Summary
Deze studie geeft betrouwbare en eenvoudige procedures voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van een micro-organisme zonder dure apparatuur in transmissie-elektronenmicroscopie.
Abstract
Observeren van cellen en celbestanddelen in drie dimensies bij hoge vergroting in transmissie-elektronenmicroscopie vereist voorbereiding van seriële uiterst dunne secties van het specimen. Hoewel de voorbereiding van seriële uiterst dunne secties wordt beschouwd als moeilijk, is het vrij eenvoudig als de juiste methode wordt gebruikt. In deze paper tonen we een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen van veilig seriële uiterst dunne secties van micro-organismen. De belangrijkste punten van deze methode zijn: 1) het grote deel van het model gebruiken en aanpassen van het specimen oppervlak en mes-rand zodat zij parallel aan elkaar; 2) te snijden seriële secties in groepen en voorkomen van problemen bij het scheiden van de secties met behulp van een paar haarlokken bij het ophalen van een groep van seriële secties op de gleuf rasters; 3) gebruik van een 'sectie-bedrijf loop' en niet te vermengen met de volgorde van de sectiegroepen; 4) te gebruiken van een 'Water-oppervlak-raising loop' en zorg ervoor dat de secties zijn geplaatst op de top van het water en dat ze het raster eerst, aanraken om hen in de gewenste positie op de roosters; 5) gebruiken de ondersteuning film op een aluminium rek en gemakkelijker om te herstellen van de secties op de rasters en om te voorkomen dat kreuken van de film van de steun; en 6) gebruik van een kleuring buis te voorkomen dat per ongeluk breken de steun films met een pincet. Deze nieuwe methode kan verkrijgen van seriële uiterst dunne secties zonder problemen. De methode maakt het mogelijk om te analyseren cel structuren van micro-organismen op hoge resolutie in 3D, dat niet kan worden bereikt met behulp van de automatische tape-verzamelen ultramicrotome methode en seriële blok-gezicht of gerichte ion beam scanning elektronen microscopie.
Introduction
Juiste seriële uiterst dunne vectorafbeeldingsbestanden techniek is onmisbaar voor het bestuderen van de cellen en celbestanddelen ruimtelijk op microscopisch niveau elektron. We hebben onderzocht de dynamiek van de spindel pole lichaam in de celcyclus van gistcellen, en morfologische veranderingen van hun ultrastructuur onthuld tijdens de celcyclus en de tijd voor dubbel1,2,3, 4,5. In 2006 bedacht we een nieuw woord 'structome' door het combineren van 'structuur' en '-ome', en het verstaan van de "kwantitatieve en drie-dimensionale structurele informatie van een hele cel op microscopisch niveau elektron" 6,7.
Door structome analyse, waarvoor seriële uiterst dunne vectorafbeeldingsbestanden techniek, bleek dat een gistcel Saccharomyces cerevisiae en Exophiala dermatitidis had ongeveer 200.000 ribosomen7,8, een Escherichia coli cel had 26.000 ribosomen9, een Mycobacterium tuberculosis cel had 1.700 ribosomen10 en Myojin spiraal bacteriën had slechts 300 ribosomen11. Deze informatie is nuttig bij het schatten van niet alleen het groeitempo op jaarbasis in elk organisme, maar ook in de identificatie van soorten9.
Verder structome analyse leidde tot de ontdekking van een nieuwe organisme; Parakaryon myojinensis werd gevonden in de diepe zee voor de kust van Japan, waarvan celstructuur waren een intermediair tussen die van prokaryoten en eukaryoten,12,13,14,15. Op dit moment seriële uiterst dunne vectorafbeeldingsbestanden techniek wordt beschouwd als zo moeilijk dat het lang om te overmeesteren duren zou. In deze studie hebben we een betrouwbare methode waarin iemand kunt uitvoeren seriële uiterst dunne afdelen zonder problemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: De specimens gebruikt in deze studie werden micro-organismen, snel bevroren met propaan in vloeibare stikstof, bevriezen gesubstitueerde in aceton met 2% osmium tetroxide en ingesloten in epoxy hars1,2,,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. bereiding van ondersteuning film (Figuur 1-3)
Opmerking: Zilverkleurige Formvar ondersteuning film is bereid met behulp van de methode van de cast-op-glas-19.
