Summary
이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.
Abstract
폐 전이 분석 결과 (푸 마) 이며 폐 explant 비보 전 폐쇄 셀 문화 시스템 형광 현미경 검사 법에 의해 폐 식민 osteosarcoma (OS)에서 생물학을 공부 하는 연구원입니다. 이 문서는 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 전이성 성장 widefield 또는 공초점 형광 현미경 플랫폼을 사용 하 여 이미지 데이터를 얻는 예에 설명 합니다. 푸 마 모델의 유연성 허용 연구원 폐 microenvironment에서 운영 체제 셀의 성장 뿐만 아니라 공부 뿐만 아니라 시간이 지남에 안티 전이성 치료제의 효과 평가 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 폐 실질과 OS 세포 상호 작용의 전례 없는, 고해상도 이미징에 대 한 수 있습니다. 또한, 푸 마 모델은 형광 염료 나 형광 단백질 유전자 기자와 함께, 연구팀은 폐 microenvironment, 세포 및 subcellular 구조, 유전자 기능 및 전이성 OS 셀에 발기인 활동 공부할 수 있습니다. 푸 마 모델 다리 연구자 새로운 전이 생물학 발견 하 고 새로운 안티 전이성, 타겟 요법의 활동을 평가에 대 한 새로운 도구를 제공 합니다.
Introduction
전이성 osteosarcoma (OS)와 소아 환자에 대 한 향상 된 결과 여전히 중요 한 충족된 임상 필요 1남아 있습니다. 이 새로운 분자로-타겟 요법 개발의 중요성을 밑줄. 대상 종양 세포 증식 하지 전이성 질병, 그리고 이렇게 새로운 전략을 치료에 효과가 입증 된 기존의 chemotherapeutics 2전이성 과정 자체를 타겟으로 해야 합니다. 현재 문서에서는 상대적으로 새로운 유형의 비보 전 폐 전이 모델, 폐 전이 분석 결과 (푸 마) 멘도사와 동료3, 새로운 발견에 유용한 도구를 제공 하 여 개발의 실용적인 측면을 설명 합니다. OS 4,5에서 폐 전이 진행에서 분자 드라이버. 그러나 계속 하기 전에, 그것은 간단히, 전이의 몇 가지 현재 모델에 따라 터치 것 하 고 어떻게 푸 마 모델은 기존의 시험관에 비해 여러 이점을 제공 분석 실험.
전이 공부 하는 데 사용 하는 가장 실험적인 모델 특정 단계 또는 전이성 캐스케이드의 여러 단계를 정리 하는 생체 외에서 그리고 vivo에서 시스템의 구성. 이러한 단계를 포함: 1) 종양 세포 주변 혈관 (혈액 또는 임 파 액) 및 교통 순환, 내 기본 종양, 2) intravasation에서 마이그레이션 3) 보조 사이트, 4) 넘쳐 흐름 및 보조 사이트, 5) 형성에 생존에서 체포 micrometastases, 및 6)의 vascularized 전이 (그림 1)로 성장. 전이의 생체 외에서 모델 2 차원 (2D) 마이그레이션을 포함할 수 있으며 3 차원 (3D) Matrigel 침공 분석 실험에서 검토는 자세히 다른 곳 6. Vivo에서 모델에 대 한 두 가지 일반적으로 사용 되 모델 시스템 포함: 1) 자발적 전이 모델 은 종양 세포가 저절로 전이성 세포 나 지방 종양을 형성 하는 특정 조직 유형으로 주입 하는 orthotopically 먼 사이트; 2) 실험 전이 모델 은 종양 세포는 혈관 상류의 대상 기관에 주사 된다. 예를 들어 한 꼬리 정 맥 주입의 종양 세포 개발 폐 전이5,,78. 다른 실험적인 전이 모델 비장 또는 간 전이9,10의 개발에 결과 mesenteric 정 맥으로 종양 세포의 주입을 포함 됩니다. 이러한 비보에 모델의 실용적인 고려 사항 웰 치 11자세히 설명 되어 있습니다. 또 다른 vivo 모델 소아 sarcomas에 전이 공부 하는 데 사용 로컬 종양 형성 및 자연 스러운 전이 폐 12,13에 귀착되는 신장 신장 subcapsular 종양 이식 모델이입니다. Intravital videomicroscopy 수 같은 더 기술적으로 까다로운 기술을 직접 시각화에 전이성 암 세포와 전이성 사이트의 microvasculature 간의 실시간, 상호 작용 (예. 폐 또는 간) 맥도날드14에 의해 설명 된 대로 및 Entenberg15또는 김 16에 의해 설명 된 대로 chorioallantoic 막에 암 셀 넘쳐 흐름.
푸 마 모델은 폐 조직 explant 비보, ex , 닫힌된 문화 시스템 어디 형광 종양 세포의 성장을 관찰 될 수 있다 경도 형광 현미경 검사 법을 통해 한 달의 기간 동안 ( 그림 2A참조). 이 모델이 전이성 캐스케이드에서 폐 식민 (3 ~ 5 단계)의 초기 단계. 기존의 체 외에 모델을 통해 푸 마 모델의 주요 장점은: 1)에 경도 측정 폐 microenvironment 의 많은 기능을 유지 하는 3D microenvironment에 전이성 암 세포 성장 하는 기회 제공 vivo 3; 2) 푸 마 수 후보 유전자 또는 약물 치료의 최저 3D 폐 microenvironment;의 맥락에서 안티 전이성 활동을가지고 있는지를 평가 하는 연구원 3) 푸 마 모델은 유연한 형광 현미경 검사 법 (그림 2B)와 같은 플랫폼 widefield 형광 현미경 검사 법 또는 레이저 스캔 confocal 현미경 검사 법의 많은 유형으로, 각각의 예제 그림 2C & D에 표시 됩니다. 각각. 이 문서는 푸 마 모델의 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 전이성 성장에 경도 이미징 데이터를 얻기 위해 사용 하는 방법을 설명 합니다-표현, 인간의 높고 낮은 전이성 다리 셀 (MNNG와 호 셀, 각각)를 사용 하 여 낮은 확대 widefield의 형광 형광 성 염료는 폐 실질, 레이블 및 레이블 운영 체제에서 미토 콘 드리 아 유전자 기자 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하는 푸 마 모델에 셀 레드-형광 단백질 이미징의 예 또한 토론 된다.
