Summary
Questo studio presenta procedure affidabili e facili per ottenere sezioni ultrasottili seriale di un microorganismo senza costose attrezzature in microscopia elettronica di trasmissione.
Abstract
Osservazione di cellule e componenti delle cellule in tre dimensioni ad alto ingrandimento in microscopia elettronica di trasmissione richiede la preparazione di sezioni ultrasottili di serie dell'esemplare. Anche se la preparazione di sezioni ultrasottili seriale è considerato essere molto difficile, è piuttosto facile se viene utilizzato il metodo corretto. In questa carta, indichiamo una procedura dettagliata per ottenere in modo sicuro seriale sezioni ultrasottili di microrganismi. I punti chiave di questo metodo sono: 1) per utilizzare la gran parte dell'esemplare e regolare il bordo di superficie e coltello di esemplare affinché siano paralleli tra loro; 2) per tagliare le sezioni di serie in gruppi ed evitare difficoltà di separare sezioni usando un paio di ciocche di capelli durante il recupero di un gruppo di sezioni di serie sulle griglie a fessura; 3) utilizzare un 'sezione-holding loop' e evitare di confondere l'ordine dei gruppi di sezione; 4) per utilizzare un ciclo di acqua di superficie-sensibilizzazione e assicurarsi che le sezioni siano posizionate all'apice dell'acqua e che toccano la griglia in primo luogo, al fine di metterli nella posizione desiderata sulle griglie; 5) per utilizzare il film di supporto su un rack di alluminio e rendere più facile per recuperare le sezioni sulle griglie ed evitare grinze della pellicola supporto; e 6) utilizzare un tubo di colorazione ed evitare accidentalmente rompere il film di supporto con le pinzette. Questo nuovo metodo permette di ottenere sezioni ultrasottili seriale senza difficoltà. Il metodo permette di analizzare la struttura cellulare dei microrganismi ad alta risoluzione in 3D, che non può essere realizzato utilizzando il metodo ultramicrotomo raccolta nastro automatico e blocco-faccia seriale o fascio ionico focalizzato, microscopia elettronica a scansione.
Introduction
Tecnica di sezionamento ultrasottile seriale corretta è indispensabile per lo studio di cellule e componenti cellulari tridimensionalmente a livello microscopico dell'elettrone. Abbiamo studiato la dinamica del corpo del mandrino palo nel ciclo cellulare delle cellule di lievito e ha rivelato i cambiamenti morfologici delle loro ultrastruttura durante il ciclo cellulare ed il tempo di duplicazione1,2,3, 4,5. Nel 2006, abbiamo coniato una nuova parola 'structome' combinando 'struttura' e '-ome' e l'ha definita il 'informazioni strutturali quantitative e tridimensionale di una cella intera a livello microscopico dell'elettrone' 6,7.
Dall'analisi di structome, che richiede tecnica seriale di sezionamento ultrasottile, si è constatato che una cellula di lievito Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis ha circa 200.000 ribosomi7,8, un Escherichia coli cella aveva 26.000 ribosomi9, una cella di tubercolosi del micobatterio avuto 1.700 ribosomi10 e batteri a spirale Myojin avevano solo 300 ribosomi11. Queste informazioni sono utili nella stima non solo il tasso di crescita in ogni organismo, ma anche nell'identificazione di specie9.
Inoltre, analisi di structome ha portato alla scoperta di un nuovo organismo; Parakaryon myojinensis è stato trovato nel mare profondo al largo delle coste del Giappone, la cui struttura di cella erano un intermedio tra quelli dei procarioti e negli eucarioti12,13,14,15. Allo stato attuale, tecnica di sezionamento ultrasottile seriale è considerato essere così difficile che ci vorrebbe molto tempo per master. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo affidabile in cui chiunque può eseguire il sezionamento seriale ultrasottile senza difficoltà.
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Protocol
Nota: I campioni utilizzati in questo studio sono stati microrganismi, rapidamente congelati con propano in azoto liquido, congelare sostituiti in acetone contenente 2% tetrossido di osmio e incorporati in resina epossidica resina1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. preparazione del supporto pellicola (Figura 1-3)
Nota: Color argento Formvar supporto pellicola viene preparata utilizzando il metodo di fusione su vetro19.
