Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन में लिपिड Peroxidation के उच्च प्रवाह माप के लिए सेल मुक्त जैव रासायनिक Fluorometric एंजाइमी परख

Published: October 12, 2017 doi: 10.3791/56325
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 1,4, 2,4, 1
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

Summary

हम यहां एक fluorometric कोशिका-एचडीएल लिपिड peroxidation के निर्धारण के लिए नि: शुल्क जैव रासायनिक परख का वर्णन । इस तेजी से और प्रतिलिपि परख बड़े पैमाने पर अध्ययन में एचडीएल समारोह का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और मानव रोग में एचडीएल समारोह की हमारी समझ में योगदान कर सकते हैं ।

Abstract

कम उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन कोलेस्ट्रॉल (एचडीएल-सी) के स्तर atherosclerotic हृदय रोग (सीवीडी) के सबसे शक्तिशाली स्वतंत्र नकारात्मक भविष्यवक्ताओं में से एक हैं । संरचना और एचडीएल के समारोह के बजाय एचडीएल-सी अधिक सही atherosclerosis भविष्यवाणी कर सकते हैं । कई एचडीएल प्रोटीन और लिपिड संरचना परिवर्तन है कि एचडीएल समारोह ख़राब ऐसे atherosclerosis के रूप में भड़काऊ राज्यों में होते हैं । एचडीएल समारोह आमतौर पर ऐसे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख के रूप में सेल आधारित परख द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन इन परख मानकीकरण के कई कमियां कमी है । कोशिका मुक्त परख सेल आधारित परख की तुलना में एचडीएल समारोह के अधिक मजबूत उपाय दे सकता है । एचडीएल ऑक्सीकरण एचडीएल फंक्शन को बाधित करते हैं । एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड परिवहन में एक प्रमुख भूमिका है और लिपिड पेरोक्साइड की उच्च राशि असामान्य एचडीएल समारोह से संबंधित है । लिपिड-जांच बातचीत जब गैर के परिणामों की व्याख्या पर विचार किया जाना चाहिए एंजाइमी प्रतिदीप्ति परख लिपिड oxidative राज्य को मापने के लिए । यह हमें प्रेरित एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री (HDLox) है कि एचडीएल रोग के लिए योगदान का आकलन करने के लिए एक सेल मुक्त जैव रासायनिक एंजाइमी विधि विकसित करने के लिए । इस विधि एंजाइम सहिजन peroxidase (एचआरपी) और fluorochrome Amplex लाल है कि (कोलेस्ट्रॉल oxidase के बिना) एचडीएल-C के प्रति मिलीग्राम लिपिड पेरोक्साइड सामग्री की मात्रा कर सकते हैं पर आधारित है । यहां एक प्रोटोकॉल एचडीएल लिपिड peroxidation का describedfor दृढ़ संकल्प है fluorochrome एजेंट का उपयोग कर । परख परिवर्तनशीलता प्रयोगात्मक शर्तों के सख्त मानकीकरण से कम किया जा सकता है । उच्च HDLox मूल्यों कम एचडीएल एंटीऑक्सीडेंट समारोह के साथ जुड़े रहे हैं । इस परख के readout सत्यापित सेल के readouts के साथ जुड़ा हुआ है आधारित परख, हृदय रोग के किराए के उपाय, प्रणालीगत सूजन, प्रतिरक्षा रोग, और जुड़े हृदय और चयापचय जोखिम phenotypes । यह तकनीकी दृष्टिकोण मानव रोग जहां प्रणालीगत सूजन, oxidative तनाव और ऑक्सीकरण लिपिड एक महत्वपूर्ण भूमिका (जैसे atherosclerosis) में एचडीएल समारोह का आकलन करने के लिए एक मजबूत तरीका है ।

Introduction

Atherosclerotic हृदय रोग (सीवीडी) मौत का प्रमुख कारण दुनिया भर में1,2है । जानपदिक रोग विज्ञानी अध्ययनों से पता चला है कि उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन के निंन स्तर (एचडीएल) कोलेस्ट्रॉल आमतौर पर व्युत्क्रम atherosclerosis1,2के विकास के लिए जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं । हालांकि कई अध्ययनों से एचडीएल1,2के लिए एक atheroprotective भूमिका का समर्थन करता है, तंत्र जिसके द्वारा एचडीएल atherosclerosis की दीक्षा और प्रगति को क्षीण कर रहा है, वह जटिल 3,4है । इस प्रकार, यह सुझाव दिया गया है कि जटिल संरचना और एचडीएल के समारोह के बजाय निरपेक्ष स्तर पर और अधिक सही भविष्यवाणी कर सकते है atherosclerosis 5,6,7,8। कई एचडीएल प्रोटीन और लिपिड संरचना परिवर्तन है कि एचडीएल समारोह ख़राब ऐसे atherosclerosis के रूप में भड़काऊ राज्यों में होते हैं । ये i) अपने कोलेस्ट्रॉल समाप्ति संभावित 9, द्वितीय कमी) विरोधी भड़काऊ और वृद्धि एचडीएल-जुड़े समर्थक भड़काऊ प्रोटीन 6,7, iii) कमी एंटीऑक्सीडेंट कारक स्तर और गतिविधि और डेंसिटी क्षमता कम घनत्व लिपोप्रोटीन (LDLox) के ऑक्सीकरण को बाधित करने के लिए10 और iv) वृद्धि लिपिड hydroperoxide सामग्री और redox गतिविधि (HDLox)9,11. मजबूत परख कि एचडीएल के pleotropic कार्यों का मूल्यांकन (जैसे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति, एंटीऑक्सीडेंट समारोह के रूप में) एचडीएल-एचडीएल-सी क्लिनिक में दृढ़ संकल्प का पूरक हो सकता है ।

एचडीएल समारोह आमतौर पर सेल आधारित तरीकों जैसे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख8,12,13,14के द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । इन तरीकों के साथ महत्वपूर्ण विविधता सहित प्रमुख सीमाएं है इस्तेमाल किया कोशिकाओं के प्रकार, readout के प्रकार की सूचना दी, मानकीकरण की कमी और ट्राइग्लिसराइड्स 7,15के प्रभाव को ढूंढने । इन कमियों16बड़े नैदानिक अध्ययन के लिए कठिनाइयों मुद्रा । कोशिका मुक्त परख सेल आधारित परख की तुलना में एचडीएल समारोह के अधिक मजबूत उपाय दे सकता है । कोलेस्ट्रॉल समाप्ति एचडीएल के सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक है, लेकिन यह केवल सेल आधारित परख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । प्रोटियोमिक्17,18,19,20,21,22,23जैसे एचडीएल फंक्शन का निर्धारण करने के लिए अंय दृष्टिकोण 24 और सेल आधारित monocyte chemotaxis की परख एचडीएल फंक्शन 17,22,25 का मानकीकृत नहीं किया गया है और इसका इस्तेमाल बड़े पैमाने पर मानव अध्ययन में नहीं किया जा सकता ।