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Protocol
영상 데이터를 가져온 모든 동물 프로토콜 승인 동물 관리 및 사용 위원회 국립 암 연구소, 국립 보건원의 수행 했다. 모든 동물 프로토콜 설명 및 비디오 문서에서 브리티시 컬럼비아의 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 종양 세포 주입 및 푸 마 모델에 대 한 자료 준비
참고: 솔루션 및 셀의 양을 1 마우스에 대 한 충분 한 될 것입니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 되는 경우 필요에 따라 규모. 미디어 요리법을 표 1 과 표 2를 참조 하십시오.
- 전 37 oC 물 욕조에 15 mL 원뿔 튜브에 A-미디어의 5 mL 따뜻한.
- 1.2% 낮은 녹는 agarose 솔루션을 (살 균 물)에 연구소 전자 레인지를 사용 하 여 녹 인 다.
- 15 mL 원뿔 튜브에 녹은 agarose의 5 mL을 전송 하 고 37 oC 물 욕조에 따뜻한 유지. 37 oC 및 폐 insufflation 단계 전에 액체에서 녹은 agarose가 확인 합니다.
- 미리 30 mL 세포 배양 학년 얼음 양동이에 1 X 펜/strep 보충 PBS의 진정.
- 6 잘 플레이트의 한 잘, 미리 B-미디어의 1.5 mL에 젤라틴 스폰지를 적시 게. 스펀지 폐 조각에 대 한 지원 앵커 것입니다.
- OS 셀은 약 70-90% 보장 절차의 날에 confluent. -합칠 경우 또는 미디어 오렌지 노란색 셀은 일반적으로 스트레스와 시점에서 생존 능력을 감소는 때문에 셀을 사용 하지 마십시오. 다리 셀 라인, MNNG와 호, 100 μ의 볼륨에서 5 x 105 1 마우스의 꼬리 정 맥에 주사에 사용 됩니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 하는 경우 그에 따라 고급.
- 0.25 %trypsin-EDTA (3 mL T75 플라스 크 또는 10 cm 배양 접시에 2 mL)을 사용 하 여 종양 세포를 수확. 셀은 시작 하면 접시에서 해제, 완벽 한 미디어 트립 신-EDTA를 중화. 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 세포 배양 학년 PBS로 한 번 씻어. PBS의 5 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 표준 방법으로 세포 수를 수행 합니다. 그것은 최고의 세포 현 탁 액의 손실을 자주 바늘 그리기 중 발생 이후 주입 시도 실패 실제로 필요한 것 보다 더 많은 세포 현 탁 액을 확인 하는.
- Trypan 블루 제외 분석 결과 세포의 생존 능력을 평가 하기 위해 세포 현 탁 액의 샘플에 수행 합니다. 셀 표시 90% 생존 하는 경우에 진행 또는 더 높은.
- 5 x 105 셀 100 μ의 볼륨을 주입. 준비 하려면이 금액의 2 배를 초과, 1 x 106 셀 한다 스핀 다운 되며 HBSS 0.2 mL에 resuspended.
- 주입을 위한 쥐를 준비 하는 동안 얼음 양동이에 세포 현 탁 액을 놓습니다.
2. 꼬리 정 맥 주입 및 폐 Insufflation
참고: 솔루션 및이이 섹션에 있는 셀 1 마우스에 대 한 충분 한 될 것입니다. 더 많은 생쥐 연구에 사용 되는 경우 필요에 따라 규모. 장비, 자료 및 다음 단계에서 사용 되는 수술 도구 목록에 대 한 표 3 및 표 4를 참조 하십시오.
- 더 눈에 띄게 명백한 그들의 꼬리 정 맥을 만들기 위하여 여성 마우스 (나이 6-8 주) 5 분 동안 열 램프 아래 따뜻한. Murine K7M2 또는 K12 셀 사용 Balb/c 마우스; 인간의 MG63.3, MG63, MNNG, 및 호 셀에 대 한 심한 결합 된 면역 결핍 쥐를 사용 합니다.
- 셀 서 스 펜 션은 부드럽게 튜브를 떨고 하 여 균일 한 다는 것을 확인 하십시오. 신중 하 게 바늘 없이 1 mL 주사기로 세포 현 탁 액을 그립니다. 모자는 27와 주사기 바늘 게이지. 바늘 베벨은 바늘에 볼륨 표시와 같은 측면에 다는 것을 확인 하십시오.
- Restrainer에 마우스를 놓고 면봉 알코올 지우기와 꼬리.
- 꼬리 정 맥 주사를 수행 하 고 셀 서 스 펜 션의 100 μ 주사를 진행 합니다. 주입 후 5 분 CO2 챔버에 마우스 놓고 (기관 동물 관리 위원회 개요)으로 안락사 표준 운영 절차를 시작 합니다. 자 궁 경부 전위 이후 절차는 기관 손상 됩니다 안락사의 수단으로 사용할 수 없습니다.
- 일단 마우스를 안락사 insufflation agarose/A-미디어 솔루션 마우스 폐의 층 류 후드의 준비를 시작 합니다. 층 류 흐름 후드 내에서 살 균 패드와 함께 작업 영역을 설정 합니다. 이 패드에 소독된 기기, 4 카 테 터, IV 확장 세트, 및 중력 관류 장치 ( 보충 그림 1참조)를 넣을 것입니다.
- 지 recumbancy에 마우스를 놓습니다. 메 마른 작은 위, 신중 하 게 흉 폭로 흉 골 밖으로 해 부. Agarose/A-미디어 솔루션 폐를 insufflate 하는 데 사용 될 것입니다 폐를 찌를 하지 주의 하십시오.
- 때 흉 골 밖으로 해 부 해 부 양쪽에 흉부 입구 과거 기도. 멀리 주변 부드러운 조직 해 부에 의해 기도 노출 합니다.
- 20 게이지 4 카 테 터와 기관지 cannulate 느슨하게 cannulated 기관지 주위 살 균 다 봉합 사를 사용 하 여 수술 매듭 넥타이.
