Summary
Цель этой статьи заключается в том, предоставить подробное описание протокола для assay легочных метастазов (PuMA). Эта модель позволяет исследователям изучить метастатического остеосаркома (OS) рост клеток в легочной ткани, с помощью widefield флуоресценции или конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.
Abstract
Assay легочных метастазов (PuMA) — ex vivo экспланта легких и закрытыми порами культуры система, которая позволяет исследователям для изучения биологии легких колонизации в остеосаркома (ОС) по микроскопии флуоресцирования. Эта статья содержит подробное описание протокола и рассматриваются примеры получения данных изображения на метастатическим роста, с помощью widefield или конфокальный флуоресценции микроскопии платформ. Гибкость Пума модели позволяет исследователям изучить не только рост клеток ОС в легких микроокружения, но и оценить эффекты анти метастатическим терапии с течением времени. Конфокальная микроскопия позволяет беспрецедентным, с высоким разрешением изображений ОС взаимодействия клеток с паренхимы легких. Кроме того когда модель PuMA сочетается с флуоресцентными красителями или генетические Репортеры флуоресцентный белок, исследователи могут изучить легких микроокружения, клеточном и субклеточном структур, функции гена и промоутер деятельность в метастатических OS клеток. PuMA модель обеспечивает новый инструмент для остеосаркомы исследователей для обнаружения новых метастаз биологии и оценить деятельность роман с метастазами, целенаправленной терапии.
Introduction
Улучшения результатов для педиатрических больных с метастатическим остеосаркома (ОС) по-прежнему остается критическим неудовлетворенный клинических 1. Это подчеркивает важность разработки новых молекулярно целевой терапии. Обычные химиотерапевтические, что целевой пролиферации клеток опухоли не доказаны, чтобы быть эффективным в лечении метастатической болезни и таким образом новые стратегии должны быть ориентированы самого метастатического процесса 2. В текущей статье рассматриваются практические аспекты относительно нового типа ex vivo легких метастазов модели, пробирного легочных метастазов (PuMA), разработанный Мендоса и коллеги3, который обеспечивает полезный инструмент в раскрытии новых молекулярные драйверы в легких метастазов прогрессии в OS 4,5. Прежде чем продолжить, однако, было бы целесообразно кратко затронуть несколько текущих моделей метастазов, и как PuMA модель предлагает несколько преимуществ по сравнению с обычными в vitro assays.
Самые экспериментальные модели используются для изучения метастазов составляют in vitro и in vivo систем, которые охарактеризовать конкретный шаг или несколько шагов метастатического каскада. Эти шаги включают в себя: 1) опухолевых клеток, переход от первичной опухоли, 2) intravasation в близлежащих сосудов (кровь или лимфатическую) и транзита в циркуляции, 3) арест на дополнительный сайт, 4) кровоподтек и выживания на дополнительном сайте, 5) образование микрометастазы и 6) рост в васкуляризированной метастазов (рис. 1). В vitro модели метастазов может включать 2-мерной миграции (2D) и 3-мерные (3D) Matrigel вторжения анализов, которые рассматриваются в других местах подробно 6. Для моделей в естественных условиях , два часто используемых модель системы включают в себя: 1) спонтанное метастазов модель является, где опухолевые клетки orthotopically вводят в конкретных тканей типа сформировать местные опухоль, которая спонтанно проливает метастатического клетки в отдаленные места; 2) метастазов в экспериментальной модели является, где опухолевые клетки вводят в кровеносный сосуд, вверх по течению органа-мишени. Например хвост инъекции Вену опухолевых клеток приводит к развития легких метастазов5,7,8. Другие экспериментальные метастазов модели включают в себя инъекции опухолевых клеток селезенки или брыжеечных вен, что приводит в развитии метастазов в печени9,10. Уэлч 11подробно обсуждаются практические соображения в отношении этих моделей в естественных условиях . Другая модель в естественных условиях , используется для изучения метастазов в педиатрических сарком является модель имплантации подкапсулярный опухоли почечной функции почек, которая приводит в формировании местной опухоли и спонтанное метастазов легких 12,13. Технически более требовательных техники такие как прижизненной videomicroscopy могут непосредственно визуализировать, в режиме реального времени, взаимодействия между метастазами раковых клеток и microvasculature метастатического узла (т.е. легких или печени) как описано Макдональда14 и Entenberg15, или рак ячейки кровоподтек в chorioallantoic мембраны, как описано на Ким 16.
PuMA модель является ex vivo, тканях экспланта легких, закрытые культуры системы где флуоресцентные опухолевых клеток может быть продольно наблюдается рост через микроскопии флуоресцирования в течение месяца (см. рис. 2а). Эта модель воспроизводятся на начальных стадиях колонизации (шаги 3-5) легких в метастатических Каскад. Некоторые основные преимущества модели PuMA над обычными в vitro модели: 1) предоставляет возможность продольно измерять рост клеток метастатического рака в 3D микроокружения, который сохраняет множество функций легких микроокружения в VIVO 3; 2) puMA позволяет исследователю оценить ли нокдаун кандидат ген или наркотиков лечения имеет анти метастатического деятельности в контексте микроокружения 3D легких; 3 модель PuMA является гибкой со многими типами платформ микроскопии флуоресцирования (Рисунок 2B) как widefield микроскопии флуоресцирования или сканирование лазерная конфокальная микроскопия, приведены примеры каждого из них в рисунке 2 c и D, соответственно. Этой статье мы обсудим, как использовать модель PuMA для получения продольной визуализации данных на метастатический рост расширенной зеленого флуоресцентного белка (eGFP)-выражая, клетки человека высоких и низких метастатического остеосаркома (МННГ и HOS клеток, соответственно) с помощью низкий увеличение widefield флуоресценции. Также обсуждаются примеры изображений Люминесцентную краску, которая этикетки паренхимы легких и красный флуоресцентный белок, которую генетических репортер, который этикетки митохондрий в OS клеток в Пума модели с помощью конфокальной микроскопии лазерное сканирование.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы животных, от которых были получены визуализации данных выполнялись с одобрения животное уход и использование Комитета национального института рака, национальные институты здравоохранения. Все животные протоколы обсудили и изображается в статье видео были утверждены Комитетом животных ухода Университета Британской Колумбии.
