Summary
Denna studie presenterar tillförlitlig och lätt förfaranden för att erhålla seriell ultrathin sektioner av en mikroorganism utan dyr utrustning i transmissionselektronmikroskopi.
Abstract
Att observera celler och cell komponenter i tre dimensioner med hög förstoring i transmissionselektronmikroskopi kräver förbereder seriella ultrathin sektioner av provet. Även förbereder seriella ultrathin sektioner anses vara mycket svårt, är det ganska lätt om den korrekta metoden används. I detta papper visar vi ett stegvis förfarande för att säkert få följetong ultrathin sektioner av mikroorganismer. De viktigaste punkterna i denna metod är: 1) att använda den stora delen av preparatet och justera preparatet yta och kniv kant så att de är parallella med varandra. (2) att skära seriell avsnitt i grupper och undvika svårigheter i att separera sektioner med ett par hårstrån vid hämtning av en grupp av seriell avsnitt på gallren för slit; (3) att använda en 'avsnitt-anläggning loop ”och undvika blanda upp ordningen på de avsnitt grupperna. (4) att använda en 'vatten-ytan-höjning loop ”och kontrollera att avsnitten är placerade på apexen av vattnet och att de röra rutnätet först, för att placera dem i önskad position på rutnäten; (5) att använda stöd filmen på en aluminium rack och göra det lättare att återställa avsnitten på gallren och undvika skrynkling av stöd filmen; och 6) att använda en färgning tube och undvika att oavsiktligt bryta stöd filmerna med pincett. Denna nya metod kan få följetong ultrathin sektioner utan svårighet. Metoden gör det möjligt att analysera cellstrukturer av mikroorganismer med hög upplösning i 3D, vilket inte kan uppnås med hjälp av automatiska tejp-samlande ultramicrotome metoden och seriell block-ansikte eller fokuserad ion beam svepelektronmikroskopi.
Introduction
Rätt seriella ultrathin snittningen teknik är nödvändig för att studera celler och cell komponenter tredimensionellt på elektron mikroskopisk nivå. Vi har studerat dynamiken i spindeln pole kroppen i cellcykeln av jästceller, och avslöjade morfologiska förändringar av deras ultrastruktur under cellcykeln och tidpunkten för dubbelarbete1,2,3, 4,5. I 2006, vi myntat ett nytt ord 'structome' genom att kombinera 'struktur' och '-ome', och definierat det som 'kvantitativa och tredimensionella strukturell information av en hel cell på elektron mikroskopisk nivå' 6,7.
Av structome analys, som kräver seriell ultrathin snittningen teknik, konstaterades det att en jäst cell av Saccharomyces cerevisiae och Exophiala dermatitidis hade omkring 200.000 ribosomer7,8, en Escherichia coli cell hade 26.000 ribosomer9, en Mycobacterium tuberculosis cell hade 1.700 ribosomer10 och Myojin spiral bakterier hade endast 300 ribosomer11. Denna information är användbar inte bara beräkna tillväxttakten i varje organism, men också i identifiering av arter9.
Vidare, structome analys ledde till upptäckten av en ny organism; Parakaryon myojinensis hittades i det djupa havet utanför Japans kust, vars cellstruktur var en intermediär mellan prokaryoter och Eukaryoter12,13,14,15. För närvarande anses seriell ultrathin snittningen tekniken vara så svårt att det skulle ta lång tid att bemästra. I denna studie har vi utvecklat en pålitlig metod där någon kan utföra seriell ultrathin snittning utan svårighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: De prover som används i denna studie var mikroorganismer, snabbt frysta med propan i flytande kväve, frysa substituerade i aceton som innehåller 2% osmium vanligtvis, och inbäddade i epoxi harts1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. beredning av stöd film (figur 1-3)
Obs: Silver-färgad Formvar stöd film bereds med cast-på-glas metod19.
- Tillsätt 100 mL av 1,5% Formvar i etylendiklorid till en Formvar-making apparatur (figur 1). Doppa hälften av en glasskiva (76 x 26 x 1,3 mm) i Formvar lösning i kolumnen upper av apparaten genom att trycka på lösningen med luft genom 'a' med en gummi boll19.
- Dränera lösningen från kolumnen genom att öppna tre-vägs Avstängningskranen och släppa luft genom 'b' för att minska trycket. Ta ut glasskiva från apparaten och torrt i luften att bilda en film på ytan av en glasskiva. Använda en glödlampa för att påskynda torkning av Formvar filmen.