- Aggiungere 100 mL di 1,5% Formvar in dicloruro di etilene a un apparato di Formvar-making (Figura 1). Tuffo a metà di una lastra di vetro (76 x 26 x 1,3 mm) nella soluzione di Formvar nella colonna superiore dell'apparecchio premendo la soluzione con l'aria attraverso la 'a' utilizzando una palla di gomma19.
- Scaricare la soluzione dalla colonna aprendo il rubinetto a tre vie e rilasciando aria attraverso 'b' per ridurre la pressione. Estrarre il vetrino dall'apparecchio e asciugare all'aria per formare una pellicola sulla superficie del vetrino. Utilizzare una lampada ad incandescenza per accelerare l'essiccazione del film Formvar.
- Dopo raschiando i quattro bordi del film sul vetrino con una lama di rasoio (Figura 2a) e la respirazione sulla diapositiva per facilitare la separazione del film dalla diapositiva20, galleggiare fuori la pellicola sull'acqua immergendo il vetrino nella acqua lentamente ad un angolo orizzontale basso (circa 10°, Figura 2b).
- Raccogliere il film Formvar dall'acqua utilizzando un rack in alluminio (30 x 25 x 3 mm) con fori (4 mm di diametro) (Figura 3a). Mantenere il rack con il film di Formvar in un essiccatore fino all'utilizzo (Figura 3b).
2. tagliare il blocco di campione con una lama di taglio ad ultrasuoni e una lama di rasoio 21 sotto un microscopio stereoscopico (Figura 4)
- Assicurarsi che non vi siano cellule sulla superficie del blocco osservando la punta del blocco con un microscopio ottico (Figura 4a).
- Montare il blocco di esemplare nel mandrino (supporto del blocco) e montare il mandrino su un taglio fase21 (Figura 4b). Questa fase di taglio ha un meccanismo di illuminazione dal retro dell'esemplare.
- Tagliare il blocco a una dimensione di 0,7 x 1,0 mm (figure 4 c, 5d). Poiché la resina epossidica è molto difficile, tagliare i blocchi in primo luogo usando una lama di taglio ad ultrasuoni. La lama di taglio ad ultrasuoni è una macchina appena introdotta, e i blocchi vengono facilmente eliminati. Quindi tagliare il blocco ulteriormente con una lama di rasoio. Tagliare una spalla per contrassegnare la direzione di taglio (Vedi Figura 5 d, Figura 8).
3. tagliare il blocco di esemplare con lama di diamante usando il microtomo (Figura 5)
- Impostare il blocco di esemplare chuck nel portacampioni dell'ultramicrotomo. Collocare il campione 90° in senso antiorario contro la posizione effettiva quando sezionamento seriale ultrasottile è eseguita (Vedi Figura 5d).
- La superficie del blocco di taglio con un coltello di taglio del diamante (Vedi Figura 5 d). Impostare il bordo del coltello di diamante parallelo alla faccia del blocco campione e tagliare la quantità minima di superficie del campione per non perdere alcun esemplare (Figura 5d).
Nota: Questo passaggio viene fatto per lisciare la superficie del campione. La parte della superficie del campione della parte sottile è lasciata intatta (quindi questa parte non è brillante come uno specchio, Figura 5d), per non perdere qualsiasi parte dell'esemplare per sezionamento seriale. Questo è perché l'esemplare è esposto sulla superficie del blocco. - Posizionare uno specchio (taglio di Mesa, M) sul palco coltello per monitorare il taglio del blocco campione (Figura 5C).
- Tagliare il bordo sinistro (che diventa il lato superiore, Figura 5d, del campione nella divisione di serie) del blocco utilizzando il coltello multiuso ruotando la fase coltello 30 ° a sinistra (Figura 5a).
- Tagliare il volto di blocco a circa 100 µm dal bordo sinistro dell'esemplare (che diventa il lato inferiore del provino in sezionamento seriale, Figura 5d) ruotando la fase coltello 30 ° a destra (Figura 5b).
Nota: Le sezioni di serie saranno tagliate dalla parte sottile dell'esemplare di circa 90 nm x circa 1 mm di dimensioni. La gran parte serviranno per regolare la superficie del campione e il bordo della lama in modo che sono parallele. Dopo aver regolato la superficie del campione per essere parallela al bordo del coltello, la gran parte verrà rimosso con una lama di rasoio. Tagliando i lati superiori e inferiori del campione usando il microtomo, entrambi i lati del provino diventano liscia ed esattamente parallelo a vicenda (Figura 5d), che è necessario per ottenere sezioni di nastro dritto e ininterrotta.