एचडीएल महत्वपूर्ण एंटीऑक्सीडेंट atheroprotective प्रभाव5,6,7,8है । एचडीएल की एंटीऑक्सीडेंट फंक्शन पिछले सेल में एलडीएल की उपस्थिति में निर्धारित किया गया है नि: शुल्क fluorometric परख 26। एचडीएल एंटीऑक्सीडेंट समारोह के इन जैव रासायनिक fluorometric तरीके मूलतः मोहम्द Navab और एलन Fogelman और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किए गए थे26. हालांकि कई मानव अध्ययन एचडीएल समारोह का निर्धारण करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया है 17,18,19,20,21,22,23 ,24, लिपिड (एचडीएल)-लिपिड (एलडीएल) और लिपिड fluorochrome बातचीत कर सकते हैं सीमा reproducibility इन सेल मुक्त गैर एंजाइमी एचडीएल समारोह की जैव रासायनिक परख27,28.

हाल ही में ब्याज एचडीएल ऑक्सीकरण के कार्यात्मक परिणामों पर ध्यान केंद्रित किया है कि एचडीएल के भीतर लिपिड और प्रोटीन के ऑक्सीकरण का परिणाम है 27,29,30. पहले अध्ययनों से पता चला है कि एचडीएल के ऑक्सीकरण के साथ 27,29,30 एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड परिवहन में एक प्रमुख भूमिका है और लिपिड पेरोक्साइड की उच्च राशि असामान्य एचडीएल समारोह से संबंधित है । इस प्रकार एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री एचडीएल समारोह 9,17,20,31 और एचडीएल समारोह7के पूर्व परख के ज्ञात सीमाओं को देखते हुए निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, 15,27,३२, हम एक वैकल्पिक fluorometric विधि विकसित की है कि quantifies एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री (HDLox) ३२। इस विधि एंजाइम सहिजन peroxidase (एचआरपी) और fluorochrome Amplex लाल है कि (कोलेस्ट्रॉल oxidase के बिना) एचडीएल-C ३२के प्रति मिलीग्राम लिपिड पेरोक्साइड सामग्री की मात्रा कर सकते हैं पर आधारित है । परख के जैव रासायनिक सिद्धांत चित्रा 1में दिखाया गया है । हमें पता चला है कि इस प्रतिदीप्ति आधारित दृष्टिकोण पहले एचडीएल समारोह परख27,28की सीमाएं नहीं है । यह परख और परिष्कृत किया गया है और हमारी प्रयोगशाला में मानकीकृत इतना है कि यह मज़बूती से बड़े पैमाने पर मानव अध्ययन cryopreserved प्लाज्मा ३२के साथ भी इस्तेमाल किया जा सकता है,३३,३४, ३५ , ३६ , ३७ , ३८ , ३९ , ४० , ४१ , ४२. इस परख के readout सत्यापित सेल के readouts के साथ जुड़ा हुआ है आधारित परख, हृदय रोग, प्रणालीगत सूजन, प्रतिरक्षा रोग और जुड़े हृदय और चयापचय जोखिम के किराए के उपाय phenotypes ३२ , ३३ , ३४ , ३५ , ३६ , ३७ , ३८ , ३९. यहां, हम एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री (HDLox) को मापने के लिए इस सरल, अभी तक मजबूत विधि का वर्णन करते हैं । इस परख एक उपकरण के लिए महत्वपूर्ण अनुसंधान मानव रोग में एचडीएल समारोह की भूमिका के बारे में सवाल का जवाब जहां प्रणालीगत सूजन, oxidative तनाव और ऑक्सीकरण लिपिड एक महत्वपूर्ण भूमिका (जैसे atherosclerosis)३२के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_content" > मानव जैविक नमूनों का उपयोग कर सभी प्रयोगों को कैलिफोर्निया के लॉस एंजिल्स, लॉस एंजिल्स और अल्फ्रेड अस्पताल मानव नैतिकता समिति, मेलबोर्न विश्वविद्यालय से नैतिकता अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया ।

< p class = "jove_content" > नोट: fluorochrome एचडीएल फंक्शन की कई विविधताएं हैं (चर्चा देखें) < सुप क्लास = "xref" > ३२ . नीचे हम प्रोटोकॉल है कि सबसे सुसंगत और प्रतिलिपि परिणाम देता है का वर्णन करेंगे । परख का अवलोकन < सुदृढ वर्ग में दिखाया गया है = "xfig" > चित्रा 2 .

< p class = "jove_title" > 1. नमूना प्रसंस्करण

  1. का उपयोग करें ताजा, गैर hemolyzed सीरम (सीरम विभाजक ट्यूबों में एकत्र किया जा सकता है) या साइट्रेट 12-14 घंटे उपवास के बाद प्राप्त प्लाज्मा । cryopreserved नमूने का उपयोग करते हैं, तो इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में उपयुक्त नियंत्रण शामिल करें ।
< p class = "jove_title" > 2. 0 दिन-परख के लिए तैयारी

  1. उपयुक्त नियंत्रण, नमूने और प्रतिकृति के साथ प्रयोग के काम लेआउट तैयार करते हैं । प्रत्येक नमूना कम से triplicates में चलाएं । एक प्रतिनिधि ९६ अच्छी तरह से लेआउट में दिखाया गया है < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ .
  2. कि नमूनों की संख्या के आधार पर परख के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और प्रतिकृति के सभी संस्करणों की गणना ।
    नोट: प्रत्येक कार्य स्टॉक में विशिष्ट प्रयोग के लिए प्रत्येक एजेंट के लिए पर्याप्त मात्रा है सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त 10% वॉल्यूम शामिल करें ।
  3. लेबल सभी आवश्यक ट्यूबों परख के विभिंन चरणों के लिए उदाहरण के लिए एचडीएल की जुदाई के लिए, एचडीएल की माप-सी (वैकल्पिक) और fluorochromeassay.
< p class = "jove_title" > 3. दिन 1-नियंत्रण की तैयारी