- Voeg 100 mL van 1,5% Formvar in ethyleendichloride op een Formvar-making apparatuur (Figuur 1). Dompel de helft van een glasplaatje (76 x 26 x 1.3 mm) in Formvar-oplossing in de bovenste kolom van het apparaat door het indrukken van de oplossing met lucht via 'a' met behulp van een rubberen bal19.
- Giet de oplossing uit de kolom door te openen van de afsluiter van de drie-weg en vrijgeven van lucht door 'b' naar het verminderen van de druk. Neem het glasplaatje uit het apparaat en droge lucht aan vorm een film op het oppervlak van het glasplaatje. Gebruik een gloeilamp versneld drogen van de film Formvar.
- Nadat uit de vier randen van de film op het glasplaatje met een scheermesje (Figuur 2a) schrapen, en ademhaling op de dia om de scheiding van de film van de dia20, uit de film op het water zweven door het glasplaatje in onder te dompelen de water langzaam op een lage horizontale hoek (ongeveer 10°, Figuur 2b).
- Schep op de film van de Formvar uit het water met behulp van een aluminium rack (30 x 25 x 3 mm) met gaatjes (4 mm diameter) (Figuur 3a). Houd de rek met de film van de Formvar in een exsiccator tot gebruik (Figuur 3b).
2. het trimmen van het specimen blok met een ultrasone trimmen lemmet en een scheermesje 21 onder een stereomicroscoop (Figuur 4)
- Zorg ervoor dat er cellen op het oppervlak van het blok door het observeren van de tip van het blok met een lichte Microscoop (figuur 4a).
- Mount het specimen blok in de chuck (blok houder), en bevestig de chuck op een trimmen etappe21 (figuur 4b). Dit stadium trimmen heeft het mechanisme van een verlichting vanaf de achterkant van het model.
- Trim het blok aan een grootte van 0.7 mm x 1.0 mm (figuren 4 c, 5d). Aangezien de epoxyhars zeer moeilijk is, trim de blokken eerst met een ultrasone trimmen lemmet. De ultrasone trimmen blade is een nieuw geïntroduceerde machine, en de blokken zijn gemakkelijk bijgesneden. Vervolgens snijd het blok verder met een scheermesje. Snijd een schouder ter gelegenheid van de richting van het snijden (Zie Figuur 5 d, Figuur 8).
3. trimmen het specimen blok met diamant mes met behulp van de microtoom (Figuur 5)
- Stel het specimen blok chuck in de monsterhouder van de ultramicrotome. Plaats het model 90° tegen de klok in tegen het werkelijke standpunt als seriële uiterst dunne segmenteren is uitgevoerd (Zie Figuur 5 d).
- Snij het oppervlak van het blok met een diamant trimmen mes (Zie Figuur 5 d). Instellen van de diamant mes rand evenwijdig aan het specimen blok gezicht, en snijd de minimale hoeveelheid monster oppervlak om niet te verliezen een specimen (Figuur 5 d).
Opmerking: Deze stap wordt gedaan om het specimen oppervlak glad. Het deel van het oppervlak van het model van het dunne deel intact is gelaten (daarom dit deel niet schijnt als een spiegel, Figuur 5 d), om niet te verliezen een deel van het specimen voor seriële segmenteren. Dit is omdat het model is blootgesteld aan de oppervlakte van het blok. - Plaats een spiegel (Mesa knippen, M) in het werkgebied van de mes te controleren van het snijden van het specimen blok (Figuur 5 c).
- Snijd de linkerrand (dit wordt de bovenzijde, Figuur 5 d, van het monster in seriële afdelen) van het blok met behulp van trimmen mes door het draaien van het mes podium 30 ° naar links (figuur 5a).