4. regolazione bordo esemplare di superficie e coltello in modo che si trovano ad affrontare parallelo a vicenda 21
- Rimuovere il coltello multiuso e ruotare il blocco campione 90° in senso orario.
- Impostare un coltello di taglio ultrasottile per la fase di coltello.
- Regolare la superficie del campione e il bordo della lama in modo che si trovano ad affrontare parallelo a vicenda utilizzando la gran parte della superficie del campione.
Nota: La maggior parte del campione viene utilizzata per la regolazione perché il volto di taglio di sezionamento seriale è così piccolo, rendendo difficile regolare il bordo di superficie e coltello esemplare utilizzando questa parte solo, soprattutto in direzione verticale. Così, utilizzando la grande parte dell'esemplare di facile regolazione.
5. diffusione soluzione in neoprene sul blocco campione (Figura 6)
- Per posizionare il mandrino di esemplare esattamente nella stessa posizione come la posizione originale, applicare il nastro sul mandrino e titolare del mandrino del microtomo e tagliata sul confine (Figura 6a).
- Prendere il campione chuck dal microtomo e posizionarlo sotto lo stereomicroscopio (Figura 6b). Tagliare la parte grande del campione con una lama di rasoio, lasciando la parte sottile, da cui si otterranno le sezioni di serie.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, cadere il campione da utilizzare per il sezionamento seriale, per rendere l'adesivo di lati di sezione soluzione di circa 1 µ l 0,5% in neoprene (Figura 6b). Coprire l'intero campione con soluzione in neoprene. Assorbire la soluzione in eccesso in neoprene immediatamente con un pezzo di carta da filtro posizionato vicino l'esemplare. Ottenere un nastro delle sezioni è essenziale per scattare foto di sezioni seriali delle cellule, e colla neoprene è molto utile per attaccare le sezioni insieme.
- Preparare 3-fessura griglie (dimensioni delle fessure: centrale, 0,4 mm x 2,2 mm, entrambi i lati di 0,2 mm x 2,2 mm) (Figura 6C) per raccogliere le sezioni di serie piegando la maniglia delle griglie a 60 °, trattando le griglie con soluzione in neoprene 0,5% e rendendo le griglie idrofila di di scarico di incandescenza22.
6. rendere le sezioni di serie (Figura 7-9)
- Posto il blocco campione chuck torna nel microtomo nella stessa posizione come 5.1 (Figura 6a) allineando le parti nastrate. Ciò mantiene il volto di blocco e il bordo della lama perfettamente parallelo a vicenda. Quindi portare il coltello vicino al campione.
- Riempire la barca di coltello con acqua.
- Coprire il microtomo con una copertura di plastica per impedire il flusso d'aria (Figura 7).
Nota: Il flusso d'aria durante il sezionamento ultrasottile e il recupero di sezioni spesso causare problemi. Il coperchio di plastica ha tre fori: un buco è per le lenti del binocolo, e sono gli altri due fori per le braccia permettere il funzionamento mentre la copertura è su. Il bracciolo in legno è usato per posizionare le braccia mentre si fa un lavoro delicato, come il recupero di sezioni di serie con griglie. Il bracciolo in legno è posto su tabelle diverse dalla tabella microtomo (Figura 7, frecce), per non trasmettere le vibrazioni delle mani dell'operatore per il microtomo. - Iniziare a tagliare il campione allo spessore di sezione 200 nm (Figura 8). Impostazione a spessore di 200 nm farà risparmiare tempo nel portare il coltello alla superficie del provino.
- Dopo la prima sezione è tagliata, è possibile impostare lo spessore di sezione a 70 nm (Figura 8).
- Quando il numero delle sezioni di serie raggiunge 20 (precisamente parlando, dopo la raggiunge nastro circa 1.8 mm; il numero di sezioni varia a seconda della larghezza delle sezioni), impostare lo spessore di sezione a 10 nm (Figura 8) pur continuando a tagliare.
