100 מיקרומטר מהקצה השמאלי של הדגימה (זה הופך בצד התחתון של הדגימה ב טורי חלוקתה, איור 5 d) על-ידי סיבוב על הבמה סכין 30 מעלות ימינה (איור 5b).
הערה: הסעיפים טורי יהיה לחתוך חלק רזה של הדגימה כ- 90 ננומטר x בערך בגודל 1 מ מ בלבד. החלק הגדול ישמש כדי להתאים את השטח הדגימה ואת קצה הסכין כך הם מקבילים. לאחר התאמת השטח הדגימה כדי להיות מקביל עד קצה הסכין, החלק גדול יוסרו עם סכין גילוח. על ידי גזירה את הצדדים העליון והתחתון של הדגימה באמצעות את האזמל הקטן, בשני הצדדים של הדגימה הופך בדיוק מקבילים זה לזה (איור 5 d), וחלקה אשר הכרחי לקבל את הכלים ישר ואינו רצופה מקטעים.
4. התאמת לקצה משטח והסכין הדגימה כך שהם פונים במקביל אחד לשני 21
- להסיר את הסכין זמירה, וסובב את הרחוב דגימה 90° בכיוון השעון.
- הגדר את הסכין אופטים זגוגית של השלב הסכין.
- התאם משטח הדגימה לבין קצה הסכין כך שהם פונים במקביל זו לזו באמצעות חלק גדול משטח הדגימה.
הערה: חלק גדול הדגימה משמש עבור התאמה כי הפנים חיתוך של טורי חלוקתה כל כך קטנה, ומקשה על התאם משטח הדגימה קצה הסכין באמצעות החלק הזה בלבד, בעיקר בכיוון אנכי. לכן, באמצעות החלק הגדול של הדגימה הופך התאמה קלה.
5. מריחה אטומה פתרון על הרחוב דגימה (איור 6)
- כדי למקם את צ'אק הדגימה-בדיוק באותה העמדה המיקום המקורי, להחיל את הקלטת של הצ'אק, צ'אק האוחז האזמל הקטן ושרטתי הגבול (איור 6a).
- סעו הדגימה צ'אק האזמל הקטן, מניחים אותה מתחת stereomicroscope (איור 6b). לחתוך את החלק הגדול של הדגימה עם סכין גילוח, עוזב את החלק הדק, שממנו ניתן להשיג חלקים טורי.
- באמצעות פיפטה של פסטר, ירידה בערך µL 0.5% אטומה פתרון (איור 6b) על גבי הדגימה שישמש עבור חלוקתה טורי, לעשות הדבק הצדדים בסעיף. מכסים את הדגימה כל פתרון אטומה. לספוג עודפי אטומה פתרון מיד עם חתיכת נייר סינון ממוקם בסמוך הדגימה. מקבל סרט סעיפים חיוני עבור צילום תמונות סעיפים תא טורי, אטומה דבק הוא מאוד שימושי עבור מנתחות את הסעיפים.
- להכין 3 םיקדסה רשתות (בגדלים של חריצים: באמצע, 0.4 מ מ x 2.2 מ מ, שני הצדדים 0.2 מ"מ x 2.2 מ"מ) (איור 6 c) עבור אוסף קטעים סדרתי על ידי כיפוף בידית של הרשתות עד 60 ° צלזיוס, בטיפול הרשתות עם 0.5% אטומה פתרון, ולהפוך את הרשתות הידרופילית על ידי זוהר פריקה22.
6. ביצוע סעיפים טורי (איור 7-9)
- המקום הרחוב דגימה צ'אק פנימה את האזמל הקטן במיקום זהה כמו 5.1 (איור 6a) על ידי יישור החלקים מוקלט. פעולה זו שומרת את פני בלוק לבין קצה הסכין מקבילים זה לזה באופן מושלם. ואז להביא את הסכין קרוב הדגימה.
- למלא את הסירה את הסכין במים.
- מכסים את האזמל הקטן עם כיסוי פלסטיק כדי למנוע זרימת אוויר (איור 7).
