Summary
Descriviamo qui un'analisi fluorometrica senza cellula biochimica per la determinazione di HDL-perossidazione lipidica. Questo test rapido e riproducibile può essere utilizzato per determinare la funzione di HDL in studi su larga scala e può contribuire alla nostra comprensione della funzione di HDL nella malattia umana.
Abstract
Lipoproteina ad alta densità bassa di livelli di colesterolo (HDL-C) sono uno dei più potenti predittori negativi indipendenti della malattia cardiovascolare aterosclerotica (CVD). La struttura e la funzione di HDL piuttosto che HDL-C può predire più accuratamente l'aterosclerosi. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l'aterosclerosi. Funzione di HDL è solitamente determinato dalla cella basata saggi come saggio di efflusso di colesterolo ma queste analisi hanno numerosi inconvenienti mancanza di standardizzazione. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. Ossidazione di HDL altera la funzione di HDL. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Interazioni lipido-sonda dovrebbero essere considerati quando l'interpretazione dei risultati di fluorescenza non enzimatici dosaggi per misurare lo stato ossidativo del lipido. Questo ci ha motivato a sviluppare un metodo enzimatico senza cellula biochimico per valutare HDL perossido contenuto lipidico (HDLox) che contribuisce a disfunzione di HDL. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C. Qui è un protocollo describedfor determinazione di HDL-perossidazione lipidica utilizzando il reagente fluorocromo. Variabilità di dosaggio può essere ridotto dalla rigorosa standardizzazione delle condizioni sperimentali. I valori più alti di HDLox sono associati con ridotta funzione antiossidante di HDL. La lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive di malattia cardiovascolare, l'infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico. Questo approccio tecnico è un metodo affidabile per valutare la funzione di HDL nella malattia umana dove l'infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l'aterosclerosi).
Introduction
Malattia aterosclerotica cardiovascolare (CVD) è la principale causa di morte nel mondo1,2. Studi epidemiologici hanno dimostrato che bassi livelli di colesterolo della lipoproteina ad alta densità (HDL) sono generalmente associati inversamente con il rischio per lo sviluppo di aterosclerosi1,2. Anche se parecchi studi sostengono un ruolo atheroprotective per HDL1,2, il meccanismo con cui HDL attenua l'inizio e la progressione di aterosclerosi è complesso 3,4. Così, è stato suggerito che la complessa struttura e la funzione di assoluto livello di HDL piuttosto che può prevedere più accuratamente aterosclerosi 5,6,7,8. Si verificano diversi HDL del lipido e della proteina compositivo modifiche che alterano la funzione di HDL negli Stati infiammatori come l'aterosclerosi. Questi i) ridurre le potenziali efflusso di colesterolo 9, ii) diminuire anti-infiammatori e aumentare HDL-collegati di proteine pro-infiammatorie 6,7, iii) ridurre i livelli di fattore antiossidante e attività e HDL capacità di inibire l'ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (LDLox)10 e iv) aumentare del lipido del perossido d'idrogeno contenuto e redox attività (HDLox)9,11. Saggi di robusti che valutano le funzioni di pleotropic di HDL (ad esempio di efflusso di colesterolo, funzione antiossidante) possono complementare determinazione del HDL-HDL-C nella clinica.
La funzione di HDL è solitamente valutata dai metodi basati su cellule quali il colesterolo efflusso dosaggio8,12,13,14. Questi metodi hanno limiti principali tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizzate, il tipo di lettura segnalata, mancanza di standardizzazione ed effetti confondenti di trigliceridi 7,15. Questi inconvenienti pongono difficoltà per grandi studi clinici16. Analisi senza cellula possono dare misure più robuste della funzione di HDL rispetto alle analisi cell-based. L'efflusso di colesterolo è una delle funzioni più importanti di HDL, ma può essere determinato solo da analisi cell-based. Altri approcci per determinare la funzione di HDL come proteomica17,18,19,20,21,22,23, 24 e chemiotassi del monocito basati su cellule di HDL funzione 17,22,25 non sono state standardizzate e non può essere utilizzati negli studi umani su larga scala.
HDL ha antiossidanti significative atheroprotective effetto5,6,7,8. La funzione antiossidante di HDL è stata determinata in presenza di LDL in precedente cella analisi fluorometriche gratis 26. Questi metodi fluorometrica biochimici della funzione antiossidante di HDL sono stati originariamente sviluppati da Mohamad Navab e Alan Fogelman e loro colleghi26. Anche se molti studi umani hanno utilizzato questi metodi per determinare HDL funzione 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipidi (HDL)-lipidica (LDL) e interazioni lipido-fluorocromo possono limitare la riproducibilità di questi saggi biochimici non enzimatico libero delle cellule del HDL funzione27,28.
