Summary
Descrevemos aqui um ensaio livre celular bioquímico fluorométrica para determinação da peroxidação lipídica-HDL. Este ensaio rápido e reprodutível pode ser usado para determinar a função do HDL em estudos de grande escala e pode contribuir para nossa compreensão da função do HDL em doenças humanas.
Abstract
Os níveis de colesterol (HDL-C) baixa lipoproteína de alta densidade são um dos mais poderosos preditores independentes de negativos de doença cardiovascular aterosclerótica (CVD). A estrutura e a função do HDL, ao invés de HDL-C podem prever com mais precisão a aterosclerose. Ocorrem vários HDL proteínas e lipídios composicionais alterações que prejudicam a função do HDL em Estados inflamatórios como a aterosclerose. Função do HDL é geralmente determinada por célula com base em ensaios como ensaio de efluxo de colesterol mas estes ensaios tem numerosos de inconvenientes de falta de padronização. Ensaios sem célula podem dar mais eficázes de função de HDL em comparação com ensaios cell-based. Oxidação de HDL prejudica a função do HDL. HDL tem um papel importante no transporte de peróxidos lipídicos e alta quantidade de peróxidos lipídicos está relacionada com função anormal do HDL. Interações lipid-sonda devem ser consideradas quando a interpretação dos resultados de fluorescência não enzimáticos ensaios para medir o estado oxidativo de lipídios. Isto motivou-na desenvolver um método enzimático bioquímico celular livre para avaliar HDL peróxido teor lipídico (HDLox) que contribui para a disfunção de HDL. Este método baseia-se a enzima peroxidase de rábano (HRP) e o fluorocromo vermelho Amplex que pode quantificar (sem oxidase de colesterol), o teor de peróxido lipídico por mg de HDL-C. Eis um protocolo describedfor determinação da peroxidação lipídica HDL usando o reagente de fluorocromo. Variabilidade do ensaio pode ser reduzida pela padronização rigorosa das condições experimentais. Valores mais altos de HDLox estão associados com a função de antioxidante HDL reduzida. A leitura deste teste é associada com leituras de ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e fenótipos associados risco cardiovascular e metabólico. Esta abordagem técnica é um método robusto para avaliar a função do HDL em doenças humanas, onde a inflamação sistêmica, estresse oxidativo e lipídios oxidados têm um papel fundamental (tais como a aterosclerose).
Introduction
Doença cardiovascular aterosclerótica (DCV) é a principal causa de morte em todo o mundo1,2. Estudos epidemiológicos têm demonstrado que baixos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) colesterol geralmente estão inversamente associados com o risco para o desenvolvimento da aterosclerose1,2. Embora diversos estudos apoiam um papel atheroprotective para HDL1,2, o mecanismo pelo qual o HDL atenua o início e progressão da aterosclerose é complexo 3,4. Assim, tem sido sugerido que a complexa estrutura e função do HDL, ao invés de nível absoluto podem prever com mais precisão aterosclerose 5,6,7,8. Ocorrem vários HDL proteínas e lipídios composicionais alterações que prejudicam a função do HDL em Estados inflamatórios como a aterosclerose. Estes i) reduzir seu potencial de efluxo de colesterol 9, ii) diminuir anti-inflamatório e aumento de HDL-associado a proteínas pró-inflamatórias 6,7, iii) diminuição fator os níveis de antioxidantes e atividade e HDLs capacidade de inibir a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDLox)10 e iv) aumentar lipídico hidroperóxido conteúdo e redox atividade (HDLox)9,11. Robustos ensaios que avaliam as funções de pleotropic de HDL (tais como o efluxo de colesterol, função antioxidante) podem complementar a determinação de HDL-HDL-C, na clínica.
Função do HDL é geralmente avaliada por métodos baseados em células, tais como o colesterol efluxo ensaio8,12,13,14. Esses métodos têm limitações principais incluindo heterogeneidade significativa em relação a tipos de células utilizadas, tipo de leitura relatado, a falta de padronização e confundimento efeitos de triglicerídeos 7,15. Estas desvantagens apresentam dificuldades para grandes estudos clínicos16. Ensaios sem célula podem dar mais eficázes de função de HDL em comparação com ensaios cell-based. O efluxo de colesterol é uma das mais importantes funções de HDL, mas isso só pode ser determinado por ensaios cell-based. Outras abordagens para determinar a função do HDL como proteomics17,18,19,20,21,22,23, 24 e ensaios de quimiotaxia de monócitos baseada em célula de HDL função 17,22,25 não tem sido padronizados e não pode ser usados em estudos humanos em grande escala.
HDL tem antioxidante significativa atheroprotective efeito5,6,7,8. Determinou-se a função antioxidante de HDL na presença de LDL anterior célula livre ensaios fluorométrica 26. Estes métodos bioquímicos fluorométrica de função antioxidante de HDL foram originalmente desenvolvidos por Mohamad Navab e Alan Fogelman e seus colegas26. Embora muitos estudos humanos usaram estes métodos para determinar o HDL função 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipídios (HDL)-lipídeos (LDL) e interações lipid-fluorocromo podem limitar a reprodutibilidade destes celular grátis não enzimáticos bioquímicos ensaios de HDL função27,28.
Recente interesse centrou-se sobre as consequências funcionais da oxidação de HDL que é o resultado da oxidação de lipídios e proteínas dentro de HDL 27,29,30. Estudos prévios mostraram que oxidação de HDL prejudica HDL função 27,29,30. HDL tem um papel importante no transporte de peróxidos lipídicos e alta quantidade de peróxidos lipídicos está relacionada com função anormal do HDL. Assim, teor de peróxido lipídico HDL pode ser usado para determinar o HDL função 9,17,20,31 e dada as limitações conhecidas dos ensaios prévios de HDL função7, de27,de 15,32, desenvolvemos um método alternativo de fluorométrica que quantifica o HDL lipid índice de peróxido (HDLox) 32. Este método baseia-se a enzima peroxidase de rábano (HRP) e o fluorocromo vermelho Amplex que pode quantificar (sem oxidase de colesterol), o teor de peróxido lipídico por mg de HDL-C 32. O princípio bioquímico do ensaio é mostrado na Figura 1. Mostramos que essa abordagem baseada em fluorescência não tem as limitações de prévia HDL função ensaios27,28. Este ensaio tem sido ainda mais refinado e padronizado em nosso laboratório para que confiável pode ser usada em estudos humanos em grande escala, mesmo com criopreservado plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. a leitura deste teste é associada com leituras de ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e risco cardiovascular e metabólico associado fenótipos 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. aqui, descrevemos este método simples, porém robusto para medir o teor de peróxido do lipídico HDL (HDLox). Este ensaio pode ser usado como uma ferramenta para responder perguntas de pesquisas importantes sobre o papel da função de HDL em doenças humanas onde a inflamação sistêmica, estresse oxidativo e lipídios oxidados têm um papel-chave (tais como aterosclerose)32.
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Protocol
todos os experimentos utilizando amostras biológicas humanas foram realizados com aprovação de ética da Universidade da Califórnia em Los Angeles, Los Angeles e o Comité de ética humana do Alfred Hospital, Melbourne.
Nota: há muitas variações da função fluorocromo HDL ensaio (ver discussão) 32. Abaixo descrevemos o protocolo que dá os resultados mais consistentes e reprodutíveis. Uma visão geral do ensaio é mostrada na Figura 2.
1. processamento de amostras
- uso soro fresco, não hemolizado (podem ser coletadas em tubos de separador de soro) ou plasma citrato obtidos após 12-14 horas de jejum. Se usando amostras criopreservadas, incluem controle apropriado conforme descrito neste protocolo.
2. Dia 0-preparação para o ensaio
- preparar layout de trabalho de experiência com os controles apropriados, amostras e Replica. Execute cada amostra pelo menos em triplica. Um layout bem representante 96 é mostrado na Figura 3.
- Calcular todos os volumes dos reagentes que serão utilizados para o ensaio com base no número de amostras e repetições.
Nota: Incluir um volume adicional de 10% em cada estoque de trabalho para garantir que haja volume suficiente para cada reagente para o experimento específico. - Etiqueta tubos necessários para todas as diferentes etapas do ensaio, por exemplo, para a separação de HDL, medição de HDL-C (opcional) e o fluorochromeassay.
3. Dia 1-preparação de controles
- preparação de estudo específico em pool controle
- criar uma amostra de soro ou plasma em pool de estudo todas as amostras. Se executando 20 amostras em cada placa em triplicado, combine 10 µ l de cada amostra em um controle de 200 µ l em pool. Dê uma alíquota separada deste controle em pool para o laboratório clínico para determinar o valor de HDL-C deste controle.
Nota: Usar esse controle em pool para padronizar o ensaio e contabilizar tudo possível conhecido (por exemplo, tipo de soro de matriz versus plasma, ciclos de gelo-degelo, criopreservação) e confundidores desconhecidas que podem afetar a variabilidade experimental 27 , 28.
- criar uma amostra de soro ou plasma em pool de estudo todas as amostras. Se executando 20 amostras em cada placa em triplicado, combine 10 µ l de cada amostra em um controle de 200 µ l em pool. Dê uma alíquota separada deste controle em pool para o laboratório clínico para determinar o valor de HDL-C deste controle.
- Preparação específicas do laboratório de controle de qualidade (QCs)
- preparar um grande estoque de HDL em cada laboratório (por exemplo HDL isolada de 5 mL de plasma de 10 doadores saudáveis) e cryopreserve várias alíquotas do presente ações para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento.
- Uso de pelo menos 10 diferentes Replica deste estoque para determinar o valor médio de HDLox. Uma faixa aceitável de medição HDLox valores para cada amostra QC incluída em cada ensaio é dentro < 15% do coeficiente de variação deste valor médio.
- Dar uma alíquota separada deste controle em pool para o laboratório clínico para determinar o valor de HDL-C de controle (por exemplo, 40 mg/dL).
Nota: Uma abordagem detalhada como usar sangue de bancos de sangue para criar esses controles anteriormente foi descrito 27 , 28 , 32. Use QCs adicionais conforme necessário (por exemplo, uma de um doador saudável, conhecido por ter a função de HDL normal e uma de um doador conhecido por ter a função de HDL em grande parte anormal.
- Otimização de sinal de fundo e valores em branco (opcionais)
- para minimizar o plano de fundo, adicionar a quantidade apropriada de catalase (1-4 U/mL) no meio de incubação para remover rapidamente o formado de H 2 O 2 devido à oxidação do ar espontânea dos buffers.
Nota: Desde que os valores dos poços em branco (não HDL) estão sendo subtraídos os valores das amostras de HDL e os resultados estão sendo relatados em relação a um controle em pool (que está incluído no mesmo prato bem 96), encontramos que este passo é que praticamente não afecte t os resultados. Assim, a otimização do sinal de fundo com catalase pode ser omitida, se necessário.
- para minimizar o plano de fundo, adicionar a quantidade apropriada de catalase (1-4 U/mL) no meio de incubação para remover rapidamente o formado de H 2 O 2 devido à oxidação do ar espontânea dos buffers.
4. Dia 1-separação de HDL-colesterol utilizando a precipitação de HDL
Nota: Use um reagente precipitante comercialmente disponível de padronizada HDL colesterol para isolar apoB empobrecido soro de acordo com o fabricante ' s instruções. Estes reagentes são amplamente utilizados em ensaios colorimétricos para determinar os níveis de colesterol HDL.
- Usar fresco (ou descongelar) amostra de soro ou plasma.
- Misturar volumes iguais (por exemplo, 80 µ l) de plasma e reagente precipitante do HDL colesterol (20% w/v polietilenoglicol em tampão glicina pH 10,0 (25 ° C)).
- Mix bem pipetando para cima e para baixo.
- Centrifugar a 1000 a 2000 x g por 10 min.
- Aspire o sobrenadante (fração de HDL).
- Idealmente usar imediatamente o HDL isolado para o fluorochromeassay de peroxidação lipídica de HDL. No entanto, se várias amostras são executadas no mesmo dia e outros passos, tais como a medição da concentração de HDL-colesterol também são feitas, então armazenar o HDL isolado a 4 ° C e usá-lo no dia seguinte para a função de fluorochromeHDL ensaio.
5. Dia 1-determinação de HDL-C, HDL isolado
Nota: isto é opcional, se o valor de HDL-C de laboratório clínico é usado para normalizar HDLox pela quantidade de HDL-C.
- Quantify o HDL-colesterol do plasma, utilizando padrão colorimétrico ensaios 27. Adicionar 50 µ l de reagente de colesterol em cada poço e determinar a concentração de colesterol, usando um leitor colorimétrico e um colesterol padrão fornecido em cada kit.
6. Dia 2-preparação dos reagentes
- soluções preparar HRP e colesterol de HRP 5 U/mL de solução (intervalo de 1-10 U/mL).
- Preparar 20mm fluorocromo (por exemplo, Amplex vermelho) soluções: descongelar um frasco de reagente fluorocromo e DMSO à temperatura ambiente. Antes da utilização, dissolva o reagente fluorocromo (1 mg) em 200 µ l de DMSO. Armazenar a solução estoque congelada no ≤-20 ° C, protegido da luz.
- Preparar controles positivos e negativos: uso 1 X ' amortecedor da reação ' sem colesterol e 20 mM H 2 O 2 solução de trabalho como um controle negativo e positivo, respectivamente.
7. Dia 2-fluorocromo ensaio
- Adicionar 50 µ l de tampão de reação como branco (controle negativo) 1x.
- Opcional: Adicionar solução de trabalho de 20 mM de H 2 O 2 como controle positivo em cada placa.
- Para minimizar a variabilidade experimental e certifique-se que a adição de reagentes e amostras é feitas de forma consistente e em tempo hábil, realizar todas as adições de amostras em uma placa separada de bem fundo redondo, claro, poliestireno ou polipropileno 96 (chapa 1). Em seguida, usar uma pipeta multicanal para transferir volumes específicos em 3 placas de 96 poços (placas de 2-4: polipropileno, plana botTom, preto) (que tem o layout idêntico) ( Figura 2, Figura 3).
- Por exemplo, primeiro adicione 160 µ l de HDL isolado em cada poço/amostra de placa 1 e depois com o uso da pipeta multicanal transferir 50 µ l de HDL-colesterol de cada poço/amostra para as placas de 96 poços pretas. Mudar dicas entre cada linha/coluna e usar dicas não filtrada para todas as transferências.
- Deixar amostras dos poços. Não jogue fora. Não há nenhum etapas de lavagem entre adição dos reagentes.
- Adicionar 50 µ l de solução de HRP 5 U/mL (0,25 U) em cada Pocito.
Nota: Uso HRP antes da adição do reagente fluorocromo. - Incube durante 30 min a 37 ° C. Não descartar amostras após incubação (sem etapas de lavagem entre adições de reagentes).
- Adicionar 50 µ l de fluorochromereagent para uma concentração final de 300 µM. Neste ponto, a reação total volume é 150 µ l. Misture bem e proteger da luz.
- Avaliar a leitura fluorescente (no escuro) cada minuto mais de 120 min a 37 ° C, com um leitor de placa fluorescente (filtros de 530/590 nm).
Nota: Utilize um intervalo de 60 minutos mais curto com amostras frescas. Encontramos esse ensaio de 120 minutos dá mais dados podem ser reproduzidos com a utilização de amostras criopreservadas. - Gravar dados usando o software apropriado.
8. Análise de dados 3 dia
- gravar unidades de fluorescência (unidades arbitrárias) 120 minutos após a adição do fluorocromo reagente para todas as amostras, incluindo poços em branco e todos os controles.
- Calcular o valor médio das unidades de fluorescência (com base em, pelo menos, triplica) (HDL ox_sample). Não tome valores atípicos (> 2 SDs de valor médio) em consideração.
- Subtrair a fluorescência de fundo usando a seguinte equação:
- normalização para a quantidade de colesterol HDL (HDL-C): normalizar o valor de peroxidação lipídica HDLox para cada amostra (incluindo o controle em pool) pela HDL-C) (mg/dl). Em toda a seção de resultados, HDL boi é apresentado como n HDLox (HDL-C) medida para refletir o ajustamento para HDL-C. Use a seguinte equação:
- padronizar a expressão do HDLox valor de peroxidação lipídica de cada amostra contra o valor de um controle em pool. Normalize o n (HDL-C) HDLox valor de peroxidação lipídica para cada amostra (ajustada para HDL-C) pelo n (HDL-C) HDLox valor de peroxidação lipídica do controle em pool. Em toda a seção de resultados, HDL boi é apresentado como medida de boi nHDL para refletir a adaptação à variabilidade experimental e HDL-C. Use a seguinte equação:
Nota: esta abordagem é semelhante a outras abordagens experimentais estabelecidas para reduzir variabilidade experimental das medições, tais como internacional normalizado ratio (INR) 44 , 45. Esta abordagem foi validada em estudos clínicos 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. - Executar controle de qualidade dos resultados experimentais usando amostras de controlo de qualidade padrão. Cada laboratório deve estabelecer seus próprios controles de qualidade (QCs). Idealmente, há um QC para nHDLox de uma amostra com conhecidos HDL disfuncional e um QC para nHDLox de uma amostra de doadores saudáveis [por exemplo, uso amostras de jovens adultos que são estabelecidos banco de sangue de doadores e não tem conhecida comorbidade e fatores de risco para doença cardiovascular incluindo fumar]. Controle o último padroniza resultados entre diferentes laboratórios. Os valores médios destes QCs são com base em pelo menos 5 é replicada estabelecidas (normalmente usamos 10 repetições para este passo importante).
- Seleção se QCs medidos em cada ensaio têm valores dentro do intervalo esperado de valores. Assumindo uma variabilidade experimental máxima aceitável de 15%, todos os valores medidos experimentais devem cair dentro de 15% dos valores médios conhecidos do QC estabelecido. Use as seguintes equações:
Nota: se também do controle da qualidade incluído amostras ( normal versus disfuncional HDL) dá HDLox valores fora do intervalo esperado (estabelecido em cada laboratório), em seguida, repetir a experiência.
- Seleção se QCs medidos em cada ensaio têm valores dentro do intervalo esperado de valores. Assumindo uma variabilidade experimental máxima aceitável de 15%, todos os valores medidos experimentais devem cair dentro de 15% dos valores médios conhecidos do QC estabelecido. Use as seguintes equações:
- Executar controle de qualidade dos resultados experimentais, usando o coeficiente de variação (CV) para quantificar a variabilidade experimental: repetir todas as amostras com CV % > 15%. Use a seguinte equação:
Nota: é um típico intraensaio (dentro da mesma placa) e variabilidade experimental inter-ensaio (entre diferentes placas) < 15%. 2) um típico intraensaio CV é entre 1-7% e um típico interassay CV é entre 3-10%.
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Representative Results
50 µ l de cada amostra de HDL são adicionados em cada poço como no passo 7.3. 50 µ l de solução HRP 5 U/mL (0,25 U) são adicionados para cada poço como na etapa 7.5. As amostras são incubadas por 30 min a 37 ° C, como na etapa 7,6. 50 µ l de reagente fluorocromo são então somados para cada poço como na etapa 7,7 (concentração final de 300 µM). A leitura fluorescente (no escuro) é então avaliada cada minuto mais de 120 minutos a 37 ° C, com um leitor de placa fluorescente (filtros de 530/590 nm). Dados representativos da fluorescência para controle em branco, em pool, amostra com conhecidos HDL disfuncional e amostra com HDL normal são mostrados na Figura 4. Dados brutos representativos e passo a análise dos resultados utilizando as equações descritas na seção 8 do protocolo são mostrados em tabela 1. Neste exemplo, foram utilizadas amostras frescas de HDL e valores mais altos de HDLox geralmente são obtidos com HDL fresco. Por exemplo, o HDL, conhecido por ser disfuncionais ensaios independentes com base em função de HDL e de pessoa infectadas pelo VIH tinha aproximadamente 2 vezes relativamente maior quantidade de peróxido lipídico em comparação com o HDL em pool de participantes saudáveis. A Figura 5 mostra resultados representativos de um estudo com temas conhecidos para ter prejudicado HDL função28,32. As pessoas infectadas pelo HIV tinham cerca de 60% mais alto significa o teor de peróxido HDL-lipídico (por mg de HDL-C) em relação às pessoas não infectadas. Em nossos estudos publicados prévios com HDL criopreservado, este método foi capaz de demonstrar, pelo menos, 10% diferenças relativas em HDLox comparado a HDL do controle grupos (sem doença, por exemplo, infecção de HIV crônica)36,37, 38.
Figura 1: Determinação do teor de peróxido lipídico HDL por quantidade específica de HDL-C.
Nos Estados de inflamação sistêmica e estresse oxidativo HDL aumentou peróxidos lipídicos (LOOH) (HDLox) que estão associados com insuficiência de HDL. HRP catalisa a oxidação do fluorocromo não-fluorescente para vermelho fluorescente resorufin. Esta oxidação pode ser conduzida por tanto endógenos peróxidos presentes na reação (OH-) e os peróxidos HDL-lipídico (LOOH-). Sem oxidase de colesterol, resorufin (com HRP) pode quantificar o teor de HDL intrínseco lipídico de peróxido de uma quantidade específica de HDL-colesterol. A produção de fundo de OH - como resultado da oxidação do ar do buffer é subtraída a leitura fluorescente de cada poço. Resorufin tem mínima autofluorescência na maioria das amostras. Esta figura tem sido modificados 32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral do fluxo de trabalho para o fluorochromeassay de peroxidação lipídica de HDL.
Dia 0: Preparação para o ensaio: A) design 96 layouts de placa bem, estimar o volume de necessários (soro/plasma) de amostras e reagentes (enzima HRP, fluorocromo reagente, amortecedores, reagente PEG), rotular tubos
Dia 1: Preparação para o ensaio e o isolamento de HDL: A) preparação de precipitação de HDL B) controles (estudo específico-pool controle, controles de qualidade, controles positivos e negativos) usando o reagente de PEG.
Dia 2: Preparação para o ensaio (se não feito em 1 dia) e o ensaio de fluorocromo: A) preparação do controles (estudo específico-pool controle, controles de qualidade, controles positivos e negativos) A) adição de amostras de HDL: para minimizar a variabilidade experimental e Certifique-se de que além dos reagentes e amostras serão feitas consistentemente e em uma maneira oportuna recomenda-se que todos os acréscimos de amostras (por exemplo, 160 µ l) são feitos primeiro em um prato separado de bem fundo redondo, claro, poliestireno ou polipropileno 96 (chapa 1). Em seguida, uma pipeta multicanal pode ser usada para transferir volumes específicos (por exemplo, 50 µ l) em 3 placas de 96 poços (placas de 2-4: polipropileno, fundo redondo, pretas placas) (que tem o layout idêntico). B) adição de HRP: Adicionar 50 µ l de 5 U/mL (0,25 U) para cada poço usando uma pipeta multicanal C) incubar a 37 ° C por 30 min D) adicionar 50 µ l membros de 300 µM/bem de fluorocromo reagente a cada poço usando uma pipeta multicanal E) avaliar a leitura fluorescente (no escuro), cada minuto mais de 120 minutos a 37 ° C, com um leitor de placa fluorescente (filtros de 530/590 nm).
Dia 3: Análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Layout representativo de 96 placas bem que normalmente são usados na função fluorocromo HDL do ensaio.
Diferenças no momento da adição de amostras de HDL em poços de uma placa podem levar a diferenças na oxidação espontânea entre diferentes poços. Para minimizar a variabilidade experimental, evitar a oxidação espontânea variável entre diferentes poços e garantir que a adição de reagentes e amostras será feita constantemente e em tempo hábil, é recomendável que todos os acréscimos de amostras (por exemplo, 160 µ l) são Primeiro, feito em um separado poliestireno 96 de fundo bem redondo, claro, ou placa de polipropileno (chapa 1). Em seguida, uma pipeta multicanal pode ser usada para transferir volumes específicos (por exemplo, 50 µ l) em 3 placas de 96 poços (placas de 2-4: polipropileno, fundo redondo, pretas placas) (que tem o layout idêntico). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dados representativos do ensaio de peroxidação lipídica HDL.
A leitura fluorescente (no escuro) é então avaliada cada minuto mais de 120 minutos a 37 ° C, com um leitor de placa fluorescente (filtros de 530/590 nm). Dados representativos (unidades arbitrárias) são mostrados para espaço em branco (não HDL; controles negativos), controle positivo (H2O2), controle em pool de HDL e HDL de paciente conhecido por ter HDL disfuncional (com base na função de HDL dois independente efluxo de colesterol-ensaios e ensaio de quimiotaxia de monócitos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O ensaio de peróxido lipídico da função de HDL pode detectar peróxido lipídico elevado conteúdo por uma quantidade específica de HDL-C em vivo.
HDL foi isolado e HDLox foi determinada conforme descrito no protocolo em 50 indivíduos saudáveis e 100 pacientes com infecção pelo HIV. As pessoas infectadas pelo HIV tinham maior HDLox (1.59±0.53) em comparação com os controles (1.01±0.31) (p < 0.001). Esta figura tem sido modificados 32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui oferece uma ferramenta robusta para responder perguntas importantes pesquisas sobre o papel da função de HDL em aterosclerose e doenças humanas. O ensaio quantifica o teor de peróxido lipídico HDL por mg de HDL-C usando amplificação enzimática (HRP). Essa abordagem evita as limitações conhecidas dos ensaios de função prévias HDL (por exemplo, o ensaio de efluxo de colesterol) incluindo a heterogeneidade significativa em relação a tipos de células utilizadas, tipo de leitura que relatou, falta de padronização e confundimento efeitos de triglicerídeos7,15,32. Determinação de bioquímica em vez de propriedades biológicas (por exemplo, efluxo de colesterol) de HDL pode ser mais reprodutível. A variabilidade experimental inter-ensaio de < 10% compara-se favoravelmente com os ensaios cell-based da função do HDL, onde inter variabilidade experimental é frequentemente > 15% (ou não declarados). Além disso, esta abordagem pode limitar as interações bioquímicas entre lipídios e fluorescentes sondas32. Determinação da oxidação de HDL é relevante no contexto de doenças cardiovasculares, dado o papel chave do estresse oxidativo dentro da parede arterial na patogênese da atherogenesis 46. Nós usamos o ensaio da função fluorocromo HDL para detectar função prejudicada do HDL em Estados de stress oxidativo crônico como aterosclerose e vírus da imunodeficiência humana (HIV) de infecção32. Usando o ensaio bioquímico da função do HDL, vários estudos têm confirmado a associação de HDLox com obesidade e doença cardiovascular 19,21,,27,34,35 ,36,47. Significativamente, em estudos-piloto humanos temos demonstrado associações de HDLox com ensaios cell-based validados, medidas de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune de aluguel e associado a risco cardiovascular e metabólico fenótipos32,36. Embora este teste tem sido utilizado em diversos estudos para abordar o papel da função de HDL em diferentes doenças como crônica HIV infecção32,38, aterosclerose obesidade e 32 a36, ela continua a ser validado em estudos de grande escala com pontos de extremidade disponíveis clínicos de DCV (por exemplo, ataques cardíacos).
A reação do fluorocromo com peróxidos na presença de HRP para produzir resorufin altamente fluorescente é bem estabelecido 48,49. HRP catalisa a oxidação do fluorocromo não-fluorescente fluorescente resorufin vermelho50,51. Esta oxidação pode ser conduzida por tanto endógenos peróxidos presentes na reação (OH-) e os peróxidos HDL-lipídico (LOOH-). Sem oxidase de colesterol, resorufin (com HRP) pode quantificar o teor de HDL intrínseco lipídico de peróxido de uma quantidade específica de HDL-colesterol. A produção de fundo de OH - como resultado da oxidação do ar do buffer é subtraída a leitura fluorescente de cada poço. Resorufin tem mínima autofluorescência na maioria das amostras. Adição de catalase (1-4 U/mL) no amortecedor da reação rapidamente pode atenuar peróxidos endógenos, para que o aumento da leitura do fluorescente ao longo do tempo é conduzido por peróxidos lipídicos de HDL. O ensaio é versátil e pode avaliar o teor de peróxido lipídico em ésteres de colesterol HDL versus livre HDL colesterol32,,48,49 .
Há muitas variações da função de HDL fluorocromo ensaio32. Resumidamente, há pelo menos 3 abordagens principais: um) adicionar um volume específico de HDL (p. ex. 50 µ l) por bem e depois normalizar o valor de peroxidação lipídica HDL pelo nível de HDL-C, conforme determinado no laboratório clínico; b) determinar a concentração de HDL-C em cada amostra com base em ensaios de colesterol colorimétrico padrão e em seguida, adicionar uma quantidade específica de HDL-C (por exemplo, 1 µ g) por alvéolo; e c) normalizar a leitura de função do HDL HDL ou apoA-eu conteúdo de proteína32. Também há pelo menos 3 abordagens principais sobre como isolar HDL para ensaios de peroxidação lipídica HDL: colesterol HDL) uma precipitação, por exemplo, com polietileno glicol; b) Immunoaffinity captura; e c) outros métodos não elevado-throughput padrão para isolamento de HDL como µLtracentrifugation32. Além disso, o ensaio é versátil e pode avaliar o teor de peróxido lipídico em ésteres de colesterol HDL versus livre de colesterol HDL 32. Existem várias maneiras para relatar que os resultados, por exemplo, fluorescência arbitrário unidades, resorufin padronizada fluorescência, normalizado proporção para um controle em pool de32. Aqui apresentamos a abordagem mais reprodutível.
Se o plasma é usado é importante preparar o plasma em tubos com citrato de sódio como anticoagulante 27,28. Sulfato de sódio EDTA40 e heparina pode interferir com as reações de oxidação 41,42. Sulfato de heparina pode interferir com ensaios bioquímicos de HDL função 27,28. Embora o plasma e soro criopreservado são ideais para determinação de lipídios, a função do HDL e a peroxidação lipídica de HDL, amostras criopreservadas podem quantificar diferenças relativas na peroxidação lipídica de HDL por mg de HDL. É importante processar todas as amostras dentro de um estudo específico da mesma maneira (por exemplo, mesmo ciclos de congelamento e descongelamento) e incluir um controle agrupado em cada placa para contabilizar potenciais confundidores relacionados às diferenças no processamento da amostra entre diferentes estudos. Criopreservação de longo prazo pode comprometer os resultados de HDL função ensaios43 mas diferenças relativas na peroxidação lipídica de HDL entre amostras dentro de um estudo ainda poderão ser avaliadas, se um controle apropriado em pool é usado 27, 28.
Importante, prévia HDL função ensaios não são padronizados. Aqui nós descrevemos uma abordagem onde o uso de controles adequados garante padronização da leitura do. Mais especificamente, existem vários parâmetros conhecidos que podem afetar a leitura dos ensaios bioquímicos de HDL função tais como efeitos de matriz (soro vs método de preparação do plasma), presença de albumina e outras proteínas, criopreservação, congelamento-descongelamento 32. ensaio de fluorocromo HDL a função pode ser padronizado com o uso de padrões comercialmente disponíveis e reagentes experimental32. No entanto, existem tambémvários confundidores desconhecidos (ou mal caracterizadas) em cada estudo e entre pessoas diferentes que podem afetar a determinação de HDL função resultados. Assim, em cada placa, usamos um controle HDL em pool, preparado a partir de espécimes específicos de interesse dentro de um determinado estudo (que tenham sido tratados de forma idêntica) que minimiza artefatos e confundidores32. Utilização de amostras de plasma banco de sangue e os valores de HDL-C de laboratório clínico mais pode padronizar o ensaio,32.
Mostramos anteriormente que diferentes métodos de isolamento de HDL podem afetar significativamente a leitura de ensaios bioquímicos de HDL função 27,28,32 mas o fluorocromo confiável pode medir independentemente de HDLox o isolamento de HDL 32. Métodos de isolamento de HDL são um fator limitante para estudos de alto rendimento da função do HDL. Ultracentrifugação é considerada o método de referência hoje, mas continua a ser um método demorado52. Eletroforese é imprecisa e não padronizado 53. Métodos de precipitação de HDL envolvem o uso de polianiões tais como o polietileno glicol (PEG) para precipitar deixando o HDL no sobrenadante 54de lipoproteínas de baixa densidade. Embora esses métodos exibido certas desvantagens como resultados variáveis com soros lipémicas e interferências com colesterol enzimático procedimentos 55 prévio modificações no original usando o procedimento padronizado disponível comercialmente os reagentes produzem um procedimento simples, confiáveis e precisos56. Embora PEG precipitação é um método comumente usado para isolar o HDL21,57 de soro, uma questão importante é a presença de não-HDL proteínas como albumina58. Immunoaffinity isolamento pode ser usado para minimizar o efeito da albumina na HDL função 32. Apesar de diferenças relativas em HDLox para um método de captura específico podem ser avaliadas, anticorpos específicos contra o HDL não totalmente podem capturar estruturas complexas de HDL. Usando controles apropriados, conforme descrito no presente protocolo, diferenças relativas em HDLox entre espécimes de HDL (isolados por PEG precipitação) podem ser determinadas de forma fiável.
Este ensaio, como todos os outros ensaios de função do HDL, tem limitações principais. Oxidação no vivo de HDL na parede arterial é bastante complexa e heterogênea e teor de peróxido lipídico apenas parcialmente pode refletir HDLox46. Função e estrutura do HDL muda continuamente na vivo e medição da função de HDL em um Commit pode não refletir o impacto da disfunção de HDL em doença órgão final sobre tempo59. Não se sabe se a leitura de HDLox deve ser normalizada pela HDL-C, ou HDL proteína 22. Futuros estudos clínicos devem validar a importância da leitura do ensaio (teor de peróxido de lipídico HDL por mg de HDL-C).
Em conclusão, o ensaio de função fluorocromo HDL é um método confiável para determinação do teor de peróxido lipídico HDL por uma quantidade específica de HDL (HDLox). Valores mais altos de HDLox estão associados com a função de antioxidante HDL reduzida. A leitura deste teste é associada com ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e risco cardiovascular e metabólico associado fenótipos 19, 21,,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. este método oferece uma ferramenta conveniente, mas robusta para examinar o papel da função de HDL em doenças humanas.
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Disclosures
Este protocolo e ensaio são relevantes para a patente PCT/US2015/018147.
Acknowledgments
Os autores, com gratidão, reconhecer o trabalho do Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman e Srinivasa Reddy para seu papel-chave no desenvolvimento de iterações anteriores deste modelo. T.A.A. é suportado por um RMIT University Vice-Chanceler do Postdoctoral Fellowship. AJ e AH são suportados por NHMRC projeto grant 1108792. TK é suportado pelo NIH concede NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387--955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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