Summary
Este estudio presenta procedimientos confiables y fáciles para la obtención de secciones ultrafinas seriales de un microorganismo sin equipo costoso en microscopía electrónica de transmisión.
Abstract
Observación de células y componentes de la célula en tres dimensiones en el gran aumento en microscopía electrónica de transmisión requiere la preparación de secciones ultrafinas seriales de la muestra. Aunque la preparación de secciones ultrafinas seriales es considerado como muy difícil, es bastante fácil si se utiliza el método apropiado. En este documento, se muestra un procedimiento paso a paso para la obtención segura de las secciones ultrafinas seriales de microorganismos. Los puntos claves de este método son: 1) a utilizar gran parte de la muestra y ajustar el borde de la superficie y cuchillo de muestra para que sean paralelas entre sí; 2) para cortar secciones seriales en grupos y evitar dificultades en la separación de las secciones con un par de mechones de pelo al recuperar un grupo de secciones seriadas en las rejillas de ranura; 3) usar un 'lazo de retención de sección' y evitar mezclar el orden de los grupos de sección; 4) para utilizar un bucle de aumento de superficie de agua y asegúrese de que las secciones se colocan en el ápice del agua y que tocan la red en primer lugar, con el fin de colocarlos en la posición deseada sobre las rejillas; 5) para utilizar la película de soporte en un bastidor de aluminio y que sea más fácil recuperar las secciones en las rejillas y evitar el arrugamiento de la película de soporte; y 6) a utilizar un tubo de coloración y evitar romper accidentalmente las películas de soporte con las pinzas. Este nuevo método permite obtener secciones seriadas ultrafinas sin dificultad. El método permite analizar las estructuras celulares de los microorganismos en alta resolución en 3D, que no puede lograrse mediante el método automático de recogida de cinta ultramicrótomo y serie bloque-cara o viga de ion enfocada microscopía electrónica de barrido.
Introduction
Técnica de seccionamiento ultrafina serie adecuada es indispensable para el estudio de las células y los componentes de la célula tridimensionalmente en el nivel microscópico de electrones. Hemos estudiado la dinámica del cuerpo de polo del huso en el ciclo celular de las células de levadura y reveló cambios morfológicos de su ultraestructura durante el ciclo celular y el tiempo de duplicación1,2,3, 4,5. En 2006, acuñó una nueva palabra 'structome' mediante la combinación de 'estructura' y '-ome' y se define como la 'información cuantitativa y tridimensional estructural de una célula entera en el nivel microscópico de electrones' 6,7.
Por el análisis de structome, que requiere técnica de seccionamiento ultrafino serial, se encontró que una célula de levadura de Saccharomyces cerevisiae y Exophiala dermatitidis tenía unos 200.000 ribosomas7,8, un Escherichia coli celular tenía 26.000 ribosomas9, un celular de la Mycobacterium tuberculosis tenía 1.700 ribosomas10 y bacterias en espiral Myojin tenían los ribosomas sólo 30011. Esta información es útil en la estimación no solo de la tasa de crecimiento en cada organismo, pero también en la identificación de especies9.
Además, structome análisis conducido al descubrimiento de un nuevo organismo; Parakaryon myojinensis fue encontrado en el mar frente a las costa de Japón, cuya estructura de la célula fueron un intermedio entre los de procariotas y eucariotas,12,13,14,15. En la actualidad, serie técnica de seccionamiento ultrafino se considera tan difícil que tomaría mucho tiempo al maestro. En este estudio, hemos desarrollado un método fiable en la que cualquiera puede realizar seccionamiento ultrafino serial sin dificultad.
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Protocol
Nota: Los especímenes utilizados en este estudio fueron microorganismos, propano rápidamente congelados en nitrógeno líquido, congelarán substituido en acetona que contiene tetróxido de osmio 2% y embebidos en resina epoxy1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. preparación de película de soporte (figura 1-3)
Nota: Película de soporte Formvar color plateado está preparada usando el método de fundición en vidrio19.
- Añadir 100 mL de 1,5% Formvar en dicloruro de etileno a un aparato de fabricación de Formvar (figura 1). Sumerja la mitad de un portaobjetos de cristal (76 x 26 x 1,3 mm) en la solución de Formvar en la columna superior del aparato presionando la solución con el aire a través de la 'a' usando una bola de caucho19.