L'interesse recente si è concentrata sulle conseguenze funzionali dell'ossidazione di HDL che è il risultato dell'ossidazione di lipidi e di proteine all'interno di HDL 27,29,30. Studi precedenti hanno dimostrato che l'ossidazione di HDL altera HDL funzione 27,29,30. HDL ha un ruolo importante nel trasporto perossido lipidico ed elevata quantità di perossidi del lipido è relativo a funzione anormale di HDL. Così il contenuto di perossido lipidico HDL può essere utilizzato per determinare HDL funzione 9,17,20,31 e dato le limitazioni note di analisi preventiva di HDL funzione7, 15,27,32, abbiamo sviluppato un metodo fluorimetrico alternativo che quantifica HDL lipidi perossido contenuto (HDLox) 32. Questo metodo si basa sulla perossidasi di rafano (HRP) e il fluorocromo rosso di Molceular che può quantificare (senza colesterolo ossidasi) il contenuto di perossido lipidico per mg di HDL-C 32. Il principio biochimico del dosaggio è mostrato nella Figura 1. Abbiamo dimostrato che questo approccio basato sulla fluorescenza non ha le limitazioni del precedente HDL funzione saggi27,28. Questo test è stato ulteriormente affinato e standardizzato nel nostro laboratorio in modo che può essere utilizzato in modo affidabile negli studi umani su larga scala anche con crioconservati plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. la lettura di questo test è associata con le letture di analisi cell-based convalidate, misure sostitutive della malattia cardiovascolare, l'infiammazione sistemica, disfunzione immune e fenotipi associati rischio cardiovascolare e metabolico 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. qui, Descriviamo questo metodo semplice, ma robusto per misurare il contenuto di perossido lipidico di HDL (HDLox). Questo test utilizzabile come strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nella malattia umana dove l'infiammazione sistemica, stress ossidativo e lipidi ossidati hanno un ruolo chiave (come l'aterosclerosi)32.
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Protocol
tutti gli esperimenti utilizzando campioni biologici umani sono stati eseguiti con l'approvazione di etica presso l'Università di California Los Angeles, Los Angeles e il Comitato di etica umana di Alfred Hospital, Melbourne.
Nota: ci sono molte variazioni della funzione fluorocromo HDL Assay (Vedi la discussione) 32. Qui di seguito descriviamo il protocollo che dà i risultati più coerenti e riproducibili. Una panoramica del test è illustrata nella Figura 2.
1. esemplare lavorazione
- uso fresco, non emolizzato (possono essere raccolti in provette separazione siero) del siero o plasma citrato ottenuto dopo 12-14 ore di digiuno. Se utilizza campioni crioconservati, includere il controllo appropriato come descritto in questo protocollo.
2. Giorno 0-preparazione per l'analisi
- preparare layout di lavoro di esperimento con gli opportuni controlli, campioni e replica. Eseguire almeno ogni esempio in triplici copie. Un rappresentante 96 ben layout è illustrato nella Figura 3.
- Calcolare tutti i volumi dei reagenti che verranno utilizzati per il dosaggio basato sul numero di campioni e replicati.
Nota: Includere un volume supplementare di 10% in ogni magazzino di lavoro per assicurarsi che ci sia abbastanza volume per ciascun reagente per l'esperimento specifico. - Provette obbligatori per tutte le diverse fasi del dosaggio ad es. per la separazione di HDL, misura di HDL-C (opzionale) e il fluorochromeassay.
3. Giorno 1-la preparazione dei controlli
- preparazione del controllo pool specifici dello studio
- Crea un campione di controllo da pool di plasma o siero di studio tutti i campioni. Se in esecuzione 20 campioni in ogni piatto in triplice copia, è possibile combinare 10 µ l di ogni campione in un controllo di 200 µ l in pool. Dare un'aliquota separata di questo controllo in pool per il laboratorio clinico per determinare il valore di HDL-C di questo controllo.
Nota: Utilizzare questo controllo in pool per standardizzare il dosaggio e conto per tutti i possibili noto (ad esempio tipo di siero di matrice rispetto al plasma, cicli di gelo-disgelo, crioconservazione) e sconosciuti fattori di confondimento che possono influenzare la variabilità sperimentale 27 , 28.
- Crea un campione di controllo da pool di plasma o siero di studio tutti i campioni. Se in esecuzione 20 campioni in ogni piatto in triplice copia, è possibile combinare 10 µ l di ogni campione in un controllo di 200 µ l in pool. Dare un'aliquota separata di questo controllo in pool per il laboratorio clinico per determinare il valore di HDL-C di questo controllo.