הערה: זרימת אוויר במהלך חלוקתה ודק במיוחד, שליפת מקטעים לעיתים קרובות לגרום לבעיות. מכסה פלסטיק יש שלושה חורים: חור אחד הוא עבור עדשות המשקפת, שני החורים אחרים נועדו הזרועות לאפשר פעולה בעוד השער נמצא על. משענת עץ משמשת להנחה הידיים בזמן ביצוע עבודה עדינה, כגון אחזור מקטעים טורית בעזרת רשתות. משענת עץ מושם על שולחנות שונים מן השולחן מיקרוטום (איור 7, חצים), כדי לא לשדר את הרטט של הידיים של המפעיל האזמל הקטן. - לחתוך את הדגימה-עובי סעיף 200 ננומטר (איור 8). הגדרה-200 ננומטר בעובי יחסוך זמן להביא את הסכין אל פני השטח של הדגימה.
- לאחר החלק הראשון הוא נחתך, להגדיר את עובי סעיף ל-70 ננומטר (איור 8).
- כאשר מספר קטעים סדרתי מגיע ל- 20 (בדיוק מדברים, לאחר מגיע סרט כ 1.8 מ"מ; מספר קטעים משתנה בהתאם לרוחב של סעיפים), להגדיר את עובי סעיף 10 ננומטר (איור 8) תוך לחתוך.
הערה: מאז האזמל הקטן לא יכול לחתוך קטעים ננומטר בעובי 10, אין סעיף חדש שמופיע ולאחר הסעיפים בעבר לחתוך המופרדות קצה הסכין. חשוב לקבל קבוצות מקטעים נפרדים (איור 9) עבור אוסף טורי מקטעים למנוע קושי הפרדת המקטעים באופן ידני באמצעות זוג קווצות שיער. כיוון התצוגה של השדה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים הוא 2.0 מ מ, החתכים צריכים להיות באורך 1.8 מ מ לכל היותר. - להגדיר את עובי סעיף 60 ננומטר (איור 8). זה יהיה לייצר nm 70 חלקים (איור 8) כי המכונה יוסיף את עובי nm 10 הקודם.
- להגדיר את עובי סעיף חזרה ל-70 ננומטר (איור 8) ולהמשיך חיתוך עד 1.8-מ מארוך מקטעים מתקבלים.
- חזור על 6.6-6.8 עד לחמישה מדורים ארוך מ מ 1.8 מתקבלים (איור 9). אנו מבצעים בדרך כלל חמש קבוצות מקטעים מאז יש חמש מחזיקי הדגימה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים זמינים במעבדה שלנו, אבל חמש דקות הם לא הגבול.
7. אוסף טורי מקטעים (איור 10-12)
- במקום 'סעיף החזקת loop'23 (בקוטר הפנימי של הלולאה: 5.0 מ"מ) (איור 10a) על קבוצת המקטע השלישי (איור 10 ב').
הערה: זה הכרחי לאחזר את הסעיפים לפי סדר שלהם חלוקתה כדי לצלם תמונות בסדר הנכון. עם זאת, מאז יש חמש קבוצות מקטעים על הסירה את הסכין, זה לעתים קרובות מקבל מבלבל אילו קבוצות הם אשר. על ידי הנחת את הלולאה על הקבוצה השלישית, מתברר כי שתי הקבוצות ליד המפעיל הן הראשון, השני, ושני מרוחק מהמרכזן הן הקבוצות הרביעית והחמישית (איור 10 ב'). פעולה זו תמנע ערבוב את ההזמנה. - במקום 'הרמת-מים-פני לולאה'23 (WSRL, הקוטר הפנימי של הלולאה: 4.0 מ"מ) (איור 11 א) על הבמה הסכין (איור 11b). WSRL לעמוד ביציבות על הבמה סכין כי הוא מצויד מגנט בתחתית.
- במקום הלולאה של WSRL ממש מעל הסעיפים טורי על-ידי הזזת מוט וידית שלה. להוריד את הלולאה של WSRL על גבי משטח מים כך הלולאה מקיף הסעיפים.