- Snijd het blok gezicht op ongeveer 100 µm vanaf de linkerrand van het specimen (dit wordt de onderkant van het model in seriële afdelen, Figuur 5 d) door het draaien van het mes podium 30 ° naar rechts (Figuur 5b).
Opmerking: De seriële secties zal worden gesneden uit het slanke deel van het model van ongeveer 90 nm x ongeveer 1 mm groot. Het grote deel worden gebruikt voor het aanpassen van het oppervlak van het model en de mes-rand zodanig dat ze parallel. Na het aanpassen van het specimen oppervlak om parallel aan de mes-rand, zal de grotendeels verwijderd worden met een scheermesje. Door het snijden van de bovenste en onderste zijkanten van het monster met behulp van de microtoom, beide zijden van het specimen worden vloeiend en precies parallel aan elkaar (Figuur 5 d), die is noodzakelijk om recht en ononderbroken lint secties.
4. het verstellen van de specimen oppervlak en mes rand zodat zij parallel aan elkaar 21 worden geconfronteerd
- Verwijder het trimmen mes, en het specimen blok 90° rechtsom draaien.
- Een uiterst dunne vectorafbeeldingsbestanden mes mes strument instellen
- Het oppervlak van het model en de mes-rand aanpassen zodat zij parallel aan elkaar met behulp van het grote deel van het oppervlak van het specimen worden geconfronteerd.
Opmerking: Het grote deel van het model wordt gebruikt voor aanpassing omdat het snijden gezicht van seriële segmenteren zo klein is, waardoor het moeilijk is om aan te passen specimen oppervlak en mes rand met behulp van dit deel, met name in verticale richting. Dus, met behulp van het grote deel van het specimen gemakkelijk aanpassing.
5. verspreiding van neopreen oplossing op het specimen blok (Figuur 6)
- Om te plaatsen het specimen chuck op precies dezelfde positie als de oorspronkelijke positie, tape van toepassing op de chuck en de chuck houder van de microtoom en snijd aan de grens (Figuur 6a).
- Neem het specimen chuck uit de microtoom, en plaats deze onder de stereomicroscoop (Figuur 6b). Afgesneden de groot deel van het model met een scheermesje, verlaten de slanke deel, waar seriële secties zullen worden verkregen.
- Met behulp van een pipet van Pasteur, ongeveer 1 µL 0,5% neopreen oplossing (Figuur 6b) in het model moet worden gebruikt voor seriële segmenteren, om de sectie zijden lijm neerzet. Dekking van het hele model met neopreen oplossing. Absorberen overtollige neopreen oplossing onmiddellijk met een stukje papier van de filter geplaatst in de buurt van het model. Krijgen van een lint van secties is essentieel voor het nemen van foto's van seriële cel secties, en neopreen lijm is erg handig voor het vasthouden van de secties samen.
- Bereiden 3-gleuf rasters (maten van spleten: midden, 0.4 mm x 2,2 mm, beide zijden 0,2 x 2,2 mm) (Figuur 6 c) voor het oppakken van seriële secties door het handvat van de rasters buigen tot 60 °, behandelen de rasters met 0,5% neopreen oplossing, en het maken van de rasters hydrofiele door gloed geen kwijting22.
6. het maken van seriële secties (Figuur 7-9)
- Plaats het specimen blok chuck terug in de microtoom op dezelfde positie als 5.1 (Figuur 6a) door het uitlijnen van de gelaste delen. Dit houdt het gezicht van de blok en de rand van het mes perfect evenwijdig aan elkaar. Breng het mes dicht bij het model.
- De boot van de mes met water vullen.
- Bedek de microtoom met een plastic dopje om te voorkomen dat de luchtstroom (Figuur 7).