- Preparazione di specifici del laboratorio controllo qualità (QCs)
- preparare un grande magazzino di HDL in ciascun laboratorio (ad esempio HDL isolato da 5 mL di plasma di donatori sani 10) e crioconservare diverse aliquote di questo magazzino per ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo.
- Uso almeno 10 diversi replica da questo stock per determinare il valore medio di HDLox. Una gamma accettabile di HDLox misurato valori per ciascun campione QC incluso in ogni dosaggio è all'interno di < 15% del coefficiente di variazione di questo valore medio.
- Dare un'aliquota separata di questo controllo in pool per il laboratorio clinico per determinare il valore di HDL-C di questo controllo (es. 40 mg/dL).
Nota: Un approccio dettagliato come utilizzare sangue da banche del sangue per creare questi controlli è stato precedentemente descritto 27 , 28 , 32. Utilizzare ulteriori QCs come necessario (per esempio uno da un donatore sano, noto per avere la funzione di HDL normale e uno da un donatore conosciuto per avere la funzione di HDL in gran parte anormale.
- Ottimizzazione del segnale di fondo e valori vuoti (opzionali)
- per ridurre al minimo di sfondo, aggiungere la quantità appropriata di catalasi (1-4 U/mL) nel medium di incubazione per rimuovere rapidamente il formato di H 2 O 2 a causa di ossidazione spontanea aria dei buffer.
Nota: Poiché i valori dai pozzetti vuoti (nessun HDL) sono essere sottratti dai valori dei campioni HDL e i risultati sono stati segnalati rispetto a un controllo in pool (che è incluso nello stesso piatto ben 96), abbiamo trovato che questo passaggio non praticamente non applicar t i risultati. Così, ottimizzazione del segnale sfondo con catalasi può essere omesso, se necessario.
- per ridurre al minimo di sfondo, aggiungere la quantità appropriata di catalasi (1-4 U/mL) nel medium di incubazione per rimuovere rapidamente il formato di H 2 O 2 a causa di ossidazione spontanea aria dei buffer.
4. Giorno 1-separazione di HDL colesterolo usando la precipitazione di HDL
Nota: utilizzare un reagente precipitante di HDL colesterolo standardizzato commercialmente disponibile per isolare apoB impoverito siero secondo il produttore ' s istruzioni. Questi reagenti sono ampiamente usati in saggi colorimetrici per determinare i livelli di colesterolo di HDL.
- Fresca (o sbloccare) campione di plasma o siero.
- Mescolare volumi uguali (per esempio 80 µ l) di plasma e reagente precipitante colesterolo di HDL (20% w/v polietilene glicole in tampone di glicina a pH 10,0 (25 ° C)).
- Mix ben pipettando su e giù.
- Centrifugare a 1000-2000 x g per 10 min.
- Aspirare il supernatante (frazione di HDL).
- Idealmente utilizzare immediatamente l'HDL isolato per il fluorochromeassay di perossidazione lipidica di HDL. Tuttavia, se parecchi campioni vengono eseguiti nello stesso giorno e altri passi come misura della concentrazione di HDL-colesterolo sono anche fatto, quindi memorizzare l'HDL isolato a 4 ° C e utilizzarlo il giorno successivo per la funzione di fluorochromeHDL Assay.
5. Giorno 1-determinazione di HDL-C a HDL isolato
Nota: questo è facoltativo se il valore di HDL-C da laboratorio clinico è utilizzato per normalizzare HDLox dalla quantità di HDL-C.
- Quantificare il HDL-colesterolo da plasma, utilizzando standard colorimetrico dosaggi 27. Aggiungere 50 µ l di reagente di colesterolo in ciascun pozzetto e calcolare la concentrazione di colesterolo mediante un lettore colorimetrico e un colesterolo standard fornito in ogni kit.
6. Giorno 2-preparazione dei reagenti
- preparare HRP e colesterolo soluzioni HRP 5 U/mL di soluzione (gamma 1-10 U/mL).
- Preparare 20mm fluorocromo (ad es., Molceular rosso) soluzioni: scongelare un flacone di reagente fluorocromo e DMSO a temperatura ambiente. Prima dell'uso, sciogliere reagente fluorocromo (1 mg) in 200 µ l di DMSO. Conservare la soluzione stock congelati a ≤-20 ° C, al riparo dalla luce.
- Preparare i controlli positivi e negativi: uso 1 X ' tampone di reazione ' senza colesterolo e 20 mM H 2 O 2 soluzione di lavoro come controllo positivo e negativo, rispettivamente.
7. Giorno 2-fluorocromo Assay
- aggiungere 50 µ l di tampone di reazione come vuoto (controllo negativo) 1x.
- Facoltativo: aggiungere la soluzione di lavoro di 20 mM di H 2 O 2 come controllo positivo in ogni piastra.