  1. अध्ययन की तैयारी-विशिष्ट परित नियंत्रण
    1. एक नियंत्रण नमूना बनाने से pooled प्लाज्मा या सीरम के सभी अध्ययन के नमूने बनाएँ । यदि तपसिल में प्रत्येक प्लेट में 20 नमूने चल रहे हैं, तो प्रत्येक नमूने से 10 & #181; l को एक २०० & #181; l परित नियंत्रण में संयोजित करें । इस नियंत्रण का एचडीएल-C मान निर्धारित करने के लिए नैदानिक प्रयोगशाला को इस परित नियंत्रण की एक पृथक aliquot दें.
      नोट: इस परित नियंत्रण का उपयोग करने के लिए परख और सभी ज्ञात संभव खाते के लिए मानकीकरण (जैसे मैट्रिक्स सीरम बनाम प्लाज्मा, फ्रीज-गल चक्र, cryopreservation) और अज्ञात संस्थापकों है कि प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को प्रभावित कर सकते है का प्रकार < सुप वर्ग = "xref" > 27 , < सुप class = "xref" > 28 .
  2. प्रयोगशाला के विशिष्ट गुणवत्ता नियंत्रण (QCs) की तैयारी
    1. प्रत्येक प्रयोगशाला में एचडीएल का एक बड़ा भंडार तैयार करें (उदाहरण के लिए 10 स्वस्थ दाताओं से प्लाज्मा के 5 मिलीलीटर से अलग एचडीएल) और cryopreserve इस के कई aliquots स्टॉक फ्रीज-गल चक्र को कम करने के लिए.
    2. HDLox के औसत मूल्य का निर्धारण करने के लिए इस स्टॉक से कम से कम 10 अलग प्रतिकृति का उपयोग करें । प्रत्येक QC नमूने के लिए मापा HDLox मूल्यों की एक स्वीकार्य श्रेणी प्रत्येक परख में शामिल & #60 के भीतर है; इस औसत मान की भिंनता के गुणांक का 15% ।
    3. इस नियंत्रण के एचडीएल-C मान निर्धारित करने के लिए नैदानिक प्रयोगशाला के लिए इस परित नियंत्रण के एक अलग aliquot दे (जैसे ४० मिलीग्राम/dL) ।
      नोट: एक विस्तृत दृष्टिकोण कैसे इन नियंत्रणों को बनाने के लिए रक्त बैंकों से रक्त का उपयोग करने के लिए पहले बताया गया है < सुप class = "xref" > 27 , < सुप class = "xref" > 28 , < सुप क्लास = "xref" > ३२ . जरूरत के रूप में अतिरिक्त QCs का प्रयोग करें (एक स्वस्थ सामांय एचडीएल समारोह के लिए जाना जाता दाता से एक उदाहरण के लिए और एक बड़े पैमाने पर असामांय एचडीएल समारोह के लिए जाना जाता दाता से ।
  3. पृष्ठभूमि संकेत और रिक्त मानों का अनुकूलन (वैकल्पिक)
    1. पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, मशीनी माध्यम में catalase (1-4 यू/एमएल) की उपयुक्त मात्रा को तेजी से हटाने के लिए गठित एच 2 ओ 2 के कारण के सहज हवा ऑक्सीकरण हो जाते थें.
      नोट: के बाद से मूल्यों के खाली कुओं (कोई एचडीएल) एचडीएल के नमूनों के मूल्यों से घटाया जा रहा है और परिणाम एक परित नियंत्रण के सापेक्ष रिपोर्ट किया जा रहा है (जो एक ही ९६ वेल प्लेट में शामिल है), हमने पाया है कि यह कदम व्यावहारिक रूप से नहीं affec टी परिणाम । इस प्रकार, catalase के साथ पृष्ठभूमि संकेत का अनुकूलन लोप किया जा सकता है, अगर जरूरत है ।
< p class = "jove_title" > 4. दिन 1-एचडीएल कोलेस्ट्रॉल की जुदाई एचडीएल वर्षा का उपयोग कर

< p class = "jove_content" > नोट: एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानकीकृत एचडीएल कोलेस्ट्रॉल के लिए apoB घट सीरम को अलग करने के लिए एक वाणिज्यिक रूप से उपलब् निर्देश. इन रिएजेंटों व्यापक रूप से वर्णमिति परख में इस्तेमाल के लिए एचडीएल कोलेस्ट्रॉल के स्तर का निर्धारण कर रहे हैं ।

  1. उपयोग ताजा (या गल) प्लाज्मा या सीरम नमूना ।
  2. मिश्रण बराबर मात्रा (उदाहरण के लिए ८० & #181; L) प्लाज्मा और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल हाला रिएजेंट (20% डब्ल्यू/वी पॉलीथीन ग्लाइकोल glycine बफर में पीएच १०.० (25 & #176; C)).
  3. को ऊपर और नीचे pipetting करके अच्छी तरह मिलाएं ।
    4. 10 मिनट के लिए 1000-2000 x g पर
  4. केंद्रापसारक
  5. महाप्राण supernatant (एचडीएल अंश).
  6. आदर्श रूप में एचडीएल लिपिड peroxidation के fluorochromeassay के लिए पृथक एचडीएल का तुरंत उपयोग करें । हालांकि, अगर एक ही दिन में कई नमूने चलाए जाते हैं और अन्य कदम जैसे एचडीएल-कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता का माप भी किया जाता है, तो अलग एचडीएल को 4 & #176; C पर संग्रहीत करें और fluorochromeHDL फ़ंक्शन परख के लिए अगले दिन इसका उपयोग करे ।
< p class = "jove_title" > 5. दिन 1-अलग एचडीएल में एचडीएल-सी का निर्धारण-ए पी वर्ग = "jove_content" > नोट: यदि नैदानिक प्रयोगशाला से एचडीएल-सी का मूल्य एचडीएल-c की मात्रा के अनुसार HDLox को सामान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है तो यह वैकल्पिक है ।

  1. एचडीएल-कोलेस्ट्रॉल को प्लाज्मा से बढ़ाता है, मानक वर्णमिति की परख का उपयोग कर < सुप क्लास = "xref" > 27 . Add ५० & #181; प्रत्येक कुआं में कोलेस्ट्रॉल रिएजेंट के एल और एक वर्णमिति प्लेट रीडर और एक कोलेस्ट्रॉल एक किट में प्रदान की मानक का उपयोग कर कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता का निर्धारण ।
< p class = "jove_title" > 6. 2 दिन-रिएजेंट्स की तैयारी