- Efter skrapning av fyra kanterna av filmen i glas bilden med ett rakblad (figur 2a), och andas in i bilden att underlätta separering av filmen från den bild20, flyta ut filmen på vatten genom nedsänkning i glas bilden i den vatten långsamt på en låg horisontell vinkel (ca 10°, figur 2b).
- Skopa upp Formvar filmen från vattnet med en aluminium rack (30 x 25 x 3 mm) med hål (4 mm i diameter) (figur 3a). Håll i racket med Formvar filmen i exsickator till användning (figur 3b).
2. trimning preparatet med ett ultraljud trimning blad och ett rakblad 21 under ett stereomikroskop (figur 4)
- Kontrollera att det finns celler på ytan av blocket genom att observera spetsen på blocket med ett ljusmikroskop (figur 4a).
- Montera preparatet i chucken (block hållare) och montera chucken på en trimning scenen21 (figur 4b). Denna trimning scenen har en belysning mekanism från baksidan av preparatet.
- Trimma blocket till en storlek av 0,7 x 1,0 mm (figur 4 c, 5d). Eftersom epoxiharts är mycket svårt, putsa blocken först med hjälp av en ultraljud trimning blad. Ultraljud trimning bladet är en nyligen införda maskin, och blocken är lätt trimmade. Sedan trimma blocket ytterligare med ett rakblad. Skär ena axeln för att markera riktning mot skärning (se figur 5 d, figur 8).
3. trimning preparatet med diamantkniven använder mikrotomen (figur 5)
- Ställ in preparatet chuck i preparathållaren av ultramicrotome. Placera preparatet 90° moturs mot den faktiska positionen när seriell ultrathin snittning utförs (se figur 5 d).
- Skär ytan på blocket med en trimning diamantkniven (se figur 5 d). Ställ diamond knivseggen parallellt till preparatet block ansiktet, och skär den minsta mängden preparatytan så att inte förlora varje exemplar (figur 5 d).
Obs: Detta steg görs för att utjämna preparatytan. Del av preparatytan av den smala delen lämnas intakt (därför denna del inte skiner som en spegel, figur 5 d), så att inte förlora någon del av preparatet för seriell sektionering. Detta beror på att preparatet är utsatta på ytan av blocket. - Placera en spegel (Mesa cut, M) på kniv scenen att övervaka styckning av preparatet (bild 5 c).
- Skär vänsterkant (detta blir ovansidan, figur 5 d, av provet i seriell sektionering) blocket med trimning kniv genom roterande kniv scenen 30 ° till vänster (bild 5a).
- Skär blocket ansiktet vid ungefär 100 µm från den vänstra kanten av preparatet (detta blir den lägsta sidan av förlagan i seriell sektionering, figur 5 d) av roterande kniv scenen 30 ° till höger (Figur 5b).
Obs: Avsnitten seriell kommer att minska från den smala delen av förlagan till ca 90 nm x ca 1 mm i storlek. Den stora delen används för att justera preparatytan och knivseggen så att de är parallella. Efter justering preparatytan för att vara parallell med kniveggen, tas den stora delen bort med ett rakblad. Genom att skära de övre och nedre sidorna av preparatet med hjälp av mikrotomen, bli båda sidor av preparatet smidig och exakt parallella med varandra (figur 5 d), vilket är nödvändigt för att få raka och obrutna band sektioner.
4. Justera preparatet yta och kniv kant så att de möter parallell till varje annan 21
- Ta bort trimning kniven och rotera preparatet 90° medurs.
- Ange en ultrathin snittningen kniv kniv scenen.
- Justera preparatytan och kniv kant så att de möter parallellt med varandra med hjälp av den stora delen av preparatytan.
Obs: Den stora delen av preparatet används för justering eftersom skärande ansikte seriell sektionering är så liten, vilket gör det svårt att justera preparatet yta och kniv kanten med denna del, särskilt i vertikal riktning. Således gör använder den stora delen av preparatet justering lätt.
5. sprida neopren lösning på preparatet (figur 6)
- För att placera preparatet chucken på exakt samma position som den ursprungliga positionen, applicera tejpen på chucken och chuck innehavaren av mikrotomen och skär vid gränsen (figur 6a).
- Ta preparatet chuck ut från mikrotomen och placera det under stereomikroskopet (figur 6b). Klipp av den stora delen av preparatet med ett rakblad, lämnar den smala delen, från vilken seriell avsnitt kommer att erhållas.