1. Подготовка опухолевых клеток для инъекций и материалы для Пума модели
Примечание: Количество решений и клетки будет достаточно для мыши. Масштабирование при необходимости, если в исследовании используются больше мышей. Для СМИ рецепты обратитесь к таблице 1 и таблице 2.
- Предварительно теплой 5 мл A-СМИ в 15 мл конические пробки на 37 oC на водяной бане.
- Расплава 1,2% низких плавления агарозы решения (в стерильной воде) с помощью микроволновой лаборатории.
- Передача 5 мл расплавленный агарозы в 15 мл Конические трубки и держать в тепле на 37 oC водяной бане. Убедитесь, что на 37 oC и жидкости до легких инсуффляции шаг растопленным агарозы.
- Предварительно охладите 30 мл культуры клеток класса PBS, дополнены 1 Х перо/воспаление в ведёрке со льдом.
- В одной скважиной 6-ну плиты, предварительно Замочите желатин губку в 1,5 мл B-медиа. Губка будет поддержки привязки для легких ломтиками.
- OS клетки обеспечивают около 70-90% вырожденная в день процедуры. Не используйте клетки, которые являются чрезмерного притока или если средства массовой информации является оранжевый желтый, поскольку клетки обычно подчеркнул и уменьшились жизнеспособность на данный момент. Для остеосаркомы клеточных линий, МННГ и ХОС, 5 x 105 в объеме 100 мкл будет использоваться для вставки в духе хвост мыши. Высококлассные соответственно если больше мышей, используются для изучения.
- Урожай опухолевых клеток с помощью 0,25% трипсина ЭДТА (3 мл для T75 колбу или 2 мл в 10 см культуры блюдо). Когда клетки начинают поднимите пластину, нейтрализовать трипсина ЭДТА с полной СМИ. Спин вниз клетки и один раз промыть культуры клеток класс PBS. Ресуспензируйте Пелле в 5 мл ФСБ.
- Выполните подсчет клеток стандартными методами. Это лучше сделать более суспензию клеток, чем на самом деле необходима, поскольку потеря суспензию клеток часто происходит во время игла дро вверх и неудавшиеся попытки инъекции.
- Выполните Assay исключения Трипановый синий на выборке из суспензии клеток оценить жизнеспособность клеток. Только если ячейка Показать жизнеспособность 90% или выше.
- Придать 5 x 105 клеток в объеме 100 мкл. Подготовить избыток 2 X этой суммы, 1 x 106 клеток должны вращаться вниз и высокомобильна в 0,2 мл HBSS.
- Место суспензию клеток в ведро льда при подготовке мышей для инъекций.
2. хвост инъекции Вену и легких инсуффляции
Примечание: Количество решений и клетки в этом разделе будет достаточно для мыши. Масштабирование при необходимости, если в исследовании используются больше мышей. Список оборудования, материалов и хирургических инструментов, используемых в следующих шагов обратитесь к таблице 3 и таблице 4.
- Теплый женского мышь (возраст 6-8 недель) под лампой Отопление для 5 минут для того, чтобы сделать их хвост вен более явно очевидной. Для мышиных K7M2 или K12 ячеек используйте мышей Balb/c; для клеток человека MG63.3, MG63, МННГ и ХОС используйте тяжелый комбинированный иммунодефицит мышей.
- Убедитесь, что форма суспензию клеток, осторожно встряхивая трубки. Тщательно составить суспензию клеток в 1 мл шприц без иглы. Колпачок шприца с 27 манометра. Убедитесь, что скос иглы находится на той же стороне как объем маркировку на иглу.
- Поместите указатель мыши в фиксатор и хвост с алкоголем протрите тампоном.
- Перейдите к выполнить инъекции Вену хвост и залить 100 мкл суспензии клеток. 5 мин после инъекции, поместите указатель мыши в камере2 CO и начать Стандартная операционная процедура эвтаназии (как план институционального ухода за животными Комитетом). Шейки матки вывих не должны использоваться как средство эвтаназии, поскольку процедура будет повредить трахею.
- После того, как мышь умерщвлены, начните подготовку Ламинарный шкаф для инсуффляции мыши легких с агарозы/A-медиа-решение. В пределах Ламинарный шкаф настроить рабочую зону с стерильных площадку. На эту площадку место стерилизованные инструменты, IV катетер, IV расширение набора и тяжести перфузии аппарата (см. дополнительный рисунок 1).
- Поместите указатель мыши в спинной recumbancy. С небольшой стерильными ножницами тщательно анализировать из грудины подвергать грудной полости. Позаботьтесь, чтобы не прокола легких, поскольку агарозы/A-медиа-решение будет использоваться для insufflate легких.