Nota: Poiché il microtomo non può tagliare 10 nm di spessore sezioni, nessuna nuova sezione viene visualizzato, e le sezioni tagliate precedentemente diventano separate dal bordo della lama. È importante arrivare gruppi di sezioni separate (Figura 9) per raccogliere le sezioni di serie evitare difficoltà di separare le sezioni manualmente usando un paio di ciocche di capelli. Poiché il campo visivo del microscopio elettronico a trasmissione è 2.0 mm, sezioni dovrebbero essere al massimo 1,8 mm di lunghezza. - Impostare lo spessore di sezione a 60 nm (Figura 8). Questo produrrà 70 sezioni nm (Figura 8), perché la macchina aggiungerà spessore precedente 10 nm.
- Impostare lo spessore di sezione torna a 70 nm (Figura 8) e continuare a tagliare fino a 1,8-mm-lungo sezioni sono ottenuti.
- 6.6-6.8 Ripetere cinque sezioni lunghe 1,8 mm sono ottenuti (Figura 9). Facciamo solitamente cinque gruppi di sezioni, poiché ci sono cinque portacampioni il microscopio elettronico a trasmissione disponibile nel nostro laboratorio, ma cinque non è il limite.
7. raccogliendo le sezioni di serie (Figura 10-12)
- Posizionare la 'sezione-holding loop'23 (diametro interno del loop: 5,0 mm) (Figura 10a) sul terzo gruppo di sezione (Figura 10b).
Nota: È necessario recuperare le sezioni nell'ordine loro sezionamento per prendere le immagini nell'ordine corretto. Tuttavia, poiché ci sono cinque gruppi di sezioni sulla barca coltello, spesso ottiene confondendo quali gruppi sono che. Inserendo il ciclo il terzo gruppo, diventa chiaro che i due gruppi vicino all'operatore sono il primo e secondo e i due distanti dall'operatore sono i gruppi di quarto e quinto (Figura 10b). Ciò impedirà di miscelazione l'ordine. - Luogo 'acqua di superficie-sensibilizzazione loop'23 (WSRL, diametro interno del loop: 4,0 mm) (Figura 11a) sul palco del coltello (Figura 11b). Il WSRL sarà stare saldamente sul palco coltello perché è dotato di un magnete nella parte inferiore.
- Posizionare l'ansa della WSRL appena sopra le sezioni seriale spostando il suo albero e maniglia. Abbassare il ciclo di WSRL sulla superficie dell'acqua in modo che il ciclo circonda le sezioni.
- Spingere l'anello verso il basso ruotando la vite verso il basso, così che la superficie dell'acqua genererà dalla tensione superficiale (figure 11c-d). Spostare la sezione al centro del loop, posizionarlo sull'apice dell'acqua e regolare la direzione della sezione utilizzando un filo di capelli21.
- Pick up gruppi sezione toccandola con una fessura nuda-griglia, che è detenuta da pinzette e mantenuta parallela alla superficie dell'acqua (Figura 11d). È importante per sezioni a toccare la griglia in primo luogo, non l'acqua, a porre sezioni proprio al centro della griglia (Figura 11d).
- Posizionare le griglie con sezioni insieme una piccola goccia di acqua su Formvar supporto pellicola16 (Figura 12) e rimuovere l'acqua in eccesso con carta da filtro.
Nota: Increspatura del film di supporto è spesso un problema quando sezioni vengono prelevati utilizzando una griglia con supporto pellicola perché membrana (sezioni) tocca la membrana (supporto pellicola) direttamente. Il problema di ottenere le rughe sul film di supporto risulta significativamente ridotto inserendo una griglia di sezione-cuscinetto insieme con una goccia di acqua sulla Formvar supporto pellicola16.
8. colorazione di sezioni16,24 (Figura 13)
- Dopo le sezioni sono completamente asciutta, strappare il film di Formvar da intorno le griglie e togliere le griglie, le sezioni del cuscinetto.
- Impostare le griglie nella scanalatura del tubo colorazione16 nell'ordine corretto (Figura 13) e macchia sezioni con uranile acetato e piombo citrato24.
Nota: C'è un solco profondo 0,6 mm lungo l'asse del tubo tagliato con una lama di rasoio. Il tubo è utile per evitare rotture accidentali del film di supporto quando usando la pinzetta, poiché la manipolazione diretta di griglie non è necessario durante la colorazione e lavatrice processo16.