- Använder en Pasteur-pipett, släppa ca 1 µL 0,5% neopren lösning (figur 6b) på preparatet skall användas för seriell sektionering, för att göra avsnitt sidor limmet. Täcka hela preparatet med neopren lösning. Absorbera överflödig neopren lösning omedelbart med en bit av filtrerpapper placeras nära preparatet. Att få ett band av sektioner är viktigt för att ta bilder av seriell cell sektioner och neopren lim är mycket användbart för klibbar avsnitten ihop.
- Förbered 3-slit rutnät (storlekar av slitsar: mitten, 0,4 mm x 2,2 mm, båda sidor 0,2 x 2,2 mm) (figur 6 c) för att plocka upp seriell avsnitt genom att böja handtaget på gallren till 60 °, behandling av rutnäten med 0,5% neopren lösning, och att göra rutnäten hydrofil av Glow ansvarsfrihet22.
6. att göra seriell avsnitt (figur 7-9)
- Plats preparatet chuck tillbaka i mikrotomen på samma position som 5.1 (figur 6a) genom att anpassa de tejpade delarna. Detta håller block ansiktet och knivseggen helt parallella med varandra. Sedan sätta kniven nära preparatet.
- Fyll kniv båten med vatten.
- Täcka mikrotom med ett plasthölje att förhindra luftflöde (figur 7).
Obs: Luftflöde under ultrathin snittning och hämtning av sektioner ofta orsaka problem. Plastskyddet har tre hål: ett hål är för kikare linser, och de andra två hålen är för armarna att tillåta drift när locket är på. Det trä armstödet används för att placera vapen medan du gör delikat arbete, till exempel hämtar serial sektioner med galler. Det trä armstödet placeras på olika tabeller från tabellen mikrotomen (figur 7, pilar), så att inte överföra vibrationer i operatörens händer på mikrotomen. - Börja skära preparatet på 200 nm snittjocklek (figur 8). Inställningen på 200 nm tjocklek kommer att spara tid att föra kniven till ytan av preparatet.
- Efter det första avsnittet är skuren, ange snittjockleken till 70 nm (figur 8).
- När antalet seriella sektioner når 20 (just sett, efter de band når ca 1,8 mm, antalet sektioner varierar beroende på bredden på sektioner), snittjockleken till 10 nm (figur 8) medan man fortsätter att skära.
Obs: Eftersom mikrotomen inte kan skära 10 nm tjocka sektioner, inga nya avsnitt visas, och avsnitten tidigare skär blivit separerade från knivseggen. Det är viktigt att få separerade avsnittsgrupper (figur 9) för att plocka upp seriell avsnitt att undvika svårigheter i att separera sektioner manuellt med ett par hårstrån. Eftersom synfältet i transmissionselektronmikroskop är 2,0 mm, bör avsnitt 1.8 mm lång på mest. - Ställa in snittjocklek till 60 nm (figur 8). Detta kommer att producera 70 nm sektioner (figur 8) eftersom maskinen kommer att lägga den tidigare 10 nm tjockleken.
- Ställa in snittjocklek tillbaka till 70 nm (figur 8) och fortsätt skära tills 1,8-mm långa sektioner erhålls.
- Upprepa 6,6-6.8 tills fem 1,8 mm långa avsnitt erhålls (figur 9). Vi göra brukar fem avsnittsgrupper eftersom det finns fem preparathållare i transmissionselektronmikroskop i vårt labb, men fem är inte gränsen.
7. plocka upp seriella sektioner (figur 10-12)
- Placera den 'avsnitt-anläggning slinga'23 (inre diameter av slingan: 5,0 mm) (figur 10a) på den tredje avsnittsgruppen (figur 10b).
Obs: Det är nödvändigt att hämta avsnitten i den ordning deras snittning för att ta bilder i rätt ordning. Men eftersom det finns fem avsnittsgrupper på kniv båten, blir det ofta förvirrande vilka grupper är som. Genom att placera en slinga på den tredje gruppen, blir det tydligt att de två grupperna nära operatören är först och andra, och de avlägsna två från operatören är de fjärde och femte grupperna (figur 10b). Detta förhindrar blanda upp ordern. - Placera 'vatten-ytan-höjning slinga'23 (WSRL, innerdiameter av slingan: 4,0 mm) (Fig. 11a) på kniv scenen (Fig. 11b). WSRL kommer att stå fast på kniv scenen eftersom den är utrustad med en magnet i botten.
- Placera ramantennen på av WSRL precis ovanför de seriella sektioner genom att flytta dess skaft och handtag. Lägre kretsa av WSRL på vattenytan så att slingan omsluter avsnitten.