  1. एचआरपी 5 u/एमएल समाधान (रेंज 1-10 u/एमएल) के एचआरपी और कोलेस्ट्रॉल समाधान तैयार ।
  2. तैयार 20 मिमी fluorochrome (जैसे, Amplex लाल) समाधान: गल fluorochrome रिएजेंट और DMSO के कमरे के तापमान के लिए एक शीशी । प्रयोग करने से पूर्व, भंग fluorochrome रिएजेंट (1 mg) में २०० & #181; DMSO के एल. स्टोर स्टॉक समाधान फ्रोजन पर & #8804;-20 & #176; C, प्रकाश से रक्षित.
  3. पॉजिटिव और नेगेटिव कंट्रोल्स तैयार करें: Use 1x & #39; रिएक्शन बफर & #39; बिना कोलेस्ट्रॉल और 20 एमएम एच 2 ओ 2 एक नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर समाधान, क्रमशः ।
< p class = "jove_title" > 7. Day 2-Fluorochrome परख

  1. Add ५० & #181; 1x रिएक्शन बफ़र के रूप में रिक्त (ऋणात्मक नियंत्रण) का L.
  2. वैकल्पिक: 20 मिमी का काम समाधान जोड़ें H 2 O 2 प्रत्येक प्लेट में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में.
  3. प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए और सुनिश्चित करें कि इसके अलावा के एजेंट और नमूनों लगातार किया जाता है और एक समय पर ढंग से, एक अलग ९६ में नमूनों के सभी जोड़ प्रदर्शन अच्छी तरह से गोल-नीचे, स्पष्ट, polystyrene या के लिए प्लेट (प्लेट 1). फिर एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए ३ ९६ में विशिष्ट संस्करणों हस्तांतरण-अच्छी तरह से प्लेटें (प्लेटें 2-4: के, फ्लैट बीओटीटॉम, काले) (जो समान लेआउट है) (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २ , < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ ).
    1. उदाहरण के लिए, पहले जोड़ें १६० & #181; एल अलग एचडीएल के प्रत्येक वेल में/1 प्लेट के नमूने और फिर मल्टीचैनल पिपेट अंतरण के उपयोग के साथ ५० & #181; एचडीएल के एल-कोलेस्ट्रॉल एक अच्छी तरह से/९६-अच्छी तरह से काले प्लेट में नमूना । प्रत्येक पंक्ति/स्तंभ के बीच युक्तियां बदलें और सभी स्थानांतरण के लिए गैर-फ़िल्टर युक्तियों का उपयोग करें ।
  4. कुएँ में नमूने छोड़े. मत छोड़ना । रिएजेंट्स के अलावा कोई वॉश स्टेप्स नहीं हैं ।
  5. Add ५० & #181; L के एचआरपी सॉल्यूशन 5 यू/एमएल (०.२५ यू) को एक वेल.
    नोट: fluorochrome रिएजेंट के अतिरिक्त करने से पहले एचआरपी का उपयोग करें ।
    6. ३७ & #176 पर 30 मिनट के लिए
  6. मशीन; सी. मशीन के बाद नमूनों को न छोड़ें (रिएजेंट के जोड़ के बीच कोई धो चरण).
  7. Add ५० & #181; L का अंतिम एकाग्रता के लिए fluorochromereagent के ३०० & #181; मी. इस बिंदु पर, कुल प्रतिक्रिया मात्रा १५० & #181 है; L अच्छी तरह मिक्स और प्रकाश से रक्षा.
  8. एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर (530/590 एनएम फिल्टर) के साथ फ्लोरोसेंट readout (अंधेरे में) १२० मिनट से अधिक हर मिनट में ३७ & #176; सी का आकलन करें ।
    नोट: ताजा नमूनों के साथ एक छोटे ६०-मिनट के अंतराल का उपयोग करें । हमने पाया है कि १२० मिनट की परख cryopreserved नमूनों के उपयोग के साथ और अधिक प्रतिलिपि डेटा देता है ।
  9. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रिकॉर्ड डेटा.
< p class = "jove_title" > 8. 3 दिन-डेटा विश्लेषण

  1. रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति इकाइयों (मनमाने ढंग से इकाइयों) १२० मिनट में fluorochrome रिएजेंट के अलावा खाली कुओं और सभी नियंत्रण सहित सभी नमूनों के लिए ।
  2. प्रतिदीप्ति इकाइयों के माध्य मूल्य की गणना (कम से triplicates के आधार पर) (एचडीएल ox_sample ) । मत ले outliers (& #62; 2 एसडीएस औसत मान से) ध्यान में रखें ।
  3. निम्न समीकरण का उपयोग करके पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाना:
    < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg"/>
  4. सामान्यीकरण एचडीएल कोलेस्ट्रॉल राशि (एचडीएल-c) के लिए: प्रत्येक नमूने के लिए HDLox लिपिड peroxidation मान को सामान्य (pooled नियंत्रण सहित) एचडीएल-c) (mg/ परिणाम अनुभाग के दौरान एचडीएल बैल को एचडीएल-सी के लिए समायोजन को प्रतिबिंबित करने के लिए n (एचडीएल-c) HDLox उपाय के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । निंन समीकरण का उपयोग करें:
    < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg"/>
  5. एक पूलिंग नियंत्रण के मान के विरुद्ध प्रत्येक नमूने के HDLox लिपिड peroxidation मान की अभिव्यक्ति को मानकीकृत । सामान्य n (एचडीएल-c) HDLox लिपिड peroxidation मान प्रत्येक नमूने के लिए (एचडीएल-c के लिए समायोजित) n द्वारा (एचडीएल-c) HDLox लिपिड peroxidation मान परित नियंत्रण. परिणाम अनुभाग के दौरान, एचडीएल बैल प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता और एचडीएल-सी के लिए समायोजन को प्रतिबिंबित करने के लिए nHDL बैल उपाय के रूप में प्रस्तुत किया है । निंन समीकरण का उपयोग करें:
    < img alt = "समीकरण 3" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg"/>
    नोट: यह दृष्टिकोण इस तरह के रूप में माप की प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए अन्य स्थापित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के समान है अंतर्राष्ट्रीय सामान्यीकृत अनुपात (INR) < सुप वर्ग = "xref" > ४४ , < सुप वर्ग = "xref" > ४५ . नैदानिक अध्ययनों में इस दृष्टिकोण को मान्य किया गया है < सुप क्लास = "xref" > ३२ , < सुप class = "xref" > 33 , < सुप class = "xref" > 34 , < सुप class = "xref" > 35 , < सुप class = "xref" > 36 , < सुप वर्ग = "xref" > ३७ , < सुप वर्ग = "xref" > ३८ , < सुप वर्ग = "xref" > ३९ .
  6. मानक गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों का उपयोग कर प्रयोगात्मक परिणामों की गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन । प्रत्येक प्रयोगशाला अपने स्वयं के गुणवत्ता नियंत्रण (QCs) स्थापित करना चाहिए । आदर्श रूप में वहां जाना जाता है बेकार एचडीएल के साथ एक नमूना से nHDLox के लिए एक qc और स्वस्थ दाताओं से एक नमूना से nHDLox के लिए एक qc है [उदाहरण के लिए युवा वयस्कों जो रक्त बैंक दाताओं की स्थापना की है और कोई ज्ञात comorbidity और जोखिम कारक है से परित का नमूना धूंरपान सहित हृदय रोग] । उत्तरार्द्ध नियंत्रण अलग प्रयोगशालाओं के बीच परिणाम मानक । इन QCs के औसत मानों के आधार पर स्थापित कर रहे है कम 5 प्रतिकृतियां (सामांयतया हम उपयोग 10 इस महत्वपूर्ण चरण के लिए प्रतिकृति) ।
    1. की जांच करें कि प्रत्येक परख में मापा QCs मूल्यों की उंमीद रेंज के भीतर मूल्यों है । 15% की एक स्वीकार्य अधिकतम प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता संभालने, सभी मापा प्रयोगात्मक मूल्यों स्थापित QC के ज्ञात औसत मूल्यों के 15% के भीतर गिर जाना चाहिए । निंन समीकरणों का उपयोग करें:
      < img alt = "समीकरण 4" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg"/>
      < img alt = "समीकरण 5" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg"/>
      नोट: या तो शामिल गुणवत्ता नियंत्रण नमूने ( सामांय बनाम बेकार एचडीएल) की उंमीद सीमा के बाहर HDLox मूल्यों देता है (प्रत्येक प्रयोगशाला में स्थापित) तो प्रयोग दोहराने ।
  7. प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए भिन्नता के गुणांक (cv) का उपयोग प्रयोगात्मक परिणामों की गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन: cv% & #62; 15% के साथ सभी नमूनों को दोहराएँ. निंन समीकरण का उपयोग करें:
    < img alt = "समीकरण 6" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg"/>
    नोट: एक ठेठ अंतर परख (एक ही प्लेट के भीतर) और अंतर-परख (अलग प्लेटों के बीच) प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता & #60; 15% .2) एक ठेठ अंतर परख cv 1-7% और एक ठेठ परख cv के बीच है 3-10%.
    8. के बीच है