- Catheterized 기도에서 중력 관류 장치의 10 mL 주사기로 설정 4 확장을 연결 합니다.
- 1:1 혼합물으로 미리 데워 진된 37 oC agarose (5 mL) 및 A-미디어 (5 mL)을 결합. 중력 관류 장치의 10 mL 주사기로 액체 agarose/A-미디어 솔루션을 붓는 다. Insufflation agarose/A-미디어 솔루션으로 폐의, 이전 확장 집합의 전체 길이 agarose/A-미디어, 공기와 함께 폐 샘플의 실수로 insufflation 함으로써 negating와 준비 되어 있는지 확인 합니다.
- 폐는 완전히 insufflated 때까지 폐 agarose/A-미디어 솔루션을 작성 합니다.
- 일단 폐 insufflated 완벽 하 게는 정을 제거 하 고 기도 통해 agarase/A-미디어 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 수술 매듭을 단단히 묶어.
- 가슴 구멍에서 당기기 (기관, 심장, 폐)에 밖으로 부를 진행 합니다. 빵 꾸 하지 주의 또는 폐의 표면 손상.
- 장소 미리 냉장된 30 mL PBS의에서 (아니 특정 방향)에서 뽑은 1 X 펜/strep, 보충 하 고 20 분을 강화 하기 위해 agarose/A 미디어 허용.
- 좋은 위, 핀셋, 그림 1A와 같이 폐 (3 m m x 1.5 m m)의 작은 조각을 잘라 사용 합니다. 작은 폐 조각은 수 수 쉽게 몇 군데 2.5 X 목표를 사용 하 여. 여러 조각은 실험 조건, 당 그룹 당 4-10 조각 일반적으로 자를 수 있습니다.
참고: 각 실험 그룹에 대 한 미리 B 미디어에 배어 2 x 2 cm 젤라틴 스폰지를 포함 된 별도 우물 (6 잘 플레이트)으로 폐 조각 놓습니다. 잘 당 미디어의 양을 1.5 mL 이어야 한다. 2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. 약물 연구에 대 한 미디어/약물 변화의 주파수 결정 하는 사용자입니다.
3. Widefield 형광 이미징 폐 슬라이스 및 분석의
참고: widefield 형광에 대 한 이미징, 작은 조각 폐 섹션 2.5 X 목표를 사용 하 여 1 이미지에 맞추기 위해 (1.5 m m x 1 m m x 3)를 절단 됩니다.
Widefield 형광 현미경에서 이미지 수집:
- 폐 슬라이스는 일반적으로 0, 3, 7, 14 일 후 주입에서 몇 군데. 생물 캐비닛의 메 마른 환경에서 신중 하 게 폐 분할 영역 전송에서 젤라틴 스폰지 살 균 35 m m 유리 하단에 라운드 접시. 폐 조각에서 초과 하는 액체에서 소량으로 초과 하는 액체는 거울으로 서 행동 하 고 종양 세포에서 나오는 형광 빛을 반영 하는 것을 주의.
- 그림 1A에서 묘사 된 비슷한 방식으로 폐 분할 영역을 정렬. 각 열은 다른 실험 상태를 나타내는 것 이다. 교차-오염 하지 폐는 핀셋으로 알아서. 70% 에탄올과 린스를 폐 다른 실험적인 그룹에서 분할 영역을 처리 하기 전에 건조 합니다.
- 이미지 매개 변수를 최적화 (즉. 이득, 오프셋, 노출 시간, binning) 형광 종양 세포와 배경 폐 조직 제어 (치료 되지 않는 차량)에 사이 좋은 대조를 제공 하 그룹. 컨트롤 그룹에서 동일한 매개 변수를 사용 하 여 실험적인 그룹 이미지. Tiff 이미지 형식으로 저장 합니다.
- 에 대 한 규모, 동일한 목표에는 마이크로미터의 디지털 사진을 찍을.
- 이후 폐 자동 형광 시간이 지남에 따라, 이미징 매개 변수 해야 합니다 조정 제어 폐 각 이미징 세션. 한 세션에 대 한 이미징 매개 변수 않을 수 있습니다 반드시 최적의 후속 이미징 세션에 대 한.
이미지 분석:
참고: 다음 이미지 처리 단계 ImageJ 1.51 h 소프트웨어 패키지 17할 수 있습니다.
- ImageJ (그림 3A)에서 이미지 파일을 엽니다.
- 배경 빼기: 과정 > 배경 빼기 > 롤링 볼 반경 50 픽셀 (시작), 선택을 취소 "빛 배경" (그림 3B).
- 8 비트 형식으로 이미지 변환: 이미지 > 형식 > 8-비트 (그림 3C).
- 단위를 픽셀로 설정: 이미지 > Enter "픽셀" 단위의 길이에 "픽셀 너비", "픽셀 높이", "복 깊이"에 1을 입력. "Global" 확인란을 다음 이미지에 적용 합니다.
- 다각형 선택 도구를 사용 하 여 전체 폐 조각의 윤곽 고 총 폐 조각의 영역 (픽셀2)을 결정 합니다. 이 값은 폐의 백분율 종양 부담을 계산 하기 위해 사용 됩니다.
- 임계값 이미지: 이미지 > 조정 > 임계값 > "기본" 및 "B & W" 강조 > 종양 세포의 대부분은 정확 하 게 강조 표시 되도록 임계값 이미지 슬라이더를 사용. 폐는 모든 검정, 및 형광 성 병 변은 흰색 흑인과 백인 이미지를 귀 착될 것 이다 "적용"을 누르면 (그림 3D). 두 번째 시간 "적용"을 누르면 모든 형광 구조는 지금 검은 모양 (그림 3E) 이미지를 반전 됩니다.
- 병 변의 모양과 수의 정량화:
분석 > 측정 설정 > "지역"를 확인 하십시오. 다른 모든 상자를 선택 취소 합니다.
입자 분석 > 크기 (픽셀2): 0-무한 ImageJ 열거 하는 도형 범위를 나타냅니다. 경험적으로 하루 0 차량 이미지에는 단일 종양 셀 것으로 판단 되는 작은 병 변을 확인 합니다. 하한값으로이 단일 종양 세포의 영역을 사용 하 여 데이터 집합에는 나머지 이미지에 대 한. 이 문서에 소개 된 작품에 대 한 11 픽셀2 하한값으로 설정 됩니다. 비디오 예제에 제시 하는 작품에 대 한 24 픽셀2 하한값으로 설정 됩니다. "순환" 범위를 0-1로 둡니다. "표시"로 설정할 수 있습니다 "아무것도". 또는, "표시" 및 "설명"을 선택 하는 경우 모든 개요 도형 드로잉 생성 됩니다. 팝업 측정의 별도 창에 대 한 "표시 결과"를 확인 합니다. 필요한 경우, "관리자 추가" 상자를 체크 하는 데 나중에 참조할 저장 될 수 있다 투자 수익 관리자를 측정할 모든 셰이프 저장 됩니다. 확인을 누른 후 "결과" 창 포함 하는 모든 열거 모양 및 면적 측정 (그림 3 층) 나타납니다. - 복사 하는 스프레드시트에 "결과" 창에서 데이터를 붙여 넣습니다. Excel에서 SUM 수학 함수를 사용 하 여 해당 특정 폐 슬라이스에 대 한 전이성 병 변의 모든 분야를 요약. 폐 조각의 백분율 폐 종양 부담 평가, 폐 조각의 전체 면적에 의해 전이성 병 변의 영역의 합계를 나눕니다. 이 매개 변수는 일컬어 지역 일부 (A)는 언더우드 18여 더.
폐 종양 부담 = 폐 슬라이스의 전이성 병 변 지역/총 면적의 합 - 제어 그룹 및 그룹 남은 폐 섹션의 나머지 부분에 대 한 폐 종양 부담을 계산 합니다. 0, 3, 7, 14 일 동안 그룹당 평균 폐 종양 부담을 플롯 합니다. 진보적인 시간 포인트에서 푸 마 모델에 성장 및 로우 전이성 인간 OS 셀의 대표 widefield 형광 사진 (그림 4A) 표시 됩니다. 시간이 지남에 따라 백분율 전이성 종양 부담에 배 변경 (0으로 정규화)을 보여주는 선 그래프 (그림 4B) 표시 됩니다.
4. 푸 마 모델의 confocal 형광 이미징
참고: confocal 이미징, 조직 처리가 비슷합니다 그 이전 섹션에서 제외 하 고는 큰 폐 슬라이스 이미지 수를 더 ROIs 있도록 (완전 한 횡 근 섹션, 1-2 m m 두께) 잘립니다.
DAR4M와 폐 실질의 라벨:
- 폐 조각 10 μμM에서 DAR4M (HBSS)에서 37 ° c.에 45 분 동안 담가 DAR4M 라벨 폐의 세포 내에서 반응성 질소 종.
- 외피의 45 분, 후 폐 조각 신선한 HBSS로 린스.
- 요리, 그리고 confocal 현미경 이미지 라운드 35 m m 유리 하단에 폐 슬라이스를 놓습니다.
- 그림 5 에 표시 된 예제에서는 이미지에 대 한 이미징 매개 변수는 표 5에 나열 됩니다.
- 관심 영역에 대 한 Z-스택 취득. 나이 키스 트 샘플링에 대 한 제안된 Z 슬라이스 두께 사용 합니다. 3D 스택 DAR4M 표시 된 폐 조직에서 녹색 형광 OS 셀을 보여주는 대표 영화 영화 1 과 보충 영화 1에 제공 됩니다.
그림 5에 표시 된 예제에서는 confocal 이미지 이미징 세션 터미널 이었다. 경도 화상 진 찰이 필요한 경우 2 광자 또는 다 광자 갖춘된 confocal LSM 현미경 이미징의 사용 때문에 생활에 더 적은 photodamage 좋습니다 조직19,20.
푸 마 모델에서 미토 RFP 표현 MG63 세포 이미징:
- 1 단계와 2 미토 RFP 구조를 표현 하는 MG63 세포를 사용 하 여 윤곽선으로 푸 마 프로토콜을 수행 합니다.
- 요리, 그리고 confocal 현미경 이미지 라운드 35 m m 유리 하단에 폐 슬라이스를 놓습니다.
- 그림 6 에 표시 된 예제에서는 이미지에 대 한 이미징 매개 변수는 표 6에 나열 됩니다. 영화 2 에 추가 영화 2형광 미토 콘 드리 아를 제공 하는 빨간색과 녹색 형광 OS 셀을 보여주는 3 차원 스택의 대표적인 영화.
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Representative Results
낮은 확대 widefield 형광 현미경 검사 법
푸 마 폐 조각의 widefield 형광 현미경, 대표 이미지와 부 량 데이터 그림 2C및 그림 4A 와 B에 표시 됩니다. 높고 낮은 전이성 세포 라인에 대 한 전이성 경향은 시각적으로 명백한 진보적인 시간 포인트. 호 셀 전혀 성장할 수 없다 반면 MNNG 세포 폐 조직 식민지 화 효율적으로 수 있습니다. 이미지 분석, 그림 4B의 그래프와 같이 시간이 지남에 성장 평가를 양적 데이터를 얻을 수 있습니다. 낮은 확대율 (2.5 X)에서 획득 한 이미지에 전체 폐 슬라이스를 캡처하기 위해 선호 된다. 이 메서드는 큰 숫자 퓨마 조각의 배치 이미지를 허용합니다.
고배율 공초점 형광 현미경 검사 법
푸 마 폐 조각의 confocal 현미경 검사 법, 대 한 대표적인 이미지는 그림 5에 나와 있습니다. 개별 eGFP 표현 MG63 세포는 그림 5B에서 DAR4M 형광 염료에 의해 표시 된 폐 실질에 관하여 그림 5A 에서 볼 수 있습니다. 병합 된 이미지 그림 5C및 확대 된에 표시 됩니다 선박에 형광 종양 세포의 이미지 그림 5D에 표시 됩니다. 그림 5C 및 5d의 3D 영화는 영화 1 과 보충 영화 1, 각각 표시 됩니다. 미토 콘 드리 아에 나와 같은 subcellular 구조 confocal 영상 그림 6. Cytosolic eGFP 식 그림 6A, 개요 종양 세포를 허용 하 고 미토 콘 드리 아 RFP와 함께 표시 그림 6B에 나와 있습니다. 병합 된 이미지를 그림 6 c에서 볼 수 있다. 그림 6 c 의 3D 영화는 영화 2 및 보충 영화 2에 표시 됩니다. 이미징 subcellular 구조는 미토 콘 드리 아 등 다른 형광 라벨 전이성 OS 세포에 세포 기관이 생물학 공부를 결합할 수 있습니다. 더 많은 레이블을 추가 하는 경우 레이저 라인 및 방출 필터 관심의 특정 fluorophore/형광 단백질와 호환 되는지 확인 합니다. 이미징 fluorophores/형광 단백질의 여기 및 방출 스펙트럼 밀접 하 게 중복 하지 마십시오.
그림 1 : 전이성 캐스케이드를 보여주는 다이어그램. 전이성 캐스케이드 여러, 속도 제한 단계도 세분화 될 수 있습니다. (1) 전이성 종양 세포 기본 종양 사이트 유지 및 지역 실질;으로 침공 (혈액/림프 혈관에 순환; 내에서 전송 2) 종양 세포 intravasating (는 보조 사이트에서 3) 종양 세포로 (4) 종양 세포 넘쳐 흐름 밖으로 microvasculature를 보조 사이트;에 생존 (5) micrometastases;로 성장 (6) vascularized 명백한 전이성 종양으로 성장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Widefield 형광 공초점 형광 현미경 플랫폼을 사용 하 여 이미징 푸 마 폐 조각. (A) 예를 들어 푸 마 조각 유리 하단 35mm 접시에 표시 됩니다. (B) 공초점 현미경 장비입니다. (C) 예 eGFP 식 운영 체제 셀 푸 마 조각의 낮은 확대 이미지. Scalebar 0.5 m m. (D) 푸 마 슬라이스의 하위의 이미지 예제 confocal =. Scalebar = 100 μ m. (*) 폐 실질은 이라고 표시 된 빨간색 DAR4M (삽입 참조) 및 (∇) eGFP 표현 MG63 셀을 가리킵니다. Scalebar = 30 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . ImageJ를 사용 하 여 퓨마 조각의 이미지를 낮은 확대 처리. (A) 원래 푸 마 이미지입니다. (B) 배경 빼기입니다. (C)는 8 비트 이미지를 변환. (D) 형광 종양 세포를 강조 하기 위해 임계 처리 이미지. (E) 이미지의 반전입니다. (F) 개별 모양 및 모양 분야의 정량화의 열거입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 매우 낮은 전이성 인간 OS의 성장 시간이 지남에 푸 마 모델에서 세포를 보여주는 낮은 확대 직렬 이미지. (높은 전이성 MNNG 셀과 낮은 전이성 호 셀의 A) 직렬 이미지는 0, 3, 7, 14 일 후 사출에 표시 됩니다. MNNG 셀 호 셀 달리 폐 microenvironment에 더 나은 성장 수 있습니다. Scalebar = 1 m m. (B) 배-변경 시간이 지남에 MNNG와 호 셀에 대 한 백분율 전이성 종양 부담에 선 그래프로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : DAR4M 표시 된 푸 마 폐 조각의 confocal 현미경 검사 법. DAR4M으로 표시 하는 푸 마 폐 조직에서 MG63 셀 eGFP 표현 대표 confocal 이미지. (A) 녹색 채널 eGFP 표현 MG63 셀 (∇)를 보여주는. (B) 빨간색 채널 폐 실질 세포에서 반응성 질소 종에 바인딩 DAR4M 염료를 보여주는. 염료 하이라이트 폐 실질 (#), 그리고 혈관 (*)을 닮은 구조. 폐 섹션은 푸 마의 가장자리 (↓) 표시 됩니다. (C) 결합 된 녹색 및 빨간색 이미지입니다. Scalebar = 100 μ m. ((C)에서 점선된 흰색 상자의 확대 된 이미지 D)를 선박에 종양 세포를 보여줍니다. Scalebar = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 다리 셀 푸 마 모델에 미토 콘 드리 아의 confocal 현미경 검사 법. MG63 셀 eGFP 표현에 미토 콘 드리 아의 대표 confocal 이미지. (A) 녹색 채널 eGFP 표현 MG63 셀 (∇)를 보여주는. (B) 빨간색 채널 RFP 미토 콘 드리 아 (*)로 보여주는. (C) 결합 된 녹색 및 빨간색 이미지입니다. Scalebar = 10 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 문화 미디어 | 레시피 |
| 완전 한 미디어 (500 mL) | •440 mL DMEM |
| •50 mL FBS | |
| 펜/strep 솔루션 (10000U/mL) X •5 mL 10 | |
| •5 mL L-글루타민 (200 mM) | |
| A-미디어 (250 mL) | •177.58 살 균 물 |
| M-199 매체 •50 mL 10 | |
| •15 mL 7.5% 나트륨 중 탄산염 해결책 | |
| 50mm hydrocortizone의 •2.25 mL | |
| •125 mL 0.4 mg/ml 레 티 놀 아세테이트 (살 균 물)에 | |
| 펜/strep 솔루션 (10000U/mL) X 10의 •5 mL | |
| 10 mg/ml 소 인슐린의 •50 mL | |
| B-미디어 (500 ml) | •427.6 살 균 물 |
| M-199 매체 •50 mL 10 | |
| •15 mL 7.5% 나트륨 중 탄산염 해결책 | |
| 50mm hydrocortizone의 •2.25 mL | |
| •125 mL 0.4 mg/ml 레 티 놀 아세테이트 (살 균 물)에 | |
| 펜/strep 솔루션 (10000U/mL) X 10의 •5 mL | |
| 10 mg/ml 소 인슐린의 •50 mL |
표 1입니다. 완전 한 미디어에 대 한 요리법 A-미디어, B-미디어. 세포 배양에 대 한 조리법과 푸 마 분석 결과 대 한 미디어 나열 됩니다.
| 세포 배양 시 약 | 설명 | 카탈로그 번호 | 회사 |
| MNNG 호 | 높은 전이성 OS 셀 라인 | CRL-1547 | ATCC |
| 호 | 저조한 전이성 OS 셀 라인 | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | 높은 전이성 OS 셀 라인 | N/A | 에 이미 르블랑 연구소 (NCI) |
| MG63 | 저조한 전이성 OS 셀 라인 | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 미디어 | A 미디어와 B-미디어에 대 한 기본 미디어 | 11825015 | Thermofisher |
| 증류수 (소독) | A 미디어의 구성 요소 및 | 15230-147 | Thermofisher |
| B-미디어 | |||
| 7.5% 나트륨 중 탄산염 솔루션 | A 미디어의 구성 요소 및 | 25080094 | Thermofisher |
| B-미디어 | |||
| Hydrocortizone | A 미디어의 구성 요소 및 | H6909 | 시그마-Alrich |
| B-미디어 | |||
| 레 티 놀 아세테이트-물 soluable | A-미디어 & B-미디어의 구성 요소 | R0635-5 MG | 시그마-Alrich |
| 집중된 (10000 U/ml) X 10 페니실린/스 솔루션 | A 미디어의 구성 요소 및 | 15140122 | Thermofisher |
| B-미디어, 완벽 한 미디어 | |||
| 둔감 한 인슐린 솔루션 (10 mg/ml) | A 미디어의 구성 요소 및 | I0516-5 ML | 시그마-Alrich |
| B-미디어 | |||
| DMEM, 높은 포도 당 | 완전 한 미디어의 기본 미디어 | 11965092 | Thermofisher |
| L-글루타민 (200 mM) | 완전 한 미디어의 구성 요소 | 25030081 | Thermofisher |
| 소 태아 혈 청 | 완전 한 미디어의 구성 요소 | 16000044 | Thermofisher |
| Dulbecco의 인산 염 버퍼 | 세포 배양에 사용 | 14190144 | Thermofisher |
| 행 크의 버퍼링 소금 솔루션, 아무 칼슘, 아니 마그네슘, 아니 페 놀 레드 | 주입 전에 펠 릿 셀 resuspend 하는 데 사용 | 14175095 | Thermofisher |
| 트립 신-EDTA (0.25%), 페 놀 레드 | 세포 배양에 사용 | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | 폐 실질을 분류 하는 데 사용 | ALX-620-069-M001 | 엔 조 |
표 2입니다. A-미디어, B-미디어, 문화 시 약을 휴대 하 고 미디어. 미디어 요리법, 시 약, 및 버퍼에 대 한 부품 카탈로그 번호와 회사 이름으로 나열 됩니다.
| 재료 | 설명 | 카탈로그 번호 | 회사 |
| Zeiss 710 Confocal LSM | 똑바로 LSM confocal 현미경 | N/A | 자이 스 |
| Zeiss 780 Confocal LSM | 거꾸로 LSM confocal 현미경 | N/A | 자이 스 |
| SCID 마우스 | 끄 덕. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, 여성, 나이 6-8 주 | N/A | 찰스 강 |
| GelFoam | 폐 조직 섹션에 대 한 지원으로 사용 | 59-9863 | 하버드 장치 |
| SeaPlaque Agarose | 폐의 insufflation 동안 사용 | 50100 | Lonza |
| 27과 1 ml 주사기 바늘 계기 | 꼬리 정 맥 주입에 사용 | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| 10 ml 주사기 | 폐의 insufflation에 사용 | 309604 | BD |
| 20 게이지 카 테 터 | 폐의 insufflation 동안 사용 | SR-OX2032CA | Terumo |
| 애 보트 4 확장 설정 (30", 멸 균) | 폐의 insufflation 동안 사용 | 8342 | Medisca |
| 알코올 면봉 | 꼬리를 닦아 위해 정 맥 주입 하기 전에 | 326895 | BD |
| 무 균 수술 장갑 | Asceptic 마우스 폐의 전달 | 크기에 따라 다름 | Fisherscientific |
| 30cm 눈금자 | 폐의 insufflation에 사용 | 스테이플 | |
| 눈금자에 대 한 지원 서 | 폐의 insufflation에 사용 | HS29022A | Pipette.com |
| 35 m m 유리 바닥 문화 요리 | 폐 조각의 이미징 동안 사용 | 81158 | Ibidi |
| 흡수 성 Underpads 방수 습기 방지와 | 줄 생물 후드에서 무 균 작업 영역 사용 | 56617-014 | VWR |
| 다 일반 흡수 되기 쉬운 봉합 사 | Cannulated 기관에서 연결 하는 데 사용 | N/A | 브라운 |
테이블 3입니다. 푸 마에 대 한 자료입니다. 푸 마 프로토콜에 필요한 자료 카탈로그 번호와 회사 이름으로 나열 됩니다.
| 재료 | 설명 | 카탈로그 번호 | 회사 |
| 마이크로 해 부가 위는 3.5"스트레이트 샤 프/샤 프 | 절단 폐 섹션에 대 한 | RS-5910 | Roboz |
| 4"(10 cm) 오랫동안 바로 톱니 여분의 섬세 한 0.5 m m 팁 | 조작/지주 폐 섹션에 대 한 | RS-5132 | Roboz |
| 4"(10 cm) 오랫동안 톱니 모양으로 약간의 곡선 0.8 m m 팁 | 조작/지주 폐 섹션에 대 한 | RS5135 | Roboz |
| 드레싱 포 셉; 엄지 톱니 모양의; 섬세 한; 4.5 "길이; 1.3 m m 팁 폭 | 일반적인 해 부에 대 한 | RS-8120 | Roboz |
| 폭 2.2 m m 팁 겸 4.5"톱니 드레싱 엄지 | 일반적인 해 부에 대 한 | RS-8100 | Roboz |
| 미세 마이크로 Dissecting가 위 3.5"스트레이트 샤 프/샤 프, 20 m m 블레이드 | 일반적인 해 부에 대 한 | RS-5880 | Roboz |
| Knapp가 위; 똑 바른; 샤 프-무딘; 27 m m 블레이드 길이; 4"전체 길이 | 일반적인 해 부에 대 한 | RS-5960 | Roboz |
표 4입니다. 푸 마 외과 악기입니다. 프로토콜에 사용 되는 다양 한 스테인레스 스틸 악기 카탈로그 번호와 회사 이름으로 나열 됩니다.
| 매개 변수 | 488 레이저 | 561 레이저 | |
| 목표 | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0.3 W (DIC) M27 | ||
| 전원 | 2% | 2% | |
| 면만 픽셀 | 1.61 | 1.61 | |
| 평균 | 0 | 0 | |
| 확대/축소 | 1 | 1 | |
| 마스터 이득 | 820 | 814 | |
| 디지털 이득 | 1 | 0.51 | |
| 디지털 오프셋 | -4.5 | -9.24 | |
| 작은 구멍 | 51 | 57 | |
| 가변 필터 | 496-553 | 570-618 | |
표 5입니다. 푸 마 DAR4M 표시 된 섹션의 confocal 영상에 대 한 매개 변수. 현재 종이에 confocal 이미지를 획득 하는 데 사용 하는 특정 이미지 매개 변수 테이블에 제공 됩니다.
| 매개 변수 | 488 레이저 | 561 레이저 | |
| 목표 | 계획-Apochromat 63 x / 1.40 오일 DIC M27 | ||
| 전원 | 2% | 2% | |
| 면만 픽셀 | 0.6 | 0.6 | |
| 평균 | 2 (선) | 2 (선) | |
| 확대/축소 | 2.3 | 2.3 | |
| 마스터 이득 | 449 | 390 | |
| 디지털 이득 | 1 | 1.23 | |
| 디지털 오프셋 | 0 | 0 | |
| 작은 구멍 | 136 | 136 | |
| 가변 필터 | 493-550 | 566-703 | |
표 6입니다. 미토 콘 드리 아 푸 마 섹션에서 MG63 셀의 confocal 영상에 대 한 매개 변수. 현재 종이에 confocal 이미지를 획득 하는 데 사용 하는 특정 이미지 매개 변수 테이블에 제공 됩니다.
보충 그림 1: 중력 관류 장치. 중력 관류 장치 H20 압의 20 cm에서 액체 agarose/A-미디어 솔루션으로 폐를 insufflate 하는 데 사용 됩니다. Agarose/A-미디어 솔루션 cannulated 기도 (표시 되지 않음)로 설정 4 확장에 의해 연결 된 10 mL 주사기에 붓고 있습니다. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: eGFP 표현 운영 체제의 3D confocal z-스택 이미지의 회전 DAR4M 표시 된 푸 마 폐 조각에서 세포. DAR4M (빨강 채널)은 폐 실질을 강조 하는 데 사용 됩니다 및 MG63 세포 eGFP 표현 볼된 (녹색 채널) 수도 있습니다. Scalebar = 100 μ m. 이 움직임을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 2: RFP 표시 된 미토 콘 드리 아의 eGFP 표현 OS에서의 3D confocal z-스택 이미지의 회전 푸 마 모델에서 셀. 미토 콘 드리 아 같은 subcellular 세포 eGFP 표현 MG63 셀 (녹색 채널)에 푸 마 모델 RFP (빨강 채널)와 함께 레이블이 표시 됩니다. Scalebar = 10 μ m. 이 움직임을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 1: 폐에 선박에 전이성 OS 셀의 확대 된 3D 영화. EGFP 표현 MG63 셀 선박 폐 microenvironment 내에 표시 됩니다. Scalebar = 30 μ M. 이 움직임을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 2: 폐의 전이성 OS 셀에 미토 콘 드리 아의 확대 된 3D 영화. RFP와 함께 표시 하는 미토 콘 드리 아 폐 microenvironment에서 MG63 셀에 표시 됩니다. Scalebar = 5 μ M. 이 움직임을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
다음 기술 문서에서는 운영 체제에서 폐 식민지 공부에서 푸 마 모델의 몇 가지 실용적인 측면을 설명 합니다. 어디 연구 해야 합니다 여분의 처리 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계는 다음과 같습니다.
a) cannulation 기도 의입니다. 기도 주변 근육 및 결합 조직 해 부 동안 쉽게 손상 될 수 있습니다. 또한, 카 테 터의 바늘 기도 통해 쉽게 밀어 수 있습니다. 바늘의 경사는 캐 뉼 러를 삽입 하는 경우 기도 입력 하는 방법에 세심 한 관심을 지불 합니다.
b) puncturing 또는 폐의 표면에 손상을 입히기. 폐는 쉽게 구멍이 나 흉 골을 제거 하 고 흉 노출 동안가 위를 해 부 손상 될 수 있습니다. 가슴 구멍에서 당기기에 밖으로 해 부 할 때 주의 해야 합니다. Puncturing 또는 폐의 표면에 손상을 입히기를 발생 합니다 미디어 밖으로 누출 agarose/A는-액체는 폐의 공기를 빼는 것입니다.
c). 이미징 동안 폐 섹션에서 초과 미디어 제거 폐 섹션을 둘러싼 초과 액체 미디어 현미경 아래에서 볼 때 "미러" 효과 발생할 수 있습니다. 초과 액체 그로 인하여 이미지에 형광 영역을 과장 하는 종양 세포에서 형광 빛을 반영할 수 있습니다. 초과 미디어 액체의 제거는 이미지에이 유물을 막을 것 이다. 또는, 이미지 유물 이미지 후 처리 하는 동안 제거할 수 있습니다.
d) Photodamage 생활 조직입니다. 수은 전구 또는 1-광자 현미경의 레이저를 사용할 경우에 빛에 노출 되는 시간을 제한 해야 합니다. 광원의 강도/전원 비율 또한 줄일 수 있습니다. 광원에 노출 과도 photodamage 폐 조직에 발생할 수 있습니다. 발광 다이오드 (LED) 장착 현미경 또는 경도 이미징 연구 기간 동안 적은 photodamage 일으키기 때문에 이상적인 것 2-광자/멀티 photon 현미경.
푸 마 모델 적응 고 폐 식민 프로세스의 여러 측면을 연구 하도록 수정 될 수 있습니다. 이 비보 전 접근의 또 다른 변종은 반 덴 Bijgaart와 동료 21에 의해 설명 되어 있습니다. 개입의 효과 마스크 수 있습니다 이후 연구에 대 한 좋습니다 3 × 105 5 x 105 에서 주입 하는 셀의 수를 다시 확장, 폐에 종양 세포 성장에 유전자 노크 다운 또는 반대로 전이성 마약 활동의 효과 검토 동안에 더 큰 셀 innoculum의 지 수 성장. 여러 연구 결과 폐의 전이성 진행 4,5,8,22,,2324의 드라이버 공부를 푸 마 모델을 사용 했습니다. 다양 한 형광 표시기 염료 나 형광 성 취재 원 유전자 세포 생리학 또는 유전자 식 8 폐 microenvironment에서 변경 확인 라벨 종양 세포를 사용할 수 있습니다.
푸 마 모델의 한계가 호환 세포의 제한 된 수를 포함합니다. 이 분석 결과와 호환 설립된 셀 라인 멘도사와 동료 3 으로 나열 됩니다. 높고 낮은 전이성 다리 셀 라인, clonally 관련된 셀 라인 따라 쌍 발견 되었습니다 성장 하 고 그들의 전이성 성향 푸 마 모델에서을 유지: 인간 MG63.3 & MG63, MNNG & 143B, 전지와 murine K7M2 및 K12 호 셀 셀입니다. 연구원은 경험적으로 여부 그들의 셀 라인 B 미디어에 남아 있을 수 있습니다 확인 해야 합니다. 고려해 야 할 또 다른 한계 시간 폐 조직에 시험관을 유지 될 수 있는 제한 된 길이입니다. 폐 조직 당시 넘어 30 일 동안 그것의 세포질 분 대를 유지할 수 있습니다 그리고 폐의 세포 구성 성분 멸망 하기 시작. 따라서 종양 세포와 폐 실질 세포 간의 상호 작용을 공부 하 고 30 일 초과 하지 않아야 합니다.
푸 마 모델 어떻게 전이성 OS 공부를 전례 없는 방법을 제공 한다 세포 식민지 폐 조직. 푸 마 모델의 가장 두드러진 측면 몇 낮은 전이성 OS 셀 라인 (호, MG63, K12), 다른 25, 특징 그 비보에 고기 되었습니다 푸 마 모델에서 성장할 수 없다는 사실에서 온다. 반면, clonally 관련된 높은 전이성 OS 셀 (MNNG, MG63.3, K7M2) 폐 조직 vivo에서25 식민지와 푸 마 모델 큰 경향이 있다. 이 세포와 세포 외의 구성 요소 폐 microenvironment 낮은 전이성 OS 셀 라인에 vivo에서, 성장 하는 것을 방지 하는 혈액의 흐름이 부족에도 불구 하 고 푸 마 모델 여전히 유지 나왔다. 즉, 푸 마 모델의 폐 microenvironment는 여전히 낮은 전이성 OS 셀 폐에 성장 하지 못하게 하는 "선택 압력을"을 발휘 한다. 실제로, 공부 높은 전이성 OS 세포 성장 푸 마 전이성 형 4,5의 새로운 분자 드라이버 확인 되었습니다. 또한, 높은 전이성 세포에 있다 대상의 유전자 다운 변조 푸 마 모델에 전이성 용량을 줄이기 위해 표시 했다 및 vivo에서 5. 후보 반대로 전이성 약물 연구, 모델 농도 범위는 폐 조직, 전이성 파생물을 줄일 수 있습니다 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다 푸 마는 차례로 다음 수 검증 vivo에서.
이 모델의 미래 응용 프로그램 운영 체제 전이 진행의 기본적인 생물학에 깊이 탐구 하기 위해 상용 형광 염료와 리포터 유전자의 과다를 이용 한다. 예를 들어 푸 마 모델에서 종양 세포의 산화 환 원 상태를 평가 하기 위해 2', 7'-dichlorofluorescin diacetate 또는 dihydroethidium 같은 형광 염료를 사용할 수 있습니다. 형광 성 취재 원 유전자 세포 기관이 생물학을 공부 하거나 어떤 신호 경로 높은 전이성 OS 셀에 식민 과정 활성화 됩니다 확인 하려면 발기인 활동을 평가에 사용할 수 있습니다. 이러한 접근 여부 약물 치료 폐에 성장 하는 종양 세포에 활동에는 시각화를 사용할 수 있습니다. LED 장착 된 현미경 또는 2-광자/다 confocal 현미경, 사용할 수 있습니다와 같은 조직, 적은 photodamage를 생성 하는 형광 현미경 플랫폼 공부 어떻게 전이성 OS 셀 마이그레이션 및 폐 조직에 걸쳐 침공. 또한, 형광 성 취재 원 유전자와 종양 세포와 폐 실질 세포 사이 접착 상호 작용을 모니터링할 수 있습니다.
요약 하면, 현재 종이 멘도사와 동료 3에 의해 처음 개발 된 푸 마 모델의 실용적인 측면을 설명 합니다. 높고 낮은 전이성 인간 OS 세포의 성장을 평가 하 낮은 배율, widefield 형광 현미경 및 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 표시 됩니다. 프로토콜의 몇 가지 중요 한 단계를 설명 했습니다. 또한, 장점 및 푸 마 모델의 제한 사항 논의 되었습니다. 폐 식민 과정을 공부 하는 푸 마 모델의 미래 응용 프로그램, 앞으로 넣어 왔다 그리고 그것은이 모델 다리 연구 커뮤니티에서 광범위 한 사용을가지고 것입니다 기대.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 박사 Arnulfo 멘도사 푸 마 기술에서 훈련을 제공 감사 하 고 싶습니다. 또한, 우리는이 연구의 과정에서 그들의 현미경의 사용을 제공 하기 위한 박사 Chand Khanna, 수잔이 필드 (NCI/NIH), 그리고 샘 Aparicio (기원전 암 기구)를 인정 하 고 싶습니다. 이 연구는 건강의 국가 학회, 소아 종양학 분기 암 연구 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 (부분적으로) 지원 되었다. M.M.L.는 국립 연구소 건강 교내 방문 동료 프로그램의 (수상 15335)에 의해 지원 되었다 그리고 현재 전이 연구에서 조 앤 파커 친교에 의해 지원 됩니다. P.H.S.는 브리티시 컬럼비아 암 재단에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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