Summary
この資料では、プラズマまたは哺乳類細胞における地上州枯渇 (GSD) 超解像顕微鏡法を用いた細胞膜タンパク質の検出のためのプロトコルについて説明します。ここでは、我々 は利点およびそのようなアプローチを使用して可視化と細胞蛋白質の定量化のための考慮事項について説明します。
Abstract
強化に、蛍光顕微鏡、細胞生物学の進歩が密接に関連付けられる方法の私達の理解の劇的な飛躍につながる携帯電話のイベントを視覚化する機能細胞機能。超解像顕微鏡法の普及や開発がかなり ~ 250 20 から光学分解能の限界を拡張 nm。生物学者は、もはや回折限界領域内の共存の観点から分子間相互作用を記述する限られた、むしろそれは個々 の分子の動的な相互作用を視覚化することが可能です今。ここでは、我々 は固定細胞イメージングのための地上州枯渇顕微鏡による可視化と細胞蛋白質の定量化のプロトコルを概説します。我々 は 2 つの異なる膜タンパク質は、小胞体トランスロコン、sec61β、および細胞膜局在電位依存性 L 型 Ca2 +チャネル (CaV1.2) 要素からの例を提供します。議論は、特定の顕微鏡のパラメーター、固定方法、光スイッチング バッファーの定式化と落とし穴と画像処理の課題。
Introduction
細胞内シグナル伝達反応は、細胞応答を開始する内部および外部環境の変化を変換します。彼らは、ホルモン、伝達物質の放出、ハートビート、ビジョン、受精、そして認知機能のための基礎として、人間の生理機能のすべての側面を調節します。これらのシグナル伝達カスケードの混乱は、がん、パーキンソン病、アルツハイマー病などの病態生理学的条件の形で深刻な影響を持つことができます。何十年も、生物的および医学研究者使用している正常に蛍光蛋白質、プローブ、およびプライマリ ツールとして蛍光顕微鏡と相まってバイオ センサー細胞のこれらの精密な時空構造を理解するには通知します。
落射蛍光、共焦点、または内部全反射 (TIRF) 蛍光顕微鏡などの光学技術の強みは、その感度、速度、および生細胞イメージング、主要な制限は、互換性の回折限界解像度、意味構造または 200-250 nm より小さい蛋白質の複合体を解決できません。確定的な超解像の理論と実践の開発 (例えば、誘導放出の枯渇顕微鏡 (STED1) 構造化照明顕微鏡を用いて (SIM2) または確率超解像 (など、センサー局在基底状態や顕微鏡 (パーム3) 枯渇 (GSD4,5))、蛍光顕微鏡で曲げ・軸方向の解像度は、のために回折の障壁を超えて拡張されています。数十ナノメートル。したがって、調査官は今、視覚化し、タンパク質のダイナミクスと組織に近く分子レベルで関数に変換する方法を理解する比類のない能力を持っています。
知られているでは基底状態の枯渇顕微鏡戻り個々 の分子が続く (GSDIM) または単に GSD、fluorophores が付いて4,5を同時に発光の数を減らすことによって回折限界を回避します。高エネルギー レーザー光を使用して、励起蛍光ラベル サンプル、光子と電子の砲撃と確率 'スピン反転' を受ける、4励起状態から三重項または '暗状態' を入力します。これは効果的に基底状態を使い果たす、それ故に名前「地上州枯渇'。三重項状態のフルオロは光子を放出しないし、サンプルが暗く表示されます。ただし、これら fluorophores が付いては確率的基底状態に戻り、三重項状態に戻る前に地上へ励起状態の遷移を発光いくつかの光子を行くことができます。以下の同時発光任意の時点で、フォトン バースト個々 fluorophores が付いて fluorophores の近隣から時空間明確化から作成されます。光子のバーストは、ガウス関数の場合、定位精度に使用される光の波長、レンズの開口 (数 NA) に依存するいると蛍光体の位置に対応する計算された重心と合うことが励起と重大、fluorophore あたりのフォトンの数です。GSD の制限の 1 つは、fluorophores のサブセットのみをいつでも積極的に出力するので画像の数千人は、完全なローカリゼーション マップを作成するのに数分以上収集する必要があります。高レーザー電源要件と組み合わせて長い集録時間は、GSD ライブ サンプルではなく固定に適して ことを意味します。
この資料では、超解像顕微鏡イメージング膜と小胞体 (ER) のため固定サンプルの準備を記述する-(必要な消耗品や試薬を参照テーブルの材料のリスト) の居住者のタンパク質。このプロトコルことができます簡単に適応サイズと L 型電位依存性 Ca2 +チャネル (Cav1.2) 心臓 myocytes のモルモットでのクラスタ リングの程度を定量化するまたは、小胞体の細胞の分布を視覚化するために使用する方法の例示されています。分布とこれらの細胞成分の組織を理解することが開始、翻訳、および最終的に多く Ca2 +の機能を理解する上で非常に重要な-依存シグナル伝達カスケード。たとえば、Cav1.2 チャネル、興奮収縮連関、受容体を介した小胞体から Ca2 +放出はおそらく哺乳類細胞で最もユビキタス シグナル伝達カスケードの根本的に重要です。