- Tryck slingan ned genom att vrida skruven nedåt så att vattenytan kommer att höja av ytspänning (siffrorna 11c-d). Flytta avsnittet till mitten av slingan, placera den på toppen av vattnet och justera riktningen på avsnittet genom att använda en hår strand21.
- Plocka upp avsnittsgrupper genom att röra den med en bare slit-grid, som innehas av pincett och hålls parallellt med vattenytan (figur 11 d). Det är viktigt för sektioner röra rutnätet först, inte vattnet, att placera sektioner exakt på mitten av rutnätet (figur 11 d).
- Placera gallren med sektioner tillsammans med en liten droppe vatten på Formvar stöd film16 (figur 12) och avlägsna överskottsvatten med filterpapper.
Obs: Skrynkling av stöd filmen är ofta ett problem när sektioner plockas med ett rutnät med stöd film eftersom membranet (sektioner) berör membran (stöd film) direkt. Problemet med att få rynkor på filmen stöd minskas avsevärt genom att placera ett avsnitt räntebärande rutnät tillsammans med en liten droppe vatten på Formvar stöd film16.
8. färgning avsnitt16,24 (figur 13)
- Efter avsnitten är helt torkat, Riva Formvar filmen från runt gallren, och ta bort gallren bär avsnitten.
- Rutnäten i spåret av färgning tube16 i rätt ordning (figur 13) och fläcken sektioner med uranyl acetat och bly citrat24.
Obs: Det finns ett spår 0,6 mm djup längs den långa axeln av röret skär med ett rakblad. Röret är användbar för att förhindra oavsiktligt går sönder av stöd filmer när du använder pincett, eftersom direkt hantering av nät inte är nödvändig under de färgning och tvätt processen16.
9. observation av seriell avsnitt (figur 14)
- Ange 5 rutnäten i flera preparathållaren i rätt ordning (figur 14a), orientera längdaxel rutnät skåran vinkelrät mot preparatet innehavaren. Handtagen (pilspetsar) av rutnäten behöver inte klippas, eftersom de 'grid-fixers' inte kommer vidrör handtagen.
- Fixa rutnäten med 'grid-fixers' (bild 14b) och sätt in preparathållaren i transmissionselektronmikroskop.
Obs: Det är ofta användbart att ta låg förstoring bilder av alla cell sektioner (figur 15) för att hitta intressanta mikroorganismer eller celler i bra skick med ingen förorening och med bra fixering, innan du tar bilder på målcellen. - Ta bilder av målceller i alla cell delar med hög förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll användes tre-slit rutnät för att plocka upp seriell avsnitt. Gallren är tillverkade av nickel eller koppar. Avsnitten seriell placeras på mitten skåran. Skårorna på båda sidor är nödvändiga för att visa avsnitten när plockande dem upp med rutnätet. För att hålla rutnäten parallellt med seriell avsnitt när plockande dem upp med pincett (figur 11 d), handtaget är böjd (figur 6 c, höger). Ett litet handtag är fördelaktigt att förhindra böjning av den huvudsakliga delen av rutnätet som orsakar allvarliga problem i plocka upp sektioner, och förhindra att lämna avsnitten under färgningen. Detta rutnät har fördelar jämfört med konventionella 2,0 x 1,0 mm single-håls rutnätet. Nämligen sektioner stöds direkt av två metallstänger 0,4 mm apart (smalare än 1,0 mm) och av Formvar stöd filmen i ett tre-slit rutnät, medan avsnitt stöds endast av stöd filmen i ett konventionella single-håls rutnät. Preparatet drift kan därför förhindras i fotografering med hög förstoring med hjälp av en tre-slit rutnät.
Figur 15 visar en låg förstoring vy fem rutnät, som bär seriell avsnitt. Eftersom varje avsnitt håller ihop, är det lätt att hitta samma cell i nästa avsnitt även vid högre förstoring. Figur 16 och 17 är exempel på seriell bilder av cell sektioner. Eftersom sektioner stöds säkert på 3-slit rutnät, tas enkelt foton på hög förstoring (x 50,000) utan förlaga drift. Fibrer av DNA 2 nm i diameter fotograferades i dessa studier9,12.