- לדחוף את הלולאה למטה על-ידי סיבוב הבורג כלפי מטה כך פני המים יעלה על ידי מתח (דמויות 11c-d). להעביר את המקטע למרכז הלולאה, למקם אותו על השיא של המים, ולהתאים את הכיוון של המקטע באמצעות קווצת שיער21.
- לאסוף קבוצות מקטעים על ידי נגיעה בו עם חשוף חריץ-רשת, אשר מוחזק על ידי פינצטה, המשיך מקביל פני המים (איור 11 d). חשוב עבור מקטעים הרשת נוגעת, לא המים, למקם קטעים בדיוק מרכז הרשת (איור 11 d).
- מניחים את הרשתות עם מקטעים יחד עם טיפה קטנה של מים על ה Formvar תמיכה הסרט16 (איור 12), ולהסיר עודפי מים באמצעות נייר סינון.
הערה: התקמטות של הסרט התמיכה הוא לעיתים קרובות בעיה כאשר מקטעים לאסוף באמצעות רשת תמיכה הסרט כי הממברנה (סעיפים) נוגע ישירות ממברנה (סרט, תמיכה). הבעיה של מקבל קמטים על הסרט תמיכה פוחת באופן משמעותי על-ידי הצבת רשת סעיף מניבי יחד עם טיפת מים זעירים הסרט תמיכה Formvar16.
8. צביעת סעיפים16,24 (איור 13)
- לאחר הסעיפים הם יבשים לחלוטין, לקרוע את הסרט Formvar מ סביב הרשתות, ולהסיר את רשתות הנושאת את המקטעים.
- להגדיר את הרשתות לקצב של ה צינור מכתימים16 בסדר הנכון (איור 13), כתם מקטעים עם uranyl אצטט ולהוביל ציטראט24.
הערה: יש חריץ עמוק 0.6 מ"מ לאורך הציר הארוך של הצינור לחתוך עם סכין גילוח. הצינור שימושית למניעת שבירה מקרית של סרטים תמיכה כאשר באמצעות פינצטה, שכן טיפול ישיר של רשתות אין צורך במהלך ה מכתימים והניקיונות תהליך16.
9. תצפית סעיפים טורי (איור 14)
- הגדר את רשתות 5 ב בעל הדגימה מרובות בסדר הנכון (איור 14 א'), המכוונת לציר הארוך של הסדק רשת בניצב לציר מחזיק הדגימה. הידיות (חץ) הרשתות לא צריך לחתוך, כי "הרשת-מקובל" לא תיגע האחיזה.
- לתקן את הרשתות עם 'רשת-מקובל' (איור 14 ב) והכנס את מחזיק הדגימה לתוך המיקרוסקופ האלקטרוני שידור.
הערה: לעתים קרובות שימושי לקחת תמונות הגדלה נמוכה של תא כל המקטעים (איור 15) למצוא מעניין מיקרואורגניזמים או תאים במצב טוב ללא זיהום, עם קיבוע טוב, לפני לקיחת תמונות של תא היעד. - לצלם תמונות של תאי היעד בכל המדורים תא בהגדלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ב פרוטוקול זה, שימשו םיקדסה שלוש רשתות אוסף קטעים טורי. הרשתות עשויות ניקל או נחושת. הסעיפים טורי ממוקמות על הסדק האמצעי. החריצים משני הצדדים יש צורך להציג את המקטעים בעת לאסוף אותם עם הרשת. כדי להשאיר את הרשתות במקביל הסעיפים טורי בעת לאסוף אותם עם פינצטה (איור 11 d), מכופף את הידית (איור 6 ג, נכון). ידית קטנה יש יתרון כדי למנוע כיפוף של החלק העיקרי של הרשת, אשר גורמת לבעיות חמורות ב לאסוף במקטעים, וכדי למנוע נשירה הסעיפים במהלך צביעת. רשת זו יש יתרונות על פני הרשת יחיד-חור קונבנציונאלי 2.0 מ"מ x 1.0 מ"מ. כלומר, מקטעים נתמכים ישירות על ידי שני מוטות המתכת בנפרד 0.4 מ"מ (צר יותר 1.0 מ מ) ועל -ידי הסרט תמיכה Formvar שלוש םיקדסה ברשת, בזמן מקטעים נתמכים רק ב- הסרט תמיכה ברשת יחיד-חור קונבנציונלי. לכן ניתן למנוע את הדגימה להיסחף בצילום בהגדלה באמצעות רשת םיקדסה שלוש.