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Protocol
1。 洗浄ガラス Coverslips
- サンプル処理の前に一日 1 h のコの 1 M 溶液で sonicating によって #1.5 ガラス coverslips をきれい。これは、coverslips に存在する任意の蛍光汚染物質を削除します。
- 脱イオン水で coverslips から島を徹底的にすすいでください 。
- 島で洗浄、一度、70% エタノールを使用する準備ができるまで、coverslips を格納します 。
2。コーティング ガラス Coverslips
注: 汚染を防ぐ細胞文化フードではこのセクションの手順を実行します
。- 70% エタノール溶液から個々 の coverslip を削除する鉗子を使用し、過剰を削除する炎の迅速。場所 6 ウェル プレートに coverslips。文化フードで炎のオプションは、場合は、オートクレーブ、coverslips 少なくとも 30 分のための文化フードに紫外線の下で滅菌および/または脱イオン水で洗浄した後
- 細胞の接着性を支援するためにコート無菌 0.01% ポリ-L-リジンの室温で 1 時間 coverslips 。
- は、ポリ-L-リジンを吸引し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で coverslips をすすいでください。空気が乾燥し、冷蔵庫で一晩します 。
- 次の朝、冷蔵庫から、coverslips を削除、少なくとも 30 分間室温を 50 μ g/mL の濃度でラミニンの 300 μ L を追加します。ラミニンが慎重に、coverslip の上に直接配置されていることを確認します
。 注: このラミニン手順は、COS 7 細胞や HEK293 細胞の必要はありませんが、心室筋細胞の分離に必要な。他細胞血管平滑筋細胞や神経細胞が付着などより良いコラーゲンとフィブロネクチン コーティング coverslips 。
3。細胞の調製
10 mL ダルベッコの 10 cm 培養皿に- の 培養細胞 成長 COS 7 細胞 (または最寄りのセルライン) ' s 1% 10% 牛胎児血清 (FBS) と変更されたワシ媒体 (DMEM) 文化培ペニシリン/ストレプトマイシン (PS) ソリューション。37 ° C および 5% の CO 2 の携帯文化のインキュベーターで細胞を成長します 。
- 、電池が 90% の confluency に達するときは、DMEM メディアを吸引し、0.05% トリプシン グリコールエーテルジアミン四酢酸溶液 5 mL を追加して 10 cm 皿からそれらを収穫します。一度セルを切り上げるし、デタッチを開始、すぐに補われた DMEM にトリプシンを中和します。
- 用 5 mL 血清ピペットお皿からセルを削除します。残っているセルを削除する皿の基地に対して媒体の数回をピペット付着して培養液中の細胞をゆく配布 。
- Transfection のための 70% の confluency を達成するために 35 mm の培養皿上に細胞をプレートします。皿の中のボリュームを作る 2 mL まで新鮮な DMEM/国債/PS ソリューションと 。
- 目的プラスミド DNA transfect COS 7 細胞構成要素 (例えば、sec61β mCherry プラスミド)、適切なトランスフェクション試薬を使用し、メーカーによると、' の指示
。 注: プラスミッドおよび/または使用されるトランスフェクション試薬によって表現する蛋白質の 24-48 時間かかる場合があります 。
- アダルト マウス心室筋細胞
- 老舗蛍光灌流方法 6 を使用してアダルト マウス心室筋細胞を分離します。中 199 (M199) PS の 2.5 %fbs と 1% 添加で細胞の結果として得られるペレットを再停止
4。めっきセル
- トランスフェクション COS 7 細胞
- 35 mm ディッシュから解決を DMEM/国債/PS 2 mL を吸引し、Ca 2 + 1 つの mL を追加-PBS を無料します。皿 2 分のためのインキュベーターに収穫のセルを返すお皿から最初吸引 Ca 2 + によって-無料の PBS、0.05% トリプシン グリコールエーテルジアミン四酢酸溶液 1 mL を追加します。
- セルを切り上げるとデタッチ、すぐに補われた DMEM の 1 mL のトリプシンを中和するために開始します。上下に数回 transfected セルは 2 mL のトリプシン グリコールエーテルジアミン四酢酸 DMEM サスペンション全体均等に配らように優しくピペットします 。
- プレート、単一セル視覚化することができ、料理のボリュームをいっぱいに適切な密度でポリ L リジン被覆カバーガラス上 COS 7 細胞を導入した DMEM/国債/ps 2 mL まで (例えば、90 μ L 細胞懸濁液を加える、coverslip1,910 μ L 添加 DMEM を追加し、セルを均等に皿を旋回).
注: セルはカウントする必要はありませんが、それぞれの料理に追加するセルのボリュームは、細胞の密度によって異なります 。
- リターン メッキ細胞細胞が接着し、回復できるようにセルの文化インキュベーターを一晩にします 。
- 35 mm ディッシュから解決を DMEM/国債/PS 2 mL を吸引し、Ca 2 + 1 つの mL を追加-PBS を無料します。皿 2 分のためのインキュベーターに収穫のセルを返すお皿から最初吸引 Ca 2 + によって-無料の PBS、0.05% トリプシン グリコールエーテルジアミン四酢酸溶液 1 mL を追加します。
- アダルト マウス心室筋細胞
- 個々 の細胞を可視化することができますので、適切な密度で被覆カバーガラス上直接ラミニンとプレートの筋細胞を吸引します。これは分離可能な細胞の密度に依存します 。
- Coverslip と接着を許可する ~ 45 分の CO 2 を 37 ° C、5% で細胞文化のインキュベーターで場所にドーム内の細胞懸濁液のバランスをとる 。
5。細胞の固定
- インキュベーターからセルを削除し、慎重に培地を吸引します。
- 付着性のセル PBS で 1 回洗浄.
- 修正プログラム細胞個々 のアプリケーションや抗体に最適化された固定液と
。 注: 定着剤を選択する際に留意すべき重要な基準も興味の抗原の構造変化がないことを確保しつつ、サンプルの細胞構造の保存であります。メタノールの説明このプロトコル固定 3 %paraformaldehyde/0.1% グルタルアルデヒド (PFA/GA) と 100% 固定のため 。
- PFA/GA 固定 transfected COS 7 細胞表現 Sec61β mCherry
- ミックス 1.9 mL 16 %pfa と 20 μ L 50% GA 10 mL の最終的なボリュームに PBS を追加 。
- 追加 1 mL 作りたて PFA/GA 溶液セルと修正の各料理を室温で 10 分間します 。
- PBS で 3 回 PFA/GA とリンスの細胞を吸引します 。
- は、5 回各 5 分間、pbs 付着細胞を洗います。(例えば、1 分あたり 50 サイクル) 適当な速度に設定回転ですべての洗浄手順を実行します 。
- 次に、1 ml の脱イオン水中で水素化ホウ素 0.1% 質量/体積ナトリウムが作りたて無料アルデヒド グループを削減します 。
- リンス細胞の水素化ホウ素ナトリウムとアルコール無料アルデヒドと反応するときにそれが生成するすべてのトレースを削除する PBS の各 5 分の 3 回二度洗いします 。
- アダルト マウス心室筋細胞のメタノール固定
- セルに冷えた 100% メタノール 1 mL を慎重に追加します。6 ウェル プレートを傾けるし、ピペットのメタノール、coverslip に直接ではなく、反対側の壁。傾け、均等に洗浄するメタノールを許可するように水平に戻す 6 ウェル プレート上のセルです。-20 ° C で 5 分間を修正
- PBS で 3 回定着剤とリンスの細胞を吸引します 。
- 5 回の回転で 5 分、pbs 付着細胞を洗うです 。
6。非特異的結合をブロック
- ブロッキング液に室温で 1 時間
- ブロック (材料の表 を参照してください).
注: さまざまなソリューションは 3% ウシ血清アルブミン (BSA) または一次抗体と同じ種から非免疫血清を含む非特異抗体の結合をブロックする使用ことがあります 。
7。検出
- 一次抗体の孵化
- 吸引ブロッキング液。洗っていないまたはリンスします 。
- 準備一次抗体ソリューション次のように (手順 7.1.5 参照): 10 μ G/ml の濃度に一次抗体を希釈 (または製造元 ' 提案された濃度) 抗体培養液 (材料表を参照してください。).この小さなボリュームで、上のバランスをとるし、慎重に上プラスチック パラフィン膜の角を設定します。これにより、coverslip の抗体の少量の広がるして蒸発を 。
- 湿度チャンバー内 6 ウェル プレートを置き、冷蔵庫で一晩インキュベートします 。
- 朝は、湿度チャンバーからセルを削除、慎重に一次抗体溶液を吸引し、カバーガラスの表面から正方形パラフィン映画を削除します 。
- 、PBS で 3 回すすぎ、5 回 5 分間洗浄ウォッシュ ブロック ソリューション (材料の表 を参照してください)、回転子に
。 注: このプロトコルを使用して、次の抗体、抗 RFP マウス抗体画像の 図 2 で表示され、ウサギ ポリクローナル FP1 7 抗-ca V 1.2 抗体 (教授からの贈り物。ヨハネス ・地獄、カリフォルニア大学デービス校) の画像表示される 図 3。湿度チャンバーに関しては、タイト フィットのふた付きプラスチック ランチ ボックス、作品が湿紙タオルが並んでいます。PBS は、しかし、このプロトコル ラベルの特異性を向上させる、洗浄ステップのブロッキング液の希釈を使用してバック グラウンドを低減手順を洗浄に使用する場合があります 。
- 二次抗体の孵化
- 洗浄液を吸引し、抗体培養液 200 μ L の共役二次抗体希釈ソリューション縮尺を追加。パラフィン、coverslip の上に映画の広場を配置 (ステップ 7.1.2 参照).
- 暗闇の中で部屋の温度で 1 時間加温します 。
- 吸引二次抗体と PBS で 3 回すすぎ 。
- ロッカー上で 5 分間 5 回希釈ブロッキング液で細胞を洗うです 。 PBS の 5 分の 3 回洗顔
- .
注: このプロトコルはそれぞれ 図 2 図 3、抗マウス Alexa 647 共役二次抗体と抗家兎 Alexa 647 共役二次抗体の使用を説明します。ラベルの単一蛋白質、Alexa 647 はその高い光子数 (定位精度が向上) と (時間分解能の向上) 低デューティ サイクルにより最寄りの fluorophore 8。Atto や Cy の染料などのような他の多くの蛍光標識二次抗体オプションがあります。デンプシー ら を参照してください。 8 Chozinski ら超解像イメージングのいくつかの同時/染料の適合性の包括的な評価の 9.
8。ポスト固定 (オプションの手順)
- 希釈 50 μ L 50% GA 10 mL の PBS 0.25 %ga の解を得るために。後 10 分間室温でこのソリューションでセルを修正します 。
- PBS で 3 回ローテーター上で 5 分間洗浄します 。
9。試料の保存
- イメージングまでを光から保護するアルミ箔並ぶコンテナーの冷蔵庫 (4 ° C) で試料を保存します 。
- (数ヶ月) までサンプルの長期保存、細菌の増殖を防ぐために 3 mM アジ化ナトリウムを含む PBS で格納します 。
10。GSD 超解像イメージング機能制御バッファー準備
- 酸素清掃準備 ' GLOX ' 次のように解決策:
- 1.5 mL 遠心チューブに 12.5 μ L カタラーゼ (ストック 34 mg/mL)、3.5 mg を追加グルコース酸化酵素と 0.5 μ l 1 M トリス (pH = 8) 49.5 μ L の PBS にします 。
- に簡単にソリューションにコンポーネントを溶解し、4 で 3 分間 20,800 × g で遠心分離渦 ° C
注: 退色に反対する酸素清掃ソリューション GLOX などが発見されています。GLOX は、最大 1 週間冷蔵庫に保管する必要があります。それを使用するたびに遠心分離機の手順を繰り返します 。
- 通り準備のスイッチングを誘発するチオール ソリューション:
- PBS で 100 mM β-mercaptoethylamine (MEA) ソリューションを準備し、pH 8 あるいは使用 β-メルカプトエタノール (βME) の pH を変更します。冷凍庫 (-20 ° C) で 1 週間の検体測定ソリューションを格納します 。
- イメージングの直前に、チオールを追加することによって氷の上最終スイッチング バッファーを準備および酸素ラジカル コンポーネント一緒に。500 μ L の GLOX MEA、50 μ L MEA に 5 μ L GLOX を追加 (pH = 8) と 445 μ L の生理食塩水のバッファー (2.5 mL 1 M トリス pH = 8、29.22 mg (10 mM 最終濃度)、塩化ナトリウム 5 g のグルコースと水 47.5 mL)。また、GLOX βME ソリューションの 5 μ L βME と 490 μ L の生理食塩水バッファーに 5 μ L GLOX を追加します。
- 氷のソリューションを維持、必要に応じてを使用してうつ病スライド ガラスのサンプルをマウントします
。 注: βME や MEA などチオール含有溶液は、Alexa 647 10 などシアニン系の色素または Alexa 568 などキサンテン系色素の光スイッチングを誘発します。MEA は、Alexa 568 または 2 つのタンパク質が Alexa 568 と 647 の両方を利用した二重ラベルをつける方法でイメージを作成するのに対し、βME は Alexa 647 でより良い結果を生成します。バッファーが酸性のため、時間の期間にわたって悪くなります。これはサンプルの平均光子数の削減に します。これを防ぐには、2-3 h または平均光子数の低下または誘導のスイッチングにかかる時間の著しい拡張が観察されるかどうか行った新鮮な光制御バッファーを作成することをお勧めします。最近の記事説明新しいの画像バッファー Ox EA 我々 はまだテストしていないが、報道によると展示安定した pH レベルの数日間とマルチカラー イメージング アプリケーションの 11 の GLOX よりも優れています 。
- 氷のソリューションを維持、必要に応じてを使用してうつ病スライド ガラスのサンプルをマウントします
11。サンプルをマウント
- ラベル付きセル (セクション 1-9 参照) うつ病にマウント coverslips スライド、100 μ L を使用してイメージング バッファーします 。
- は、イメージングのバッファーの急速な酸化を防ぐためにシリコーン接着剤でカバーガラスの端を密封します。イメージ投射、シリコーン接着剤が完全に、coverslip を硬化以外まで数分待つがドリフトします
。 注: βME が接触する場合、シリコーン接着剤は硬化せず。シリコーン接着剤がイメージングのバッファーに連絡するを防ぐためにカバーガラスの端を乾燥してください 。
12。画像取得
- 画像 図 2 と 図 3 で使用されるパラメーターの一覧については表 1 を参照してください。
- 開始するには、選択した蛍光体によってサンプルを照らすに適切なレーザーを選択します。このプロトコルで使われる SR GSD システムが高出力レーザ搭載 (488 nm、1.4 KW/cm 2; 532 nm、2.1 KW/cm 2; 561 nm、2.1 KW/cm 2 642 nm、2.1 KW/cm 2)。 図 2 は、642 nm のレーザーを使用します 。
- 油浸対物レンズを使用し高 NAここで使用される SR GSD システムが HC PL APO 160 X 搭載/1.43 NA 目的 。
- は、適切なダイクロイック イメージング キューブを選んだ。このプロトコルでは SR GSD システムが 488 HP-T、搭載 532 HP-T、568 HP-T、505-605 nm、550-650 nm と 660 760 nm の発光帯域通過フィルターが 642 HP T 。
- は、2 D のアクイジション ・ モードを選択します。フレーム転送モードと露出時間を 10 ms (100 Hz) にカメラを設定します。EM ゲインを 300 に設定します。検出のしきい値を選択します
。 注: 低閾値は高いバック グラウンドを持つ画像を生成します。高しきい値は興味の信号をフィルター可能性があります。非 transfected セルまたはセルだけ二次抗体とインキュベート coverslips イメージングなどネガティブ コントロールに基づいて、しきい値を決定します 。
- イベントの自動制御と画像 8 にあたり設定のイベントを有効にします 。
- は、GSD の取得] タブでピクセル サイズを入力 (10 で始まる nm、20 nm ピクセル サイズ)。いることを確認 " ヒストグラム モード " GSD ツール タブの画像集録前に高解像度イメージの計算オプションでは、[.
- 膜タンパク質をイメージ、全反射モードを選択および浸透深さを確認する入射角を変更します 。
- 暗状態 (ポンプと呼ばれる) に電子を送信、レーザー強度を 100% に設定します 。
- ポンピングしながら単一分子検出を選択し、ときフレーム相関は 0.20 を自動的に取得するを設定します 。
- の取得、レーザー強度を 50% に設定します 。
- は 60,000 に買収フレームの数を設定します
。 注: 調査官がサンプル必要ありますもっとまたはより少なくこれ以上のフレーム。さらにイベントを検出しない場合、蛍光退色停止取得の観測に基づくフレーム数を変更します 。
- 開始取得します
。 注: 取得の初めには、すべての色素分子蛍光状態し、暗状態に切り替えています。フレーム相関は 0.20 を達すると、画像が取得する開始されます。フレームあたり未満 8 イベントが検出されると、405 のレーザーは基底状態の暗い状態から遷移するフルオロを奨励、切り替えられます。N のデータセットの画像取得時 = n からの細胞 x 必要があります全反射蛍光浸透深さ、検出しきい値、および取得するフレームの数は、一定に保たするよう y 動物、パラメーターを = 。
13。画像解析
- タンパク質クラスター サイズを定量化するを使用して、' 粒子の分析 ' ImageJ の機能
。 注: さらなる分析は、確率の光再構成顕微鏡ベースの相対的な局在解析 (嵐 RLA) または類似した 13 を使用して実行可能性があります。- 通り ImageJ を用いたクラスター分析 ( 図 3) を実行:
- 分析する画像ファイルを開きます。これは 10 nm ヒストグラム単一分子の局在地図をする必要があります (セクション 12) 上記は、イメージング ソフトウェアで生成します 。
- 調整明るさとコントラスト画像を視覚化する: [イメージ] メニューの [クリックしては、[明るさとコントラストを調整します。[自動] をクリックします 。
- イメージの種類を 8 ビットに変更: イメージ] メニューの [を選択し、種類を選択し、8 ビットを選択します 。
- イメージの縮尺を設定する: 分析] メニューを開き、尺度を設定をクリックし、次のパラメーターを入力: 距離 = 1、距離を知られている = 10、1 画素 = 10 nm 。
- 取得する測定を選択、分析メニューを開き、設定測定を選択、領域オプションの横にあるボックスをチェックします 。
- は、画像のしきい値を調整します。上/下のしきい値を選択調整、画像ウィンドウ メニューを開きを選択します。最大値を 255 に移動し、移動は、最小値 1 をクリックして適用します 。 、粒子を分析する
- は、[分析] メニューを開き、分析粒子を選択します。ピクセル単位を選択して、結果を表示および要約にチェック マークを配置します。4 無限にサイズを設定 (解像度は ~ 20 nm)、裸の輪郭オプションを選択し、[ok] をクリックします。クラスターの平均サイズや画像内のクラスターの数など解析の詳細を含む概要のファイルが作成されます
。 注: ローカライズされたポイント数として特定のクラスター内の蛋白質の数についての結論を作る直線的相関性がないタンパク質の多いとき、注意を行使する必要があります。GSD ローカライズ抗体、共役系色素によるエピトープの蛍光ラベルを転置するリンケージ エラーが発生 > 10 nm 任意の方向で。また、ポリクローナル抗体を使用する場合 2 つ以上の抗体は、単一の抗原にバインドできます、問題、さらに商業二次を混同する抗体は平均で 3-6 分子色素 1 分子蛍光は常に等しくないので、共役系一つの蛋白質。生物学: ナノボディでベース ラベリング方式 14 を使用して、(セカンダリを排除) 一次抗体に直接染料を固着させ、リンケージ エラーを減らすことができます 。
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Representative Results
導入に記載され、多く異なる超解像顕微鏡画像診断法があります。このプロトコルは、GSD 超解像イメージングに焦点を当てください。代表的な画像とローカリゼーション マップの図 2と図 3のとおりです。
図 2は、小胞体タンパク質、mCherry-Sec61β、上記の方法を使用して処理されますをトランスフェクトした COS 7 細胞を示しています。図 2A-2B全反射モード (A) で超解像顕微鏡を使用し、GSD アクイジション ・ モード (B) を使用してを撮影した小胞体のイメージの比較を許可します。画像は、GSD モードで取得するときの軸解像度の改善を見る。これはさらに ImageJ は、(黄色の線) のエリアで正規化輝度曲線の分布の違いを示していますを使用して生成することができます付属のプロット プロファイルで示されます。これらのカーブは、狭く GSD モードで調べたときに表示される ER 細管の直径を表します。GSD 顕微鏡は約 20 nm そしてこうして表す側面局在化精密回折限界を超えた分解能で約十倍。ER 尿細管の構造のより正確な表現では解像度の結果が向上します。
GSD イメージング、さらに図 3の抗-cav1.2 抗体、前述の処理でラベル付けされた心筋細胞に示されて超解像で提供する解像度で改善。図 3 aの画像は、全反射の設定で GSD 超解像顕微鏡を使用して撮影されました。CaV1.2 のクラスター t 細管ネットワークに沿って整理するチャンネルを見ることができます。図 3 bは、しかし、このイメージは、GSD モードを使用して取得された同じセルを示しています。軸方向の分解能の改善がチャンネル (図 3 b) の 1 つのクラスターに焦点を全反射と GSD を使用してイメージを作成、同じ投資収益率間の比較が行われるチャネルの別々 のクラスターとして識別しやすいパネルでより顕著GSD イメージングによる提供する解像度の改善の結果。これらのパネルは、ピクセルあたりの光子の数として定義されている検出閾値の差も比較します。このパラメーターは慎重に選択、実験の要求に適合する必要があります。パネル 3 D GSD 画像処理 ImageJ ソフトウェアを使用して時にクラスターのアウトラインを示しています、これから画像のそれぞれの個々 のクラスターのクラスター領域を定めることができる (注上記 13.1.8 とディスカッションについては、重要な考慮事項を参照してください。ときにこのような定量化を実施)。この情報は、パネル3 Cの周波数ヒストグラムを生成する使用できます。この分析は、クラスター サイズ、またはテスト条件 (例えばWT 対変異体チャネルまたは未処理対薬剤処理細胞) と制御の下でサンプル間のクラスター数の変化を確認する使用できます。捜査官が決定した相補的な折れ曲がり退色実験と一緒にこのプロトコルで説明されている方法を使用して、その CaV1.2 チャネルが、クラスター平均分布、8 チャンネル心筋15.
図 1: 膜タンパク質の超解像イメージングのイベントのタイムラインの概略図。0 日目は抗体の分類の処理の最初の日を指します。プロトコル セクションは、プロトコルの各ステップについて詳細な情報がある場所を指します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 超解像顕微鏡法は、ノイズを改善、空間解像度を増加を提供しています。(A) 左 COS 7 細胞表現する mCherry Sec61β、固定しプロトコルで説明されているようにラベルし、従来の全反射型顕微鏡を使ってイメージ化します。右、上部パネル: 尿細管 ER 単一。右、下パネル: ER 尿細管 (黄色の線) の幅を渡って取られるプロファイルをプロットします。(B) 局在化を除く (A) として同じセルのマップは、GSD 超解像を使用して生成されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 心筋細胞における Cav1.2 チャンネルの超解像イメージング。から分離心筋線維、(A) 全反射のフット プリントは固定で、抗-caVで 1.2 抗体 (FP1) を染色します。(B) 左: (A) と同様に同じ心筋細胞からの超解像全反射のフット プリント。右: 拡大、ローカリゼーション マップの異なる検出しきい値にさらされている部分です。検出のしきい値を 1 つにつれて CaV1.2 チャネル クラスターの見かけ上のサイズが減少に注意してください。(C) (B) のローカリゼーション マップからクラスター サイズの頻度分布が得られます。(D) 左: (B) からクラスターの CaV1.2 の概要。右: 画像の拡大部分は異なる検出しきい値を施してあります。ノートでは、検出のしきい値が増加 (B) と同様、CaV1.2 チャネル クラスター減少によって占有される領域。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 蛍光体の使用 | Alexa-647 |
| レーザー | 642 nm |
| 排ガス浄化装置 | 623 HP T |
| レンズ | 160 × 1.43 NA |
| 露光時間 | 10 ms |
| 検出しきい値 | 65 |
| 入射角 (浸透深さ) | 65.04 ° (150 nm) |
| EM ゲイン | 300 |
| #frames 取得 | 30,000-60,000 |
| 励起用レーザ | 100% |
表 1: 撮像パラメーターのリスト。
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Discussion
回折限界を超えたイメージングを可能にする技術の最近の爆発は、哺乳類細胞の空間と時間におけるシグナル伝達の複雑さに新しいウィンドウを提供しています。これらのテクノロジには、嵐、STED、パーム、GSD、SIM、亜種 (例えばdSTORM、FPALM) が含まれます。これらの技術の背後にある科学者たちの創意工夫は、光の回折現象を支配する物理学の法則によって課された制限を回避するために私たちができました。にもかかわらずこの巨大な成果は、各技術の超解像を達成するために妥協のいくつかの並べ替えになりますそしてなどの制限があります。細胞生物学者ととらわれるが追求する理想的な状況はないの退色で、高速の捕捉、高解像度、最適感度。さらに、動物からセルを削除する我々 は本質的にそれらを変更して、分子動力学を変更する可能性があることを常時 1 つ必要があります。したがって、動的、可能にする超解像技術を開発するクエスト ライブ セル、生きて動物における単一分子イメージングに行きます。今のところ、我々 は回折限界解像度で 10 倍改善で画像を生成することができます私達の処分でツールを持っています。この記事で曲げ・軸方向寸法の 20 と 50 nm までの解像度を下げたり GSD のサンプル準備、画像集録および解析について述べる。
このプロトコルの焦点は Sec61β と CaV1.2 L 型 Ca2 +チャネルが上記プロトコルは、GSD 顕微鏡で自分のラボでイメージの異なるタンパク質を希望者のテンプレートとして使用できます。プロトコルのこのタイプの肯定的な属性が比較的簡単なすることができます変更、種類の異なる細胞数に適用し、マルチカラー イメージングに容易に適応することができます。明らかな限界がその超解像の単一分子検出のできる敏感な EM CCD カメラを搭載したシステムは、まだ多くの実験室の法外に高価になる傾向があります。
超解像顕微鏡法を使用して、最寄りのイメージング手法として研究所の数が成長するにつれ、画像の取得、処理、および解釈についてより多くの均一な理解と合意が必要です。方法については、たとえば、1 つは 2 つのタンパク質をコードして, 回折限られたピクセルで表示されますが、実際に超解像画像/地図にすべての重複はほとんどを表示する発生の近さのレベルを定量化は?確かに、このシナリオは以前コードして, 蛋白質、zyxin の接着複合タンパク質 paxillin などを想定していくつかのすでに生じています。顕微鏡達成常増加でない解像度、おそらく蛋白質もはやに報告される 'colocalize' ではなく、1 つの別の好ましいローカリゼーションのパターンを配布したが非ランダムに。結局のところ、まったく同じ 3 次元の空間を物理的に占有する 2 つのタンパク質のため不可能です。この分析の難問にいくつかのソリューションは、周波数と重なりの程度を定量化できます伝え確率光再建顕微鏡ベースの相対的なローカライズ分析 (嵐 RLA) を含む文献の出現し始めています。2 つのタンパク質をラベル付け共同とも重なっていない蛋白質13間の距離の測定を提供します。超解像の別のものに 1 つのチャネルを比較すると、2 つのチャネル間の正しいレジストリをあることを確認重要ですもちろん。これは、微小球マルチカラー蛍光ビーズを用いた、各チャンネルでイメージングし、画像をオーバーレイに評価できます。さらに、SR GSD の 3 D 顕微鏡することができますも全反射顕微鏡として機能し、超解像のローカリゼーションを生成マップ全反射、以来それは浸透深さによって全反射角度変更として、2 色チャンネル間に一致することが重要、試料に使用されるライトの波長。
さらに、図 3Bと3 D 図で描かれている、ローカリゼーション マップが 'しきい値' の程度によって大幅に異なる表示されることができます。検出のしきい値の設定が低すぎると、彼らは本当に、1 つはスプリアス非固有ラベル '騒音' が含まれている確率よりも大きくなるように構造が表示されます。逆に、検出のしきい値の設定が高すぎる場合構造体可能性があります彼らは本当に '本当' のイベントを除外するようにあるより小さい表示。したがって、しきい値を適用して、理由と注意ください。どのようにである特定のサンプルのための合理的な閾値を決定ことができますか。コントロールが重要です。として、任意の免疫標識のアプローチでは、正と負のコントロールを行う抗体の特異性を示す。適切なコントロールは、観察する必要がありますのみを特殊にラベリングを検出しきい値を派生することが可能です。適切なコントロールには、二次抗体にのみ公開されているサンプルを観察できるので、一次抗体の孵化が省略されているサンプルが含まれます。そのようなコントロールから二次抗体の非特異的結合を識別できます。よく準備されたサンプルではこれはイメージ、およびプライマリとセカンダリのインキュベートしたサンプルと比較した場合、ピクセルあたりの光子の低い平均数ごとのはるかに小さいイベント カウントになります。イメージの検出閾値非固有のラベルを排除できるように設定できます。イメージングの自信を高めるためにプライマリとセカンダリの培養サンプル 'ノイズ' は除去される場合、同じ検出しきい値を使用してください。さらにコントロールには、これらの一次抗体の特異性をテストが含まれます。Transfected セルに分類された蛋白質が細胞のネイティブ表現されていない場合一次抗体の特異性の単純なテストは、融合細胞に対してラベリング処理を実行します。初代培養細胞の一次抗体の特異性を示すためには、分類された蛋白質の遺伝子ノックアウトはゴールド スタンダードです。これらの一次抗体の制御実験を用いた検出しきい値を設定もできます。標的抗原がない場合は、任意の蛍光性の放出は非固有です。良い一次抗体と二次の唯一のコントロールでイメージごとに以下のイベントを守らなければなりませんし、したがって、同じフレーム数、以上低い意味ピクセルあたりの光子の数は明らかにする必要があります。検知閾値は、ターゲットを一次抗体結合による染色非固有バック グラウンドを排除するレベルにこのように設定できます。完全に透明のそれは明記しきい値パラメーターと、おそらく、onlin の生データへのリンクを作成者が画像を提示しなければならないことが示唆されました。e 保管。
調査官も 1:1 プライマリ: セカンダリ バインド率は想定できませんので、複数の二次抗体は単一の一次抗体にバインドできます認識のままする必要があります。さらに、商業二次抗体は複数の同時に一般共役は、たとえば、このプロトコルで採用されている二次抗体によって記録されます 2 8 fluorophores に共役するメーカー。回避するこれに、として、fluorophore は、一次抗体に直接共役することができます。吸光光度法は、一次抗体あたり fluorophores の平均数を決定する使用できます。この過程を実行するいくつかの市販キットがあります。ただし、1:1 の化学量論を達成すると、場合でも、蛍光分子自体は点滅と蛍光物質の可逆的スイッチングのためにさらに過剰の問題を作成できます。実際には、これは、fluorophore が地面とそれがそうするように光子のクラスターを発光励起状態間数回を繰り返すことを意味します。これらの光子はいくつかの隣接ピクセルの検出可能性があります、クラスター サイズの過大評価に 。他の研究者蛍光排出時間と空間の16,17の短い期間にわたってクラスター化を結合する選択することによってこの問題に対処しました。これはまだ同じ fluorophore もう一度長期間、サイクリング発光状態に逆の暗状態に戻るサイクルが、2 番目の分子として判断される可能性を排除していませんやや実証的アプローチ。したがって、クラスター内の分子の数を計算できないに基づいてクラスター サイズのみに。現時点では、これらの問題に最適なソリューションがないと、したがって、折れ曲がりの退色など別の手法と組み合わせて超解像イメージングの使用はクラスターあたりの分子数の概算を与えることができます。クラスター領域測定の信頼性を高めるため関連するコントロールがあります知られている単量体蛋白質 (例えばCD86) と知られている二量体蛋白質 (例えば、ctla の条項 4) のクラスター サイズを比較するが推奨する、興味の蛋白質のフリッケら18。
要約すると、現在の記事では、単純な反応プロトコルなど超解像イメージングのため固定サンプルの準備を記述する設定されています。さらに、画像の取得と分析のいくつかの一般的な落とし穴を説明します。超解像イメージングがより一般的になると、雑誌などこれらの複雑な画像/ローカリゼーション マップの不適切な操作を回避するためのガイドラインの新しいセットを設定するために必要なある可能性があります。超解像顕微鏡法は細胞生物学者、とらわれるのツールボックスに強力な新しいツールが追加し、既に細胞アーキテクチャと分子機構の理解に異常な影響を与えた。
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Disclosures
著者は開示する競合する興味を持ってないです。
Acknowledgments
この作品は、R.E.D. (15SDG25560035) に、AHA からの助成金によって支えられました。著者は、彼のライカ SR GSD 3 D 顕微鏡の使用のための博士フェルナンド ・ サンタナと FP1 抗体を提供する親切博士ヨハネス ・地獄を認めたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10x PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1x with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
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