Figur 1 . Formvar stöd filmskapande apparatur. Hälften av glasskiva doppas i Formvar lösning i kolumnen upper av apparaten genom att trycka på lösningen med luft genom 'a' med hjälp av en gummiboll. Lösningen är dräneras från kolumnen genom att öppna tre-vägs Avstängningskranen och släppa luft genom 'b' för att minska trycket. (Återges från Yamaguchi och Adachi, 201119 med tillåtelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Metod för att släppa filmen från glaset glida på vatten. (a) fyra kanterna av filmen på glasskiva skrapas bort med rakblad. (b) Formvar film är flöt ut på vattnet genom att sänka glas bilden långsamt på en låg vinkel. (Återges från Yamaguchi och Adachi, 201119 med tillåtelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Formvar stöd film på en aluminium rack. (a) Formvar filmen är öste upp ur vattnet med en aluminium-rack. (b) racket hålls i exsickatorn fram till användning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Putsning av preparatet med ett ultraljud trimning blad och ett rakblad under ett stereomikroskop. (a) förekomst av preparatet bekräftas genom att observera preparatet under ett ljusmikroskop. Blocket visas i figur innehöll mikroorganismerna är associerad med en skala-mask-chaeta (ca 1,7 mm i längd) som samlas in från den djupa hav12,14. (b) trimning scenen. (c) hela bilden av ett stereomikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Putsning av preparatet med diamantkniven använder mikrotomen. (a) illustration för att skära den vänstra kanten. (b) block ansikte klipps vid en position på ca 100 nm från den vänstra kanten av preparatet. (c) en spegel (Mesa cut, M) placerats på kniv scenen. (d) preparatytan. Observera att ovansidan och den nedre sidan av den smala delen är smidig och helt parallella. Observera också att axeln är skuren för att markera riktning mot skärning (se figur 8). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Neopren behandling på preparatytan. (a) för att placera preparatet chucken tillbaka på exakt den ursprungliga positionen, är chucken och chuck innehavaren av mikrotomen markerade med ett band och skär vid gränsen. (b) vätning preparatet med neopren lösning med hjälp av Pasteur-pipett. (c) tre-slit rutnät för att plocka upp seriell avsnitt. Handtaget är vridet till 60 grader (c, rätt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . Plastskyddet mikrotomen och trä armstöd. Plastskyddet är användbar för att förhindra luftflöde under ultrathin snittning. Det trä armstödet används för att göra delikat arbete såsom hämtar serial sektioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 . Inställning av snittjocklek och erhålla sektioner på ordentlig tjocklek. Efter antalet seriella sektioner har nått 20, snittjockleken ställs till 10 nm. Eftersom mikrotomen inte kan skära 10 nm tjocka sektioner, inga nya avsnitt visas, och avsnitten tidigare skär blivit separerade från knivseggen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 . Exempel på ultrathin sektioner som erhållits genom protokollet. Observera att de fem grupperna av seriell avsnitt på ca 1,8 mm lång redan är separerade efter styckning. I detta fall är färgen på mitten av avsnitten ultrathin gulaktig på grund av preparatet. Andra delar av avsnittet som inte innehåller preparatet och består av harts endast, är silver i färg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10 . 'Avsnitt-anläggning slinga'. (a) ovanifrån (övre delen) och underifrån (nedre delen av bilden) av slingan. (b) avsnitt-anläggning loopen används för att hålla den tredje gruppen av seriell avsnitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11 . Hämtning av seriell avsnitt. (a) vatten-ytan-höjning slinga' (WSRL). Handtaget på slingan kan avlägsnas från axeln, som är flyttbara. Slingan kan också flyttas upp och ned genom att vrida skruven upp. (b) WSRL är fast på kniv scenen av en magnet. (c) närmare vy av (b). (d) diagram av loop, vattenytan, sektioner och rutnät under hämtning (sidovy). Ultrathin sektioner kan hämtas just till slit rutnätet genom att sänka det kala rutnätet parallellt ultrathin avsnitten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12 . Att placera rutnätet på Formvar film. Rutnätet håller avsnitten placeras tillsammans med en liten droppe vatten på Formvar filmen på aluminium rack. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 13 . Färgning tube16. Ett spår 0,6 mm djupa görs längs den långa axeln med ett rakblad. Galler placeras i spåret i rätt ordning. Ena änden av röret kapas (pil) för att markera dess riktning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 14 . Att placera gallren i preparathållaren. (a) rutnäten placeras i provhållaren i rätt ordning. (b) nät fixeras sedan med 'grid-fixers'. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 15 . Seriell avsnitt monterad på slit rutnät. Figuren visar 18 – 25 avsnitten monterad på ett rutnät. Siffrorna i varje skåra indikera sekvens nummer början från det första avsnittet. Det första avsnittet är tjockare än de andra (se figur 8). Observera att avsnitten är kopplade tillsammans och har samma tjocklek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 16 . Seriell avsnitt av Parakaryon myojinensis12. Siffrorna längst ned till vänster visar sekvensen i förhållande till det första avsnittet. Figuren visar 12 av 67 komplett sektioner. Denna cell befanns ha en stor nucleoid bestående av nakna DNA fibrer, med en enda nucleoid membran och endosymbionts som liknar bakterier, men inga mitokondrier. Således, denna organism verkar vara en mellanform liv utvecklas från prokaryoter till Eukaryoter12. N, nucleoid. Återgivits från Yamaguchi och Wörman, 2014. 14 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 17 . Seriell avsnitt av Escherichia coli9. Siffrorna längst ned till vänster visar sekvensen i förhållande till det första avsnittet. Figuren visar 12 kompletta sektioner. Denna cell befanns innehålla 21,700 ribosomer9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden presenteras här kräver ingen dyr utrustning. Det kräver bara en aluminium rack (figur 3), tre-slit rutnät (figur 6 c), avsnitt-anläggning loopar (figur 10a), vatten-ytan-höjning loop (Fig. 11a) och en färgning tube (figur 13). Det finns många funktioner i denna metod. Den stora delen av preparatet används för att justera preparatet yta och kniv kant så att de möter parallellt med varandra. Seriell sektioner skärs i grupper för att undvika svårigheter att separera sektioner med ett par hårstrån vid hämtning av en grupp av seriell avsnitt på gallren för slit. En 'avsnitt-anläggning slinga' används för att undvika att blanda upp ordningen på de avsnitt grupperna. En 'vatten-ytan-höjning slinga' används för att kontrollera att avsnitten är placerade på apexen av vattnet och att de röra rutnätet först, för att placera dem i önskad position på gallren. Formvar stöd film på en aluminium galler används för att göra det lättare att återställa avsnitten på gallren och undvika skrynkling av stöd filmen. En färgning rör används för att undvika att oavsiktligt bryta stöd filmerna med pincett.
En automatisk tejp-samlande ultramicrotome var nyligen utvecklade25 att samla avsnitt automatiskt för svepelektronmikroskopi (SEM) imaging på elektron-ogenomskinlig plast band. Denna metod kan tillförlitligt skär tusentals ultrathin avsnitt26, vilket inte är möjligt av denna metod. Också, seriell block ansikte (SBF) 27 och fokus ion beam (FIB)-SEM28 används för att samla in 3D information av celler och vävnader från djur. I dessa metoder, är snittning med en diamant kniv eller fokus ion beam integrerad i mikroskopet SEM och utförs på en helautomatisk sätt som kräver inga speciella tekniker. Även om dessa metoder är användbara, är apparaten så dyrt att inte många institutioner som köper dessa maskiner. Också, eftersom dessa metoder använder SEM fotografi avsnitten, resolutionen av micrographs är sämre än den nuvarande metoden som sysselsätter transmissionselektronmikroskopi (TEM). Dessa metoder kan inte lösa de enskilda Ribosomen partiklar, mikrotubuli, microfilaments och DNA fibrer i dagsläget.
För structome analys av mikroorganismer och ultrastrukturella studie av okända mikroorganismer är det nödvändigt att iaktta celler och cell komponenter såsom cellväggen, plasmamembranet, mitokondrier, nucleus, kärn membran, endoplasmatiska nätverket, kloroplaster, plastids, Golgiapparaten, ribosomer och fintrådiga element med hög upplösning. TEM observation av seriell ultrathin sektioner är en av några metoder för att möjliggöra sådan analys i tre dimensioner. Eftersom ultrathin sektioner kvar efter observation i denna metod, kan samma område observeras upprepade gånger; Detta är inte möjligt i SBF eller FIB-SEM, eftersom området observerade förloras efter observation. Denna funktion är viktigt att studera deep-sea mikroorganismer där det är nödvändigt att söka intressanta organismer i låg förstoring först och sedan ta bilder seriellt mikroorganismens vid hög förstoring.
Sammanfattningsvis, ultratunna snittningen seriemetoden kan nu utföras på ett enkelt, Billigt och relaible sätt av den aktuella studien, vilket är viktigt för 3D ultrastructual studie av mikroorganismer med hög upplösning i elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Shigeo Kita för hans värdefulla förslag och diskussion. Vi tackar också John och Sumire Eckstein för deras kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