- Когда вскрывали из грудины, вскрыть мимо грудной входе на обеих сторонах трахеи. Предоставить трахеи, пройдя от окружающих мягких тканей.
- Иглу трахеи с катетером IV 20 калибра. Слабо завязывайте хирургический узел с помощью шовный материал стерильный кетгут вокруг канюлированной трахеи.
- Прикрепите IV расширение набора из catheterized трахеи шприц 10 мл аппарата перфузии гравитации.
- Объедините подогретым 37 oC агарозы (5 мл) и A-медиа (5 мл) в смесь 1:1. Залейте жидкий раствор агарозы/A-СМИ в шприц 10 мл тяжести перфузии устройства. До инсуффляции легких с агарозы/A-медиа решения убедитесь, что по всей длине расширение набора был заливают агарозы/A-средства массовой информации, тем самым отрицая случайного инсуффляции образцов легких воздухом.
- До тех пор, пока полностью интраназально легких, заполните легких агарозы/A-медиа-решение.
- После легких полностью интраназально, удалить канюлю и твердо галстук с хирургический узел для предотвращения утечки agarase/A-медиа решения через трахею.
- Перейти к вскрыть вне общипывает (трахеи, сердца и легких) из грудной полости. Будьте осторожны, чтобы не прокола или повредить поверхность легких.
- Место шайбу (в никакой конкретной ориентации) в предварительно охлажденные 30 мл PBS с 1 Х перо/воспаление и позволяют агарозы/A-СМИ закрепить за 20 мин.
- С помощью тонкой ножницы и щипчики, вырезать кусочки легких (3 x 1,5 мм), как показано на рисунке 1A. Небольшие кусочки легких может быть легко imaged с использованием 2,5 X цель. Несколько фрагментов можно резать на экспериментальные условия, как правило 4-10 ломтиков каждой группы.
Примечание: Для каждой экспериментальной группы, место ломтики легких в отдельную скважину (6-ну Латы) содержащий губкой желатин 2 x 2 см, предварительно смоченной в B-СМИ. Количество средств массовой информации за хорошо должна быть 1,5 мл. Измените СМИ каждые 2-3 дня. Для исследования наркотиков частота смены СМИ/наркотиков является определяется пользователем.
3. Widefield флуоресценции томографии легких ломтиками и анализа
Примечание: Для флуоресценции widefield изображений, небольшие фрагменты разрезают (3 x 1,5 x 1 мм) чтобы уместить в разделе легких в 1 изображение с использованием 2,5 X цель.
Приобретение изображений на widefield флуоресцентным микроскопом:
- Кусочки легких обычно отражаются на 0, 3, 7 и 14 дней после инъекции. В стерильных условиях биологического кабинета, тщательно передачи легких фрагменты из желатина губки для стерильных 35 мм стекло дно раунд блюдо. Позаботьтесь, чтобы тыкать от лишней жидкости из легких среза как лишнюю жидкость будет действовать как зеркало и отражают флуоресцентный свет, исходящий от опухолевых клеток.
- Устройте ломтики легких в подобной манере, изображенные на рисунке 1A. Различные экспериментальные Условие будет представлять каждый столбец. Позаботьтесь, чтобы не кросс загрязнять легких с помощью пинцета. Промойте с 70% этанола и просохнуть легких фрагменты из другой экспериментальной группы.
- Оптимизировать параметры обработки изображений (т.е. усиление, смещение, воздействие время, биннинг) которая обеспечивает лучший контраст между флуоресцентные опухолевые клетки и ткани легкого фона в элементе управления (автомобиль не лечить) группы. Используйте те же параметры из контрольной группы для изображения экспериментальной группы. Сохраните в формате tiff изображений.
- Для ссылки на шкале сфотографируйте цифровые микрометра на той же цели.
- Поскольку легких авто флуоресценции изменяется с течением времени, изображений параметры должны быть скорректированы в легкие управления изображений каждой сессии. Изображений параметры для одной сессии может не обязательно быть оптимальной для последующих сессий изображений.
Анализ изображений:
Примечание: Следующие шаги обработки изображения сделаны с ImageJ 1.51h программного пакета 17.
- Откройте файл изображения в ImageJ (рис. 3A).
- Вычитание фона: процесс > вычитание фона > Rolling шар радиуса (начать с 50 пикселей), снимите флажок «Свет фон» (рис. 3B).
- Конвертируйте изображение в формат 8-битный: изображение > тип > 8 - бит (рис. 3 c).
- Значение единицы пикселей: изображение > Ввод «Пиксели» в единицу длины, введите 1 в «Пикселей в ширину», «Пикселей высота», «Voxel». Установите флажок «Глобальные» для применения к последующим изображениям.
- Используя инструмент выделения многоугольник, наметить форму срез всей легких и определить области (2пикселя) всего легкого фрагмента. Это значение будет использоваться для вычисления бремя процент опухоли легких.
- Порог изображения: изображение > Настройка > порог > голы «По умолчанию» и «B & W» > Используйте бегунок порог изображение таким образом, что большинство клеток тумора точно выделяются. Нажмите «Применить» приведет к черно-белое изображение, где легкя все черные, и белые флуоресцентные поражения (рис. 3D). Нажмите «Применить» во второй раз будет инвертировать изображение, где все флуоресцентные структуры в настоящее время черные фигуры (Рисунок 3E).