Opmerking: De luchtstroom tijdens uiterst dunne segmenteren en ophalen van secties vaak problemen veroorzaken. De plastic dekking heeft drie gaten: één gat is voor de verrekijker lenzen, en de andere twee gaten zijn voor de armen toe werking terwijl de cover ingeschakeld is. De houten armleuningen wordt gebruikt voor het plaatsen van de armen terwijl het doen van delicate werkzaamheden, zoals het ophalen van seriële secties met rasters. De houten armleuningen is geplaatst op verschillende tafels uit de microtoom tabel (Figuur 7, pijlen), dus niet doorgeven van de trilling van de exploitant van de handen aan de microtoom. - Beginnen met het snijden van het specimen op 200 nm sectie dikte (Figuur 8). Instelling bij 200 nm dikte zal tijd besparen in het mes om het oppervlak van het model.
- Nadat het eerste gedeelte wordt gesneden, de dikte van de sectie instellen tot 70 nm (Figuur 8).
- Wanneer het aantal seriële secties bereikt 20 (juist spreken, na de lint bereikt ongeveer 1.8 mm; het aantal secties hangt af van de breedte van de secties), stelt u de dikte van de sectie op 10 nm (Figuur 8) terwijl het voortdurend om te snijden.
Opmerking: Aangezien de microtoom kan niet 10 nm-dik secties knippen, geen nieuwe sectie verschijnt en de eerder gesneden secties worden gescheiden van de mes-rand. Het is belangrijk om gescheiden sectiegroepen (Figuur 9) voor het oppakken van seriële secties om te voorkomen dat de moeilijkheid in het scheiden van secties handmatig met behulp van een paar haarstrengen. Aangezien het gezichtsveld in de transmissie-elektronenmicroscoop 2.0 mm, secties 1.8 mm moeten lange hooguit. - Stel de sectie dikte 60 nm (Figuur 8). Dit zal produceren 70 nm secties (Figuur 8) omdat de machine zal de vorige 10 nm dikte toe te voegen.
- De dikte van de sectie instellen terug naar 70 nm (Figuur 8) en blijven snijden tot 1,8 mm-durende secties worden verkregen.
- Herhaal 6.6-6,8 tot vijf 1,8 mm lange secties worden verkregen (Figuur 9). We maken meestal vijf sectiegroepen omdat er vijf specimen houders in de transmissie-elektronenmicroscoop beschikbaar in ons lab zijn, maar vijf niet de limiet is.
7. oppikken seriële secties (Figuur 10-12)
- Plaats de 'sectie-bedrijf loop'23 (binnendiameter van de lus: 5.0 mm) (figuur 10a) op de derde groep van de sectie (Figuur 10).
Opmerking: Het is nodig voor het ophalen van de secties in de volgorde van hun segmenteren om te fotograferen in de juiste volgorde. Echter, aangezien er vijf sectiegroepen op de boot mes, het vaak krijgt verwarrende welke groepen zijn die. De lus in de derde groep plaatst, wordt het duidelijk dat de twee groepen in de buurt van de exploitant zijn de eerste en tweede, en de verre twee van de exploitant zijn de vierde en vijfde groepen (Figuur 10). Dit voorkomt dat de volgorde vermengen. - Plaats van de 'Water-oppervlak-raising loop'23 (WSRL, inwendige diameter van de lus: 4,0 mm) (Figuur 11) het mes werkgebied (Figuur 11). De WSRL zal stevig staan op het podium van het mes, omdat het is uitgerust met een magneet op de bodem.
- Plaats de lus van de WSRL net boven de seriële secties door het bewegen van de schacht en handvat. Verlagen de lus van de WSRL op het wateroppervlak, zodat de lus de secties omsluit.
- Duw de loop naar beneden door de schroef naar beneden draaien zodat het wateroppervlak met oppervlaktespanning (figuren 11c-d verhogen zal). De sectie verplaatsen naar het midden van de lus, plaats ze op de top van het water en de richting van de sectie aanpassen met behulp van een streng haar21.