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रत्येक एचडीएल नमूने के ५० µ एल चरण ७.३ में प्रत्येक अच्छी तरह से में जोड़ रहे हैं । एचआरपी समाधान 5 यू/एमएल (०.२५ यू) के ५० µ एल फिर प्रत्येक अच्छी तरह से चरण ७.५ में के रूप में जोड़ रहे हैं । नमूने 30 मिनट के लिए ३७ ° c में ७.६ चरण में के रूप में मशीन हैं । ५० µ एल fluorochrome रिएजेंट की तो एक अच्छी तरह के रूप में चरण ७.७ में जोड़ रहे है (३०० µ मीटर की अंतिम एकाग्रता) । फ्लोरोसेंट readout (अंधेरे में) तो एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर (530/590 एनएम फिल्टर) के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस से अधिक १२० मिनट पर हर मिनट का आकलन किया है । प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति के लिए डेटा खाली, जमा नियंत्रण, ज्ञात बेकार एचडीएल और सामान्य एचडीएल के साथ नमूने के साथ नमूना चित्रा 4में दिखाया गया है. Raw प्रतिनिधि डेटा और चरण दर चरण प्रोटोकॉल के अनुभाग 8 में वर्णित समीकरणों का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण तालिका 1 में दिखाए जाते हैं. इस उदाहरण में, ताजा एचडीएल नमूनों का उपयोग किया गया था और उच्च HDLox मूल्यों आम तौर पर ताजा एचडीएल के साथ प्राप्त कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, एचडीएल ज्ञात एचडीएल समारोह की स्वतंत्र परख के आधार पर शिथिलता और एचआईवी से संक्रमित व्यक्ति लगभग 2 गुना स्वस्थ प्रतिभागियों से परित एचडीएल की तुलना में लिपिड पेरोक्साइड की अपेक्षाकृत अधिक राशि थी । चित्रा 5 बिगड़ा एचडीएल समारोह28,३२के लिए जाना जाता विषयों के साथ एक अध्ययन से प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों लगभग ६०% उच्च मतलब एचडीएल-लिपिड पेरोक्साइड सामग्री (एचडीएल के प्रति मिलीग्राम-सी) के लिए संक्रमित व्यक्तियों की तुलना में था । cryopreserved एचडीएल के साथ हमारे पहले प्रकाशित अध्ययनों में, इस विधि को नियंत्रण समूहों से एचडीएल की तुलना में कम से HDLox में 10% सापेक्ष मतभेद प्रदर्शित करने में सक्षम था (क्रोनिक एचआईवी संक्रमण जैसे रोग के बिना)३६,३७, ३८.