- Количественная оценка числа и формы поражения:
Анализировать > задать измерения > проверить «Район». Снимите все другие флажки.
Анализ частиц > Размер (2пикселя): 0-бесконечность представляет диапазон фигур, которые ImageJ будет перечислять. Эмпирически определите наименьший поражение, которое считается один опухолевых клеток в день 0 транспортного средства изображения. Используйте область этого единого опухолевых клеток как нижний предел для остальных изображений в наборе данных. Для работы, представленные в настоящем документе 11 пикселей2 устанавливается как нижнего предела. Для работы, представленные в пример видео 24 пикселя2 устанавливается как нижнего предела. Оставьте «Округлость» диапазон 0-1. «Показать» может быть присвоено «Ничего». Кроме того Если выбран параметр «Показать» и «Кривые», создается рисунок всех контурных фигур. Проверьте «Display results» на отдельном окне измерений всплывал. При необходимости имея флажок «Добавить в Диспетчер» сохранит все фигуры, количественно рентабельность менеджеру, который можно сохранить для будущей справки. После нажатия OK, появится окно «Результаты» содержащие всех перечисленных форм и области измерений (Рисунок 3F). - Скопируйте и вставьте данные из окна «Результаты» в электронную таблицу. Использование математической функции SUM в Excel для суммирования всех областей метастатического поражения для этого конкретного легких фрагмента. Чтобы оценить процент легких бремя опухоли легких фрагмента, разделите сумму областей метастатического поражения, Общая площадь легких фрагмента. Этот параметр также называется области фракция (A), которая описана далее Андервуд 18.
Опухоли легких бремя = сумма метастатического поражения областей/общей области легких ломтик - Рассчитайте бремя опухоли легких для остальной части легкого секций в контрольной группе и остальных групп. Участок 0, 3, 7 и 14 дней средняя легких опухоли бремя на группу. Представитель widefield флуоресцентные фотографии высоких и низких метастатического клеток человека OS, растущих в Пума модели прогрессивного время точках показаны (рис. 4A). Линия график, показывающий фолд изменения (нормализованное день 0) в процентах метастатические опухоли бремя со временем показано (рис. 4В).
4. конфокальный флуоресценции изображений модели PuMA
Примечание: Для конфокальная томография, обработка ткани похож на, в предыдущем разделе за исключением того, что более легких ломтиками вырезаны (полной поперечной секции, толщиной 1-2 мм) для более трансформирования к записи образа.
Маркировки паренхимы легких с DAR4M:
- Погрузить кусочки легких в 10 μμM DAR4M (в HBSS) 45 мин при температуре 37 ° C. DAR4M этикетки химически активные разновидности азота в клетках легких.
- После 45 минут инкубации промывайте ломтики легких с свежими HBSS.
- Место среза легких в 35 мм стекло дно вокруг блюдо и изображение на confocal микроскопа.
- В таблице 5перечислены изображений параметры для изображений пример, показанный на рисунке 5 .
- Приобрести Z-стек для региона интерес. Используйте предлагаемые толшины Z для выборки Найквиста. Представитель фильм 3D стека показаны Зеленый флуоресцентный OS клетки в DAR4M-меченых легочной ткани содержится в 1 кино и Дополнительные фильм 1.
Для примера конфокальный изображений показано на рисунке 5изображений сессии был терминала. Если требуется продольной томографии, использование 2-Фотон или несколькими Фотон оборудованный конфокальный LSM микроскопа для изображений рекомендуется так как есть меньше фотоповреждения жизни тканей19,20.
Imaging mito-RFP выражая MG63 клетки в Пума модели:
- Выполните протокол PuMA наброски в шаге 1 и 2 с использованием клеток MG63, выражая mito-RFP конструкции.
- Место среза легких в 35 мм стекло дно вокруг блюдо и изображение на confocal микроскопа.
- В таблице 6перечислены изображений параметры для изображений пример, показанный на рисунке 6 . Представитель фильм 3D стека, показывая Зеленый флуоресцентный OS клетки с красным, флуоресцентный митохондрий предоставляется в кино 2 и Дополнительные фильм 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Низкий увеличение widefield микроскопии флуоресцирования
Для widefield микроскопии флуоресцирования PuMA легких срезов представитель изображения и количественной оценки данных приводятся в Рисунок 2 cи Рисунок 4A и B. Метастатическим склонности для высокой и низкой метастатического клеточных линий визуально очевидны над время прогрессивных очков. МННГ клетки можно эффективно колонизировать легочной ткани, тогда как HOS клетки не могут расти на всех. Из анализа изображений количественные данные могут быть получены для оценки роста с течением времени, как показано на графике Рисунок 4B. Приобретение на малое увеличение (2,5 X) является предпочтительным для того, чтобы захватить весь легких фрагментов в одном изображении. Этот метод позволяет пакетный изображений большого числа фрагментов PuMA.