- Sectiegroepen halen door het aanraken van het met een kale gleuf-rooster, die is gehouden door pincet en gehouden parallel aan het wateroppervlak (Figuur 11 d). Het is belangrijk voor secties te raken het raster eerst niet het water, om secties precies in het midden van het raster (Figuur 11 d).
- Plaats de rasters met secties samen met een kleine druppel water op de Formvar ondersteuning film16 (Figuur 12), en Verwijder overtollig water met filtreerpapier.
Opmerking: Kreuken van de film van de ondersteuning is vaak een probleem wanneer secties worden opgehaald met behulp van een raster met ondersteuning film omdat membraan (secties) membraan (ondersteuning film) rechtstreeks raakt. Het probleem van het krijgen van rimpels op de ondersteuning film is aanzienlijk verminderd door een sectie-bevattende raster samen met een kleine druppel water op de Formvar ondersteuning film16plaatsen.
8. vlekken secties16,24 (Figuur 13)
- Nadat de secties zijn volledig gedroogd, scheuren van de film van de Formvar van rond de rasters en de rasters rekening houdend met de secties verwijderen.
- Stel de rasters in de groef van de kleuring van de buis16 in de juiste volgorde (Figuur 13) en vlek secties met uranyl acetaat en lood citraat24.
Opmerking: Er is een groef 0.6 mm diep snijden langs de lange as van de buis met een scheermesje. De buis is nuttig ter voorkoming van onopzettelijke breuk van films van ondersteuning bij het gebruik van pincet, aangezien rechtstreeks te worden aangeraakt van rasters niet nodig tijdens de kleuring en wassen proces16 is.
9. waarneming van seriële secties (Figuur 14)
- 5 rasters in de multi monsterhouder in de juiste volgorde (figuur 14a), kunt u de lengteas van het raster gleuf loodrecht op de as van de houder specimen instellen De handgrepen (pijlpunten) van de rasters hoeft niet te worden verlaagd, omdat de 'raster-fixeerstoffen' niet de grepen aanraken zal.
- Herstellen van de rasters met 'raster-fixeerstoffen' (figuur 14b) en de monsterhouder in de transmissie-elektronenmicroscoop invoegen.
Opmerking: Het is vaak handig lage vergroting om beelden te nemen van alle geledingen van de cel (Figuur 15) te vinden van interessante micro-organismen of cellen in goede conditie met geen besmetting en goede fixatie, alvorens foto's van de doelcel. - Foto's nemen van de doelcellen in alle secties van de cel bij hoge vergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol, werden drie-gleuf rasters gebruikt voor het oppakken van seriële secties. De rasters zijn gemaakt van nikkel of koper. De seriële secties worden geplaatst op de middelste gleuf. De spleten aan beide zijden zijn noodzakelijk voor het bekijken van de secties bij afhaling met het raster. Om te houden de rasters parallel met de seriële secties wanneer ze afhalen met een pincet (Figuur 11 d), het handvat is gebogen (Figuur 6 c, rechts). Een kleine greep is het voordelig om te voorkomen dat buigen van het grootste deel van het raster, waardoor ernstige problemen ontstaan in het oppakken van secties, en om te voorkomen dat de secties vallen tijdens de kleuring. Dit raster heeft voordelen ten opzichte van de conventionele 2.0 x 1.0 mm single holes raster. Namelijk, secties worden ondersteund door twee metalen staven 0.4 mm uit elkaar rechtstreeks (smaller dan 1,0 mm) en door de Formvar ondersteuning film in een drie-gleuf raster, terwijl secties worden alleen ondersteund door de ondersteuning film in een conventionele raster van single-gat. Specimen drift kan voorkomen worden dat in het fotograferen bij hoge vergroting met behulp van een drie-gleuf raster.