Figure 1
चित्रा 1: एचडीएल-सी की विशिष्ट राशि के प्रति एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री का निर्धारण ।
प्रणालीगत सूजन और oxidative तनाव एचडीएल के राज्यों में लिपिड पेरोक्साइड (लूह) (HDLox) है कि बिगड़ा एचडीएल समारोह के साथ जुड़े रहे हैं वृद्धि हुई है । एचआरपी catalyzes गैर फ्लोरोसेंट fluorochrome के ऑक्सीकरण resorufin के लिए लाल । इस ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में मौजूद दोनों अंतर्जात पेरोक्साइड द्वारा संचालित किया जा सकता है (OH-) और एचडीएल-लिपिड पेरोक्साइड (लूह-) । कोलेस्ट्रॉल oxidase के बिना, resorufin (एचआरपी के साथ) एचडीएल कोलेस्ट्रॉल की एक विशिष्ट राशि के आंतरिक एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री को मात्रा में कर सकते हैं । ओह के पृष्ठभूमि उत्पादन-बफर की हवा ऑक्सीकरण का एक परिणाम के रूप में एक अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट readout से घटाया है । Resorufin में ज्यादातर नमूनों में न्यूनतम autofluorescence है । यह आंकड़ा ३२संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एचडीएल लिपिड peroxidation के fluorochromeassay के लिए कार्यप्रवाह का अवलोकन ।
0 दिन: परख के लिए तैयारी: एक) डिजाइन ९६ अच्छी तरह से प्लेट लेआउट, आवश्यक नमूनों की मात्रा का अनुमान (प्लाज्मा/सीरम) और reएजेंट (एचआरपी एंजाइम, fluorochrome reएजेंट, बफ़र्स, खूंटी रिएजेंट), लेबल ट्यूबों
1 दिन: परख और एचडीएल अलगाव के लिए तैयारी: एक) नियंत्रण की तैयारी (अध्ययन विशिष्ट-परित नियंत्रण, गुणवत्ता नियंत्रण, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण) B) एचडीएल खूंटी का उपयोग करते हुए तेज वर्षा ।
2 दिन: परख के लिए तैयारी (यदि 1 दिन में नहीं किया है) और fluorochrome परख: एक) नियंत्रण की तैयारी (अध्ययन विशिष्ट-परित नियंत्रण, गुणवत्ता नियंत्रण, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण) एचडीएल नमूनों के अतिरिक्त: प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने और सुनिश्चित करें कि रिएजेंट और नमूनों के अलावा लगातार किया जाएगा और एक समय पर ढंग से यह सिफारिश की है कि नमूनों के सभी जोड़ (जैसे १६० µ एल) पहले एक अलग ९६ अच्छी तरह से गोल-नीचे, स्पष्ट, polystyrene या के रूप में किया जाता है प्लेट (1 प्लेट) । फिर एक मल्टीचैनल पिपेट के लिए विशिष्ट खंड (जैसे ५० µ l) ३ ९६ में स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता-वेल प्लेट्स (प्लेटें 2-4:, फ्लैट नीचे, ब्लैक प्लेट्स) (जो समान लेआउट है). ख) एचआरपी के अलावा: जोड़ें ५० µ एल के 5 u/एमएल (०.२५ यू) के लिए एक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट सी का उपयोग कर) ३७ ° c में 30 मिनट के लिए मशीन) जोड़ें ५० µ एल के ३०० µ एम/well के fluorochrome रिएजेंट के एक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट ई का उपयोग करने के लिए) फ्लोरोसेंट readout का आकलन (अंधेरे में) हर मिनट एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर (530/590 एनएम फिल्टर) के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस से अधिक १२० मिनट ।
3 दिन: डेटा विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3:९६ अच्छी तरह से प्लेटों है कि आम तौर पर fluorochrome एचडीएल समारोह परख में उपयोग किया जाता है के प्रतिनिधि लेआउट ।
एक थाली के कुओं में एचडीएल के नमूनों के अलावा के समय में अंतर विभिन्न कुओं के बीच सहज ऑक्सीकरण में मतभेद पैदा कर सकता है । प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, विभिन्न कुओं के बीच चर सहज ऑक्सीकरण से बचने और सुनिश्चित करें कि रिएजेंट और नमूनों के अलावा लगातार और एक समय पर ढंग से किया जाएगा, यह अनुशंसित है कि नमूनों के सभी जोड़ (जैसे १६० µ एल) कर रहे हैं पहले एक अलग ९६ अच्छी तरह से गोल-नीचे, स्पष्ट, polystyrene या के रूप में किया प्लेट (प्लेट 1) । फिर एक मल्टीचैनल पिपेट के लिए विशिष्ट खंड (जैसे ५० µ l) ३ ९६ में स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता-वेल प्लेट्स (प्लेटें 2-4:, फ्लैट नीचे, ब्लैक प्लेट्स) (जो समान लेआउट है). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एचडीएल लिपिड peroxidation परख के प्रतिनिधि डेटा.
फ्लोरोसेंट readout (अंधेरे में) तो एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर (530/590 एनएम फिल्टर) के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस से अधिक १२० मिनट पर हर मिनट का आकलन किया है । प्रतिनिधि डेटा (मनमाने ढंग से इकाइयों) खाली (कोई एचडीएल, नकारात्मक नियंत्रण), सकारात्मक नियंत्रण (एच2ओ2) के लिए दिखाया जाता है, शिथिल एचडीएल (दो स्वतंत्र एचडीएल समारोह के आधार पर) ज्ञात रोगी से एचडीएल नियंत्रण और एचडीएल परख-कोलेस्ट्रॉल समाप्ति और monocyte chemotaxis परख) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एचडीएल फंक्शन की लिपिड पेरोक्साइड की परख में एचडीएल-C की विशिष्ट मात्रा के अनुसार उच्च लिपिड पेरोक्साइड सामग्री का पता लगा सकते हैं vivo में।
एचडीएल अलग था और HDLox के रूप में ५० स्वस्थ विषयों में प्रोटोकॉल में वर्णित है और एचआईवी संक्रमण के साथ १०० रोगियों निर्धारित किया गया था । एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों के नियंत्रण (1.01 ± 0.31) (p & #60; ०.००१) की तुलना में उच्चतर HDLox (1.59 ± 0.53) था । यह आंकड़ा ३२संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल यहां वर्णित महत्वपूर्ण अनुसंधान atherosclerosis और मानव रोग में एचडीएल समारोह की भूमिका के बारे में सवालों के जवाब देने के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है । परख एचडीएल के प्रति मिलीग्राम एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री quantifies-सी एंजाइमी प्रवर्धन (एचआरपी) का उपयोग कर । इस दृष्टिकोण से पहले एचडीएल समारोह परख की ज्ञात सीमाओं से बचा जाता है (जैसे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति परख) के साथ महत्वपूर्ण विविधता कोशिकाओं के प्रकार के संबंध में इस्तेमाल किया, readout के प्रकार की सूचना दी, मानकीकरण की कमी और के प्रभाव को प्राप्त ट्राइग्लिसराइड्स7,15,३२. जैविक गुणों के बजाय जैव रासायनिक का निर्धारण (जैसे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति) एचडीएल का अधिक प्रतिलिपि हो सकता है । अंतर-परख प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता & #60; 10% एचडीएल फंक्शन की कोशिका-आधारित परख के साथ अनुकूल तुलना करता है, जहां अक्सर परख प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता है & #62; 15% (या रिपोर्ट नहीं) । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण लिपिड और फ्लोरोसेंट जांच३२के बीच जैव रासायनिक बातचीत की सीमा हो सकती है । एचडीएल ऑक्सीकरण का निर्धारण atherogenesis ४६के रोगजनन में धमनी की दीवार के भीतर oxidative तनाव की महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए हृदय रोगों के संदर्भ में प्रासंगिक है । हम इस तरह के atherosclerosis और मानव इम्यूनो वायरस संक्रमण (एचआईवी)३२के रूप में क्रोनिक oxidative तनाव के राज्यों में बिगड़ा एचडीएल समारोह का पता लगाने के लिए fluorochrome एचडीएल समारोह परख का उपयोग किया है । एचडीएल समारोह के जैव रासायनिक परख का उपयोग करना, कई अध्ययनों से मोटापा और हृदय रोग के साथ HDLox की एसोसिएशन की पुष्टि की है 19,21,27,३४,३५ ,३६,४७. गौरतलब है कि मानव पायलट के अध्ययन में हम मान्य सेल के साथ HDLox के संघों का प्रदर्शन आधारित परख, हृदय रोग के किराए के उपाय, प्रणालीगत सूजन, प्रतिरक्षा रोग और जुड़े हृदय और चयापचय जोखिम phenotypes३२,३६. हालांकि इस परख कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है पुराने एचआईवी संक्रमण३२,३८, atherosclerosis ३२ और मोटापा३६के रूप में विभिंन रोगों में एचडीएल समारोह की भूमिका पता है, यह करने के लिए रहता है सीवीडी (जैसे दिल के दौरे) के उपलब्ध नैदानिक अंतिमबिंदु के साथ बड़े पैमाने पर अध्ययन में मान्य ।