איור 15 מראה תצוגה הגדלה נמוכה של חמש רשתות שנושאים מקטעים טורי. מאז כל מקטע מחובר ביחד, קל למצוא באותו התא בסעיף הבא אפילו בהגדלה גבוהה יותר. איור 16 ו- 17 הם דוגמאות של תמונות טורי סעיפים התא. כי מקטעים נתמכים בצורה מאובטחת על 3 םיקדסה רשתות, תמונות בהגדלה (x 50,000) נלקחים בקלות מבלי להיסחף הדגימה. סיבי דנ א 2 ננומטר בקוטר צולמו מחקרים אלה,9,12.
איור 1 . Formvar תמיכה הקולנוע המנגנון. חצי אחד של השקופית זכוכית מוכנס אל תוך Formvar פתרון בעמודה העליון של המנגנון על ידי לחיצה על הפתרון עם האוויר דרך 'a' באמצעות כדור גומי. הפתרון מנוקז מן העמודה על-ידי פתיחה של צימוד-כיוונית של שחרור האוויר דרך 'b' כדי להפחית את הלחץ. (לשכפל יאמאגוצ'י, Adachi, 201119 עם הרשאה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . שיטת שחרור הסרט מהזכוכית להחליק על המים- (א) את ארבעת הקצוות של הסרט בשקופית זכוכית הם גרדו אותה באמצעות גילוח. (ב) Formvar הסרט הוא צף הנחה על המים על-ידי הנמכת השקופית זכוכית לאט בזווית נמוכה. (לשכפל יאמאגוצ'י, Adachi, 201119 עם הרשאה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . Formvar הסרט תמיכה על מתלה אלומיניום. (א) הסרט Formvar אספו את מהמים עם ארון תקשורת אלומיניום. (b המתלה) הוא שמר את desiccator עד השימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . קיצוץ של הרחוב דגימה עם להב חיתוך אולטראסוניות, סכין גילוח תחת stereomicroscope. (א) את הנוכחות של הדגימה אושר על ידי התבוננות הרחוב הדגימה במיקרוסקופ אור. הרחוב המוצגים מיקרואורגניזמים איור הכיל המשויך chaeta סולם-תולעת (בערך 1.7 מ"מ אורך) שנאסף במעמקי הים12,14. (ב) זמירה שלב. (ג) כל דימוי stereomicroscope. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . קיצוץ של הרחוב דגימה בסכין יהלום באמצעות מיקרוטום. (א) איור לחתוך את הקצה השמאלי. (ב) את פני בלוק נחתך במיקום של 100 ננומטר מהקצה השמאלי של הדגימה. (ג) מראה (Mesa קאט, ז) הניח על הבמה את הסכין. (ד) הדגימה השטח. שימו לב כי בחלק העליון, בצד התחתון של החלק הדק מקביל לחלוטין וחלקה. שימו לב גם כי הכתף הוא חתך כדי לסמן את הכיוון של חיתוך (ראה איור 8). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . טיפול אטומה על פני הדגימה. (א) על מנת למקם את צ'אק הדגימה בבית בדיוק את המיקום המקורי, את הצ'אק, צ'אק האוחז האזמל הקטן הם מסומנים קלטת ושרטתי הגבול. (ב) להרטיב את הדגימה עם פתרון אטומה באמצעות פיפטה פסטר. (ג) 3 םיקדסה רשתות שענית מקטעים טורי. הידית כפופה ל-60 מעלות (c, נכון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 . כיסוי פלסטיק של מיקרוטום ואת משענת עץ. מכסה פלסטיק שימושית למנוע זרימת אוויר במהלך חלוקתה ודק במיוחד. משענת עץ משמש עושה עבודה עדינה כגון אחזור מקטעים טורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 . הגדרת סעיף עובי וקבלת סעיפים על העובי המתאים. לאחר מספר קטעים טורי הגיעה 20, עובי מקטע מוגדר כ-10 ננומטר. מאז האזמל הקטן לא יכול לחתוך קטעים ננומטר בעובי 10, אין סעיף חדש שמופיע ולאחר הסעיפים בעבר לחתוך המופרדות קצה הסכין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9 . לדוגמה סעיפים זגוגית שהושג באמצעות הפרוטוקול. שימו לב כי הקבוצות חמישה קטעים טורי של 1.8 מ"מ מופרדים כבר לאחר חיתוך. במקרה ספציפי זה, הצבע של מרכז הסעיפים ודק במיוחד הוא צהבהב בשל נוכחותם של הדגימה. חלקים אחרים של המקטע, אשר לא להכיל את הדגימה מורכב שרף בלבד, הם כסף בצבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 10 . 