Высокого увеличения конфокальный флуоресцентной микроскопии
Для confocal микроскопии PuMA легких срезов представитель изображения показано на рисунке 5. Отдельные клетки, выражая eGFP MG63 можно увидеть в Рисунок 5A в паренхиме легких, который называется DAR4M Люминесцентную краску на рисунке 5B. Объединенное изображение будет показано в рисунке 5 cи увеличенной изображения флуоресцентных опухолевых клеток в сосуд показано на рисунке 5 d. 3D фильмы Рисунок 5 c и 5 D приводятся в кино 1 и Дополнительные фильм 1, соответственно. Конфокальный изображений внутриклеточных структур, такие как митохондрии представлены в Рисунок 6. Цитозольный eGFP выражение позволяет наброски опухолевых клеток в рисунке 6A, и митохондрии, помечены ППП показаны на рисунке 6B. Объединенное изображение рассматривается в рисунке 6 c. 3D фильмы Рисунок 6 c приведены в кино 2 и Дополнительные фильм 2. Imaging внутриклеточных структур, таких как митохондрии может сочетаться с другими флуоресцентные метки для изучения биологии органелл в метастатических OS клеток. При добавлении больше меток, убедитесь, что лазерные линии и выбросов фильтры совместимы с конкретной Флюорофор/флуоресцентный протеин интереса. Избегайте обработки изображений флуорофоров/флуоресцентных белков, возбуждения и спектры выбросов которых тесно пересекаются.
Рисунок 1 : Диаграмма, иллюстрирующая метастатического Каскад. Метастатические Каскад может быть разбита на несколько, ограничения скорости шагов. (1) метастатические опухоли клетки, оставляя на сайте первичной опухоли и вторгается в местных паренхимы; (2) intravasating опухолевых клеток в крови/лимфатической судов и транзита в рамках обращения; (3) опухолевых клеток арест на дополнительном сайте; (4) опухолевых клеток кровоподтек, от microvasculature и выживания на дополнительном сайте; (5) рост в микрометастазы; (6) рост в васкуляризированной открытой метастатические опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : PuMA томографии легких ломтики с использованием widefield флуоресценции и конфокальный флуоресценции микроскопии платформ. (A) пример PuMA фрагменты отображаются в блюдо 35 мм стекло дно. (B) оборудование конфокального микроскопа. (C) пример низким увеличение образ пума кусок с eGFP выражение OS клетки. Scalebar = 0.5 мм. (D) пример конфокальное изображение субрегиона ломтиком PuMA. Scalebar = 100 мкм. (*) Паренхимы легких является помечены красным DAR4M (см. вставку) и (∇) указывают eGFP выражая MG63 клеток. Scalebar = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Обработки низкий увеличение изображения PuMA фрагмента с помощью ImageJ. (A) оригинальное изображение PuMA. (B) вычитание фона. (C) преобразование 8-битного изображения. (D) Бинаризация изображения для выделения флуоресцентные опухолевых клеток. (E) инверсии изображения. (F) перечисление отдельных форм и количественной оценки областей формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Низкий увеличение серийный изображения показаны рост высоко и низко метастатического человека OS клетки в Пума модели со временем. (A) последовательных изображений высоко метастатического МННГ клеток и низкой клетки метастатических HOS указаны на 0, 3, 7 и 14 дней после инъекции. МННГ клетки способны расти лучше в легких микроокружения в отличие от Хос клетки. Scalebar = 1 mm. (B) фолд изменения в процентах метастатические опухоли бремя для МННГ и HOS клеток со временем отображаются в виде линейных графиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Confocal микроскопии кусок легкого DAR4M-меченых PuMA. Представитель конфокальное изображение eGFP выражая MG63 клеток в PuMA легочной ткани с DAR4M. (A) зеленый канал показывает eGFP выражая MG63 клетки (∇). (B) красный канал, показаны DAR4M краска, привязка к химически активные разновидности азота в клетки паренхимы легких. Краситель освещаются паренхимы легких (#) и структуры, напоминающие кровеносный сосуд (*). Край PuMA, легких раздел обозначается (↓). (C) Merged красный и зеленый изображения. Scalebar = 100 мкм. (D увеличенное изображение пунктирной белой коробке (от C) показывает опухолевых клеток в сосуд. Scalebar = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Confocal микроскопии митохондрий в клетках остеосаркома в модели PuMA. Представитель конфокальное изображение митохондрий в клетках eGFP выражая MG63. (A) зеленый канал показывает eGFP выражая MG63 клетки (∇). (B) красный канал, показаны ППП, локализованные в митохондрии (*). (C) Merged красный и зеленый изображения. Scalebar = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Средства массовой информации культуры | Рецепт |
| Полная СМИ (500 мл) | •440 мл DMEM |
| •50 мл FBS | |
| •5 мл 10 X перо/воспаление раствор (10000U/мл) | |
| •5 мл L-глютамин (200 мм) | |
| A-СМИ (250 мл) | •177.58 мл стерильной воды |
| •50 мл 10 X M-199 СМИ | |
| •15 мл 7,5% раствора бикарбоната натрия | |
| •2.25 мл 50 мм hydrocortizone | |
| •125 мл 0,4 мг/мл ретинола ацетат (в стерильной воде) | |
| •5 мл 10 X перо/воспаление раствор (10000U/мл) | |
| •50 мл 10 мг/мл бычьего инсулина | |
| B-СМИ (500 мл) | •427.6 мл стерильной воды |
| •50 мл 10 X M-199 СМИ | |
| •15 мл 7,5% раствора бикарбоната натрия | |
| •2.25 мл 50 мм hydrocortizone | |
| •125 мл 0,4 мг/мл ретинола ацетат (в стерильной воде) | |
| •5 мл 10 X перо/воспаление раствор (10000U/мл) | |
| •50 мл 10 мг/мл бычьего инсулина |
Таблицы 1. Рецепты для полной СМИ, A, B-массовой. Перечислены рецепты для клеточной культуры и средств массовой информации для PuMA assay.