एचआरपी की उपस्थिति में पेरोक्साइड के साथ fluorochrome की प्रतिक्रिया अत्यधिक फ्लोरोसेंट resorufin का उत्पादन अच्छी तरह से ४८,४९की स्थापना की है । एचआरपी catalyzes गैर फ्लोरोसेंट fluorochrome के ऑक्सीकरण resorufin लाल५०,५१। इस ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया में मौजूद दोनों अंतर्जात पेरोक्साइड द्वारा संचालित किया जा सकता है (OH-) और एचडीएल-लिपिड पेरोक्साइड (लूह-) । कोलेस्ट्रॉल oxidase के बिना, resorufin (एचआरपी के साथ) एचडीएल कोलेस्ट्रॉल की एक विशिष्ट राशि के आंतरिक एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री को मात्रा में कर सकते हैं । ओह के पृष्ठभूमि उत्पादन-बफर की हवा ऑक्सीकरण का एक परिणाम के रूप में एक अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट readout से घटाया है । Resorufin में ज्यादातर नमूनों में न्यूनतम autofluorescence है । catalase के अलावा (1-4 यू/एमएल) प्रतिक्रिया बफर में जल्दी से अंतर्जात पेरोक्साइड क्षीण करना कर सकते है ताकि समय के साथ फ्लोरोसेंट readout में वृद्धि एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड से प्रेरित है । परख बहुमुखी है और मुक्त एचडीएल कोलेस्ट्रॉल३२,४८,४९ बनाम एचडीएल cholesteryl एस्टर में लिपिड पेरोक्साइड सामग्री का आकलन कर सकते हैं ।

वहां fluorochrome एचडीएल समारोह परख३२के कई रूपों रहे हैं । संक्षेप में, वहाँ रहे हैं 3 प्रमुख दृष्टिकोण: a) अच्छी तरह से एचडीएल (जैसे ५० µ एल) की एक विशिष्ट मात्रा में जोड़ें और बाद में नैदानिक प्रयोगशाला में निर्धारित के रूप में एचडीएल-C के स्तर से एचडीएल लिपिड peroxidation मान को सामान्य; ख) मानक वर्णमिति कोलेस्ट्रॉल परख के आधार पर प्रत्येक नमूने में एचडीएल-सी की एकाग्रता निर्धारित करें और फिर एचडीएल-c (उदा. 1 µ g) की एक विशिष्ट मात्रा को अच्छी तरह से जोड़ें; और ग) एचडीएल या apoA-I प्रोटीन सामग्री३२द्वारा readout हुए एचडीएल लिपिड peroxidation परख के लिए एचडीएल को अलग करने के तरीके पर भी कम से कम 3 प्रमुख दृष्टिकोण हैं: एक) एचडीएल कोलेस्ट्रॉल वर्षण जैसे पॉलीथीन ग्लाइकोल के साथ; ख) Immunoaffinity कब्जा; और ग) इस तरह के µ ltracentrifugation३२के रूप में एचडीएल अलगाव के लिए उच्च प्रवाह के तरीकों नहीं । इसके अलावा, परख बहुमुखी है और एचडीएल cholesteryl एस्टर में लिपिड पेरोक्साइड सामग्री का आकलन कर सकते है बनाम मुक्त एचडीएल कोलेस्ट्रॉल ३२। मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाइयों, मानकीकृत resorufin प्रतिदीप्ति इकाइयों, एक परित नियंत्रण३२के लिए सामान्यीकृत अनुपात जैसे परिणामों की रिपोर्ट करने के लिए कई तरीके हैं । यहां हम सबसे प्रतिलिपि दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं ।

यदि प्लाज्मा प्रयोग किया जाता है यह ट्यूबों कि थक्कारोधी 27,28के रूप में सोडियम साइट्रेट है में प्लाज्मा तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है । EDTA४० और हेपरिन सल्फेट ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ४१,४२. हेपरिन सल्फेट एचडीएल समारोह 27,28के जैव रासायनिक परख के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । हालांकि cryopreserved सीरम और प्लाज्मा लिपिड, एचडीएल समारोह और एचडीएल लिपिड peroxidation के निर्धारण के लिए इष्टतम हैं, cryopreserved के नमूने एचडीएल लिपिड peroxidation में सापेक्ष अंतर की तुलना कर सकते हैं । यह एक विशिष्ट अध्ययन के भीतर सभी नमूनों की प्रक्रिया करने के लिए महत्वपूर्ण है ठीक उसी तरह (एक ही फ्रीज-गल चक्र उदा) और विभिंन अध्ययनों के बीच नमूना प्रसंस्करण में अंतर से संबंधित संभावित संस्थापकों के लिए खाते में एक प्लेट में एक परित नियंत्रण शामिल हैं । लंबी अवधि के cryopreservation एचडीएल फंक्शन परख के परिणामों से समझौता कर सकते हैं४३ लेकिन एक अध्ययन के भीतर नमूनों के बीच एचडीएल लिपिड peroxidation में सापेक्ष मतभेद अभी भी मूल्यांकन किया जा सकता है अगर एक उचित परित नियंत्रण का उपयोग किया जाता है 27, 28.