'סעיף החזקת loop'. (א) העליון נוף (החלק העליון) או התחתון (החלק התחתון של תמונה) של הלולאה. (ב) הלולאה סעיף החזקת משמש כדי להחזיק את הקבוצה השלישית של מקטעים טורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 11 . אחזור סעיפים טורי. (א) "מים-משטח-לגידול לופ" (WSRL). ניתן להסיר את הידית של הלולאה מן הפיר, אשר הוא מטלטלין. ניתן גם להעביר את הלולאה למעלה ולמטה על-ידי סיבוב הבורג העליון. (b WSRL) קבוע על הבמה את הסכין על ידי מגנט. (ג) מבט מקרוב (b). (ד) תרשים של לולאה, השקה משטח, מקטעים, רשת במהלך אחזור (נוף צדדי). ניתן יהיה לאחזר מקטעים ודק במיוחד דווקא לרשת שסע על-ידי הנמכת במקביל לרשת החשופה של הסעיפים ודק במיוחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 12 . הצבת הרשת בסרט Formvar. הרשת מחזיקה הסעיפים ממוקם יחד עם טיפת מים על הסרט Formvar על מתלה אלומיניום זעירים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 13 . צביעת צינור16. חריץ עמוק 0.6 מ"מ נעשית לאורך הציר הארוך בעזרת סכין גילוח. רשתות ממוקמים ב- groove בסדר הנכון. קצה אחד של הצינור נחתך (ראש חץ) כדי לסמן את הכיוון שלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 14 . הצבת את הרשתות בעל הדגימה. (א) הרשתות מוצבים בעל הדגימה בסדר הנכון. (b הרשתות) ואז קבועים עם 'רשת-מקובל'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 15 . סעיפים טורי רכוב על רשתות לחריצים. האיור מציג סעיפים 18-25 רכוב על רשת אחת. המספרים כל חריץ מצביעים על ההתחלה מספר רצף מהסעיף הראשון. החלק הראשון הוא עבה יותר מהאחרים (ראה איור 8). שימו לב כי הסעיפים מחוברים יחד, יש עובי אותה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 16 . טורי חלקים Parakaryon myojinensis12. המספרים בחלק השמאלי התחתון מציינים את הרצף ביחס במקטע הראשון. האיור מציג 12 מתוך 67 סעיפים מלאה. תא זה נמצאה נוקלאואיד גדול המורכב סיבי דנ א ערומה, עם ממברנה נוקלאואיד יחיד וחדר endosymbionts הדומים חיידקים, אך ללא המיטוכונדריה. לפיכך, האורגניזם הזה נראה טופס ביניים החיים המתפתחים מ פרוקריוטים איקריוטים12. נוקלאואיד N. מרובה מן יאמאגוצ'י Worman, 2014. 14 בעלי הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 17 . טורי מקטעי Escherichia coli9. המספרים בחלק השמאלי התחתון מציינים את הרצף ביחס במקטע הראשון. האיור מציג 12 מקטעים מלאה. תא זה נמצאה מכיל ריבוזומים 21,7009. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת כאן דורש אין ציוד יקר. זה דורש רק על מתלה אלומיניום (איור 3), םיקדסה שלוש רשתות (איור 6 ג), סעיף החזקת לולאות (איור 10a), לולאה הרמת-מים-פני השטח (איור 11 א) וצינור מכתימים (איור 13). ישנן תכונות רבות של השיטה הנוכחית. החלק הגדול של הדגימה משמש להתאמת לקצה משטח והסכין הדגימה, כך שהם פונים במקביל זו לזו. טורי קטעים נחתכים בקבוצות כדי להימנע קושי הפרדת המקטעים באמצעות זוג קווצות שיער בעת אחזור קבוצה של מקטעים טורית על גבי הרשתות לחריצים. 'לולאה סעיף החזקת' משמש כדי למנוע ערבוב את הסדר של קבוצות סעיף. 'הרמת-מים-פני לולאה' משמש כדי לוודא הסעיפים ממוקמות על השיא של המים, הם נוגעים הרשת קודם, על מנת למקם אותם במיקום הרצוי על הרשתות. Formvar הסרט תמיכה על מתלה אלומיניום משמש כדי שיהיה קל יותר להתאושש הסעיפים על הרשתות וכדי למנוע קמטים של הסרט תמיכה. צינור מכתימים משמש כדי להימנע לשבור את הסרטים תמיכה עם פינצטה.