Figuur 15 toont een lage vergroting weergave van vijf rasters die seriële secties voeren. Aangezien elke sectie samen stokken, is het gemakkelijk te vinden van dezelfde cel in de volgende sectie zelfs bij hogere vergroting. Figuur 16 en 17 zijn voorbeelden van seriële beelden van cel secties. Omdat secties veilig op 3-gleuf rasters worden ondersteund, worden gemakkelijk foto's op hoge vergroting (x 50,000) genomen zonder specimen drift. Vezels van DNA 2 nm diameter werden gefotografeerd in deze studies9,12.
Figuur 1 . Formvar ondersteuning film-maken toestellen. De helft van het glasplaatje wordt ondergedompeld in Formvar-oplossing in de bovenste kolom van het apparaat door het indrukken van de oplossing met lucht via 'a' met behulp van een rubberen bal. De oplossing wordt afgevoerd uit de kolom door te openen van de afsluiter van de drie-weg en vrijgeven van lucht door 'b' naar het verminderen van de druk. (Overgenomen uit Yamaguchi en Adachi, 201119 met toestemming). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Methode voor het vrijgeven van de film uit het glas schuif op water. (a) de vier randen van de film op het glasplaatje afgeschraapt worden met behulp van de razor blade. (b) Formvar film is uit op het water dreef door een verlaging van het glasplaatje langzaam onder een lage hoek. (Overgenomen uit Yamaguchi en Adachi, 201119 met toestemming). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Formvar ondersteuning film op een aluminium rek. (a) de Formvar film is schepte uit het water met een aluminium-rack. (b) het rek wordt bewaard in de exsiccator tot gebruik. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Trimmen van het specimen blok met een ultrasone trimmen mes en een scheermes onder een stereomicroscoop. (a) de aanwezigheid van het specimen wordt bevestigd door het observeren van het specimen blok onder een lichte Microscoop. Het blok weergegeven in de figuur opgenomen micro-organismen die zijn gekoppeld aan een schaal-worm chaeta (ongeveer 1,7 mm in lengte) verzameld uit de diepzee12,14. (b) trimmen fase. (c) de hele afbeelding van een stereomicroscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Trimmen van het specimen blok met diamant mes met behulp van microtoom. (a) afbeelding voor het snijden van de linkerrand. (b) het blok gezicht wordt gesneden op een positie van de ongeveer 100 nm vanaf de linkerrand van het specimen. (c) een spiegel (Mesa knippen, M) in het mes werkgebied geplaatst. (d) model oppervlak. Merk op dat de bovenzijde en de onderkant van het dunne deel glad en perfect evenwijdig. Merk ook op dat de schouder wordt gesneden ter gelegenheid van de richting van het snijden (Zie Figuur 8). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Neopreen behandeling op het oppervlak van het specimen. (a) om het specimen chuck terug aan precies de oorspronkelijke positie plaatst, zijn de chuck en de chuck houder van de microtoom gemarkeerd met een lint en snijd aan de grens. (b) bevochtiging het model met neopreen oplossing met behulp van de Pipet van Pasteur. (c) drie-gleuf rasters voor het oppakken van seriële secties. Het handvat is gebogen tot 60 graden (c, rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 . Plastic cover van de microtoom en houten armleuningen. De plastic dekking is nuttig om te voorkomen dat de luchtstroom tijdens het uiterst dunne segmenteren. De houten armleuningen wordt gebruikt voor het fijne werk zoals seriële secties ophalen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 . Instellen van de dikte van de sectie en het verkrijgen van de secties op de juiste dikte. Nadat het aantal seriële secties 20 bereikt heeft, de dikte van de sectie is ingesteld op 10 nm. Aangezien de microtoom kan niet 10 nm-dik secties knippen, geen nieuwe sectie verschijnt en de eerder gesneden secties worden gescheiden van de mes-rand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 . Voorbeeld van uiterst dunne secties verkregen door middel van het protocol. Merk op dat de vijf groepen van seriële secties van ongeveer 1,8 mm lang al zijn gescheiden na het uitsnijden. In dit specifieke geval is de kleur van het midden van de uiterst dunne secties geelachtig als gevolg van de aanwezigheid van het model. De andere delen van de afdeling, die niet het model bevatten en bestaan uit hars alleen, zijn zilver van kleur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10 . 