9. osservazione delle sezioni di serie (Figura 14)
- Impostare il 5 griglie nel supporto multi-campione nell'ordine corretto (Figura 14a), orientando l'asse lungo della fessura griglia perpendicolare all'asse di supporto del campione. Le maniglie (sagittarie) delle griglie non devono essere tagliati, perché la 'griglia-fissatori' non toccherà le maniglie.
- Fissare le griglie con 'griglia-fissatori' (Figura 14b) e inserire il supporto del campione al microscopio elettronico a trasmissione.
Nota: È spesso utile scattare immagini di basso ingrandimento di tutte le sezioni delle cellule (Figura 15) per trovare interessante microrganismi o cellule in buone condizioni senza contaminazione e con buoni agganci, prima di scattare fotografie la cella obiettivo. - Scattare foto delle cellule bersaglio in tutte le sezioni di cellule ad alto ingrandimento.
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Representative Results
In questo protocollo, tre-fessura griglie sono stati utilizzati per raccogliere le sezioni di serie. Le griglie sono costituite di nichel o rame. Le sezioni di serie vengono inserite nella fessura centrale. Le fessure su entrambi i lati sono necessari per visualizzare le sezioni quando raccoglierli con la griglia. Per mantenere le griglie parallele con le sezioni di serie quando li raccogliendo con le pinzette (Figura 11d), la maniglia è piegata (Figura 6C, destra). Una piccola maniglia è vantaggiosa per prevenire la flessione della parte principale della griglia, che provoca gravi problemi raccogliendo sezioni, e per evitare di far cadere le sezioni durante la colorazione. Questa griglia ha vantaggi sopra la griglia del singolo-foro convenzionale 2,0 x 1,0 mm. Vale a dire, sezioni sono supportati direttamente da due barre di metallo distanti 0,4 mm (inferiore a 1,0 mm) e il film di supporto Formvar in una griglia di tre-fessura, mentre sezioni sono supportati solo dal film di supporto in una griglia di singolo-foro convenzionale. Deriva del campione può essere prevenuta pertanto nel fotografare ad alto ingrandimento utilizzando una griglia di tre-fessura.
Figura 15 Mostra un ingrandimento basso di cinque griglie che trasportano le sezioni di serie. Poiché ogni sezione attacca insieme, è facile trovare la stessa cella nella sezione successiva anche a maggiore ingrandimento. Figure 16 e 17 sono esempi di immagini di serie di sezioni delle cellule. Perché sezioni sono supportati in modo sicuro su griglie di 3 passaggi, foto ad alto ingrandimento (x 50,000) facilmente sono prese senza deriva esemplare. Fibre di DNA 2 nanometro di diametro sono stati fotografati in questi studi9,12.
Figura 1 . Formvar supporto cinematografico apparato. Metà del vetrino viene immerso in soluzione di Formvar nella colonna superiore dell'apparato premendo la soluzione con l'aria attraverso la 'a' utilizzando una palla di gomma. La soluzione è drenata dalla colonna aprendo il rubinetto a tre vie e rilasciando aria attraverso 'b' per ridurre la pressione. (Tratto da Yamaguchi e Adachi, 201119 con autorizzazione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Metodo per il rilascio del film dal vetro scivolare sull'acqua. (a) i quattro bordi della pellicola sul vetrino sono raschiati usando la lama di rasoio. (b) Formvar pellicola è fatto galleggiare fuori sull'acqua abbassando il vetrino lentamente ad un angolo basso. (Tratto da Yamaguchi e Adachi, 201119 con autorizzazione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Formvar supporto pellicola su un rack alluminio. (a) il film di Formvar è scooped dall'acqua con un rack in alluminio. (b) il rack è mantenuto in un essiccatore fino all'utilizzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Taglio del blocco campione con una lama di taglio ad ultrasuoni e una lama di rasoio sotto uno stereomicroscopio. (a) la presenza del campione è confermata dalla osservazione del blocco dei campioni sotto un microscopio chiaro. Il blocco indicato in microrganismi figura contenuta connessi con una Cheta scala-vite senza fine (circa 1,7 mm di lunghezza) raccolto dal mare profondo12,14. (b) taglio fase. (c) tutta l'immagine di uno stereomicroscopio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Taglio del blocco campione con lama di diamante utilizzando microtomo. (a) illustrazione per il taglio del bordo sinistro. (b) il volto di blocco viene tagliato in una posizione di circa 100 nm dal bordo sinistro dell'esemplare. (c) uno specchio (taglio di Mesa, M) disposto sulla fase di coltello. (d) superficie del campione. Nota che il lato superiore e lato inferiore della parte sottile sono lisce e perfettamente parallele. Si noti inoltre che la spalla sia tagliata per contrassegnare la direzione di taglio (Vedi Figura 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Trattamento in neoprene sulla superficie del campione. (a) al fine di posizionare il mandrino di esemplare all'esattamente nella posizione originale, il mandrino e titolare del mandrino del microtomo sono contrassegnati con un nastro e tagliate sul confine. (b) bagnando l'esemplare con soluzione in neoprene con pipetta Pasteur. (c) tre-fessura griglie per far salire le sezioni di serie. La maniglia è piegata a 60 gradi (c, destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 . Copertura di plastica del microtomo e braccioli in legno. Il coperchio di plastica è utile per impedire il flusso d'aria durante il sezionamento ultrasottile. Il bracciolo in legno è usato per fare un lavoro delicato come il recupero di sezioni di serie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 . Impostazione dello spessore di sezione e di ottenere sezioni allo spessore corretto. Dopo il numero di sezioni di serie ha raggiunto 20, spessore della sezione è impostato a 10 nm. Poiché il microtomo non può tagliare 10 nm di spessore sezioni, nessuna nuova sezione viene visualizzato, e le sezioni tagliate precedentemente diventano separate dal bordo della lama. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9 . Esempio di sezioni ultrasottili ottenuti attraverso il protocollo. Si noti che i cinque gruppi di sezioni di serie di circa 1,8 mm di lunghezza sono già separati dopo il taglio. In questo caso particolare, il colore del centro delle sezioni ultrasottili è giallastro per la presenza dell'esemplare. Le altre parti della sezione, che non contengono il provino e sono costituiti da resina solo, sono in colore argento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10 . 'Sezione-holding loop'. (a) vista dall'alto (parte superiore) e la vista inferiore (parte inferiore della foto) del ciclo. (b) il ciclo di sezione-holding viene utilizzato per contenere il terzo gruppo di sezioni di serie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11 . Recupero delle sezioni di serie. (a) ' loop di acqua di superficie-sensibilizzazione' (WSRL). La maniglia del ciclo può essere rimosso dall'albero, che è mobile. Il ciclo può anche essere spostato su e giù ruotando il tappo a vite. (b) la WSRL è fisso sul palco coltello da un magnete. (c) una più stretta vista (b). (d) diagramma del ciclo, la superficie dell'acqua, sezioni e griglia durante il recupero (vista laterale). Sezioni ultrasottili possono essere recuperati proprio alla griglia fessura abbassando il parallelo di griglia nuda per le sezioni ultrasottili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12 . Posizionamento della griglia su pellicola Formvar. La griglia che tiene le sezioni viene inserita insieme con una goccia di acqua sulla pellicola Formvar sulla cremagliera in alluminio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13 . Tubo di colorazione16. Un solco profondo 0,6 mm fatta lungo l'asse con una lama di rasoio. Griglie vengono inseriti nella scanalatura nell'ordine corretto. Un'estremità del tubo è tagliata (testa di freccia) per contrassegnare la sua direzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 14 . Posizionamento delle griglie sul supporto esemplare. (a) le griglie vengono inserite nel supporto esemplare nell'ordine corretto. (b) le griglie sono poi fissate con 'griglia-fissatori'. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 15 . Le sezioni di serie montato su griglie a fessura. Nella figura 18 a 25 sezioni montate su una griglia. I numeri in ogni fessura indicano l'inizio di numero di sequenza della prima sezione. La prima sezione è più spessa rispetto agli altri (Vedi Figura 8). Si noti che le sezioni sono legate insieme e hanno lo stesso spessore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 16 . Le sezioni di serie di Parakaryon myojinensis12. I numeri in basso a sinistra indicano la sequenza relativo alla prima sezione. Nella figura 12 su 67 sezioni complete. Questa cella è stata trovata per avere un nucleoide grande costituito da fibre di DNA nudi, con una membrana singola nucleoide ed endosimbionti che assomigliano a batteri, ma non i mitocondri. Quindi, questo organismo sembra essere una forma di vita intermedia in evoluzione da prokaryote a eucariote12. N, nucleoide. Tratto da Yamaguchi e Worman, 2014. 