לאחרונה, ultramicrotome אוטומטית איסוף הקלטת הייתה מפותחת25 כדי לאסוף במקטעים באופן אוטומטי עבור סריקת הדמיה בקלטות פלסטיק אטום אלקטרון מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM). בשיטה זו ניתן באופן אמין גזור אלפים ודק במיוחד סעיפים26, אפשרי בשיטה הנוכחית. כמו כן, רחוב טורי הפנים (SBF) 27 ו המוקד יון קרן (שיקרתי)-SEM28 משמשות לאיסוף נתוני תלת-ממד של תאים ורקמות של בעלי חיים. בשיטות האלה חלוקתה עם יהלום סכין או ריכוז יון קרן משולב בתוך מיקרוסקופ SEM, מתבצעת באופן אוטומטי מלא דורש שום טכניקות מיוחדות. למרות ששיטות אלה שימושיים, המנגנון הוא כל כך יקר כי מוסדות רבים לא לקנות מכונות אלה. גם, מאז שיטות אלה מעסיקים SEM תצלום למקטעים, ברזולוציה של micrographs הוא נחות בשיטת ההווה מעסיקה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). שיטות אלה אין אפשרות לפענח את חלקיקים בודדים ריבוזום microtubules, שמתרגם, סיבי דנ א בזמן הנוכחי.
לניתוח structome של מיקרואורגניזמים ולקבלת ultrastructural חקר מיקרואורגניזמים לא ידוע, יש צורך להתבונן תאים ומרכיבים התא דופן התא, קרום פלזמה, המיטוכונדריה, גרעין, גרעיני ממברנות, רשתית תוך-פלזמית. מהכלורופלסט, plastids, גולג'י, ריבוזומים ואלמנטים filamentous ברזולוציה גבוהה. תצפית TEM סעיפים זגוגית טורי הוא אחד מספר שיטות לבצע ניתוח כזה אפשרי בשלושה ממדים. מכיוון מקטעים זגוגית נשארים לאחר התבוננות בשיטה זו, באותו האזור ניתן לראות שוב ושוב; זה לא אפשרי SBF או שיקרתי-SEM, מאז האזור שנצפה אובד לאחר התצפית. תכונה זו חשובה ללמוד מיקרואורגניזמים במים עמוקים שבו יש צורך לחפש אורגניזמים מעניין בהגדלה נמוכה קודם, ואז לצלם תמונות באופן סדרתי על האורגניזם היעד בהגדלה.
לסיכום, טורי שיטת אופטים ודק במיוחד עכשיו ניתן לבצע ב קל, זול, וללמוד דרך relaible על ידי המחקר הנוכחי, אשר חיוני 3D ultrastructual של מיקרואורגניזמים ברזולוציה גבוהה במיקרוסקופ אלקטרונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים שיגאו קיטה עבור הצעות ערך ודיון שלו. אנו מודים גם Sumire אקשטיין וג'ון שלהם לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