'Sectie-bedrijf loop'. (a) bovenaanzicht (bovenste deel) en de onderste weergave (onderste deel van de foto) van de lus. (b) de sectie-bedrijf-lus wordt gebruikt om de derde groep van seriële secties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11 . Ophalen van seriële secties. (a) ' Water-oppervlak-raising loop' (WSRL). Het handvat van de lus kan worden verwijderd uit de schacht, die roerende. De lus kan ook op en neer worden bewogen door te draaien aan de top van de schroef. (b) de WSRL is vastgesteld op het podium van het mes door een magneet. (c) nauwere weergave van (b). (d) diagram van de lus, wateroppervlak, secties en raster tijdens ophalen (zijaanzicht). Uiterst dunne secties kunnen precies op de gleuf raster worden opgehaald door het verlagen van de kale raster parallel aan de uiterst dunne secties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 12 . Plaatsen van het raster op de film Formvar. Het raster houden de secties wordt samen met een kleine druppel water op de Formvar film op aluminium rek geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 13 . Kleuring van de buis16. Een groef 0.6 mm diep gebeurt langs de lange as met behulp van een scheermesje. Rasters zijn in de gleuf in de juiste volgorde geplaatst. Één uiteinde van de buis wordt gesneden (pijl hoofd) ter gelegenheid van zijn richting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 14 . Het plaatsen van de rasters in de monsterhouder. (a) de rasters in de monsterhouder in de juiste volgorde worden geplaatst. (b) de rasters worden dan opgelost met 'raster-fixeerstoffen'. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 15 . Seriële secties gemonteerd op gleuf rasters. De afbeelding ziet u 18 tot 25 secties gemonteerd op een grid. De nummers in elke spleet geven de volgorde nummer vanaf de eerste sectie. De eerste sectie is dikker dan de andere (Zie Figuur 8). Merk op dat de secties met elkaar zijn verbonden en dezelfde dikte hebben. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 16 . Seriële secties van Parakaryon myojinensis12. De nummers linksonder geven de volgorde ten opzichte van de eerste sectie. De figuur toont 12 van 67 volledige secties. Deze cel werd gevonden te hebben een grote nucleoïde bestaande uit naakte DNA vezels, met een enkele nucleoïde-membraan, en endosymbionten die lijken op bacteriën, maar geen mitochondriën. Dus, dit organisme lijkt te zijn een tussenvorm van leven evolueert van prokaryote en eukaryote12. N, nucleoïde. Gereproduceerd van Yamaguchi en Worman, 2014. 14 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 17 . Seriële secties van Escherichia coli9. De nummers linksonder geven de volgorde ten opzichte van de eerste sectie. De figuur toont 12 volledige secties. Deze cel bleek te bevatten 21,700 ribosomen9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier voorgestelde methode vereist geen dure apparatuur. Het vereist alleen een aluminium rack (Figuur 3), drie-gleuf rasters (Figuur 6 c), sectie-bedrijf lussen (figuur 10a), water-oppervlak-raising lus (Figuur 11), en een kleuring buis (Figuur 13). Er zijn vele functies van de huidige methode. Het grote deel van het model wordt gebruikt om de model-oppervlak en mes-rand zodat zij parallel aan elkaar lopen. Seriële secties worden gesneden in groepen om te voorkomen dat de moeilijkheden in de scheitrechter secties met behulp van een paar haarlokken bij het ophalen van een groep van seriële secties op de gleuf rasters. Een 'sectie-bedrijf loop' wordt gebruikt om het niet te vermengen met de volgorde van de sectiegroepen. Een 'Water-oppervlak-raising loop' wordt gebruikt om ervoor te zorgen de secties zijn geplaatst op de top van het water en dat ze het raster eerst, aanraken om hen in de gewenste positie op de roosters. Formvar ondersteuning film op een aluminium rek wordt gebruikt om het gemakkelijker om te herstellen van de secties op de rasters en om te voorkomen dat kreuken van de film van de steun. Een kleuring buis wordt gebruikt om te voorkomen dat per ongeluk breken de steun films met een pincet.