| Клетки культуры реагентов | Описание | № каталога | Компания |
| МННГ HOS | линия клетки высоко метастатического ОС | CRL-1547 | ATCC |
| ХОС | плохо метастатического OS клеточная линия | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | линия клетки высоко метастатического ОС | Н/Д | Эми Леблан лаборатория (NCI) |
| MG63 | плохо метастатического OS клеточная линия | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 СМИ | Базовый СМИ для A- и B | 11825015 | Thermofisher |
| Вода дистиллированная (стерилизованные) | Компонент А-медиа & | 15230-147 | Thermofisher |
| B-СМИ | |||
| 7,5% раствора бикарбоната натрия | Компонент А-медиа & | 25080094 | Thermofisher |
| B-СМИ | |||
| Лицо | Компонент А-медиа & | H6909 | Сигма Alrich |
| B-СМИ | |||
| Ретинола ацетат воды растворяется | Компонент А-СМИ и B-СМИ | R0635 - 5 МГ | Сигма Alrich |
| Раствора пенициллина/стрептомицина 10 X концентрации (10000 ед/мл) | Компонент А-медиа & | 15140122 | Thermofisher |
| B-массовой, полный | |||
| Решение бычьего инсулина (10 мг/мл) | Компонент А-медиа & | I0516 - 5 МЛ | Сигма Alrich |
| B-СМИ | |||
| DMEM, высокие глюкоза | Базовые средства массовой информации полной СМИ | 11965092 | Thermofisher |
| L-глютамин (200 мм) | Компонент полного средств массовой информации | 25030081 | Thermofisher |
| Плода бычьим сывороточным | Компонент полного средств массовой информации | 16000044 | Thermofisher |
| Фосфат Дульбекко в буфер солевой раствор | Используется в культуре клеток | 14190144 | Thermofisher |
| Хэнк буферизуются солей решение, нет кальция, не магния, не фенола Красного | Используется для Ресуспензируйте Пелле клеток до инъекции | 14175095 | Thermofisher |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенола Красного | Используется в культуре клеток | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | Используется для обозначения паренхимы легких | ALX-620-069-M001 | Энцо |
В таблице 2. Клетки культуры реагентов для A-СМИ, B-средства массовой информации и полное СМИ. Перечислены компоненты для СМИ рецепты, реагенты и буферы с каталог номер и название компании.
| Материалы | Описание | № каталога | Компания |
| Конфокальный LSM Zeiss 710 | Вертикальном положении LSM Конфокальный микроскоп | Н/Д | Zeiss |
| Конфокальный LSM Zeiss 780 | Перевернутый LSM Конфокальный микроскоп | Н/Д | Zeiss |
| ТКИД мышей | КИВОК. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, женщина, возраст 6-8 недель | Н/Д | Чарльз Ривер |
| GelFoam | Используется в качестве поддержки для разделов ткани легких | 59-9863 | Гарвардский аппарат |
| SeaPlaque агарозы | Используется во время инсуффляции легких | 50100 | Lonza |
| шприц 1 мл с 27 манометра | Используется для инъекции Вену хвост | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| 10 мл шприц | Используется для инсуффляции легких | 309604 | BD |
| катетер 20 калибра | Используется во время инсуффляции легких | SR-OX2032CA | Terumo |
| Abbott IV расширение набора (30», стерильными) | Используется во время инсуффляции легких | 8342 | Medisca |
| Тампоны алкоголя | Для протирания хвост Вены до инъекции | 326895 | BD |
| Стерильные хирургические перчатки | Asceptic передача мыши легких | Зависит от размера | Fisherscientific |
| правитель 30 см | Используется для инсуффляции легких | Скобы | |
| Поддержка стенд для линейки | Используется для инсуффляции легких | HS29022A | PIPETTE.com |
| 35 мм прозрачным дном культуры блюдо | Используется при томографии легких фрагментов | 81158 | Ibidi |
| Абсорбирующие Underpads с водонепроницаемый влаги барьер | Используется для линии стерильных рабочей области в биологических Худ | 56617-014 | VWR |
| Кетгут простой рассасывающиеся шовные | Используется для галстук с канюлированной трахеи | Н/Д | Браун |
В таблице 3. Материалы для PuMA. Материалы, необходимые для PuMA протокола перечислены с каталог номер и название компании.
| Материалы | Описание | № каталога | Компания |
| Микро рассекает ножницы 3.5" прямой Sharp/Sharp | Для резки легких секций | RS-5910 | Roboz |
| 4» (10 см) длиной зубчатые прямо Совет дополнительно деликатный 0,5 мм | Для легкого манипулирования/проведение секций | RS-5132 | Roboz |
| 4» (10 см) длиной зубчатого небольшой кривой 0,8 мм наконечник | Для легкого манипулирования/проведение секций | RS5135 | Roboz |
| Большой палец отделочные щипцами; Зазубренные; Нежный; 4.5" Длина; Ширина кончика 1.3 мм | Для общего рассечение | RS-8120 | Roboz |
| Большой палец отделочные щипцы 4.5" зубчатые 2,2 мм кончик ширина | Для общего рассечение | RS-8100 | Roboz |
| Дополнительный штраф микро Dissecting ножницы 3.5" прямой Sharp/Sharp, лезвие 20 мм | Для общего рассечение | RS-5880 | Roboz |
| Knapp ножницы; Прямо; Шарп тупой; Длина клинка 27 мм; 4" Общая длина | Для общего рассечение | RS-5960 | Roboz |
Таблица 4 . Хирургические инструменты для PuMA. Различных инструментов из нержавеющей стали, используется в протоколе перечислены с каталог номер и название компании.