- Per ridurre al minimo la variabilità sperimentale e garantire che l'aggiunta di reagenti e campioni sono fatto costantemente e in modo tempestivo, eseguire tutte le aggiunte di campioni in un separato piastra di ben rotondo-fondo, chiaro, polistirolo o polipropilene 96 (tavola 1). Quindi utilizzare una pipetta multicanale per trasferire volumi specifici in 3 piastre da 96 pozzetti (piastre 2-4: bot in polipropilene, casalinghiTom, nero) (che hanno layout identico) ( Figura 2, Figura 3).
- , Ad esempio, aggiungere innanzitutto 160 µ l di HDL isolato in ogni pozzo/campione della piastra 1 e poi con l'uso di pipette multicanale trasferire 50 µ l di HDL-colesterolo da ciascun pozzo/campione nelle piastre 96 pozzetti nere. Cambiare suggerimenti tra ogni riga/colonna e utilizzare suggerimenti non filtrata per tutti i trasferimenti.
- Lasciare campioni nei pozzetti. Non gettare via. Non ci sono gradini di lavaggio tra aggiunta di reagenti.
- Aggiungere 50 µ l di soluzione di HRP 5 U/mL (0,25 U) in ciascun pozzetto.
Nota: Uso HRP prima dell'aggiunta del reagente fluorocromo. - Incubare 30 min a 37 ° C. Non gettare via i campioni dopo incubazione (senza fasi di lavaggio tra aggiunte dei reagenti).
- Aggiungere 50 µ l di fluorochromereagent per una concentrazione finale di 300 µM. A questo punto, volume di reazione totale è di 150 µ l. mescolare bene e proteggere dalla luce.
- Valutare la lettura fluorescente (nel buio) ogni minuto oltre 120 min a 37 ° C con un lettore di piastra fluorescente (filtri di 530/590 nm).
Nota: Utilizzare un intervallo di 60 minuti più breve con campioni freschi. Abbiamo trovato quel dosaggio di 120 minuti dà più dati riproducibili con l'uso di campioni crioconservati. - Registrare i dati utilizzando il software appropriato.
8. Giorno 3-analisi dei dati
- registrare unità di fluorescenza (unità arbitrarie) a 120 minuti dopo l'aggiunta del fluorocromo reagente per tutti i campioni compresi pozzetti del bianco e tutti i controlli.
- Calcolare il valore medio delle unità di fluorescenza (basato su almeno triplicates) (HDL ox_sample). Non assumere valori erratici (> 2 SDs dal valore medio) in considerazione.
- Sottrarre alla fluorescenza di fondo utilizzando la seguente equazione:
- normalizzazione per la quantità di colesterolo HDL (HDL-C): normalizzare il valore di perossidazione lipidica di HDLox per ogni campione (incluso il controllo pool) di HDL-C) (mg/dl). In tutta la sezione risultati, HDL bue è presentato come n (HDL-C) HDLox misura per riflettere la regolazione per HDL-C. Utilizzare la seguente equazione:
- standardizzare l'espressione del valore di perossidazione lipidica HDLox di ciascun campione contro il valore di un controllo in pool. Normalizzare la n (HDL-C) HDLox del lipido perossidazione valore per ogni campione (regolato per HDL-C) di n (HDL-C) HDLox valore di perossidazione lipidica del controllo in pool. In tutta la sezione risultati, HDL bue è presentato come misura di bue nHDL per riflettere la regolazione per la variabilità sperimentale e HDL-C. Utilizzare la seguente equazione:
Nota: questo approccio è simile ad altri approcci sperimentali stabiliti di ridurre la variabilità sperimentale delle misurazioni come International normalized ratio (INR) 44 , 45. Questo approccio è stato validato in studi clinici 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. - eseguire il controllo di qualità di risultati sperimentali utilizzando campioni di controllo di qualità standard. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri controlli di qualità (QCs). Idealmente, c'è un QC per nHDLox da un campione con noti HDL disfunzionali e un QC per nHDLox da un campione da donatori sani [ad es. uso campione da giovani adulti che sono stabiliti banca del sangue di donatori e non hanno conosciuto comorbidità e fattori di rischio per malattia cardiovascolare compreso il fumo]. Il controllo di quest'ultimo standardizza risultati tra i diversi laboratori. I valori medi di questi QCs sono stabiliti sulla base almeno 5 replicati (in genere si usa 10 replicati per questo importante passo).
- Check se misurato QCs in ogni dosaggio hanno valori entro l'intervallo di valori previsto. Supponendo che un'accettabile massima variabilità sperimentale del 15%, tutti i valori sperimentali misurati dovrebbero rientrare nel 15% dei valori medi noti di QC stabiliti. Utilizzare le seguenti equazioni:
Nota: se sia il controllo di qualità incluso campioni ( normali rispetto alle HDL disfunzionali) dà HDLox valori fuori intervallo previsto (stabilito in ciascun laboratorio) poi ripetere l'esperimento.
- Check se misurato QCs in ogni dosaggio hanno valori entro l'intervallo di valori previsto. Supponendo che un'accettabile massima variabilità sperimentale del 15%, tutti i valori sperimentali misurati dovrebbero rientrare nel 15% dei valori medi noti di QC stabiliti. Utilizzare le seguenti equazioni:
- Eseguire il controllo di qualità di risultati sperimentali utilizzando il coefficiente di variazione (CV) per quantificare la variabilità sperimentale: ripetere tutti i campioni con CV % > 15%. Utilizzare la seguente equazione:
Nota: un tipico intra-dosaggio (all'interno della placca stessa) e la variabilità sperimentale Inter-saggio (tra piastre differenti) è < 15%. 2) un tipico CV intra-assay è tra 1-7% e un tipico interassay CV è tra 3-10%.
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Representative Results
In tutti i pozzetti come al punto 7.3 vengono aggiunti 50 µ l di ciascun campione di HDL. 50 µ l di soluzione di HRP 5 U/mL (0,25 U) vengono quindi aggiunti in tutti i pozzetti come al punto 7.5. I campioni sono incubati per 30 min a 37 ° C come descritto al punto 7.6. 50 µ l di reagente fluorocromo vengono quindi aggiunti in tutti i pozzetti come al punto 7.7 (concentrazione finale di 300 µM). La lettura fluorescente (nel buio) è quindi valutata ogni minuto oltre 120 minuti a 37 ° C con un lettore di piastra fluorescente (filtri di 530/590 nm). Dati rappresentativi di fluorescenza per controllo vuoto, pool, campione con noti HDL disfunzionali e campione con normale HDL sono illustrato nella Figura 4. RAW dati rappresentativi e dettagliata analisi dei risultati utilizzando le equazioni descritte nella sezione 8 del protocollo sono riportati nella tabella 1. In questo esempio, sono stati utilizzati campioni freschi di HDL e i valori più alti di HDLox vengono in genere ottenuti con HDL fresco. Ad esempio, HDL notoriamente disfunzionale basata su analisi indipendente della funzione di HDL e da persona HIV-infettata aveva circa 2 volte relativamente più alta quantità di perossido lipidico rispetto al pool HDL da partecipanti in buona salute. La figura 5 Mostra risultati rappresentativi da uno studio con soggetti conosciuti per avere alterato HDL funzione28,32. Le persone affette da HIV ha avuto circa il 60% in più in alto significa HDL-perossido di lipidi (per mg di HDL-C) rispetto ai soggetti non infetti. In nostri precedenti studi pubblicati con HDL crioconservati, questo metodo è stato in grado di dimostrare almeno 10% differenze relative a HDLox rispetto a HDL da controllo gruppi (senza malattia cronica ad es. l'infezione da HIV)36,37, 38.
Figura 1: Determinazione del contenuto di perossido lipidico HDL per specifiche quantità di HDL-C.
Negli Stati di infiammazione sistemica e sforzo ossidativo HDL ha aumentato i perossidi del lipido (LOOH) (HDLox) che sono associati con la funzione alterata di HDL. HRP catalizza l'ossidazione del fluorocromo non fluorescente a fluorescente Resorufina rosso. Questa ossidazione può essere guidata da perossidi endogeni presenti nella reazione (OH-) e perossidi HDL-lipidica (LOOH-). Resorufina (con HRP), senza colesterolo ossidasi, è in grado di quantificare il contenuto di perossido intrinseco dei lipidi HDL di una specifica quantità di colesterolo HDL. La produzione di sfondo di OH - a causa dell'ossidazione di aria del buffer viene sottratto la lettura fluorescente di ciascun pozzetto. Resorufina ha minimo autofluorescenza nella maggior parte dei campioni. Questa figura è stato modificato 32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica del flusso di lavoro per la fluorochromeassay di perossidazione lipidica di HDL.
Giorno 0: Preparazione per il saggio: A) progettare 96 piastra ben formati, stimare il volume di necessari campioni (plasma/siero) e reagenti (enzima HRP, fluorocromo reagente, buffer, PEG reagente), etichettare provette
Giorno 1: Preparazione per il dosaggio e l'isolamento di HDL: A) preparazione di precipitazione di controlli (controllo dello studio specifico in pool, controlli di qualità, controlli positivi e negativi) B) HDL PEG un reagente.
Giorno 2: Preparazione per il test (se non fatto in 1 giorno) e test di fluorocromo: A) preparazione di controlli (controllo dello studio specifico in pool, controlli di qualità, controlli positivi e negativi) A) aggiunta di campioni di HDL: ridurre al minimo la variabilità sperimentale e garantire che l'aggiunta di reagenti e campioni saranno fatto costantemente e in modo tempestivo è consigliabile che tutte le aggiunte di campioni (ad esempio 160 µ l) in primo luogo sono fatte in un separato piastra di ben rotondo-fondo, chiaro, polistirolo o polipropilene 96 (tavola 1). Poi una pipetta multicanale può essere utilizzata per trasferire volumi specifici (ad es. 50 µ l) in 3 piastre da 96 pozzetti (piastre 2-4: polipropilene, fondo piatto, piastre nere) (che hanno layout identico). B) aggiunta di HRP: aggiungere 50 µ l di 5 U/mL (0,25 U) per ogni pozzetto usando una pipetta multicanale C) Incubare a 37 ° C per 30 min D) aggiungere 50 µ l di 300 µM/bene di fluorocromo reagente per ogni pozzetto usando una pipetta multicanale E) valutare la lettura fluorescente (nel buio) ogni minuto oltre 120 minuti a 37 ° C con un lettore di piastra fluorescente (filtri di 530/590 nm).
Giorno 3: Analisi di dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Layout rappresentativo di 96 pozzetti che vengono in genere utilizzati nella funzione fluorocromo HDL Assay.
Differenze nei tempi di aggiunta dei campioni di HDL nei pozzetti di una piastra possono portare a differenze nell'ossidazione spontanea tra diversi pozzi. Per ridurre al minimo la variabilità sperimentale, evitare ossidazione spontanea variabile tra diversi pozzetti e garantire che aggiunta di reagenti e campioni sarà fatto costantemente e in modo tempestivo, è consigliabile che tutte le aggiunte di campioni (ad esempio 160 µ l) sono in primo luogo fatto in un separato 96 ben rotondo-fondo, chiaro, polistirolo o la lastra in polipropilene (tavola 1). Poi una pipetta multicanale può essere utilizzata per trasferire volumi specifici (ad es. 50 µ l) in 3 piastre da 96 pozzetti (piastre 2-4: polipropilene, fondo piatto, piastre nere) (che hanno layout identico). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dati rappresentativi del dosaggio di perossidazione lipidica HDL.
La lettura fluorescente (nel buio) è quindi valutata ogni minuto oltre 120 minuti a 37 ° C con un lettore di piastra fluorescente (filtri di 530/590 nm). Dati rappresentativi (unità arbitrarie) sono mostrati per vuoto (nessun HDL; controlli negativi), controllo positivo (H2O2), controllo di HDL in pool e HDL da paziente conosciuto per avere HDL disfunzionali (basato su due funzione indipendente di HDL efflusso di colesterolo-saggi e analisi di chemiotassi del monocito). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Il dosaggio di perossido lipidico della funzione di HDL può rilevare perossido del lipido alto contenuto per specifiche quantità di HDL-C in vivo.
HDL è stato isolato e HDLox è stata determinata come descritto nel protocollo in 50 soggetti sani e 100 pazienti con infezione da HIV. Le persone affette da HIV ha avuto maggiore HDLox (1.59±0.53) rispetto ai controlli (1.01±0.31) (p < 0.001). Questa figura è stato modificato 32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto qui offre un robusto strumento per rispondere alle domande di ricerca importante per quanto riguarda il ruolo della funzione di HDL nell'aterosclerosi e nella malattia umana. Il dosaggio quantifica il contenuto di perossido lipidico HDL per mg di HDL-C usando amplificazione enzimatica (HRP). Questo approccio evita limitazioni note di saggi per la funzione di HDL preventiva (ad es. il saggio di efflusso di colesterolo) tra cui eterogeneità significativa per quanto riguarda i tipi di celle utilizzate, il tipo di lettura segnalata, mancanza di standardizzazione ed effetti confondenti di trigliceridi7,15,32. Determinazione della biochimica anziché proprietà biologiche (es. efflusso di colesterolo) di HDL potrebbe essere più riproducibile. La variabilità sperimentale Inter-saggio di < 10% confronta favorevolmente con i dosaggi basati su cellule di funzione di HDL, dove la variabilità sperimentale interdosaggio è spesso > 15% (o non segnalato). Inoltre, questo approccio può limitare le interazioni biochimiche tra lipidi e sonde fluorescenti32. Determinazione dell'ossidazione di HDL è rilevante nel contesto delle malattie cardiovascolari, dato il ruolo fondamentale dello sforzo ossidativo all'interno della parete arteriosa nella patogenesi di aterogenesi 46. Abbiamo utilizzato il test di funzione di HDL fluorocromo per rilevare la funzione alterata di HDL negli Stati di stress ossidativo cronico come aterosclerosi e Virus dell'immunodeficienza umana (HIV) infezione32. Utilizzando analisi biochimica della funzione di HDL, diversi studi hanno confermato l'associazione di HDLox con l'obesità e malattia cardiovascolare 19,21,27,34,35 ,36,47. Significativamente, in studi pilota umani abbiamo dimostrato associazioni di HDLox con analisi cell-based convalidate, misure di malattia cardiovascolare, l'infiammazione sistemica, disfunzione immune di surrogati e associati rischio cardiovascolare e metabolico fenotipi32,36. Anche se questo test è stato utilizzato in parecchi studi per affrontare il ruolo della funzione di HDL in diverse malattie quali l'infezione da HIV cronica32,38, aterosclerosi 32 e obesità36, resta da validato in studi su larga scala con endpoint clinici disponibili di CVD (ad es. attacchi di cuore).
La reazione del fluorocromo con perossidi in presenza di HRP per produrre Resorufina altamente fluorescente è affermata 48,49. HRP catalizza l'ossidazione del fluorocromo non fluorescente a Resorufina fluorescente rosso50,51. Questa ossidazione può essere guidata da perossidi endogeni presenti nella reazione (OH-) e perossidi HDL-lipidica (LOOH-). Resorufina (con HRP), senza colesterolo ossidasi, è in grado di quantificare il contenuto di perossido intrinseco dei lipidi HDL di una specifica quantità di colesterolo HDL. La produzione di sfondo di OH - a causa dell'ossidazione di aria del buffer viene sottratto la lettura fluorescente di ciascun pozzetto. Resorufina ha minimo autofluorescenza nella maggior parte dei campioni. Aggiunta della catalasi (1-4 U/mL) nel buffer di reazione può attenuare rapidamente perossidi endogeni affinché l'aumento la lettura fluorescente nel corso del tempo è guidato da HDL perossidi del lipido. Il dosaggio è versatile e in grado di valutare il contenuto perossido lipidico in esteri del colesterile HDL contro gratis HDL colesterolo32,48,49 .
Ci sono molte variazioni della funzione di HDL fluorocromo Assay32. Brevemente ci sono almeno 3 approcci principali: un) aggiungere un volume specifico di HDL (ad es. 50 µ l) per pozzetto e successivamente normalizzare il valore di perossidazione del lipido di HDL dal livello di HDL-C come determinato nel laboratorio clinico; b) determinare la concentrazione di HDL-C in ciascun campione basato su saggi colorimetrici standard del colesterolo e quindi aggiungere un importo specifico di HDL-C (es. 1 µ g) per pozzo; e c) normalizzare la lettura di funzione di HDL di HDL o apoA-I contenuto di proteina32. Ci sono anche almeno 3 principali approcci su come isolare HDL per saggi di perossidazione lipidica HDL: colesterolo HDL) precipitazione per esempio con glicole polietilenico; b) immunoaffinità cattura; e c) altri metodi standard non ad alta produttività per l'isolamento di HDL come µLtracentrifugation32. Inoltre, il dosaggio è versatile e in grado di valutare il contenuto perossido lipidico in esteri del colesterile HDL contro gratuito HDL colesterolo 32. Ci sono diversi modi per segnalare che i risultati ad esempio fluorescenza arbitrario, unità standardizzate Resorufina fluorescenza, rapporto a un pool di controllo32normalizzato. Qui presentiamo l'approccio più riproducibile.
Se il plasma è utilizzato è importante prepararsi al plasma in provette contenenti citrato di sodio come anticoagulante 27,28. Solfato di40 ed eparina EDTA può interferire con ossidazione reazioni 41,42. Solfato dell'eparina può interferire con le analisi biochimiche del HDL funzione 27,28. Sebbene crioconservato siero e plasma sono subottimali per determinazione di lipidi, la funzione di HDL e la perossidazione lipidica di HDL, campioni crioconservati è in grado di quantificare le differenze relative a perossidazione lipidica di HDL per mg di HDL. È importante elaborare tutti i campioni all'interno di uno studio specifico nello stesso esatto modo (ad es. stessi cicli di gelo-disgelo) e includere un controllo pool in ogni piatto per conto per i confounders potenziali legati a differenze di trattamento del campione tra diversi studi. Crioconservazione a lungo termine possa compromettere i risultati di HDL funzione saggi43 ma differenze relative di perossidazione lipidica HDL tra i campioni all'interno di uno studio possono ancora essere valutate se un appropriato controllo pool è usato 27, 28.
D'importanza, previa analisi di funzione di HDL non sono standardizzate. Qui descriviamo un approccio dove uso di adeguati controlli assicura la standardizzazione della lettura. Più specificamente, ci sono diversi parametri conosciuti che possono influenzare la lettura di saggi biochimici di HDL funzione come ad esempio gli effetti della matrice (siero vs metodo di preparazione dei plasma), presenza di albumina e altre proteine, crioconservazione, di congelamento-scongelamento 32. saggio di HDL la funzione fluorocromo può essere standardizzato con l'uso di standard commercialmente disponibili e reagenti sperimentale32. Tuttavia, ci sono anchediversi fattori di confondimento sconosciuti (o scarsamente caratterizzati) in ogni studio e tra persone differenti che possono influire sulla determinazione di HDL funzione risultati. Così, in ogni piatto usiamo un pool controllo HDL preparato dai campioni specifici di interesse all'interno di un dato studio (che sono state elaborate in modo identico) che riduce al minimo gli artefatti e i confounders32. Uso di campioni di plasma banca del sangue e i valori di HDL-C da laboratorio clinico può ulteriormente standardizzare il dosaggio32.
Abbiamo precedentemente dimostrato che diversi metodi di isolamento di HDL possono influenzare significativamente la lettura di saggi biochimici di HDL funzione 27,28,32 ma il fluorocromo può misurare in modo affidabile a prescindere dal HDLox isolamento del HDL 32. Metodi di isolamento di HDL sono un fattore limitante per gli studi di alto-rendimento della funzione di HDL. Ultracentrifugazione è considerato oggi il metodo di riferimento, ma rimane un metodo di tempo lunghi52. L'elettroforesi è imprecisa e non standardizzati 53. Metodi di precipitazione di HDL comportano l'uso di polianioni come polietilenglicole (PEG) a precipitare lipoproteine di densità bassa lasciando l'HDL nel surnatante 54. Sebbene questi metodi visualizzati alcuni inconvenienti quali risultati variabili con sieri lipemici e interferenze con modificazioni precedenti di colesterolo enzimatiche procedure 55 sull'originale procedura utilizzando standardizzati disponibili in commercio i reagenti resa una procedura semplice, affidabile e preciso56. Anche se la precipitazione di PEG è un metodo comunemente utilizzato per isolare HDL21,57 da siero del paziente, un grosso problema è la presenza di non-HDL proteine come l'albumina58. Immunoaffinità isolamento può essere utilizzato per ridurre al minimo l'effetto di albumina su HDL funzione 32. Anche se le differenze relative a HDLox per un metodo di acquisizione specifico possono essere valutate, anticorpi specifici contro HDL potrebbero non cogliere pienamente strutture complesse di HDL. Utilizzando controlli appropriati, come descritto in questo protocollo, differenze relative a HDLox tra gli esemplari di HDL (isolati dalla precipitazione di PEG) possono essere attendibilmente determinate.
Questo saggio, come tutte le altre analisi della funzione di HDL, ha limitazioni chiave. In vivo l'ossidazione di HDL nella parete arteriosa è piuttosto complesso ed eterogeneo e contenuto del perossido del lipido può riflettere solo parzialmente HDLox46. Funzione e struttura di HDL cambia continuamente in vivo e misura della funzione di HDL ad un determinato timepoint potrebbe non riflettere l'impatto della disfunzione di HDL nella malattia organo di estremità sopra tempo59. Non è noto se la lettura di HDLox deve essere normalizzata di HDL-C, o HDL proteina 22. Gli studi clinici futuri devono convalidare l'importanza della lettura del saggio (HDL perossido di lipidi per mg di HDL-C).
In conclusione, l'analisi di funzione fluorocromo HDL è un metodo affidabile per la determinazione del tenore di perossido di lipidi HDL per specifiche quantità di HDL (HDLox). I valori più alti di HDLox sono associati con ridotta funzione antiossidante di HDL. La lettura di questo test è associata con analisi cell-based convalidate, misure sostitutive di malattia cardiovascolare, l'infiammazione sistemica, disfunzione immune e rischio cardiovascolare e metabolico associato fenotipi 19, 21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. questo metodo offre un conveniente, robusto strumento per esaminare il ruolo della funzione di HDL nella malattia umana.
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Disclosures
Questo protocollo e il dosaggio sono rilevanti per il brevetto PCT/US2015/018147.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine il lavoro del Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman e Srinivasa Reddy per il loro ruolo chiave nello sviluppo di precedenti iterazioni di questo modello. T.A.A. è supportato da un RMIT University Vice-Cancelliere di Postdoctoral Fellowship. AJ e AH sono supportati da NHMRC progetto grant 1108792. TK è supportato da NIH concede NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # µL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387--955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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