- Vaciar la solución de la columna abriendo la llave de tres vías y liberación de aire a través de 'b' para reducir la presión. Sacar el portaobjetos de cristal del aparato y se secan en el aire para formar una película en la superficie de lo portaobjetos de vidrio. Usar una lámpara incandescente para acelerar el secado de la película de Formvar.
- Después de raspar de los cuatro bordes de la película en la diapositiva de cristal con una cuchilla de afeitar (Figura 2a) y la respiración sobre el portaobjetos para facilitar la separación de la película de la diapositiva20, flotan de la película de agua sumergiendo el portaobjeto en el agua lentamente en un ángulo horizontal baja (aproximadamente 10°, figura 2b).
- Sacar con pala encima de la película de Formvar del agua usando un bastidor de aluminio (30 x 25 x 3 mm) con agujeros (4 mm de diámetro) (figura 3a). No la rejilla con la película de Formvar en un desecador hasta su uso (figura 3b).
2. Ajuste el bloque de muestra con una cuchilla de ultrasonidos y una hoja de afeitar 21 bajo un estereomicroscopio (figura 4)
- Asegúrese de que hay células en la superficie del bloque mediante la observación de la punta del bloque con un microscopio de luz (figura 4a).
- Montar el bloque de muestra en el plato (soporte del bloque) y el mandril en un recorte etapa21 (Figura 4b). Esta etapa de recorte tiene un mecanismo de iluminación de la parte posterior de la muestra.
- Cortar el bloque a un tamaño de 0,7 x 1,0 mm (figuras 4C, 5D). Puesto que la resina de epoxy es muy dura, cortar los bloques primero usando una cuchilla cortadora ultrasónica. La cuchilla cortadora ultrasónica es una máquina recientemente introducida, y los bloques se recortan fácilmente. Luego cortar el bloque de más con una cuchilla de afeitar. Corte un hombro para marcar la dirección del corte (ver Figura 5D, figura 8).
3. Ajuste el bloque de muestras con cuchilla de diamante utilizando el micrótomo (figura 5)
- Establecer el bloque muestra tirada en el soporte de espécimen de la ultramicrotomía. Coloque la muestra 90° hacia la izquierda contra la posición actual cuando el seccionamiento ultrafino serial es realizado (ver Figura 5D).
- Cortar la superficie del bloque con un cuchillo de corte de diamante (ver Figura 5D). Ajuste el borde del cuchillo de diamante paralelo a la cara del bloque de muestra y corte la cantidad mínima de superficie de la muestra para no perder a ningún espécimen (Figura 5D).
Nota: Este paso se hace para suavizar la superficie de la muestra. La parte de la superficie de la muestra de la parte delgada queda intacta (por lo tanto, esta parte no es brillante como un espejo, Figura 5D), para que no se pierde ninguna parte de la muestra para el seccionamiento serial. Esto es porque la muestra es expuesta en la superficie del bloque. - Coloque un espejo (corte de Mesa, M) en el escenario de cuchillo para controlar el corte del bloque del espécimen (figura 5C).
- Corte el borde izquierdo (esto se convierte en la parte superior, figura 5 d, de la muestra en el seccionamiento serial) del bloque usando el cuchillo de cortar girando la etapa cuchillo 30 ° a la izquierda (figura 5a).
- Cortar la cara del bloque en cerca de 100 μm desde el borde izquierdo de la muestra (esto se convierte en la parte inferior de la muestra en el seccionamiento serial, figura 5 d) girando la etapa cuchillo 30 ° a la derecha (figura 5b).
Nota: Las secciones seriales serán cortadas de la parte delgada de la muestra de cerca de 90 nm x 1 mm de tamaño. La mayor parte se utilizará para ajustar la superficie de la muestra y el borde de cuchillo que son paralelas. Después de ajustar la superficie de la muestra para ser paralela al borde de cuchillo, se eliminará la mayor parte con una cuchilla de afeitar. Cortando los lados superiores e inferiores de la muestra con el microtomo, ambos lados de la muestra se convierten en suave y exactamente paralelas entre sí (Figura 5D), que es necesario para tener secciones rectas e ininterrumpidas de la cinta.
4. Ajuste el borde de la superficie y cuchillo de muestra para que corren paralelo a 21
- Quitar la cuchilla de corte y gire el bloque de la muestra 90° hacia la derecha.
- Establezca una cuchilla de seccionamiento ultrafino en la etapa de cuchillo.
- Ajustar la superficie de la muestra y el filo para que corren paralelo con gran parte de la superficie del espécimen.
Nota: Gran parte de la muestra se utiliza para el ajuste porque la cara de corte de seccionamiento serial es tan pequeña, lo que dificulta ajustar el espécimen de la superficie y cuchillo el borde usando esta parte solamente, sobre todo en dirección vertical. Así, utilizando gran parte de la pieza facilita el ajuste.
5. difundir la solución de neopreno en el bloque de la muestra (figura 6)
- Para colocar el portabrocas del espécimen en exactamente la misma posición como la posición original, aplique la cinta en el mandril y el mandril del microtomo y corte en el límite (Figura 6a).
- Sacar a la muestra de tirada del microtomo y se coloca bajo el estereomicroscopio (figura 6b). Cortar la parte grande de la muestra con una cuchilla de afeitar, dejando la parte delgada, de la cual se obtendrán las secciones seriales.
- Utilizando una pipeta Pasteur, gota de 1 μl 0.5% neopreno solución (figura 6b) en la muestra a utilizarse para seccionamiento serial, para hacer el pegamento de lados de la sección. Cubrir a la muestra entera con solución de neopreno. Absorba la solución de neopreno exceso inmediatamente con un pedazo de papel de filtro colocado cerca de la muestra. Una cinta de las secciones es esencial para tomar fotografías de las secciones de la serie de la célula, y pegamento de neopreno es muy útil para pegar las secciones juntas.
- Preparar rejillas de ranura 3 (tamaños de ranuras: medio, 0,4 mm x 2,2 mm, ambos lados 0,2 mm x 2,2 mm) (figura 6 c) para recoger las secciones seriales doblando el mango de las rejillas a 60 °, tratamiento de las rejillas con solución de neopreno de 0,5% y haciendo hidrofílica de las rejillas resplandor descarga22.
6. hacer las secciones seriales (figura 7-9)
- Lugar el bloque de muestra de la tirada en el micrótomo en la misma posición como 5.1 (Figura 6a) alineando las piezas con cinta. Esto mantiene la cara del bloque y el borde de cuchillo perfectamente paralelos entre sí. A continuación, llevar el cuchillo cerca de la muestra.
- Llene el bote de cuchillo con agua.
- Cubra el micrótomo con un plástico para prevenir el flujo de aire (figura 7).
Nota: Flujo de aire durante el seccionamiento ultrafino y la recuperación de las secciones a menudo causa problemas. La tapa de plástico tiene tres agujeros: un agujero es para las lentes de binoculares, y son los otros dos agujeros para que los brazos permitir la operación mientras que la cubierta es en. Los apoyabrazos de madera se utilizan para la colocación de los brazos mientras hacía trabajos delicados, como recuperar las secciones seriales con rejillas. Los apoyabrazos de madera se colocan en diferentes tablas de la mesa del micrótomo (figura 7, flechas), para no transmitir la vibración de las manos del operador para el micrótomo. - Empiece a cortar al espécimen en el espesor de sección de 200 nm (figura 8). Ajuste de grosor de nm 200 ahorrará tiempo en llevar el cuchillo a la superficie de la muestra.
- Después de la primera sección, se establece el espesor de la sección a 70 nm (figura 8).
- Cuando el número de secciones seriadas alcanza 20 (precisamente hablando, después de los tramos de cinta aproximadamente 1.8 mm; el número de secciones varía dependiendo del ancho de las secciones), el espesor de la sección a 10 nm (figura 8) sin dejar de cortar.
Nota: Puesto que el micrótomo no puede cortar 10 nm de espesor secciones, ninguna nueva sección aparece, y se separan las secciones anteriormente cortadas desde el borde de cuchillo. Es importante que los grupos separados de la sección (figura 9) para que levantar secciones seriadas evitar dificultades en la separación de secciones manualmente usando un par de filamentos del pelo. Desde el campo de visión en el microscopio electrónico de transmisión es de 2,0 mm, secciones deberían ser 1,8 mm de largo como máximo. - Ajustar el espesor de la sección a 60 nm (figura 8). Esto producirá 70 secciones de nm (figura 8) porque la máquina añadir el grueso de nm 10 anterior.
- Ajustar el espesor de la sección a 70 nm (figura 8) y corte hasta que se obtienen secciones de 1.8 mm de longitud.
- Repita 6.6-6.8 hasta cinco secciones largas de 1,8 mm se obtienen (figura 9). Generalmente hacemos cinco grupos de sección ya que hay cinco sostenedores del espécimen en el microscopio electrónico de transmisión disponibles en nuestro laboratorio, pero cinco no es el límite.
7. recoger las secciones seriales (figura 10-12)
- Colocar el 'lazo de retención de sección'23 (diámetro interior del bucle: 5.0 mm) (figura 10a) en el tercer grupo de la sección (figura 10b).
Nota: Es necesario recuperar las secciones en el orden de sus secciones para tomar fotos en el orden adecuado. Sin embargo, puesto que hay cinco grupos de sección en el barco de cuchillo, lo a menudo obtiene confusos que los grupos que son. Colocando el lazo sobre el tercer grupo, está claro que los dos grupos cerca del operador son la primera y segunda y los dos distantes del operador son los grupos cuarto y quinto (figura 10b). Esto evitará que el orden de mezcla. - Lugar de 'bucle de agua superficie de sensibilización'23 (WSRL, diámetro interno del lazo: 4.0m m) (figura 11a) en la etapa de cuchillo (Figura 11b). El WSRL estará firmemente en la escena del cuchillo ya que está equipada con un imán en la parte inferior.
- Coloque el lazo de la WSRL justo por encima de las secciones seriadas mediante el movimiento de su eje y manija. Baje el lazo de la WSRL sobre la superficie del agua para que el lazo rodea las secciones.
- Empuje el bucle girando el tornillo hacia abajo para que la superficie del agua se eleve por tensión superficial (figuras c 11-d). Mover la sección hasta el centro del lazo, colóquelo sobre el vértice del agua y ajuste la dirección de la sección utilizando un filamento de cabello21.
- Recoger grupos de sección al tocarla con una cuadrícula de raja pelada, que es sostenida por pinzas y se mantiene paralela a la superficie del agua (figura 11 d). Es importante para las secciones tocar la red en primer lugar, no el agua, colocar las secciones precisamente en el centro de la cuadrícula (figura 11 d).
- Coloque las rejillas con secciones junto con una pequeña gota de agua en la de película de Formvar en apoyo16 (figura 12) y quite el exceso de agua utilizando papel de filtro.
Nota: Arrugamiento de la película de soporte suele ser un problema cuando las secciones son recogidas con una red de película de soporte porque la membrana (secciones) abarca (película de soporte) la membrana directamente. El problema de obtener las arrugas en la película de soporte se reduce significativamente mediante la colocación de una rejilla de sección de rodamiento junto con una gota de agua el de película de Formvar apoyo16.
8. tinción de secciones16,24 (figura 13)
- Después de las secciones están completamente secas, rasgar la película de Formvar desde alrededor de las rejillas y sacar las rejillas con las secciones.
- Las rejillas en la ranura del tubo tinción16 en el orden adecuado (figura 13) y mancha secciones con uranilo acetato y plomo citrato24.
Nota: Hay una ranura 0,6 mm de profundidad en el eje largo del tubo de corte con una cuchilla de afeitar. El tubo es útil para evitar la rotura accidental de las películas de soporte al utilizar pinzas, ya que la manipulación directa de las redes no es necesario durante el proceso de tinción y lavado16.
9. observación de secciones seriadas (figura 14)
- Coloque las 5 rejillas en el soporte de múltiples muestra en el orden adecuado (figura 14a), orientando el eje largo de la ranura de la rejilla perpendicular al eje sostenedor de la muestra. Los mangos (flecha) de las rejillas no debe cortar, porque las 'fijadores de rejilla' no va a tocar las manijas.
- Fijar las rejillas con 'red-fijadores' (figura 14b) e Inserte el soporte de espécimen en el microscopio electrónico de transmisión.
Nota: A menudo es útil tomar imágenes de ampliación baja de todas las secciones de la célula (figura 15) para encontrar interesantes microorganismos o células en buen estado sin contaminación y con buena fijación, antes de tomar fotografías de la célula diana. - Tomar fotografías de las células blanco en todas las secciones de la célula en gran aumento.
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Representative Results
En este protocolo, rejillas de ranura en tres fueron utilizadas para recoger las secciones seriales. Las redes están hechas de níquel o cobre. Las secciones seriales se colocan en la ranura central. Las ranuras en ambos lados son necesarias para ver las secciones al aspirar con la rejilla. Para mantener las rejillas paralelas con secciones seriales al recoger con las pinzas (figura 11 d), el mango se dobla (figura 6 c, derecha). Un pequeño mango es ventajoso para evitar la flexión de la parte principal de la red, que causa graves problemas en escoger encima de las secciones, y para evitar caer las secciones durante la coloración. Esta rejilla tiene ventajas sobre la rejilla de un orificio convencional de 2,0 x 1,0 mm. Es decir, las secciones están soportadas directamente por dos barras metálicas separada 0,4 mm (menor de 1,0 mm) y por la película de soporte Formvar en una cuadrícula de tres-raja, mientras que las secciones sólo son compatibles con la película de soporte en una cuadrícula un orificio convencional. Deriva de la muestra por lo tanto, puede prevenirse en fotografiar a alta magnificación usando una cuadrícula de tres rendijas.
La figura 15 muestra una vista de ampliación baja de cinco redes que llevan las secciones seriales. Puesto que cada sección se pega junto, es fácil encontrar la misma celda en la siguiente sección incluso a mayor aumento. Figura 16 y 17 son ejemplos de imágenes seriales de las secciones de la célula. Porque las secciones son firmemente apoyadas en rejillas de ranura 3, fotos en magnificación de alta (x 50,000) fácilmente se toman sin deriva del espécimen. Las fibras de ADN 2 nm de diámetro fueron fotografiadas en estos estudios9,12.
Figura 1 . Aparatos de cinematografía soporte Formvar. La mitad de la diapositiva de cristal se sumerge en la solución de Formvar en la columna superior del aparato presionando la solución con el aire a través de la 'a' usando una pelota de goma. La solución se escurre de la columna, abriendo la llave de tres vías y liberación de aire a través de 'b' para reducir la presión. (Reproducido de Yamaguchi y Adachi, 201119 con permiso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Método para la liberación de la película de vidrio Deslice sobre el agua. (a) los cuatro bordes de la película en la diapositiva de cristal se raspan apagado usando la cuchilla de afeitar. (b) película de Formvar es flotada apagado en el agua bajando el portaobjetos de cristal lentamente en un ángulo bajo. (Reproducido de Yamaguchi y Adachi, 201119 con permiso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Película de soporte Formvar en un bastidor de aluminio. (a) la película de Formvar es sacado con pala para arriba del agua con un bastidor de aluminio. (b) la parrilla se mantiene en el desecador hasta su uso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Corte del bloque de muestras con una cuchilla de ultrasonidos y una hoja de afeitar bajo un estereomicroscopio. (a) la presencia de la muestra se confirma al observar el bloque de muestra bajo un microscopio de luz. El bloque se muestra en los microorganismos figura figura asociados a un chaeta escala-gusano (alrededor de 1,7 mm de longitud) de la alta mar12,14. (b) ajuste fase. (c) toda la imagen de un estereomicroscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Ajuste del bloque de muestras con cuchilla de diamante usando a micrótomo. (a) ilustración para cortar el borde izquierdo. (b) la cara del bloque se corta en una posición de aproximadamente 100 nm del borde izquierdo de la muestra. (c) un espejo (corte de Mesa, M) colocado en la escena del cuchillo. (d) superficie de la muestra. Tenga en cuenta que la parte superior y la parte inferior de la parte delgada son lisos y perfectamente paralelos. También tenga en cuenta que la paletilla para marcar la dirección del corte (ver figura 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Tratamiento de neopreno en la superficie de la muestra. (a) para colocar el portabrocas del espécimen en exactamente la posición original, el mandril y el mandril del microtoma son marcados con una cinta y corte en el límite. (b) humedecer a la muestra con solución de neopreno con pipeta Pasteur. (c) hendidura de tres rejillas para recoger las secciones seriales. El mango está doblado a 60 grados (c, derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 . Cubierta de plástico del microtomo y apoyabrazos de madera. La tapa de plástico es útil para prevenir el flujo de aire durante el seccionamiento ultrafino. Los apoyabrazos de madera se utilizan para hacer trabajos delicados como recuperar secciones seriales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 . Ajuste grueso de la sección y la obtención de secciones en el grosor adecuado. Después de que el número de secciones seriadas ha alcanzado 20, grosor de sección se establece en 10 nm. El micrótomo no puede cortar 10 nm de espesor secciones, no nueva sección aparece y se separan las secciones anteriormente cortadas desde el borde de cuchillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9 . Ejemplo de secciones ultrafinas obtenidos mediante el protocolo de. Tenga en cuenta que los cinco grupos de secciones seriadas de 1,8 mm de largo ya son separados después del corte. En este caso, el color del centro de las secciones ultrafinas es amarillento debido a la presencia de la muestra. Las otras partes de la sección, que no contienen a la muestra y consisten en resina solamente, son de plata en color. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10 . 'Sección de retención lazo'. (a) vista superior (parte superior) y vista inferior (parte inferior de la foto) del bucle. (b) el lazo de retención de sección se utiliza para contener el tercer grupo de secciones seriadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11 . Obtención de secciones seriadas. (a) ' bucle de aumento de superficie de agua' (WSRL). La manija del lazo se puede quitar el eje, que es movible. El bucle también se puede mover arriba y abajo girando el tornillo superior. (b) el WSRL se fija en la etapa de cuchillo por un imán. (c) vista más cercana (b). (d) diagrama del lazo, superficie del agua, las secciones y rejilla durante la recuperación (vista lateral). Secciones ultrafinas pueden recuperar precisamente a la rejilla de corte reduciendo el paralelo red desnudo a las secciones ultrafinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12 . Colocar la rejilla en la película de Formvar. La rejilla que sostiene las secciones se coloca junto con una pequeña gota de agua en la película de Formvar sobre aluminio de bastidor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13 . Tubo de coloración16. Se hace una ranura 0,6 mm de profundidad a lo largo del eje largo con una cuchilla de afeitar. Las rejillas se colocan en la ranura en el orden adecuado. Uno de los extremos del tubo se corta (cabeza de flecha) para señalar su dirección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 14 . Colocar las rejillas en las mordazas. (a) las rejillas se colocan en el porta muestras en el orden adecuado. (b) las rejillas son entonces fijadas con el 'red-fijadores'. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 15 . Las secciones seriales montan en rejillas de ranura. La figura muestra secciones de 18 a 25, montadas sobre una rejilla. Los números en cada ranura indican el comienzo de número de secuencia de la primera sección. La primera sección es más gruesa que los demás (ver figura 8). Tenga en cuenta que las secciones están conectadas juntos y tienen el mismo grosor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 16 . Las secciones seriales de Parakaryon myojinensis12. Los números en la parte inferior izquierda indican la secuencia en relación con la primera sección. La figura muestra a 12 de 67 secciones completas. Esta celda fue encontrada para tener un gran nucleoide compuesto por fibras de ADN desnudas, con un solo nucleoide membrana y endosimbiontes que se asemejan a las bacterias, pero no mitocondrias. Así, este organismo parece ser una forma de vida intermedia, evolución de la célula procariota a eukaryote12. N, nucleoide. Reproducido de Yamaguchi y Worman, 2014. 14 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 17 . Las secciones seriales de Escherichia coli9. Los números en la parte inferior izquierda indican la secuencia en relación con la primera sección. La figura muestra 12 secciones completas. Esta celda fue encontrada para contener ribosomas 21.7009. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método presentado aquí no requiere de costoso equipo. Requiere sólo un bastidor de aluminio (figura 3), hendidura de tres rejillas (figura 6 c), sección explotación bucles (figura 10a), lazo de aumento de superficie de agua (figura 11a) y un tubo de tinción (figura 13). Hay muchas características del método actual. Gran parte de la muestra se utiliza para ajustar el borde de la superficie y cuchillo de muestra para que corren paralelo a uno al otro. Se cortan secciones seriales en grupos para evitar dificultad en separar secciones usando un par de mechones de pelo al recuperar un grupo de secciones seriadas en las rejillas de ranura. Un 'lazo de retención de sección' se utiliza para evitar mezclar el orden de los grupos de sección. Un bucle de agua superficie de sensibilización se utiliza para asegurarse de que las secciones se colocan en el ápice del agua y que tocan la red en primer lugar, con el fin de colocarlos en la posición deseada en las rejillas. Película de soporte Formvar en un bastidor de aluminio se utiliza para hacer más fácil para recuperar las secciones en las rejillas y evitar las arrugas de la película de soporte. Un tubo de coloración se utiliza para evitar accidentalmente romper las películas de soporte con las pinzas.
Recientemente, un ultramicrótomo recogida de cinta automática fue desarrollado25 para recoger secciones automáticamente para microscopía electrónica de barrido (SEM) proyección de imagen en cintas de plástico opaco de electrón. Este método puede confiablemente corte miles de secciones ultrafinas26, que no es posible por el presente método. También, serie bloque cara (SBF) 27 y enfoque viga de ion (FIB)-SEM28 se utilizan para recoger información 3D de las células y los tejidos de los animales. En estos métodos, el seccionamiento con una viga de ion diamante cuchillo o foco se integra dentro del microscopio SEM y llevado a cabo de manera completamente automática que no requiere técnicas especiales de. Aunque estos métodos son útiles, el aparato es tan caro que no muchas instituciones compran estas máquinas. También, puesto que estos métodos emplean SEM a las secciones de fotografía, resolución de las imágenes es inferior para el presente método que emplea la microscopía electrónica de transmisión (TEM). Estos métodos no pueden resolver las partículas individuales del ribosoma, microtúbulos, microfilamentos y fibras de ADN en la actualidad.
Para el análisis de structome de microorganismos y para el estudio ultraestructural de microorganismos desconocidos, es necesario observar las células y los componentes de la célula tales como pared celular, membrana plasmática, mitocondrias, núcleo, membranas nucleares, retículo endoplásmico, cloroplastos, plastidios, aparato de Golgi, ribosomas y elementos filamentosos en alta resolución. Observación de TEM de secciones ultrafinas seriales es uno de los pocos métodos que permiten dicho análisis en tres dimensiones. Porque las secciones ultrafinas permanecen después de la observación en este método, la misma zona se observan repetidamente; Esto no es posible en SBF o FIB-SEM, puesto que el área observado se pierde después de la observación. Esta característica es importante para el estudio de microorganismos de aguas profundas donde es necesario buscar interesantes organismos en ampliación baja primero, y luego tomar fotografías en serie sobre el organismo de destino en gran aumento.
En conclusión, método de seccionamiento ultrafino serial puede ahora realizarse de una forma fácil, barata y relaible manera por el presente estudio, que es imprescindible para ultrastructual 3D estudio de microorganismos en la microscopia electrónica de alta resolución.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente a Shigeo Kita por sus valiosas sugerencias y discusión. También agradecemos a John y Sumire Eckstein para su lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar making apparatus | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| Glass slide | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| Aluminum rack with 4-mm holes | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| Trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic trimming blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Diamond knife for trimming | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Diamond knife for ultrathin sectioning | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| Mesa cut | Leica Microsystems, Vienna | - | Mirror |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Special 3-slit nickel grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | Refer to this paper |
| Special 3-slit copper grid | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | Refer to this paper |
| Section-holding loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | Refer to this paper |
| Water-surface-raising loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | Refer to this paper |
| Staining tube | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this paper |
| Multi-specimen holder | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | Transmission electron microscope |
References
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