| Параметры | 488 лазер | 561 лазер | |
| Цель | M27 Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0,3 Вт (DIC) | ||
| мощность | 2% | 2% | |
| Пиксель останавливаться | 1.61 | 1.61 | |
| Среднее | 0 | 0 | |
| Масштаб | 1 | 1 | |
| Основной прирост | 820 | 814 | |
| Цифровое увеличение | 1 | 0.51 | |
| Цифровая офсетная | -4,5 | -9.24 | |
| Пинхол | 51 | 57 | |
| Перестраиваемый фильтр | 496-553 | 570-618 | |
В таблице 5. Параметры для конфокальная томография DAR4M-меченых PuMA секций. В таблице приведены параметры конкретного изображения, используется для полученных конфокальный изображений в текущем документе.
| Параметры | 488 лазер | 561 лазер | |
| Цель | План Апохромат 63 x / 1,40 масло ДВС M27 | ||
| мощность | 2% | 2% | |
| Пиксель останавливаться | 0.6 | 0.6 | |
| Среднее | 2 (линия) | 2 (линия) | |
| Масштаб | 2.3 | 2.3 | |
| Основной прирост | 449 | 390 | |
| Цифровое увеличение | 1 | 1.23 | |
| Цифровая офсетная | 0 | 0 | |
| Пинхол | 136 | 136 | |
| Перестраиваемый фильтр | 493-550 | 566-703 | |
В таблице 6. Параметры для конфокальная томография митохондрии клетки MG63 в разделах PuMA. В таблице приведены параметры конкретного изображения, используется для полученных конфокальный изображений в текущем документе.
Дополнительные рисунок 1: гравитация перфузии аппарат. Тяжести перфузии аппарат используется для insufflate легких с жидким раствором агарозы/A-СМИ на 20 см H20 гидростатического давления. Агарозы/A-медиа раствор заливается в 10 мл шприц, который прилагается IV расширение присвоено канюлированной трахеи (не показан). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.
Фильм 1: вращение изображения 3D конфокальных z стек eGFP выражая ОС клеток в кусок легкого DAR4M-меченых PuMA. DAR4M (красный канал) используется для выделения паренхимы легких и выражая eGFP MG63 клетки также могут быть замечены (зеленый канал). Scalebar = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот шаг.
Фильм 2: вращение изображения 3D конфокальных z стек ППП меченых митохондрий в eGFP выражая OS ячеек в модели PuMA. Внутриклеточных органелл например митохондрии показываются Приклеенные этикетку с ЗП (красный канал) в клетках eGFP выражая MG63 (зеленый канал) в модели PuMA. Scalebar = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот шаг.
Дополнительные фильм 1: увеличенное 3D фильм метастатического OS ячейки в сосуд в легком. Выражая eGFP MG63 клеток показана в судно в пределах легкого микроокружения. Scalebar = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот шаг.
Дополнительные фильм 2: увеличенное 3D фильм митохондрий в ячейке OS метастазами в легких. Митохондрии, помечены ППП указаны в MG63 клетках микроокружения легких. Scalebar = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот шаг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Следующие технические статьи описывает некоторые практические аспекты модели PuMA в изучении легких колонизации в OS. Некоторые важнейшие шаги в протоколе, где исследователи должны проявлять особую осторожность, включают следующее:
) катетеризации трахеи. Трахеи могут быть легко повреждены во время рассекает окружающих мышц и соединительной ткани. Кроме того иглы катетера может быть легко толкнул через трахею. Уделять пристальное внимание как скос иглы входит трахеи при вставке канюли.
b) проколов или повреждения поверхности легких. Легких может быть легко прокалываться или повреждены с рассечения ножницы во время удаления грудины и подвергая грудной полости. Будьте осторожны, когда вскрывали, срывать из грудной полости. Проколов или повреждения поверхности легких вызовет жидкого агарозы/A-средств массовой информации просачиваться и легких будет спущен.
c) удалите избыток средств массовой информации из разделов легких при визуализации. Избыток жидкости СМИ окружающих легких секция может вызвать эффект «зеркало», если смотреть под микроскопом. Лишнюю жидкость может отражать флуоресцентный свет от опухолевых клеток, тем самым преувеличиваю флуоресценции области на изображении. Удаление избыточного СМИ жидкости позволит предотвратить этот артефакт в изображении. Кроме того артефакт изображения могут быть удалены во время пост-обработки изображений.
d) фотоповреждения живых тканей. При использовании шарик ртути или лазеры 1-Фотон микроскопа, необходимо ограничить время на свету. Можно также уменьшить процент интенсивность/мощность источника света. Передержка для источника света может вызвать фотоповреждения в легочной ткани. Микроскопы оснащены светоизлучающие диоды (LED) или 2-Фотон/multi photon Микроскопы было бы идеально, потому что они производят меньше фотоповреждения во время продольных исследований изображений.