14 con il permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 17 . Sezioni seriali di Escherichia coli9. I numeri in basso a sinistra indicano la sequenza relativo alla prima sezione. Nella figura 12 sezioni complete. Questa cella è stata trovata per contenere 21.700 ribosomi9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui presentato non richiede costose attrezzature. Richiede solo un rack di alluminio (Figura 3), tre-fessura griglie (Figura 6C), tenuta di sezione loop (Figura 10a), acqua di superficie-sensibilizzazione loop (Figura 11a) e un tubo di colorazione (Figura 13). Ci sono molte caratteristiche del presente metodo. La gran parte del campione viene utilizzata per regolare il bordo di superficie e coltello di esemplare, in modo che si trovano ad affrontare parallelo a vicenda. Le sezioni di serie vengono tagliate in gruppi per evitare difficoltà nella separazione sezioni usando un paio di ciocche di capelli durante il recupero di un gruppo di sezioni di serie sulle griglie a fessura. Un 'ciclo di sezione-holding' viene utilizzato per evitare di confondere l'ordine dei gruppi di sezione. Un ciclo di acqua di superficie-sensibilizzazione viene utilizzato per assicurarsi che le sezioni siano posizionate all'apice dell'acqua e che toccano la griglia in primo luogo, al fine di metterli nella posizione desiderata sulle griglie. Formvar supporto pellicola su un rack di alluminio viene utilizzato per rendere più facile per recuperare le sezioni sulle griglie ed evitare grinze della pellicola supporto. Un tubo di colorazione viene utilizzato per evitare di rompere accidentalmente il film di supporto con le pinzette.
Recentemente, un ultramicrotomo nastro di raccolta automatica è stato sviluppato25 per raccogliere le sezioni automaticamente per la microscopia (SEM) di imaging su nastri di plastica elettrone-opaco. Questo metodo può attendibilmente taglio migliaia sezioni ultrasottili26, che non è possibile con il presente metodo. Inoltre, blocco seriale viso (SBF) 27 e focus fascio ionico (FIB)-SEM28 vengono utilizzati per raccogliere informazioni 3D delle cellule e dei tessuti degli animali. In questi metodi, il sezionamento con un fascio di ioni diamante coltello o messa a fuoco è integrato all'interno il microscopio SEM e svolte in modo completamente automatico che non richiede alcuna tecnica speciale. Anche se questi metodi sono utili, l'apparato è così costoso che non molte istituzioni acquistare queste macchine. Inoltre, poiché questi metodi impiegano SEM a sezioni di fotografia, risoluzione delle micrografie è inferiore per il presente metodo che utilizza la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Questi metodi non possono risolvere il ribosoma singole particelle, microtubuli, microfilamenti e fibre di DNA al momento.
Per analisi structome dei microrganismi e per lo studio ultrastrutturale di microrganismi sconosciuti, è necessario osservare le cellule e componenti cellulari come la membrana plasmatica, parete cellulare, reticolo endoplasmatico, mitocondri, nucleo, membrane nucleari cloroplasti, plastidi, apparato del Golgi, ribosomi e filamentosi elementi ad alta risoluzione. Osservazione di TEM di sezioni ultrasottili seriale è uno dei pochi metodi per rendere tali analisi possibile in tre dimensioni. Perché sezioni ultrasottili rimangono dopo l'osservazione in questo metodo, la stessa area può essere osservata ripetutamente; Questo non è possibile in SBF o FIB-SEM, poiché la zona osservata è persa dopo l'osservazione. Questa caratteristica è importante per studiare i microrganismi d'altura dove è necessario cercare organismi interessanti a basso ingrandimento prima e poi scattare foto in serie sull'organismo bersaglio ad alto ingrandimento.
In conclusione, metodo di sezionamento ultrasottile seriale può ora essere eseguita in modo facile, poco costoso, e relaible modo dallo studio presente, che è essenziale per ultrastructual 3D Studio di microrganismi ad alta risoluzione in microscopia elettronica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo sinceramente Shigeo Kita per i suoi preziosi suggerimenti e discussione. Ringraziamo anche John e Sumire Eckstein per loro lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
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