Onlangs was een automatische tape-verzamelen ultramicrotome ontwikkelde25 voor het verzamelen van secties automatisch voor het scannen van elektronen microscoop (SEM) imaging op elektron-ondoorzichtige plastic tapes. Deze methode kan betrouwbaar knippen duizenden uiterst dunne secties26, die is niet mogelijk door de huidige methode. Ook seriële blok gezicht (SBF) 27 en focus ion beam (FIB)-SEM28 worden gebruikt voor het verzamelen van 3D-informatie van cellen en weefsels van dieren. In deze methoden, het segmenteren met een diamant mes of focus ion beam is geïntegreerd in de SEM-Microscoop, en uitgevoerd in een volledig automatische wijze die geen speciale technieken vereist. Hoewel deze methoden handig zijn, is de apparatuur zo duur is dat niet veel instellingen deze machines kopen. Ook, aangezien deze methoden SEM foto secties gebruiken, resolutie van de microfoto is inferieur aan de huidige methode die gebruikmaakt van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Deze methoden niet kunt oplossen van de individuele ribosoom deeltjes, microtubuli Microfilamenten en DNA vezels op dit moment.
Voor structome analyse van micro-organismen en voor Ultrastructurele studie van onbekende micro-organismen is het noodzakelijk om te observeren cellen en celbestanddelen zoals celwand plasmamembraan, mitochondriën, nucleus, nucleaire membranen, endoplasmatisch reticulum, chloroplasten, plastiden Golgi-apparaat, ribosomen en banale elementen met hoge resolutie. TEM waarneming van seriële uiterst dunne secties is een van een paar methoden om een dergelijke analyse mogelijk in drie dimensies te maken. Omdat uiterst dunne secties na observatie in deze methode blijven, hetzelfde gebied waarneembaar herhaaldelijk; Dit is niet mogelijk in SBF of FIB-SEM, aangezien het waargenomen gebied verloren na observatie. Deze functie is belangrijk voor het bestuderen van de diepzee micro-organismen wanneer het noodzakelijk is om interessante organismen bij lage vergroting eerst zoeken en dan fotograferen serieel op het doelorganisme bij hoge vergroting.
Kortom, seriële uiterst dunne vectorafbeeldingsbestanden methode kan nu worden uitgevoerd in een eenvoudig, goedkoop, en relaible manier door de huidige studie, hetgeen essentieel om 3D ultrastructual is studie van micro-organismen op hoge resolutie elektronenmicroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken oprecht Shigeo Kita voor zijn waardevolle suggesties en discussie. We ook bedanken John en Sumire Eckstein voor hun kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).
- Yamaguchi, M. Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy. Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells. J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).
- Yamaguchi, M. Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66, 283-294 (2017).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65, 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).
- Yamaguchi, M. Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea. Cytologia. 78, 333-334 (2013).
- Yamaguchi, M., Worman, C. O. Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell. Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans. mBio. 4, e00614-e00613 (2013).
- Yamaguchi, M., Adachi, K. Specimen support. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 52-57 (2011).
- Hayat, M. A. Support films. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 4th ed, Cambridge, Univ. Press. Cambridge, United Kingdom. 216 (2000).
- Yamaguchi, M., Kita, S. Ultrathin sectioning. Guide Book for Electron Microscopy. The Japanese Society of Microscopy, , 2nd ed, Kokusaibunkeninsatsusya, Tokyo. 40-52 (2011).
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65, 444-450 (2016).
- Kita, S. Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools. Kenbikyo. 46, in Japanese 253-257 (2011).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).
- Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions. Microsc. Microanal. 12, Suppl . 2. 86-87 (2006).
- Hildebrand, D. G. C., et al. Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish. Nature. 545, 345-349 (2017).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).