Пума модели могут быть адаптированы и изменены, чтобы изучить многие аспекты процесса колонизации легких. Другой вариант этого ex vivo подхода описывается ван ден Bijgaart и коллеги- 21. Для исследования изучение последствий деятельности генов нокдаун или борьбе с метастатическим наркотиков на рост клеток опухоли в легких, сокращение числа клеток вводили от 5 x 105 до 3 x 105 рекомендуется так как последствия вмешательства может быть замаскирована в ходе экспоненциальный рост больших клеток докладе. Несколько исследований использовали PuMA модель для изучения драйвера легких метастатическим прогрессии 4,5,8,,2223,24. Различные красители флуоресцентный индикатор или флуоресцентные репортер генов может использоваться для метки опухолевых клеток для выяснения изменений в ячейки физиологии или ген выражение 8 в легких микроокружения.
Одно ограничение Пума модели включает в себя ограниченное число совместимых клеточных линий. Совместим с этот assay установленным клеточных линий, перечислены Мендоса и коллеги 3 . Для высоких и низких метастатического остеосаркома клеточных линий, последующие пары клонально связанных клеточных линий были найдены расти и поддерживать их метастазами склонность в Пума модели: клетки человека MG63.3 и MG63, МННГ и 143B и HOS клетки, мышиных K7M2 и K12 клетки. Исследователи должны эмпирически определить ли их клеточных линий может оставаться жизнеспособным в B-СМИ. Еще одним ограничением для рассмотрения является ограниченное количество времени, легочной ткани может быть сохранен в пробирке. Легочной ткани может сохранить его клетчатых компонентов на 30 дней, за это время и клеточных компонентов легких начинают отмирать. Поэтому изучение взаимодействия между опухолевых клеток и клеток стромы легкого не должен превышать 30 дней.
PuMA модель обеспечивает беспрецедентную метод для изучения как метастатического OS колонизировать клетки легочной ткани. Наиболее ярким аспектом Пума модели происходит из того факта, что несколько низких метастатического OS клеточных линий (ХОС, MG63, K12), которого в vivo фенотипов были характерны других 25, не могут расти в Пума модели. В отличие от клонально связанные высоко метастатического OS клетки (МННГ, MG63.3, K7M2) имеют большую склонность к колонизировать легких тканей в vivo25 и в Пума модели. Это свидетельствует о том, что клеточной и внеклеточной компонентах легких микроокружения предотвратить низкой метастатического OS клеточных линий от выращивания в естественных условиях, по-прежнему поддерживаются в модели PuMA, несмотря на отсутствие кровотока. Другими словами легких микроокружения Пума модели по-прежнему оказывает «давление отбора», что мешает низкий клетки метастатических OS от выращивания в легких. Действительно, изучение высокой метастатического OS клетки растут в Пума была полезной в выявлении новых молекулярных драйверов метастатическим фенотип 4,5. Кроме того, генетических вниз модуляции указанных целей в высоко метастатического клеток было показано, уменьшить метастатического потенциала в обоих Пума модели и в естественных условиях 5. Кандидат анти метастатического наркотиков исследований, PuMA, модель может использоваться для определения, какой диапазон концентрации может уменьшить метастатическим нарост в тканях легких, который в свою очередь, может быть проверенных в естественных условиях.
Будущего применения этой модели следует использовать множество коммерчески доступных флуоресцентных красителей и репортер генов для того, чтобы углубиться глубоко в базовой биологии OS метастазов прогрессии. Например флуоресцентных красителей, таких как 2', 7' - dichlorofluorescin диацетата или dihydroethidium может использоваться для оценки окислительно-восстановительного состояния опухолевых клеток в Пума модели. Флуоресцентный репортер генов может использоваться для изучения биологии органелл или оценить деятельность промоутер для определения, какие сигнальные пути активируются в высоко метастатического OS клеток во время процесса колонизации. Такие подходы может использоваться для визуализации, имеет ли наркологической деятельности в опухолевых клетках, растущих в легких. Люминесцентная микроскопия платформ, которые производят меньше повреждений тканей, таких как LED оборудованная Микроскопы или 2-Фотон/multiphoton конфокальные микроскопы, могут быть использованы исследования как метастатического OS клетки мигрируют и вторгнуться в тканях легких. Кроме того взаимодействия адгезию опухолевых клеток и клеток стромы легкого может контролироваться с флуоресцентные репортер генов.
Подводя итоги, текущий рассматриваются практические аспекты PuMA, впервые разработанная модель Мендоса и коллеги 3. Приведен пример использования низким увеличение, widefield флуоресцентной микроскопии и конфокальная микроскопия высокого разрешения для оценки роста высоких и низких метастатического клеток человека ОС. Были описаны несколько критических этапов протокола. Кроме того были обсуждены преимущества и недостатки модели PuMA. Будущих приложений для изучения процесса колонизации легких Пума модели были выдвинуты, и ожидается, что эта модель будет иметь более широкое применение в остеосаркома исследовательского сообщества.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить доктора Арнульфо Мендоса, который обеспечивал подготовку в технике PuMA. Кроме того мы хотели бы признать Drs. Чанд Кханна, Сьюзен Гарфилд (NCI/низ) и Сэм Апарисио (до н.э. Рак Агентство) для обеспечения использования их микроскопов в ходе этого исследования. Это исследование было поддержано (частично) интрамуральных исследовательской программы национальных институтов здравоохранения, центр для исследований рака, отделение детской онкологии. M.M.L. была поддержана национальной институтов из интрамуральных посещения сотрудник программы здравоохранения (премия 15335) и в настоящее время поддерживается Джоан Паркер стипендий в исследованиях метастазов. Британской Колумбии рак Фонда поддерживается P.H.S..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S.
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