महत्वपूर्ण बात, पहले एचडीएल समारोह परख मानकीकृत नहीं कर रहे हैं । यहाँ हम एक दृष्टिकोण का वर्णन जहां उपयुक्त नियंत्रण का उपयोग readout के मानकीकरण सुनिश्चित करता है. अधिक विशेष रूप से वहां कई ज्ञात पैरामीटर है कि इस तरह के मैट्रिक्स प्रभाव के रूप में एचडीएल समारोह के जैव रासायनिक परख के readout को प्रभावित कर सकते हैं (सीरम बनाम प्लाज्मा तैयारी की विधि, एल्ब्युमिन और अन्य प्रोटीन की उपस्थिति), cryopreservation, फ्रीज-गल ३२. एचडीएल फंक्शन fluorochrome परख को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानकों और प्रायोगिक रिएजेंटों३२के उपयोग के साथ मानकीकृत किया जा सकता है । हालांकि, वहां भीकई अज्ञात (या खराब विशेषता) प्रत्येक अध्ययन में और विभिंन व्यक्तियों है कि एचडीएल समारोह के परिणाम के निर्धारण को प्रभावित कर सकते है के बीच में संस्थापक । इस प्रकार, प्रत्येक थाली में हम एक दिए गए अध्ययन के भीतर ब्याज की विशिष्ट नमूनों से तैयार एक pooled एचडीएल नियंत्रण का उपयोग करें (है कि हूबहू संसाधित किया गया है) कि कलाकृतियों और संस्थापकों को कम करता है३२। प्लाज्मा रक्त बैंक के नमूने और नैदानिक प्रयोगशाला से एचडीएल-सी मूल्यों का उपयोग आगे परख३२मानकीकरण कर सकते हैं.

हम पहले से दिखाया है कि एचडीएल अलगाव के विभिंन तरीकों काफी एचडीएल समारोह के जैव रासायनिक परख के readout को प्रभावित कर सकते है 27,28,३२ लेकिन fluorochrome मज़बूती से माप HDLox कर सकते है चाहे एचडीएल अलगाव की ३२। एचडीएल आइसोलेशन तरीके एचडीएल फंक्शन के उच्च-प्रवाह अध्ययनों के लिए एक प्रमुख सीमित कारक हैं । Ultracentrifugation संदर्भ विधि आज माना जाता है, लेकिन एक समय लेने वाली विधि५२रहता है । ट्रो गलत है और नहीं मानकीकृत ५३। एचडीएल वर्षा के तरीके पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के रूप में polyanions का उपयोग शामिल करने के लिए supernatant ५४में एचडीएल छोड़ने लिपो कम घनत्व हाला. हालांकि इन तरीकों lipemic सीरम और एंजाइमी कोलेस्ट्रॉल प्रक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप के साथ चर परिणाम के रूप में कुछ कमियां प्रदर्शित ५५ मूल प्रक्रिया पर पहले संशोधनों मानकीकृत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध का उपयोग रिएजेंट एक सरल, विश्वसनीय और सही प्रक्रिया५६उपज । हालांकि खूंटी वर्षण आमतौर पर एचडीएल21,५७ रोगी सीरम से अलग करने के लिए विधि का उपयोग किया जाता है, एक प्रमुख मुद्दा एल्ब्युमिन५८जैसे गैर एचडीएल प्रोटीन की उपस्थिति है. Immunoaffinity अलगाव एचडीएल समारोह ३२पर एल्ब्युमिन के प्रभाव को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि एक विशिष्ट कैप्चर विधि के लिए HDLox में सापेक्ष अंतर का आकलन किया जा सकता है, एचडीएल के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी पूरी तरह से जटिल एचडीएल संरचनाओं पर कब्जा नहीं कर सकते । इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में उपयुक्त नियंत्रण का उपयोग करना, एचडीएल नमूनों के बीच HDLox में सापेक्ष मतभेद (खूंटी वर्षण से पृथक) मज़बूती से निर्धारित किया जा सकता है.

इस परख, एचडीएल समारोह के अंय सभी परख की तरह, मुख्य सीमाएं हैं । vivo में कोरोनरी दीवार में एचडीएल का ऑक्सीकरण काफी जटिल और विषम और लिपिड पेरोक्साइड सामग्री केवल आंशिक रूप से HDLox४६प्रतिबिंबित हो सकता है । एचडीएल संरचना और कार्य लगातार vivo में परिवर्तन और एक timepoint पर एचडीएल समारोह की माप समय५९पर अंत अंग रोग में एचडीएल रोग के प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते. यह ज्ञात नहीं है कि HDLox readout एचडीएल-सी, या एचडीएल प्रोटीन 22से सामान्यीकृत होना चाहिए । भविष्य नैदानिक अध्ययन परख के readout के महत्व को मांय करना चाहिए (एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड की मात्रा प्रति मिलीग्राम एचडीएल-C) ।

अंत में, fluorochrome एचडीएल समारोह परख एचडीएल (HDLox) की विशिष्ट मात्रा प्रति एचडीएल लिपिड पेरोक्साइड सामग्री के निर्धारण के लिए एक विश्वसनीय तरीका है । उच्च HDLox मूल्यों कम एचडीएल एंटीऑक्सीडेंट समारोह के साथ जुड़े रहे हैं । इस परख के readout सत्यापित सेल के साथ जुड़ा हुआ है आधारित परख, हृदय रोग के किराए के उपाय, प्रणालीगत सूजन, प्रतिरक्षा रोग और जुड़े हृदय और चयापचय जोखिम phenotypes 19, 21,27,३२,३४,३५,३६,३७,३८,३९, ४७. इस विधि मानव रोग में एचडीएल समारोह की भूमिका की जांच के लिए एक सुविधाजनक, अभी तक मजबूत उपकरण प्रदान करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

इस प्रोटोकॉल और परख पेटेंट पीसीटी के लिए प्रासंगिक है/US2015/018147 ।

Acknowledgments

लेखक कृतज्ञता इस मॉडल के पहले पुनरावृत्तियों के विकास में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए डॉ मोहम्द Navab, एलन Fogelman और श्रीनिवास रेड्डी के काम स्वीकार करते हैं । T.A.A. एक RMIT विश्वविद्यालय के कुलपति Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है । अज और आह NHMRC परियोजना अनुदान ११०८७९२ द्वारा समर्थित हैं । TK NIH अनुदान NIH K08AI08272, NIH/NCATS ग्रांट # µ l1tr000124 द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent Pointe Scientific H7511
Amplex Red reagent. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
DMSO. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP) Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Esterase. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
5x Reaction Buffer. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. TR39601
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). Sigma Aldrich M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). Sigma Aldrich M9936
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
ClipTip 200, sterile ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125  ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.  14-387--955
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gen5 2.01 software Biotek, Vermont, USA NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gen5 Plate reader Biotek, Vermont, USA NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक १२८ एचडीएल समारोह ऑक्सीकरण एचडीएल लिपिड peroxidation सेल मुक्त परख fluorometric विधि Amplex लाल
उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन में लिपिड Peroxidation के उच्च प्रवाह माप के लिए सेल मुक्त जैव रासायनिक Fluorometric एंजाइमी परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X.,… More

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter