Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer
Summary
Bu makalede bir veya daha fazla plazma ve/veya zemin durumu tükenmesi (GSD) süper çözünürlük mikroskobu memeli hücrelerinde kullanarak hücre içi zar proteinleri tespiti için bir protokol özetlenmektedir. Burada, faydaları ve görselleştirme ve proteinlerin miktar için bu tür yaklaşımlar kullanarak konuları tartışmak.
Abstract
Floresan mikroskopi ve hücre biyolojisi gelişmeler yakından ilişkili mısınız, gelişmiş ile hücresel olaylar sık sık nasıl bizim anlayış ve dramatik sanattaki önde gelen görselleştirmek için yetenek hücreleri işlev. Geliştirme ve süper çözünürlük mikroskobu kullanılabilirliğini önemli ölçüde genişletmiştir optik çözünürlük sınırları ~ 250-20 nm. Biyologlar artık moleküler etkileşimleri açısından sınırlı kırınım alanı içinde colocalization açıklayan sınırlıdır, daha doğrusu artık bireysel moleküllerin dinamik etkileşimleri görselleştirmek mümkündür. Burada, görselleştirme ve proteinlerin miktar için bir protokol tarafından zemin-devlet tükenmesi mikroskobu sabit hücre görüntüleme için anahat. Biz iki farklı membran proteinlerinin, endoplazmik retikulum translocon, sec61β ve bir plazma zarı lokalize voltaj L tipi Ca2 + kanal (CaV1.2) unsuru örnekler sağlar. Tartışılan belirli mikroskop parametreleri, fiksasyon yöntemleri, fotoğraf geçiş arabellek formülasyonu ve tuzaklar ve görüntü işleme zorlukları vardır.
Introduction
Hücresel sinyal reaksiyonlar hücresel yanıt başlatmak için iç ve dış ortamlar değiştirme çevirmek. Onlar insan fizyolojisi, hormon ve nörotransmitter yayın, kalp atışı, görme, gübreleme ve bilişsel işlev için temel olarak hizmet veren tüm yönlerini düzenleyen. Bu sinyal cascades bozulma patofizyolojik koşulları kanser, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi şeklinde ciddi sonuçlar doğurabilir. On yıllardır, biyolojik ve tıbbi araştırmacılar başarıyla floresan proteinler, sonda ve birincil araç olarak Floresans mikroskobu ile birleştiğinde biyosensörler kesin zamansal ve mekansal organizasyonu bunlar hücresel anlamak için kullanmıştır sinyalleri.
Epifluorescence, confocal, veya toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi gibi optik teknikleri güçlü onların duyarlılık, hız ve büyük sınırlama ise canlı hücre, Imaging ile uyumluluk vardır onların kırınım-sınırlı çözünürlük, anlam yapıları veya protein kompleksleri 200-250 nm küçük çözümlenemiyor. Teorik ve pratik geliştirme deterministic süper çözünürlük ile (örneğin, uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED1), yapısal aydınlatma mikroskobu (SIM2) veya Stokastik süper çözünürlük (Örneğin , photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM3) veya zemin durumu tükenmesi (GSD4,5)), Floresans mikroskobu yanal ve eksenel çözünürlüğünde genişletmiştir kırınım bariyer için sırayla of nanometre onlarca. Böylece, müfettişler şimdi görselleştirmek ve nasıl protein dinamikleri ve organizasyon çevirir moleküler seviyede işlevine anlamak içineşsiz bir yetenek var.
Bilindiği gibi tek tek molekül dönüş takip zemin durumu tükenmesi mikroskobu (GSDIM) veya sadece GSD kırınım sınırı aynı anda fluorophores4,5yayan sayısını azaltarak kaçınmanızı sağlar. Yüksek enerjili lazer ışık fluorophore etiketli örnek, fotonlar ile elektron bombardımanı ve onlar bir ‘spin-flip’ geçmesi ve üçlüsü veya ‘karanlık-devlet’ heyecanlı devlet4girin olasılık artan heyecanlandırmak için kullanılır. Bu etkili bir şekilde yere devlet depletes, dolayısıyla adı ‘devlet tükenmesi yer’. Üçlü devlet fluorophores fotonlar yayarlar değil ve örnek dimmer görünür. Ancak, bu fluorophores stochastically zemin durumuna döndürün ve birkaç foton üçlüsü durumuna geri dönmeden önce karaya heyecanlı durum geçişlerini yayan gidebilirsiniz. Daha az fluorophores herhangi bir zamanda verilirken ile bireysel fluorophores fluorophores komşu dağınık şekilde ve geçici ayrı haline gelen foton patlamaları yayılan. Fotonlar patlama hesaplanan centroid hangi lens için kullanılan ışığın dalga boyu sayısal diyafram (NA) bağlı bir yerelleştirme hassasiyetle fluorophore konumla örtüşen bir Gauss fonksiyonu ile uygun olabilir uyarma ve en önemlisi, fluorophore yayılan fotonlar sayısı. Bir GSD yalnızca bir alt kümesini fluorophores aktif olarak herhangi bir zamanda yayar beri görüntüleri binlerce bir tam yerelleştirme harita oluşturmak için birkaç dakika üzerinden toplanan gerekir, kısıtlamasıdır. Yüksek lazer güç gereksinimi ile birlikte uzun satın alma zaman GSD daha iyi yerine canlı örnekleri sabit için uygun olduğu anlamına gelir.
Bu makalede açıklar süper kararlılık mikroskobu düşsel membran ve endoplazmik retikulum (ER) sabit örnekleri hazırlanması-ikamet proteinler (için gerekli sarf malzemeleri ve reaktifler bkz: Malzemeler tablolistesi). Nasıl bu protokolü kolayca boyutu ve L-tipi voltaj Ca2 + kanal (Cav1.2) kardiyak miyositler sarcolemma içinde kümeleme derecesi ölçmek için uyarlanmış veya acil servis hücresel dağılımını görselleştirmenizi kullanılan örnekler, içinde gösterilen. Bu hücresel bileşenleri organizasyonu ve dağıtımı anlama başlatılması, çeviri ve sonuçta birçok Ca2 +işlevini anlama önem-bağımlı sinyal cascades. Örneğin, Cav1.2 kanalları temelde uyarma-kasılma kaplin, belki de en her yerde sinyal cascade memeli hücrelerinde olmakla birlikte reseptör aracılı Ca2 + serbest bırakmak–dan acil servis için önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kırınım sınırını aşan görüntüleme sağlayan teknolojileri son patlama teklif var yeni windows memeli hücre uzay ve zaman içinde sinyal karmaşıklığı içine. Bu teknolojiler fırtına, STED, PALM, GSD, SIM ve onların türevleri (örneğin, dSTORM, FPALM) içerir. Bilim adamları bu teknikleri arkasındaki marifet ışığın kırınım yöneten fizik yasaları tarafından uygulanan sınırlamaları aşmak bize izin verdi. Bu büyük başarı rağmen bu tekniklerin herbirini bir uzlaşma süper ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser AHA bir hibe için R.E.D. (15SDG25560035) tarafından desteklenmiştir. Yazar Dr Fernando Santana için kullanma-in onun Leica SR GSD 3D mikroskop ve Dr. Johannes cehennem tür FP1 antikor sağlamak için kabul etmek istiyorum.
Materials
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
